JP2898040B2 - Antibodies to gp130 protein - Google Patents
Antibodies to gp130 proteinInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトインターロイキン−６（以下「IL−６」
と略す）のシグナル伝達に関与する蛋白質であるgp130
蛋白質と特異的に結合する抗体及びその製造方法に関す
るものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to human interleukin-6 (hereinafter referred to as "IL-6").
Gp130, a protein involved in signal transduction
The present invention relates to an antibody that specifically binds to a protein and a method for producing the same.
IL−６は、種々の重要な生理活性を有し、広く細胞の
増殖分化に関与している蛋白質である。さらにIL−６の
異常産生が種々の自己免疫疾患の病因因子である可能性
が報告されている（岸本、平野、Ann.Rev.Immunol.,6,p
485,1988年参照）。IL-6 is a protein having various important physiological activities and widely involved in cell proliferation and differentiation. Furthermore, it has been reported that abnormal production of IL-6 may be a causative factor of various autoimmune diseases (Kishimoto, Hirano, Ann. Rev. Immunol., 6, p.
485, 1988).
IL−６と特異的に結合する細胞膜上のIL−６レセプタ
ーは、田賀らにより解析され、各細胞上の数、IL−６と
の結合定数等が報告されている（J.Exp.Med.,166,p967,
1987年参照）。さらにヒトIL−６レセプターのcDNAが山
崎らにより単離され、一次構造が報告されている（Scie
nce,241,825,1988年参照）。最近になり、IL−６レセプ
ターの細胞外部分（可溶性レセプター）が、遺伝子工学
的に作製され（特願平１−9774号明細書参照）、各種免
疫疾患の治療薬、診断薬として期待されている。The IL-6 receptor on the cell membrane that specifically binds to IL-6 has been analyzed by Taga et al., And the number on each cell, the binding constant with IL-6, and the like have been reported (J. Exp. Med. , 166, p967,
1987). Furthermore, a human IL-6 receptor cDNA has been isolated by Yamazaki et al. And the primary structure has been reported (Scie
nce, 241, 825, 1988). Recently, the extracellular portion of IL-6 receptor (soluble receptor) has been prepared by genetic engineering (see Japanese Patent Application No. 1-9977), and is expected as a therapeutic or diagnostic agent for various immune diseases. I have.
さらに本発明者は、IL−６のシグナル伝達に関与する
gp130蛋白質と呼称される蛋白質を細胞膜上に見出して
いる（特願平１−200230号明細書参照）。即ち、このgp
130蛋白質は、IL−６の存在下でIL−６レセプターと結
合するが、IL−６の非存在下ではIL−６レセプターと結
合せず、SDS/PAGEにおいて130kDaの見かけの分子量を有
する蛋白質である。そしてIL−６がIL−６レセプターに
結合後、細胞内にその情報を伝達するためには、IL−６
がIL−６レセプターに結合しただけでは足りず、さらに
細胞膜上の蛋白質であるgp130蛋白質と会合しなければ
ならないこと、さらにIL−６レセプターの細胞内領域は
IL−６のシグナル伝達には関与しないことを明らかにし
た。Further, the present inventors are involved in IL-6 signaling.
A protein called gp130 protein has been found on the cell membrane (see Japanese Patent Application No. 1-223030). That is, this gp
130 protein binds to the IL-6 receptor in the presence of IL-6, but does not bind to the IL-6 receptor in the absence of IL-6, and has an apparent molecular weight of 130 kDa in SDS / PAGE. is there. Then, after IL-6 binds to IL-6 receptor, in order to transmit that information into cells, IL-6
Is not sufficient to bind to the IL-6 receptor, it must be associated with the gp130 protein, a protein on the cell membrane, and the intracellular region of the IL-6 receptor is
It was revealed that it was not involved in IL-6 signaling.
IL−６の生理的役割をさらに深く解析するためには、
細胞内への情報伝達の経路に関する知見が重要である。
そしてこのような知見は、IL−６作用を調節する物質を
治療薬として開発するためにも重要である。しかしなが
ら、gp130蛋白質の生体内での存在量は極めて微量であ
るので、大量の精製品を得るためには遺伝子工学的手法
を用いる必要がある。この様な遺伝子のクローニングノ
為にはgp130蛋白質を迅速に同定できる抗gp130蛋白質抗
体の開発が望まれる。また、IL−６レセプターとgp130
蛋白質の会合を競合的に阻止するモノクローナル抗体が
開発されれば、IL−６の生物活性を抑制する治療薬とし
ての応用が可能である。To further analyze the physiological role of IL-6,
It is important to find out about the pathway of signal transmission into cells.
Such findings are also important for developing a substance that regulates IL-6 action as a therapeutic agent. However, since the amount of the gp130 protein in a living body is extremely small, it is necessary to use a genetic engineering technique to obtain a large amount of purified products. In order to clone such a gene, it is desired to develop an anti-gp130 protein antibody capable of rapidly identifying the gp130 protein. In addition, IL-6 receptor and gp130
If a monoclonal antibody that competitively inhibits protein association is developed, it can be applied as a therapeutic agent that suppresses the biological activity of IL-6.
しかしながら、これまでにこのgp130蛋白質を認識す
るモノクローナル抗体は知られていない。However, a monoclonal antibody that recognizes this gp130 protein has not been known so far.
従って、本発明はgp130蛋白質に対する種々のタイプ
の抗体を提供しようとするものである。Accordingly, the present invention seeks to provide various types of antibodies against the gp130 protein.
