JP2902408B2 - 蛍光検出型電気泳動装置 - Google Patents

蛍光検出型電気泳動装置

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光検出型電気泳動装置に関し、さらに詳し
くは、発光波長の異なる複数の蛍光体を用いて塩基配列
を決定すべきDNAを標識し、電気泳動分離した後発する
蛍光を検出することにより前記DNAの塩基配列を決定す
るのに好適な蛍光検出型電気泳動装置に関する。
〔従来の技術〕
末端塩基種の異なるDNA断片を発光波長の異なる蛍光
体を用いて標識し、ゲル電気泳動分離しながら泳動路の
一定位置を光照射し発する蛍光波長と強度の時間変化か
ら照射部を通過するDNA断片の末端塩基種を知り配列決
定する手法が発展してきている。蛍光波長の識別検出に
は光電子増倍管の前部に4種のバンドパスフィルターを
具備した回転フィルターを使用したり、透過波長帯の異
なるフィルターを具備した2本の光電子増倍管を用いた
りしている。いずれの場合もいくつもある泳動路を横切
って検出器を掃引し複数試料DNAの塩基配列を決定して
おり、一方、ゲル板の側面からレーザー光を入射し、各
測定点を連続照射し、得られる蛍光像をプリズムで分光
し、二次元検出器で検出する方式も提案されている。
しかしながら、上記検出器を掃引する計測系ではゲル
の1つの測定点あたりの計測時間の割合αは、測定領域
の長さをl照射レーザービームの幅をdとすると となる。通常dは0.2〜0.3mm、l100mmなのでα10
-3となり、連続光照射、受光した場合の10-3程度の蛍光
受光量しか得られず、高感度が得られない難点があっ
た。一方、上記のプリズムで分光し、二次元検出器で検
出する方式では受光量は大きくこの難点は克服されう
る。しかし、プリズムによる分光制度は低く、精度の高
い塩基識別に難点があった。
〔発明が解決しようとする課題〕
上記のように、従来技術は感度を高める点で配慮がな
されていなかったり、あるいは精度高い波長分離につい
て配慮がなく、高精度の塩基配列決定ができなかった。
本発明の目的は上記難点を解消し、高精度・高感度の
DNA分離検出が可能な装置を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは研究の結果、前記ゲル電気泳動分離板へ
のレーザー照射によって得られる蛍光画像をプリズムに
よってまず複数の虚像に像分割し、ついで、前記像分割
された個々の像の光をバンドパスフィルターによって波
長分散させる等のプロセスを経て、これらの像を検出器
上に結像させて所要の分離検出を行うようにすることに
より、上記目的が良好に達成されることを見出し、この
新知見に基づいてさらに研究を重ねて本発明を完成する
に至った。
したがって、本発明の蛍光検出型電気泳動装置は、少
なくともレーザー光源とゲル電気泳動分離板と蛍光検出
器を具備した蛍光検出電気泳動装置において、前記ゲル
電気泳動分離板の所要個所へのレーザー照射によって得
られる線状の蛍光画像を分割する複数の光学的平面を有
するプリズムと、前記プリズムの複数の光学的平面によ
って分割された複数の像を前記蛍光検出器上に個別に結
像せしめる光学系とを具備したことを特徴とする。
本発明の装置の実用的な構成としては、前記ゲル電気
泳動分離板の所要個所へのレーザー照射が、前記ゲル電
気泳動分離板の側面から前記ゲル電気泳動分離板の平面
に平行に貫通する方向のレーザー照射であり、レーザー
照射によって得られる線状の蛍光画像を前記ゲル板中の
レーザー照射の通路にそって発する蛍光画像である。
光学系が、プリズムの複数の光学的平面から出た分割
された像の光の通路中に、それぞれ、対応して設置され
た透過波長帯の個々に異なるバンドパスフィルタを具備
したものとされる。
前記プリズムの具体的形状としては、実施例の図面に
示すような中心部の頂角の稜を含む断面に対称な多面
体、或いは、台形のように中心部の断面に対称な多面体
等がある。
そして、前記プリズムの材質としては、特に、本発明
の装置を多色蛍光検出型電気泳動装置として用いる場合
には、屈折率の高い材質のものとする必要があり、具体
的には、BaF01,Laf3,SF3,ガラス等を挙げることができ
る。
さらに、本発明の装置を、多色標識した試料の分離検
出に用いる多色蛍光検出型電気泳動装置とする場合にお
いては、ゲル電気泳動分離板を泳動させる分離検出用試
