JP2897959B2

JP2897959B2 - 固定化された配列特異的プローブ

Info

Publication number: JP2897959B2
Application number: JP1506359A
Authority: JP
Inventors: ケイ．サイキ，レンダル; エイ．アーリッチ，ヘンリー
Original assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG
Current assignee: EFU HOFUMAN RA ROSHU AG
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1999-05-31
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: AU632494B2; JPH03504328A; DE68928853T2; EP0451141B1; WO1989011548A1; AU3754289A; IL90358A; EP0451141A1; DE68928853D1; CA1340864C; ATE173508T1; IL90358A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明は核酸化学及び特定の核酸配列の検出に関す
る。さらに詳しくは、本発明はDNA及びRNAプローブを固
定化する方法、固定化されたプローブを含んで成る安定
な測定試薬、及びこれらの固定化されたプローブを用い
て行われるハイブリダイゼーションアッセイに関する。
本発明は、医療診断、医療微生物、法医学、微生物の環
塩監視、食料及び薬品の品質保証、並びに分子生物学に
関する。

研究微生物学的技法が診断測定に用いられている。例
えば、Wilsonら、米国特許No.4,395,486は制限断片長多
形（RFLP）による鎌形赤血球貧血の検出方法を開示して
いる。Wilsonらは、正常グロビン遺伝子を開裂すること
ができるがしかし変異した（鎌形赤血球）遺伝子を開裂
することができない制限酵素を特定した。鎌形赤血球貧
血は点変異から生ずるので、この方法は効果的であるが
しかし10〜20mlの血液又は羊水を必要とする。

病原微生物及び感染体に特徴的な特定のDNA配列の臨
床サンプル中の存在により種々の感染性疾患を診断する
ことができる。病原体にはある種々細菌、例えばサルモ
ネラ（Salmonella）、クラミジア（Chlamydia）、及び
ナイゼリア（Neisseria）；ウイルス、例えば肝炎ウイ
ルス、HTLV及びHIV;並びに原生動物、例えばマラリアを
起こすプラスモジウム（Plasmodium）の含まれる。Falk
owらの米国特許No.4,358,535は感染性疾患の診断のため
の特異的DNAハイブリダイゼーションプローブの使用を
記載している。病原体を検出するためのFalkowらの方法
はサンプル（例えば、血液、細胞、唾液等）をフィルタ
ー（例えば、ニトロセルロース）上にスポットし、細胞
を溶解し、そしてDNAを化学変性及び加熱により固定す
ることを含んで成る。次に、ラベルされたDNAプローブ
を加え、そして前記固定されたサンプルDNAとハイブリ
ダイズせしめ、そしてハイブリダイゼーションが病原体
DNAの存在を示す、ことを含む。Falkowらの方法に内在
する問題点は感度が低いことであり、感染した患者から
の臨床サンプル中に非常に少ない病原生物が存在する場
合、又は検出されるべきDNAがサンプル中の全DNAの非常
に小部分を構成する場合、この方法はうまく機能しな
い。Falkowらの教示によれば、細胞又は生物をフィルタ
ー上で培養することによりサンプルDNAを増幅すること
ができる。

WardのEP 63,879に記載されているように、非放射性
ラベル化プローブを使用することができれば、感染性疾
患の診断のためのDNAプローブの日常的臨床使用が単純
化されるであろう。Wardの方法においては、西洋ワサビ
パーオキシダーゼ（HRP）ラベル化のDNAプローブがELIS
Aに類似した発色反応により検出される。Wardの検出法
及び試薬は便利ではあるが、しかしやはり検出されるべ
き特定の配列は一般に非常に少量存在するので、比較的
低感度である。

DNA増幅の有意な改良、すなわちポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）技法がMullisにより米国特許No.4,683,202に
記載され、そしてPCRを用いる検出方法がMullisらによ
り米国特許No.4,683,195に開示されている。PCR法にお
いては、増幅されるべき配列の相対する末端にマッチす
る短いオリゴヌクレオチドプライマーが調製される。プ
ライマー間の配列は知られている必要ない。DNA又はRNA
のサンプルが抽出され、そして好ましくは熱により変性
される。次に、オリゴヌクレオチドプライマーがモル過
剰でdNTP及びポリメラーゼ、好ましくはTaqポリメラー
ゼ、と共に添加される。このTaqポリメラーゼは熱に対
して安定であり、そしてPerkin−Elmer/Cetus Instrume
ntsから市販されている。DNAポリメラーゼは「プライマ
ーにより指令され」（primer−directed）、２つのプラ
イマーアニール部位において複製が開始される。DNAが
複製され、そして次に再び変性される。