上記の課題は、ヒトインターロイキン−６シグナル伝
達に関与する次の性質を有するgp130蛋白質： （１）IL−６の存在下でIL−６レセプターと結合するが
IL−６の非存在下ではIL−６レセプターと結合しない；
及び （２）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において1
30kDaの見かけの分子量を示す； と特異的に結合し得る抗−gp130蛋白質抗体；該抗体を
生産するハイブリドーマ；該ハイブリドーマの製造方
法；並びに該ハイブリドーマを用いる前記抗体の製造方
法を提供することにより解決される。SUMMARY OF THE INVENTION The above problems were addressed by the following characteristics involved in human interleukin-6 signaling: gp130 protein having the following properties: (1) binds to the IL-6 receptor in the presence of IL-6;
Does not bind to the IL-6 receptor in the absence of IL-6;
And (2) 1 in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
An anti-gp130 protein antibody capable of specifically binding with: an apparent molecular weight of 30 kDa; a hybridoma producing the antibody; a method for producing the hybridoma; and a method for producing the antibody using the hybridoma. Is done.
本発明の抗体は、ヒトIL−６のシグナル伝達に関与す
るgp130蛋白質を特異的に認識するものであり、これに
はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれ
る。モノクローナル抗体には、ヒトIL−６レセプターと
gp130蛋白質との結合を競合的に阻害するものと、これ
を競合的に阻害しないものとが含まれる。前者の例とし
ては、本発明のハイブリドーマAM64により産生されるAM
64モノクローナル抗体が挙げられ、後者の側としてはハ
イブリドーマAM277により産生されるAM277モノクローナ
ル抗体が挙げられる。The antibody of the present invention specifically recognizes a gp130 protein involved in human IL-6 signal transduction, and includes a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. Monoclonal antibodies include human IL-6 receptor
Includes those that competitively inhibit binding to the gp130 protein and those that do not. As an example of the former, AM produced by the hybridoma AM64 of the present invention
64 monoclonal antibodies, the latter side including the AM277 monoclonal antibody produced by hybridoma AM277.
本発明の抗体の製造のために用いられる免疫原として
は、gp130蛋白質を細胞表面に発現している動物細胞を
用いることができる。この様な細胞としてはヒトIL−６
レセプター及びgp130蛋白質の両者を産生するヒト由来
細胞株、例えばヒトミエローマ細胞株U266、又はgp130
蛋白質をコードするDNAにより形質転換された宿主細
胞、例えばそのような動物細胞株が挙げられ、その例と
してgp130蛋白質をコードするcDNAを含有するプラスミ
ドにより形質転換されたマウスＴ細胞が挙げられる。し
かしながら、この様な細胞株は、細胞表面に発現してい
るgp130蛋白質の量が少ない等のため効率的な免疫原と
は言い難い。As an immunogen used for producing the antibody of the present invention, animal cells expressing the gp130 protein on the cell surface can be used. Such cells include human IL-6
A human-derived cell line that produces both the receptor and the gp130 protein, such as the human myeloma cell line U266, or gp130
Host cells transformed with the DNA encoding the protein include, for example, such animal cell lines, such as mouse T cells transformed with a plasmid containing the cDNA encoding the gp130 protein. However, such a cell line cannot be said to be an efficient immunogen due to a small amount of the gp130 protein expressed on the cell surface.
しかしながら、この様な免疫原を使用してであって
も、一旦gp130蛋白質に対する抗体を手にすれば、これ
を用いてより効率的な免疫原を調製し、これを用いてさ
らに多様な抗体を製造することができる。例えば、gp13
0蛋白質に対する抗体を適当な固体担体に結合させ、他
方、gp130蛋白質を産生する細胞、例えば前記の細胞を
培養して細胞溶解し、この細胞溶解物を、前記の抗−gp
130蛋白質抗体を結合した固体担体と接触せしめること
により細胞溶解物中のgp130蛋白質を担体上に吸着・濃
縮して、これを免疫原として使用することができる。固
体担体については抗体を結合できるもので、免疫する動
物の生育に重大な影響を及ぼさないものであれば特別の
制限はない。例えば、本発明の実施例で説明される様な
セファロース等を基材とした固体担体は、簡便な操作で
抗体を結合でき、かつ、動物の生育に影響を与えない、
等、本発明における固体担体として好適である。However, even with such an immunogen, once an antibody against the gp130 protein is obtained, a more efficient immunogen can be prepared using the same, and a wider variety of antibodies can be prepared using the same. Can be manufactured. For example, gp13
An antibody against the protein is bound to a suitable solid support, while cells producing the gp130 protein, for example, the above-described cells are cultured and lysed.
The gp130 protein in the cell lysate is adsorbed and concentrated on the carrier by contacting with a solid carrier to which the 130 protein antibody is bound, and this can be used as an immunogen. The solid carrier is not particularly limited as long as it can bind the antibody and does not significantly affect the growth of the animal to be immunized. For example, a solid carrier based on Sepharose or the like as described in Examples of the present invention can bind antibodies by a simple operation, and does not affect the growth of animals,
For example, it is suitable as a solid carrier in the present invention.