料として多色標識された試料が用いられる。そして、そ
の場合の多色標識のために用いられる蛍光色素として
は、FITC(fluorescein isothiocyanate;発光波長515n
m),NBD−F(4−fluoro−7nitrobenzofurazan;発光波
長540nm),TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyan
ate;発光波長573nm)およびTexas Red(発光波長610n
m)あるいは金属錯体を含む蛍光体などを利用できる。
多色標識に対応してバンドパスフィルタとしては、誘
電体蒸着多層膜フィルターと色ガラスフィルターの組合
せ等が用いられる。
また、プリズムの望ましい配置としては、少なくとも
プリズムの1つの頂角が、電気泳動分離板の所要個所へ
のレーザー照射によって得られる線状の蛍光画像の発光
線像と蛍光検出器の結像部位の中心を含む平面内にあ
り、かつ、前記蛍光画像の発光線像と平行におかれてい
るようにされたり、或いは、プリズムが、ゲル電気泳動
分離板の所要個所へのレーザー照射によって得られる線
状の蛍光画像の発光線像と蛍光検出器の結像部位の中心
を含む平面内に対し上下対称になり、かつ、その中心部
の頂角が前記蛍光画像の発光線像と平行になるように設
置される。
前記蛍光検出器としては、通常、二次元蛍光検出器が
用いられる。
本発明の蛍光検出型電気泳動装置による、分離検出の
対象試料としては、塩基配列を決定すべきDNA或いはRNA
が挙げられるが、蛋白質等も対象試料とすることができ
る。
本発明の装置は、上記のように最も好適には、多色蛍
光検出型電気泳動装置として用いられるが、単色の蛍光
検出の場合にも用いることができる。この場合において
も、本発明の装置を用い、線状の蛍光画像を例えば2つ
に像分割して前者で蛍光のピークの光を計測し、後者で
特定の低波長の光を計測するようにバンドパスフィルタ
の組み合わせを選択することにより、装置のレーザー照
射光のゆらぎ等の計測条件の変化による計測誤差を補正
して正確な分離検出を行うことが可能となる等のメリッ
トを生ずるものである。
〔作用〕
本発明によれば、ゲル電気泳動分離板へのレーザー照
射によって得られる蛍光画像は、まず、プリズムによっ
て複数の虚像に像分割され、ついで、前記像分割された
個々の像の光がバンドパスフィルターによる波長分散等
のプロセスを経て、これらの像が検出器上に結像され、
所要の分離検出が行われるものである。
これを更に具体的に述べれば、本発明の蛍光検出型電
気泳動装置において、受光レンズのひとみ位置から照射
部を見ると、プリズムの中心部の頂角は好ましくは線状
発光部と重なるように置かれている。そして、プリズム
の上半部と下半部を通った光は異なる点から出た光によ
うに2つの像として二次元検出器上に結像すると共に波
長分散を上下方向に起す。それぞれのプリズムから来る
光は異なるフィルターを通過して検出部に至る波長の近
い信号はプリズムの上半部を通過したか下半部を通過し
たかで分離検出し、波長差の大きい信号はプリズムによ
る波長分散で分散検出できる。本発明ではプリズムとフ
ィルターの組み合わせにより発光波長の異なる蛍光を時
分割、すなわち、時間的に分けて検出することなしに高
精度で同時に分離検出できる。
したがって、本発明の装置は、多色蛍光標識されたDN
A断片の塩基配列の決定等に好適に使用できる。
また、照射部を側面から連続的に照射し、二次元検出
器で全照射領域を同時に観測するので受光光量も多く高
感度が得られる。
〔実施例〕
以下、本発明の一実施例を第1図により説明する。第
1図は装置の概念図である。光学系は断面図となってい
る。2枚の0.3mm間隔のガラス板1(300mm×200mm×5m
m)で挟まれた6%ポリアクリルアミドのゲル板2は側
面からアルゴンレーザー(400nm10mw)で照射される。
照射部3は断面図では点として表わされる。照射部から
上方に出た光は上部プリズム4で屈折された後、レンズ
6で二次元検出器9の下側に結像する。一方下部に出た
光は下部プリズムで屈折された後、やはりレンズ6で二
次元検出器9の上側に結像する。本実施例においては、
蛍光検出の試料であるDNA断片は4種の末端塩基種に対
応した4種の異なる発光波長の蛍光色素、すなわち、FI
TC(fluorescein isothiocyanate;発光波長515nm),NBD