この複製が、対応するプライマーから始まる「長い」
生成物、及び２本のもとの鎖（二本鎖DNA分子当り）を
もたらす。合成された鎖の明確な停止点がないので、こ
の生成物は「長い生成物」と称される。次に、反応混合
物を重合条件にもどし（例えば、温度を下げ、変性剤を
不活性化し、そして必要であればさらにポリメラーゼを
加える）、そして第二サイクルを開始する。第二サイク
ルは２本のもとの鎖、第一サイクルからの２本の長い
鎖、２本の新しい長い生成物（もとの鎖から複製された
もの）、及び第一サイクルにより生成した長い生成物か
ら複製された２本の「短い生成物」をもたらす。これら
の鎖は「長い鎖」の鋳型の５′−末端…長い生成物の合
成を開始したプライマーにより規定される末端、におい
て停止しなければならないので「短い生成物」と称され
る。この短い生成物は、一端のプライマー及び他端にお
けるプライマーに相補的な配列と共に標的配列（センス
又はアンチセンス）の配列を含有する。各追加のサイク
ルにおいて、追加の２本の長い生成物が生成し、さら
に、先行するサイクルの終りにおいて残っている長い生
成物及び短い生成物の数と同じ数の短い生成物が生成さ
れる。こうして、短い生成物の数は各サイクルにより二
倍となることができる。特定の標的配列のこの指数的増
幅が非常に少量のDNAの検出を可能にする。

PCR法は核酸に基く医療診断産業に革命をもたらしそ
して新生命を与えた。本発明は、しばしばPCRと組合わ
せて使用される試薬を提供するので、PCRについての幾
分の追加の背景情報が有用であろう。PCRは、単鎖又は
二本鎖DNA又はRNA（例えばメッセンジャーRNA）、種々
の増幅反応から生成した核酸、DNA−RNAハイブリド、あ
るいはこれらの核酸の混合物を含めて、任意の核酸を増
幅するために用いることができる。増幅されるべき配列
変化を含むもとの又は標的核酸が単鎖である場合、１又
は複数のプライマー、ヌクレオチド及びポリメラーゼを
添加することによりその相補的が合成され、RNAのため
にはこのポリメラーゼは逆転写酵素である。

PCR法は、１種の特定の核酸配列を多量に生産するた
めのみならず、同一の又は異る核酸分子上に位置する複
数の特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用であ
る。PCRにおいて複数の特定の核酸配列を生産すること
を望む場合、適切な数の異るオリゴヌクレオチドプライ
マーが使用される。例えば、２種類の異る特定の核酸配
列が生産されるべき場合、４種類のプライマーが使用さ
れる。すなわち、増幅されるべき特定の核酸配列のそれ
ぞれにつき２種類のプライマーが使用される。

PCRにより増幅される特定の核酸配列はより大きな分
子の部分であることができ、あるいは最初に別個の分子
として存在し、増幅された特定の配列が完全な核酸を構
成することができる。さらに、PCRにより増幅される配
列は最初不純な形で存在することができ、あるいは複雑
な混合物の微小部分、例えば特定の生物学的サンプルの
非常に小部分のみを構成する特定の微生物に基く核酸配
列の部分であることができる。増幅されるべき一又は複
数の核酸はpBR322のごときプラスミドから、クローン化
されたDNA又はRNAから、あるいは天然DNA又はRNAから得
ることができ、ここで天然DNA又はRNAは細菌、酵母、ウ
イルス、及び植物もしくは動物のごとき高等生物からの
ものである。DNA又はRNAは血液又は組織材料、例えば絨
毛もしくは羊膜細胞から、制限酵素消化のための核酸の
調製のために一般的な、蛋白質分解及びフェノール抽出
のよく知られた技法を含めて種々の技法により抽出する
ことができる。さらに、適当な核酸調節技法は、Maniat
isら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（ニュ
ーヨーク、Cold Spring Harbor Laboratory,1982）,280
−281頁；米国特許No.4,683,195及びNo.4,683,202;EP25
8,017;並びにSaikiら、1985,Biotechnology，3:1008−1
012に記載されている。