また、gp130蛋白質の一部分を構成するペプチドを調
製し、これを適当な高分子キャリヤー、例えばオバルブ
ミンに結合して免疫原として使用することもできる。さ
らには、感染後にgp130蛋白質が発現するようにされた
ワクチニアウイルスを使用することもできる。これらの
免疫原はいずれも、ポリクローナル抗体を製造するため
の免疫原として、及びハイブリドーマを調製するための
免疫原として使用することができる。Alternatively, a peptide constituting a part of the gp130 protein can be prepared and bound to a suitable polymer carrier, for example, ovalbumin, and used as an immunogen. Furthermore, a vaccinia virus that has been made to express the gp130 protein after infection can also be used. Any of these immunogens can be used as an immunogen for producing a polyclonal antibody and as an immunogen for preparing a hybridoma.
ポリクローナル抗体の製造は、常法に従って、例えば
上記のいずれかの免疫原によりマウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ等を免疫感作することによって行うことができ
る。The polyclonal antibody can be produced by a conventional method, for example, by immunizing mice, rabbits, sheep, goats and the like with any of the above immunogens.
ハイブリドーマの作製も常法に従って行うことができ
る。例えば前記の免疫原のいずれかによりマウス等の哺
乳類を免疫し、この動物から脾臓細胞を得、これを樹立
されたミエローマ細胞と融合せしめる。次に、目的とす
る反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマをクローニングする。Hybridomas can also be prepared according to a conventional method. For example, a mammal such as a mouse is immunized with any of the above-mentioned immunogens, spleen cells are obtained from the animal, and the spleen cells are fused with established myeloma cells. Next, a hybridoma producing a monoclonal antibody having the desired reactivity is cloned.
モノクローナル抗体を製造するには、前記のようにし
てクローニングされたハイブリドーマを培養し、培養上
清からモノクローナル抗体を採取する。あるいは、前記
ハイブリドーマを動物の腹腔内に接種し、腹水を得、こ
れからモノクローナル抗体を単離することもできる。ハ
イブリドーマ細胞上清中の抗体又は腹水中の抗体は、常
法に従って、例えば硫酸アンモニウム塩析により濃縮す
ることができる、さらにアフィニティークロマトグラフ
ィー、例えばgp130蛋白質を固定化した担体を用いるア
フィニティークロマトグラフィーにより精製することが
できる。To produce a monoclonal antibody, the hybridoma cloned as described above is cultured, and the monoclonal antibody is collected from the culture supernatant. Alternatively, the hybridoma can be inoculated intraperitoneally into an animal to obtain ascites, from which a monoclonal antibody can be isolated. The antibody in the hybridoma cell supernatant or the antibody in the ascites can be concentrated according to a conventional method, for example, by ammonium sulfate salting out, and further purified by affinity chromatography, for example, affinity chromatography using a carrier on which the gp130 protein is immobilized. be able to.
上記のポリクローナル抗体の製造方法、ハイブリドー
マの作製方法、モノクローナル抗体の調製方法、抗体の
回収・精製方法は、いずれもそれ自体当業界によりよく
知られている方法により行うことができる。The above-described method for producing a polyclonal antibody, a method for preparing a hybridoma, a method for preparing a monoclonal antibody, and a method for recovering and purifying an antibody can all be performed by methods well known per se in the art.
以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例1. gp130蛋白質に対するモノクローナル抗体の
作製 gp130蛋白質に対するマウスモノクローナル抗体を作
製する目的で、免疫原として、ヒトgp130蛋白質を以下
の方法で抽出した。Example 1. Preparation of monoclonal antibody against gp130 protein In order to prepare a mouse monoclonal antibody against gp130 protein, human gp130 protein was extracted as an immunogen by the following method.
ヒトミエローマ細胞株U266の細胞３×109個を１μg/m
lのIL−６と37℃で30分間反応させて、該細胞上に存在
するIL−６レセプターとgp130蛋白質とを会合せしめた
後、こうして形成された「IL−６レセプター/gp130蛋白
質」複合体を1mlの１％ジギトニン（和光純薬製）、10m
Mトリエタノールアミンバッファー（pH7.4）、0.15M Na
Cl、1mM pAPMSF（和光純製薬）で可溶化した。一方、ブ
ロムシアンで活性化したセファロース4Bに、抗IL−６レ
セプター抗体であるMT18抗体（参考例；特願平１−1860
16号明細書参照）を常法に従って結合させた。これと前
述の可溶化した細胞の上清を混合し、可溶化したIL−６
レセプターを樹脂上のMT18抗体に、結合させることによ
り該IL−６を介してgp130蛋白質を結合させた。非特異
的結合物を前述の１％ジギトニン溶液で洗い流したの
ち、この樹脂を免疫原として用いた。3 × 10 9 cells of human myeloma cell line U266 at 1 μg / m
After reacting with IL-6 at 37 ° C. for 30 minutes to associate the IL-6 receptor present on the cells with the gp130 protein, the “IL-6 receptor / gp130 protein” complex thus formed is formed. 1 ml of 1% digitonin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 10 m
M triethanolamine buffer (pH 7.4), 0.15M Na
Cl and solubilized with 1 mM pAPMSF (Wako Pure Chemical Industries). On the other hand, Sepharose 4B activated with Bromcian was added to MT18 antibody which is an anti-IL-6 receptor antibody (Reference Example; Japanese Patent Application No. 1-1860).
No. 16) was bound according to a conventional method. This was mixed with the above-mentioned supernatant of the solubilized cells, and the solubilized IL-6 was mixed.
The gp130 protein was bound via the IL-6 by binding the receptor to the MT18 antibody on the resin. After the non-specific binding was washed away with the above 1% digitonin solution, the resin was used as an immunogen.