−F(4−fluoro−7nitrobenzofurazan;発光波長540n
m),TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate;発
光波長573nm)およびTexas Red(発光波長610nm)で蛍
光標識されているので、発光部からは前記4つの波長の
光が出て、これらはプリズムで分散され、第2図に示し
たように上部および下部にそれぞれ4本のライン(断面
図では4点)ができる。15と15′16と16′,17と17′,18
と18′はそれぞれ同じ波長の光による像で下部および上
部プリズムを通過した光に対応する。この場合15,15′
はTexas Redからの光、16,16′はTRITC、17,17′はNBD
−F、18,18′はFITCからの発光像である。この例で
は、15と16、17と18の波長差は小さくプリズムによる波
長分散で十分識別することは難しいが、15と17および16
と18は十分識別できる。そこでバンドパスフィルターと
して上部7には515nmと573nmの二カ所に透過帯のあるも
のを、下部には540nmと610nmの二カ所に透過帯のあるフ
ィルターを用いる事により4色を区別して検出できる。
第2図はこの様子を示したものでフィルターのない場合
(励起光除去フィルターは具備)には二次元検出器上に
8本の線が観測され、隣接する線ははっきり分離されな
い。フィルター7および8を装着すると4本の線が分離
して検出できるようになる。(第2図右上部および第1
図モニター画面参照)4本の蛍光像による信号はそれぞ
れ二次元検出器の1〜2本の水平走査線を用いて独立に
読み出すことができる。得られた信号はデータ処理装置
11を用いてDNA断片における4種の末端塩基種の情報に
変換され塩基配列決定される。
本実施例ではプリズム4,5は一体化し狭い頂角を30°
とした。プリズム素材にはBafガラスを用いた。プリズ
ムの頂角はプリズム4の肉厚部を通る光が屈折によりレ
ンズ6の下端より下を通過し、レンズが像を見る立体角
分の光がレンズに入り得るように決定している。
第3図は多面体プリズムを用いた例である。発光点3
から出た光は上部プリズム、あるいは下部プリズムを通
過してレンズ6により二次元検出器9上の別の位置に結
像する。上部プリズムおよび下部プリズムを図のように
角度の異なる二つの面で構成すると上部および下部プリ
ズムを通過する光はそれぞれ2本の像として、合計4本
の像として検出器9上に結像する。像数は増加するがプ
リズムの所で見た受光立体角も全体として大きくなるの
で検出蛍光像1本あたりの受光量はプリズムを使用しな
い場合と比べてほとんど変化しない。それぞれの像の結
像位置あるいはプリズム(4,5)の直後に透過波長の異
なるフィルター20を置き波長分離して信号を検出する。
バンドパスフィルターは波長による透過率の切れを非常
に鋭くできるのでプリズムによる波長分散を利用するよ
りも波長分離を高精度で行なうことができる。なお上記
実施例でのプリズム素材にはBK5を用いた。プリズムの
角度21,22はそれぞれ10°および20°である。
〔発明の効果〕
本発明によれば、まずプリズムを用いて複数個の蛍光
像を作り、ついで各々の像は波長の異なる発光を識別し
て透過させるフィルターを通して受光器上に結像させる
ので、従来のプリズム分光のみによる分離検出の方式に
比べて、多色標識されたDNA断片等からの信号を高精度
で区別して同時に計測でき、高い精度の分離検出或いは
塩基配列決定等ができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の蛍光検出型電気泳動装置を用いた計測
系の断面模式図を含むブロック図、第2図は光学系の断
面模式図、第3図は多面プリズムを用いた測定系の概念
図である。 1……ガラス板、2……ゲル板、3……照射部、4……
上部プリズム、5……下部プリズム、6……レンズ、7
……上部フィルター、8……下部フィルター、9……二
次元検出器、10……制御装置、11……データ処理装置、
12……表示装置、13……モニター、14……線画像、15,1
5′〜18,18′……蛍光像、19……励起光カットフィルタ
ー、20……4段分割バンドパスフィルター、21,22……