任意の特定の核酸配列をPCR法により製造することが
できる。一方のプライマーから合成された延長生成物が
その鋳型（相補体）から分離した場合に他方のプライマ
ーの延長のためのプライマーとして機能するように、配
列にそっての相対位置において所望の配列の異る鎖にハ
イブリダイズすることができる２種類のオリゴヌクレオ
チドプライマーを調製することができるように詳細に配
列の両端における十分な数の塩基が知られていれば十分
である。配列の両端における塩基についての知識が多く
なればなる程、標的核酸配列のためのプライマーの特異
性も大きくなることができ、そしてそれ故に、この方法
が標的を特異的に増幅する可能性が大きくなる。

PCRにより生産された特異的に増幅された核酸配列
は、鋳型又は「標的」とも呼ばれるその配列を含有する
核酸から生産される。標的核酸が２本の鎖を含有する場
合、それを鋳型として使用する前に、プライマー延長生
成物の合成と同時に又は別個の段階として分離される。
この鎖分離は、物理的手段、化学的手段又は酵素的手段
を含めての任意の適当な変性法により達成することがで
きる。核酸鎖の分離のための１つの物理的方法は、核酸
をそれが完全に（＞99％）変性するまで加熱することを
含む。典型的な熱変性は約１秒〜10分間にわたる約80℃
〜105℃の温度を用いる。鎖分離はまた、ヘリカーゼ酵
素又はヘリカーゼ活性を示すことができる酵素、例え
ば、ヘイカーゼ活性を有しそしてリボATPの存在下でDNA
を変性することが知られている酵素RecAにより誘導され
得る。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するために適
当な反応条件は、Cold Spring Harbor Symposia on Qua
ntitative Biology, Vol.XL III，“DNA:Replication a
nd Recombination"（ニューヨーク,Cold Spring Harbor
Laboratory,1978）,B.Kulnら、「DNA Helicases」63−
67頁に記載されており、そしてRecAを使用する方法はRa
dding,1982,Ann．Rev.Genetics，16:405−437において
総説されている。

１又は複数の核酸の相補的な鎖が単離されるとき、該
核酸がもともと二本鎖であったか一本鎖であったかに拘
らず、この鎖は追加の核酸鎖の合成のための鋳型として
すぐに使用できるように用意される。増幅反応は一般
に、緩衝化された水溶液中で、好ましくはpH7〜９（す
べてのpHは室温におけるもの）、最も好ましくは約pH8
において行われる。好ましくは、モル過剰（クローン化
された核酸については通常、プライマー対鋳型が約100
0:1、そしてゲノム核酸については通常、プライマー対
鋳型が10^６〜８:1）の２種類のオリゴヌクレオチドプラ
イマーを、分離された鋳型鎖を含有する緩衝液中に添加
する。しかしながら、多くの適用において相補鎖の量は
知られていないので、相補鎖の量に対するプライマーの
量は幾分決定的ではないであろう。

デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートdATP,dCT
P,dGTP及びdTTPも適当な量でPCR混合物に添加され、そ
して得られる溶液が約90℃〜100℃に約１〜10分間、好
ましくは１〜４分間加熱される。標的核酸が二次構造を
形成する場合、二次構造が生ずるという様な潜在的問題
点を回避するため、当業界において知られているように
ヌクレオチド７−デアザ−２′−デオキシグアノシン−
５′−トリホスフェートも使用される。加熱の後、溶液
を室温にまで放冷し、これはプライマーのハイブリダイ
ゼーションのために好ましい。冷却された混合物に重合
剤が添加され、そして重合反応が当業界において既知の
方法により行われる。この合成反応は、重合剤によりあ
らかじめ決定される温度において起こるであろう。すな
わち、例えば、重合剤として大腸菌のDNAポリメラーゼ
が使用される場合、重合のための最高温度は一般に約40
℃より高くない。最も便利には、大腸菌ポリメラーゼを
用いる反応は室温において起こる。しかしながら、ほと
んどのPCR用途の場合、熱安定性酵素Taqポリメラーゼが
非常に高い温度、典型的には50℃〜70℃において用いら
れる。