免疫およびハイブリドーマの作製は以下の様に行っ
た。前述した免疫原を１週間に１回、計４回、BALB/Cマ
ウスの腹空内に免疫した。次にマウスからの脾細胞と、
親株としてのミエローマ細胞株P3U1とを、ポリエチレン
グリコールを用いた通常の方法に従って融合させた。Immunization and preparation of hybridomas were performed as follows. The above-mentioned immunogen was immunized into the abdominal cavity of BALB / C mice four times in total, once a week. Next, spleen cells from the mouse,
The myeloma cell line P3U1 as a parent strain was fused according to a usual method using polyethylene glycol.
スクリーニングは以下の様に行った。まず、ハイブリ
ドーマの上清と0.01mlのプロテインＧセファロース（フ
ァルマシア社製）を混合し、上清中のイムノグロブリン
を樹脂に吸着させた。一方、35Ｓメチオニンで内部標識
したU266細胞１×107個に１μg/mlのIL−６を37℃で30
分間反応させた後、前述のMT18抗体結合セファロース4B
で35Ｓ標識IL−６レセプター/gp130蛋白質複合体をアフ
ィニティー精製した。これを前述のプロテインＧセファ
ロースで通常の方法で免疫沈降させ、SDS/PAGEとオート
ラジオグラフィーで解析した。この結果、gp130と特異
的な結合する抗体を産生しているハイブリドーマが１ク
ローン単離された。これをAM277と命名した。また、こ
のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗
体をAM277抗体と呼ぶこととする。Screening was performed as follows. First, the hybridoma supernatant was mixed with 0.01 ml of Protein G Sepharose (Pharmacia), and the immunoglobulin in the supernatant was adsorbed to the resin. On the other hand, 1 × 10 7 U266 cells internally labeled with 35 S methionine were supplemented with 1 μg / ml IL-6 at 37 ° C. for 30 minutes.
After reacting for 4 minutes, the aforementioned MT18 antibody-bound Sepharose 4B
In 35 S-labeled IL-6 receptor / gp130 protein complex was affinity purified. This was immunoprecipitated with Protein G Sepharose in the usual manner, and analyzed by SDS / PAGE and autoradiography. As a result, one clone of a hybridoma producing an antibody that specifically binds to gp130 was isolated. This was named AM277. The monoclonal antibody produced by this hybridoma is referred to as the AM277 antibody.
このAM277抗体を用いてさらなるgp130蛋白質に対する
モノクロナール抗体を次のように作製した。Using this AM277 antibody, a monoclonal antibody against the gp130 protein was prepared as follows.
U266細胞３×107個を前述の１％ジギトニン溶液で可
溶化した。一方、ブロムシアンで活性化したセファロー
ス4BにAM277抗体を常法に従って結合させた。これと前
述の可溶化した細胞の超遠心上清を混合し、可溶化した
gp130蛋白質を樹脂上のAM277抗体に結合させた。非特異
的結合物を前述の１％ジギトニン溶液で洗い流した。そ
して、この樹脂を免疫原として、前述のAM277と同様に
して、ハイブリドーマの作製を行った。3 × 10 7 U266 cells were solubilized with the aforementioned 1% digitonin solution. On the other hand, the AM277 antibody was bound to Sepharose 4B activated with Bromcian in a conventional manner. This was mixed with the above-mentioned ultracentrifuged supernatant of the solubilized cells, and the mixture was solubilized.
The gp130 protein was bound to the AM277 antibody on the resin. Non-specific binders were washed away with the 1% digitonin solution described above. Then, using this resin as an immunogen, a hybridoma was produced in the same manner as in the above-mentioned AM277.
スクリーニングは次のように行った。まず、AM277の
場合と同様にハイブリドーマの上清中のイムノグロブリ
ンをプロテインＧセファロースに吸着させた。一方、35
Ｓメチオニンで内部標識したU266細胞１×107個に１μg
/mlのIL−６を37℃で30分間反応させた後、前述のAM277
抗体結合セファロース4Bで、35Ｓ標識gp130蛋白質を精
製した。これを前述のプロテインＧセファロースで通常
の方法で免疫沈降させ、SDS/PAGEとオートラジオグラフ
ィーで解析した。この結果、gp130蛋白質と特異的に結
合する抗体を産生しているハイブリドーマが１クローン
単離された。これをAM64と命名した。また、このハイブ
リドーマによって産生されるモノクロナール抗体をAM64
抗体と呼ぶこととする。これらのハイブリドーマAM64及
びAM277は、工業技術院微生物工業技術研究所にそれぞ
れ微工研菌寄第11194号（FERM P−11194）及び微工研菌
寄第11195号（FERM P−11195）として寄託されている。Screening was performed as follows. First, as in the case of AM277, immunoglobulin in the supernatant of the hybridoma was adsorbed to protein G sepharose. While 35
1 μg per 1 × 10 7 U266 cells internally labeled with S-methionine
/ ml of IL-6 at 37 ° C. for 30 minutes,
The 35 S-labeled gp130 protein was purified using antibody-bound Sepharose 4B. This was immunoprecipitated with Protein G Sepharose in the usual manner, and analyzed by SDS / PAGE and autoradiography. As a result, one clone of a hybridoma producing an antibody that specifically binds to the gp130 protein was isolated. This was named AM64. In addition, the monoclonal antibody produced by this hybridoma was
It is called an antibody. These hybridomas AM64 and AM277 were deposited at the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, respectively, as No. 11194 (FERM P-11194) and No. 11195 (FERM P-11195). ing.