プリズムの頂角。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−263458(JP,A) 特開 昭63−209288(JP,A) 特開 昭52−37060(JP,A) 特開 昭63−19601(JP,A) 特開 昭59−187309(JP,A) 特開 昭63−231247(JP,A) 特開 昭63−36147(JP,A) 実願 昭62−93987号(実開 昭64− 3274号)の願書に添付した明細書及び図 面の内容を撮影したマイクロフィルム (JP,U)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】第1の面と該第1の面と異なる傾きを持つ
    複数の第2の面の各面とによりそれぞれはさまれ一方向
    に並ぶ複数の領域を有し、複数の泳動路にレーザー光が
    ほぼ同時に照射された線状の照射領域を泳動する試料を
    標識する蛍光体から発する蛍光線像を複数の平行な線像
    に分割するプリズムと、前記照射領域と光検出器との間
    に配置される透過波長帯の異なる複数のバンドパスフィ
    ルタとを具備し、前記蛍光線像が波長帯の異なる複数の
    平行な線像として前記光検出器の異なる位置で検出され
    ることを特徴とする電気泳動装置。
  2. 【請求項2】第1の面と該第1の面と異なる傾きを持つ
    複数の第2の面の各面とによりそれぞれはさまれ一方向
    に並ぶ複数の領域を有し、複数の泳動路にレーザー光が
    ほぼ同時に照射された線状の照射領域を泳動する試料を
    標識する蛍光体から発する蛍光線像を複数の平行な線像
    に分割するプリズムと、前記照射領域と光検出器との間
    に配置される透過波長帯の異なる複数のバンドパスフィ
    ルタとを具備し、前記プリズムの中央部の頂角の稜線が
    前記蛍光線像と前記光検出器の結像面の中心とを含む平
    面内に配置され、前記蛍光線像が波長帯の異なる複数の
    平行な線像として前記光検出器の異なる位置で検出され
    ることを特徴とする電気泳動装置。
  3. 【請求項3】試料が泳動される複数の泳動路と、第1の
    面と該第1の面と異なる傾きを持つ複数の第2の面の各
    面とによりそれぞれはさまれ一方向に並ぶ複数の領域を
    有し、前記複数の泳動路にレーザー光がほぼ同時に照射
    された線状の照射領域を泳動する前記試料を標識する蛍
    光体から発する蛍光線像を複数の平行な線像に分割する
    プリズムと、前記照射領域と光検出器との間に配置され
    る透過波長帯の異なる複数のバンドパスフィルタとを具
    備し、前記第1の面は前記複数の泳動路のなす面にほぼ
    平行に配置され、前記蛍光線像が波長帯の異なる複数の
    平行な線像として前記光検出器の異なる位置で検出され
    ることを特徴とする電気泳動装置。
  4. 【請求項4】第1の面と該第1の面と異なる傾きを持つ
    4つの第2の面の各面とによりそれぞれはさまれる4つ
    の領域を有し、レーザー光が照射された線状の照射領域
    を泳動する試料を標識する蛍光体から発する蛍光線像を
    4つの線像に分割するプリズムと、前記照射領域と光検
    出器との間に配置される透過波長帯の異なる4つのバン
    ドパスフィルタとを具備し、前記プリズムの中央部の頂
    角の稜線が前記蛍光線像と前記光検出器の結像面の中心
    とを含む平面内に配置され、前記蛍光線像が波長帯の異
    なる4つの平行な線像として前記光検出器の異なる位置
    で検出されることを特徴とする電気泳動装置。
  5. 【請求項5】試料が泳動される複数の泳動路と、第1の
    面と該第1の面と異なる傾きを持つ4つの第2の面の各
    面とによりそれぞれはさまれる4つの領域を有し、前記
    複数の泳動路にレーザー光が照射された線状の照射領域
    を泳動する前記試料を標識する蛍光体から発する蛍光線
    像を4つの線像に分割するプリズムと、前記照射領域と
    光検出器との間に配置される透過波長帯の異なる4つの
    バンドパスフィルタとを具備し、前記第1の面は前記複
    数の泳動路のなす面にほぼ平行に配置され、前記蛍光線
    像が波長帯の異なる4つの平行な線像として前記光検出
    器の異なる位置で検出されることを特徴とする電気泳動
    装置。
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