それにも拘らず、PCRのための重合剤は、ヌクレオチ
ドトリホスフェートからのプライマー延長生成物の合成
を達成するために機能するであろうあらゆる化合物又は
系、例えば酵素、であることができる。この目的のため
の好ましい酵素には、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのKlenow断片、T4DNAポリ
メラーゼ、他の入手可能なDNAポリメラーゼ、逆転写酵
素（標的がRNAである場合、PCRの第一サイクルにおいて
使用される）、及びTaqポリメラーゼのごとき熱安定性
酵素を含めての他の酵素が含まれ、このものは標的核酸
鎖に対して相補的なプライマー延長生成物を形成するた
めに適切な態様でヌクレオチドの結合を促進するであろ
う。一般に、合成は各プライマーの３′−末端において
開始され、そして合成が停止するまで鋳型鎖にそって
５′−方向に進行する。しかしながら、５′−末端にお
いて合成を開始する重合剤が存在する可能性もあり、こ
の様な重合剤がPCRにおいて重合剤として使用できない
理由はないであろう。

PCRにおいて新たに合成された鎖は相補的核酸鎖と塩
基対合して二本鎖分子を形成し、次にこれはPCR法の次
の段階において使用される。次の段階においては、二本
鎖分子の鎖が分離して単鎖分子を提供し、この上に新た
な核酸が合成される。反応を進行させるために必要であ
れば追加の重合剤、ヌクレオチド、及びプライマーを添
加することができる。鎖分離及び延長生成物合成のPCR
段階は、所望量の特定の核酸鎖を生産するのに必要なだ
け反復することができる。

前記のごとく、PCRは核酸診断産業に革命をもたらし
た。ヨーロッパ出願公開No.237,362はPCRを用いるアッ
セイ方法を開示しており、これを引用により本明細書に
組み入れる。EP237,362においては、PCRで増幅されたDN
Aがフィルターに固定され、そして次に、SDS,Ficoll、
血清アルブミン及び種々の塩を含有するハイブリダイゼ
ーション溶液により処理される。次に、特異的オリゴヌ
クレオチドプローブ（例えば16〜19ヌクレオチドの）が
添加され、そしてハイブリダイズされる。好ましくは、
このプローブは、ハイブリダイズしたプローブの検出が
可能なようにラベルされる。EP237,362はまた逆ドット
ブロットを記載しており、この場合、増幅されたDNAで
はなくプローブが膜に固定される。

PCR技術の最近の出現が、最近非常に少量（＜1ng）の
み存在する特定のDNA配列の検出を可能にした。例え
ば、Higuchiら、1988,Nature，332,543−546は、わずか
１本の毛を含むサンプルに基く個体間の遺伝子変化の特
徴付けを記載している。DNAが毛から消化及び抽出によ
り単離され、そして次に増幅を得るためにPCR条件下で
処理された。次に、特定のヌクレオチド変化が、断片長
多形（PCR−FLP）、配残特異的オリゴヌクレオチド（SS
O）プローブへのハイブリダイゼーション（Saikaら、19
86,Nature，324:163−166にも記載されている技法）、
又はジデオキシ法（クローン化DNAではなく増幅されたD
NAを用いる）による直接配列決定のいずれかにより検出
された。PCRは２種類のプライマーの間に位置するDNA配
列の複製をもたらすので、プライマー配列間の挿入及び
欠失は異る長さの生成物配列をもたらし、これはPCR−F
LPにおいて生成物のサイズを決定することにより検出す
ることができる。SSOバイブリダイゼーションにおい
て、増幅されたDNAは一連の「ドットブロット」におい
てUV照射によりナイロンフィルターに固定化することが
でき、そしてこの技法の１つの変法においては、次にHR
Pでラベルされたオリゴヌクレオチドとストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズせしめる。過剰のプローブを
洗浄により除去した後、3,3′,5,5′−テトラメチルベ
ンジジン（TMB）及びH₂O₂を添加する。HRPはTMBのH₂O₂
酸化を触媒して青色の沈澱を生じさせ、このものの存在
がハイブリダイズしたプローブの存在を示す。米国特許
No.4,789,630は本発明の目的のために有用な方法及びTB
M化合物を記載しており、この記載を引用により本明細
書に組み入れる。HRPの存在を示すために、他のロイコ
色素のいずれか（例えば、DuPontにより開発されそして
Kodakに実施許諾された赤色ロイコ色素）を使用するこ
ともできる。しかしながら、過酸化活性の結果として沈
澱性の色又は蛍光を発する任意の色原体をHRP−標識さ
れた試薬として使用することができる。実際に、酵素活
性の結果として着色物質又は蛍光物質を形成する無色の
基質であってその生成物が固体支持体に捕捉され得る限
り、ラベルのためにあらゆる酵素を使用することができ
る。試験される各対立遺伝子について個別のドットブロ
ットハイブリダイゼーションが行われる。