AM64抗体及びAM277抗体がgp130蛋白質を特異的に認識
して免疫沈降させることを確認するため、内部標識され
たU266細胞をディタージェントで可溶化後、AM64抗体又
はAM277抗体で免疫沈降し、SDS/PAGE、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果を第１図に示す。To confirm that the AM64 antibody and the AM277 antibody specifically recognize the gp130 protein and immunoprecipitate, after solubilizing the internally labeled U266 cells with a detergent, immunoprecipitate with the AM64 antibody or the AM277 antibody, and perform SDS / PAGE and autoradiography were performed. The result is shown in FIG.
この結果、AM64抗体及びAM277抗体がgp130蛋白質を特
異的に認識することが確認された。As a result, it was confirmed that the AM64 antibody and the AM277 antibody specifically recognize the gp130 protein.
実施例2. AM64抗体がgp130蛋白質の細胞外部分を認識
していることの確認 細胞膜上に表出している抗原を螢光染色する方法を用
いて、AM64抗体がgp130蛋白質の細胞外部分を認識する
か否か確認した。Example 2 Confirmation that AM64 Antibody Recognizes Extracellular Portion of gp130 Protein Using a method of fluorescently staining an antigen displayed on the cell membrane, AM64 antibody recognizes the extracellular portion of gp130 protein. Confirmed whether to do.
前述のU266細胞とAM64抗体を混合し、細胞膜上のgp13
0蛋白質に結合したAM64抗体を蛍光（FITC）標識された
抗マウスイムノグロブリン抗体（FITC anti−mIg）で蛍
光染色した。Mix the aforementioned U266 cells with the AM64 antibody, and gp13 on the cell membrane.
The AM64 antibody bound to the 0 protein was fluorescently stained with a fluorescent (FITC) -labeled anti-mouse immunoglobulin antibody (FITC anti-mIg).
第２図は、AM64抗体がU266細胞に発現されているgp13
0蛋白質の細胞外部分に結合することを示す。即ち、第
２図において、IIはU266細胞にAM64抗体を反応させた
後、細胞膜上に結合したAM64抗体を前述のFITC anti−m
Igで蛍光染色した時の細胞の蛍光強度分布を示す。培地
のみの対照を表すＩと比較すると蛍光強度が強い方にシ
フトしており、この結果、AM64抗体がgp130蛋白質の細
胞外部分を認識していることが確認された。FIG. 2 shows that gp13 in which the AM64 antibody is expressed in U266 cells.
0 indicates binding to the extracellular portion of the protein. That is, in FIG. 2, II reacted U266 cells with the AM64 antibody and then reacted the AM64 antibody bound on the cell membrane with the aforementioned FITC anti-m
4 shows the fluorescence intensity distribution of cells when fluorescently stained with Ig. Compared to I, which represents a medium-only control, the fluorescence intensity was shifted to a stronger one, and as a result, it was confirmed that the AM64 antibody recognized the extracellular portion of the gp130 protein.
実施例3. AM64抗体の認識部位がgp130蛋白質のIL−６
レセプターとの会合部分であることの確認 実施例２と同様の方法を用いて、AM64抗体の認識部位
がgp130蛋白質のIL−６レセプターとの会合部分である
ことを確認した。Example 3. The recognition site of the AM64 antibody is IL-6 of the gp130 protein.
Confirmation of Receptor-Associated Part Using the same method as in Example 2, it was confirmed that the recognition site of the AM64 antibody was the part of the gp130 protein that associates with the IL-6 receptor.
即ち、U266細胞をIL−６で刺激して、該細胞上のIL−
６レセプターとgp130蛋白質とを会合させた後、AM64抗
体をさらに混合し、前述のFITC anti−mIgで蛍光染色し
た。その時の細胞の蛍光強度を第２図にIIIとして示
す。このIIIをIIと比較すると、AM64抗体のgp130蛋白質
への結合がIL−６の刺激により、即ちIL−６レセプター
とgp130蛋白質との会合により阻害されることが確認で
きる。That is, U266 cells are stimulated with IL-6 and IL-
After associating the 6 receptor with the gp130 protein, the AM64 antibody was further mixed and stained with the aforementioned FITC anti-mIg. The fluorescence intensity of the cells at that time is shown as III in FIG. Comparison of this III with II confirms that the binding of the AM64 antibody to the gp130 protein is inhibited by IL-6 stimulation, ie, by the association of the IL-6 receptor with the gp130 protein.
次に、AM64抗体がIL−６により誘導されるIL−６レセ
プターとgp130蛋白質との会合を阻害しうるか否かを次
の様に確認した。125Ｉで細胞表面標識したU266細胞浮
遊液にAM64抗体とIL−６を同時に加えることにより、IL
−６の存在下でU266細胞上のgp130蛋白質への結合につ
いてAM64抗体と該細胞上のIL−６レセプターとを競争せ
しめた。このU266細胞を１％ジギトニン溶液で可溶化し
て、その上清を実施例１と同様にMT18抗体で免疫沈降さ
せ、SDS/PAGEで解析した。その結果を第３図にレーン２
として示す。同様の実験をAM64抗体の非存在下で行った
結果を第３図レーン１に示す。レーン１においては130k
Da及び80kDaの位置の両方にバンドが検出され、このこ
とはgp130蛋白質（分子量130kDa）と会合したIL−６レ
セプター（分子量80kDa）（いずれも125Ｉにより標識さ
れている）がMT18抗体により沈降したことを示してい
る。これに対して、レーン２においては130kDaの位置の
バンドの濃さが顕著に減少しており、このことはIL−６
レセプター（分子量80kDa）はMT18抗体により沈降する
が、AM64抗体の存在によりgp130蛋白質とIL−６レセプ
ターとの会合が阻害されたことを意味する。Next, it was confirmed as follows whether or not the AM64 antibody could inhibit the association between the IL-6 receptor induced by IL-6 and the gp130 protein. Simultaneous addition of the AM64 antibody and IL-6 to the U266 cell suspension labeled on the cell surface with 125 I
The AM64 antibody competed with the IL-6 receptor on U266 cells for binding to the gp130 protein in the presence of -6 cells in the presence of -6. The U266 cells were solubilized with a 1% digitonin solution, and the supernatant was immunoprecipitated with the MT18 antibody in the same manner as in Example 1 and analyzed by SDS / PAGE. The result is shown in FIG.
As shown. The result of a similar experiment performed in the absence of the AM64 antibody is shown in FIG. 3, lane 1. 130k in lane 1
Bands were detected at both the Da and 80 kDa positions, indicating that the IL-6 receptor (80 kDa molecular weight) associated with the gp130 protein (130 kDa molecular weight), both labeled with 125 I, was precipitated by the MT18 antibody. It is shown that. In contrast, in lane 2, the intensity of the band at the position of 130 kDa was significantly reduced, indicating that IL-6
The receptor (molecular weight: 80 kDa) was precipitated by the MT18 antibody, but the presence of the AM64 antibody inhibited the association of the gp130 protein with the IL-6 receptor.
同様の操作をAM277抗体について行なった。その結果
は第３図にレーン３として示す。この結果、AM277抗体
はIL−６レセプターと、gp130蛋白質との会合を阻害し
ないことを示している。The same operation was performed for the AM277 antibody. The result is shown as lane 3 in FIG. The results show that the AM277 antibody does not inhibit the association of the IL-6 receptor with the gp130 protein.
実施例4.AM64抗体がIL−６の機能を阻害することの確認 S.Shimizuらの方法に従うIL−６依存性のヒトＴ細胞
白血病株KT−３の増殖試験（Blood,72（５））,p1826,1
988年）によって、AM64抗体がIL−６の機能を阻害する
か否か確認した。即ち、１×104個のKT−３細胞をIL−
６（50pg/ml）存在下で、５×104細胞/mlにて72時間培
養した。この時AM64抗体を40μg/mlの濃度で添加した。
培養の最後24時間に3Ｈ−チミジン（0.5μCi）を添加
し、培養後KT−３細胞に取り込まれた放射能を測定し
た。また、AM64抗体にかえてAM277抗体を添加し、同様
にして増殖試験を行った。Example 4. Confirmation that AM64 antibody inhibits the function of IL-6 Proliferation test of IL-6-dependent human T-cell leukemia strain KT-3 according to the method of S. Shimizu et al. (Blood, 72 (5)) , p1826,1
988) confirmed whether the AM64 antibody inhibits the function of IL-6. That is, 1 × 10 4 KT-3 cells were transformed into IL-
The cells were cultured at 5 × 10 4 cells / ml for 72 hours in the presence of 6 (50 pg / ml). At this time, the AM64 antibody was added at a concentration of 40 μg / ml.
In the last 24 hours of the culture, 3 H-thymidine (0.5 μCi) was added, and the radioactivity incorporated into the KT-3 cells after the culture was measured. The AM277 antibody was added in place of the AM64 antibody, and a proliferation test was performed in the same manner.
これらの結果は、第４図に示す通りである。この結
果、AM277抗体がIL−６によるKT−３細胞の増殖を阻害
しないのに対し、AM64抗体はその増殖を阻害することが
確認された。These results are as shown in FIG. As a result, it was confirmed that the AM277 antibody did not inhibit the proliferation of KT-3 cells by IL-6, whereas the AM64 antibody inhibited the proliferation.
更に、T.Hiranoらの方法に従うSKW6−CL4細胞株のIL
−６依存性IgM抗体産生増殖を見る方法（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82,p5490,1985年）によって、AM64抗体がIL
−６の機能を阻害するか否か確認した。即ち、１×104
個のSKW6−CL4細胞をIL−６（200pg/ml）存在下で、５
×104細胞/mlにて72時間培養した。この時、AM64抗体ま
たはAM277抗体を５μg/mlの濃度で培養液に添加した。
培養後、上清中に含まれるIgM抗体を酵素抗体法によっ
て測定した。Furthermore, the IL of the SKW6-CL4 cell line according to the method of T. Hirano et al.
A method for observing -6-dependent IgM antibody production and growth (Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 82, p5490, 1985).
It was confirmed whether the function of -6 was inhibited. That is, 1 × 10 4
Of SKW6-CL4 cells in the presence of IL-6 (200 pg / ml)
The cells were cultured at × 10 4 cells / ml for 72 hours. At this time, the AM64 antibody or AM277 antibody was added to the culture at a concentration of 5 μg / ml.
After the culture, the IgM antibody contained in the supernatant was measured by the enzyme antibody method.
結果は第５図に示す通りである。この結果、AM277抗
体がIL−６によるSKW6−CL4細胞株からのIgM抗体産生を
阻害しないのに対し、AM64抗体はその産生を阻害するこ
とが確認された。The results are as shown in FIG. As a result, it was confirmed that the AM277 antibody did not inhibit the production of IgM antibody from the SKW6-CL4 cell line by IL-6, whereas the AM64 antibody inhibited the production.