Churchら、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81,1991−
1995はゲノム配列決定法を開示しており、この方法は、
制限酵素で消化されたゲノムDNA断片をUV照射を用いて
ナイロン幕に架橋し、そして結合した断片を比較的長い
（100〜200pb）DNAプローブによりプローピングするこ
とを含んで成る。Churchらはまた、ナイロン膜上で乾燥
されそして0.16KJ/m²で２分間照射されたNTPがUV照射さ
れないヌクレオチドに比べてより安定に結合される（す
なわち、TTP＝130x,dGTP＝30x,dCTP＝20x及びdATP＝10
x）ことを開示している。一級アミノ基は254nmの光で活
性化されたチミジンに対して非常に反応性が高く（Sait
oら、1981,Tetrahedron Lett.，22:3265−68を参照のこ
と）、そしてこの反応性はヌクレオチドが膜に反応する
ようになる機作であると信じられる。

SSOプローブを用いての遺伝子変化の検出は典型的に
は、まずサンプルDNAを変性しそしてナイロン膜又はニ
トロセルロース膜上に固定化することにより行われる。
次に、膜を短い（15〜20塩基）オリゴヌクレオチドによ
りストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で処
理して、正確な相補性の場合にのみアニールさせる。サ
ンプルが多くの異る配列の存在について試験される場
合、多数のハイブリダイゼーションが行われなければな
らない。例えば、地中海集団においてβ−サラセミアを
導く最もありふれた遺伝子変異の試験は12種のプローブ
を用いそして12回の個別のハイブリダイゼーションを必
要とし、このハイブリダイゼーションは１枚のフィルタ
ーを12回プロービングすることにより、あるいは12枚の
レプリカフィルター上で同時ハイブリダイゼーションを
行うことにより（あるいはこれらの組合せにより）行わ
れる。DNAを基礎とするHLAタイプ分け試験は20〜50のプ
ローブ及びハイブリダイゼーションを要求する場合があ
り、これは、プローブが存在するだけサンプルを多くの
部分に分けるか又はサンプルをブロットしそして単一の
プローブでプロービングしそして次にプローブを除去す
るという、試験されるプローブごとにプロセスを反復し
なければならない従来技術を用いるとすば非常に高くつ
く努力である。

オリゴマーハイブリダイゼーションを用いる伝統的な
核酸検出においては、ハイブリダイゼーション標的を含
めての試験サンプル中のDNAはニトロセルロース又はナ
イロンのごとき固体支持体上に非共有結合により化学吸
着され、そして次に、すぐ上に記載したSSO法の場合を
除き通常数百〜数千のヌクレオチドを含有しそして生合
成的に作られたラベルされた標的特異的プローブにハイ
ブリダイズさせる。この方法は多くの欠点を有する。非
共有結合的標的捕捉は一般に、検出中にかなりの標的が
固体支持体から洗い流されるほど十分に弱い（例えば、
Gingerasら、1987,Nucleic Acids Research，15,5373−
5390、及びGamperら、1986,Nucleic Acids Research，1
4:9943−9954を参照のこと）。標的の化学吸着は、プロ
ーブとの反応に向けて標的配列の反応性を低下せしめ
る。捕捉及びハイブリダイゼーション法は一般に完了に
達するのに長時間を要する。検出の直前に標的を化学吸
着する必要があるため、試験サンプルにすぐに適用する
ことができる標的特異性を組み込んだ貯蔵安定性の捕捉
試薬を製造することができない。捕捉の配列非特異性が
複数のプローブによる単一試薬サンプルの試験を複雑化
する。すなわち、種々のプローブとインキュベートする
ために異る固体支持体に負荷することができるように多
くの試験サンプルが入手できなければならず、あるいは
単一固定化された試験サンプルの逐次プロービングのた
めに多くの時間が費やされなければならない。

Rankiら、1983,Gene，21:77−85は、配列特異的捕捉
試薬を作り、試験サンプルからの標的配列を核酸ハイブ
リダイゼーションにより捕捉し、そして捕捉された標的
を第二のラベルされた配列特異的核酸プローブを検出す
ることによって特異性を増加することにより、伝統的技
法を改良している。しかしながら、これらの技法はなお
多くの欠陥を有する。配列特異的キャプチャープローブ
が化学吸収によって固定化されるので、インキュベーシ
ョン及び洗浄の間の捕捉プローブ及びプローブ−標的複
合体の両者の脱着によりシグナルの減衰を受けやすい。
化学吸着がプローブの反応性を低下せしめ、捕捉効率を
上昇せしめるために長いインキュベーション時間を必要
とする。１種類ではなく２種類の核酸プローブを製造し
なければならない。Rankiらの捕捉及び検出プローブは
非常に大きいため、これらは非常に安価な化学合成経路
によってではなく生合成によって調製しなければならな
い。サンプル捕捉プローブは化学吸着により効率的に固
定化されないであろう。