参考例．ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクロ
ーナル抗体の製造 ヒトIL−６レセプターに対するマウスモノクローナル
抗体を作製する目的で、免疫原として、ヒトIL−６レセ
プターを膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方
法で作製した。すなわち、特願平１−9774号明細書に記
載されているpBSF2R.236及びpSV2neoをマウスＴ細胞株C
TLL−２（ATCC,TIB214）に常法で導入し、Ｇ−418を用
いる通常の方法でスクリーニングをし、最終的にIL−６
レセプターを細胞あたり約30,000個発現している株を樹
立し、これをCTBC3と名づけた。Reference example. Production of Mouse Monoclonal Antibody Against Human IL-6 Receptor In order to prepare a mouse monoclonal antibody against human IL-6 receptor, a mouse T cell line expressing human IL-6 receptor on the membrane was used as an immunogen as follows. Fabricated by method. That is, pBSF2R.236 and pSV2neo described in Japanese Patent Application No.
It was introduced into TLL-2 (ATCC, TIB214) by a conventional method, and was screened by the usual method using G-418.
A strain expressing approximately 30,000 receptors per cell was established and named CTBC3.
免疫は以下の様に行った。RPMI1640を用いる通常の方
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL/6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６回、腹腔内に免疫した。Immunization was performed as follows. After culturing by the usual method using RPMI1640, CTBC3 washed four times with PBS buffer was added to C5
Immunization was performed intraperitoneally 1 × 10 7 cells per 7BL / 6 mouse, once a week for a total of 6 times.
前記免疫されたマウスからの脾細胞を、親株としての
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。Splenocytes from the immunized mice were fused with the myeloma cell line P3U1 as a parent strain according to a conventional method using polyethylene glycol.
スクリーニングは以下の様に行った。IL−６レセプタ
ー陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBSF
2R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、IL−６レセプターを細胞あたり約100,000個発現し
ている株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40が可
溶化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認
識しない抗体を産生しているハイブリドーマが１クロー
ン単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブ
リドーマによって産生されるモノクローナル抗体をMT18
抗体と称する。前記のハイブリドーマMT18は、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第14840号（FERM
P−10840）として寄託されている。Screening was performed as follows. PBSF was added to the IL-6 receptor-negative human T cell line JURKAT (ATCC, CRL8163).
2R.236 and pSV2neo were introduced in a conventional manner, and as a result of screening, a strain expressing about 100,000 IL-6 receptors per cell was established. This strain was named NJBC8. One clone producing a hybridoma that recognizes NP40-solubilized NJBC8 and does not recognize NP40-solubilized JURKAT was isolated and named MT18. In addition, the monoclonal antibody produced by this hybridoma was
It is called an antibody. The hybridoma MT18 was supplied to the Institute of Microbial Industry and Technology by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology No. 14840 (FERM).
P-10840).
本発明で提供されるgp130蛋白質を特異的に認識する
モノクローナル抗体は、診断薬、治療薬としての利用が
期待されるIL−６のシグナル伝達に関与するgp130蛋白
質を、大量に生産し、精製するために有益である。The monoclonal antibody specifically recognizing the gp130 protein provided by the present invention produces and purifies a large amount of the gp130 protein involved in IL-6 signal transduction, which is expected to be used as a diagnostic or therapeutic agent. Is beneficial for.
また、本発明によって提供される抗体を用いることに
より、これまでに知られていない種々の細胞が有するで
あろうgp130蛋白質の諸性質を解析することが可能にな
る。このことは、個体発生、免疫機構の研究、さらには
これらの成果に基づく治療薬、診断薬当の開発等に大き
な意義をもつ。In addition, by using the antibody provided by the present invention, it becomes possible to analyze various properties of the gp130 protein which various cells which have not been known so far may have. This is of great significance for the study of ontogeny, immune mechanisms, and the development of therapeutics and diagnostics based on these results.
第１図は、内部標識されたU266細胞をディタージェント
で可溶化後、AM64抗体又はAM277抗体で免疫沈降し、SDS
/PAGE及びオートラジオグラフィーそれぞれを行った結
果を示す。 第２図は、U266細胞膜上に結合したAM64抗体をFITC標識
抗マウスイムノグロブリン抗体で蛍光染色した時の蛍光
強度分布を示す。図中、ＩはAM64抗体を含まない培地の
みの対照、IIはAM64を反応させたとき、及びIIIはIL−
６をあらかじめ反応させさらにAM64抗体を反応させたと
きの蛍光強度分布をそれぞれ示す。 第３図は、内部標識されたU266細胞を、IL−６で刺激し
（レーン１）、AM64抗体存在下にIL−６で刺激し（レー
ン２）、またはAM277抗体存在下にIL−６で刺激し（レ
ーン３）、その後細胞をジギトニンで可溶化し、MT18抗
体で免疫沈降し、SDS/PAGE及びオートラジオグラフィー
を行った結果を示す。 第４図は、IL−６によるKT−３細胞の増殖に対するAM64
抗体及びAM277抗体の阻害効果を示す。 第５図は、IL−６によるSKW6−CL4細胞からのIgM産生に
対するAM64抗体及びAM277抗体の抑制効果を示す。FIG. 1 shows that internally labeled U266 cells were solubilized by detergent, immunoprecipitated with AM64 antibody or AM277 antibody, and subjected to SDS
The results of performing / PAGE and autoradiography are shown. FIG. 2 shows a fluorescence intensity distribution when the AM64 antibody bound on the U266 cell membrane was fluorescently stained with a FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody. In the figure, I is a control of medium only containing no AM64 antibody, II is a reaction when AM64 was reacted, and III is an IL-
6 shows the fluorescence intensity distribution when 6 was reacted in advance and further reacted with the AM64 antibody. FIG. 3 shows that internally labeled U266 cells were stimulated with IL-6 (lane 1), stimulated with IL-6 in the presence of AM64 antibody (lane 2), or with IL-6 in the presence of AM277 antibody. After stimulation (lane 3), the cells were solubilized with digitonin, immunoprecipitated with MT18 antibody, and subjected to SDS / PAGE and autoradiography. FIG. 4 shows AM64 on proliferation of KT-3 cells by IL-6.
3 shows the inhibitory effects of the antibody and the AM277 antibody. FIG. 5 shows the inhibitory effect of the AM64 antibody and the AM277 antibody on the production of IgM from SKW6-CL4 cells by IL-6.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/06 - 15/08 C12N 5/16 - 5/28 C12P 21/08 C07K 14/47 C07K 16/18 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 identification symbol FI // A61K 39/395 A61K 39/395 U C12N 5/00 B (58) Field surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) C12N 15/06-15/08 C12N 5/16-5/28 C12P 21/08 C07K 14/47 C07K 16/18 WPI (DIALOG) BIOSIS (DIALOG) MEDLINE (STN) JICST file (JOIS)
Claims (12)
に関与する次の性質を有するgp130蛋白質： （１）IL−６の存在下でIL−６レセプターと結合するが
IL−６の非存在下ではIL−６レセプターと結合せず；そ
して （２）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において1
30kDaの見かけの分子量を示す； と特異的に結合し得る抗−gp130蛋白質抗体。1. A gp130 protein having the following properties involved in human interleukin-6 signaling: (1) binds to the IL-6 receptor in the presence of IL-6
Does not bind to the IL-6 receptor in the absence of IL-6; and (2) does not bind to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
An anti-gp130 protein antibody capable of specifically binding with an apparent molecular weight of 30 kDa.
の抗体。2. The antibody according to claim 1, which is a monoclonal antibody.
に関与するgp130蛋白質との結合においてヒトインター
ロイキン−６レセプターと競合する、請求項２に記載の
抗体。3. The antibody according to claim 2, which competes with a human interleukin-6 receptor for binding to a gp130 protein involved in human interleukin-6 signal transduction.
号;FERM P−11194）により生産されるAM64抗体である、
請求項３に記載の抗体。4. A hybridoma AM64 (Microbial Aid No. 11194)
No. FERM P-11194).
The antibody according to claim 3.
に関与するgp130蛋白質との結合においてヒトインター
ロイキン−６レセプターと競合しない、請求項２に記載
の抗体。5. The antibody according to claim 2, wherein the antibody does not compete with the human interleukin-6 receptor for binding to a gp130 protein involved in human interleukin-6 signal transduction.
号;FERM P−11195）により生産されるAM277抗体であ
る、請求項５に記載の抗体。6. A hybridoma AM277 (Microbial Aid No. 11195)
No .; FERM P-11195), wherein the antibody is the AM277 antibody produced by the method.
の抗体。7. The antibody according to claim 1, which is a polyclonal antibody.
産するハイブリドーマ。8. A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 2.
に関与するgp130蛋白質抗原により哺乳類を感作し、該
哺乳類から免疫細胞を採取し、該免疫細胞をミエローマ
細胞株と融合させ、そして該融合株から該gp130蛋白質
を認識する株をクローニングすることを特徴とするハイ
ブリドーマの製造方法。9. A mammal is sensitized with a gp130 protein antigen involved in human interleukin-6 signaling, an immune cell is collected from the mammal, the immune cell is fused with a myeloma cell line, and the fusion is And cloning a strain recognizing the gp130 protein from the above.
達に関与するgp130蛋白質抗原が、固体キャリアーに結
合されたgp130蛋白質である、請求項９に記載の方法。10. The method according to claim 9, wherein the gp130 protein antigen involved in human interleukin-6 signaling is a gp130 protein bound to a solid carrier.
請求項９若しくは10に記載の方法により製造されたハイ
ブリドーマを培養し、該培養物からヒトインターロイキ
ン−６のシグナル伝達に関与するgp130蛋白質を認識す
るモノクローナル抗体を採取することを特徴とする、抗
−gp130蛋白質抗体の製造方法。11. The hybridoma according to claim 8 or the hybridoma produced by the method according to claim 9 or 10, and gp130 protein involved in human interleukin-6 signal transduction is cultured from the culture. A method for producing an anti-gp130 protein antibody, which comprises collecting a monoclonal antibody to recognize.
達に関与するgp130蛋白質抗原により哺乳類動物を免疫
感作し、該動物から該gp130蛋白質を認識するポリクロ
ーナル抗体を採取することを特徴とする、抗−gp130蛋
白質ポリクローナル抗体の製造方法。12. An anti-human animal comprising immunizing a mammal with a gp130 protein antigen involved in human interleukin-6 signal transduction, and collecting a polyclonal antibody recognizing the gp130 protein from the animal. A method for producing a gp130 protein polyclonal antibody.
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