Gingerasら、1987、前掲は、比較的短い化学合成され
たオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ
を固体支持体に共有結合により結合させ、ハイブリダイ
ゼーション時間を劇的に短縮することによりDNAプロー
ブ技法をさらに改良している。しかしながら、支持体へ
の標的特異的配列の直接カップリングが支持体による立
体的吸蔵により反応性を低下させる危険がある。さら
に、この方法は、標的への放射性ラベルの導入以外に捕
捉されたDNAを検出する方法がないことを示し、比較的
危険で且つ不便な方法である。最後に、Gingerasらの玉
状固体支持体は、多数の標的がプローブされるアッセイ
に適用するのが困難である。なぜなら、異る特異性を有
するビーズを混合しないように注意しながら、異なるプ
ローブを担持するビーズの別々の容器に試験サンプルを
暴露しなければならないからである。

Gamperら、前掲、はオリゴマーハイブリダイゼーショ
ンを促進するための異る方策を記載している。すなわ
ち、固体支持体上でではなく溶液中でオリゴハイブリダ
イゼーションが行われ、照射された場合に二本鎖DNAを
架橋する成分により標的特異的オリゴマーが化学的に修
飾されているためにハイブリド種が同時に光化学的にト
ラップされる。しかしながら、光−アダクトラベル化剤
を作ることが高価であることとは別に、この方法は、か
なり過剰量の未反応プローブを除去するための限外濾
過、及びそれに続くハイブリダイゼーション生成物を同
定し得る点まで精製するためのゲル電気永動と関連して
不便でありそして遅い。この方法は、標的を電気永動的
に分離可能に操作する必要があるために、多数の標的を
同時にプロービングするように適合させるのに特に不便
である。

本発明は、異るオリゴヌクレオチドプローブがスペー
サーアームを介して結合している個別の領域に分けられ
た単一の固体支持体を用いて単一の試験サンプル中の２
以上の特定の核酸配列又は対照条件を同時に非アイソト
ープ的に検出することを可能にする特に有利な測定方法
を提供する。この方法は、（ａ）一端がプローブに結合しそして他端が支持体に結
合するスペーサーアームを介してプローブを固体支持体
の定められた領域に結合させ；（ｂ）試験サンプルとプローブ担持固体支持体とを、試
験サンプル中のあらゆる単鎖相補的核酸配列へのプロー
ブのハイブリダイゼーションを促進する条件下で反応せ
しめ；（ｃ）プローブにハイブリダイズしない核酸を洗浄除去
し；そして（ｄ）プローブに捕捉された核酸を、好ましくはアイソ
トープを用いないで、検出する；ことを含んで成る。

共有結合による結合の永久性のため、固定化されたプ
ローブの調製とそれらの使用とを時間的に分けることが
でき、必要に応じて試験サンプル中の標的核酸配列をす
ぐに検出するために使用することができる貯蔵安定性検
出試薬、すなわちハイブリダイゼーション捕捉支持体、
の調製が可能となる。共有結合によるプローブの結合及
び支持体とプローブとの間のスペーサーの使用が、ハイ
ブリダイゼーションの効率を大いに促進しそして改良す
る。異るプローブのための個別の領域を有する寸法安定
性固体支持体の使用が経済性を大いに改良し、物理的方
式を改良し、そしてハイブリダイゼーション及び検出の
信頼性を増加せしめる。なぜなら、単一試験サンプル中
のすべての標的配列及びすべての対照条件を一回の短い
インキュベーションにおいて同時にプローブすることが
でき、そしてすべてのプローブ−標的ハイブリドが同一
のインキュベーション、洗浄及び検出条件に暴露される
からである。標的核酸に直接結合した着色ラベル又は蛍
光ラベルを介しての、あるいは特異的結合反応により標
的核酸に間接的に結合された着色ラベル、蛍光ラベル又
は酵素ラベルを介しての、アイソトープを使用しない検
出は、特に貯蔵安定性の検出試薬及びアッセイキットを
開発する際に、標的核酸に付加された放射性原子の検出
に比べて、非常に安全でありそして便利である。

本発明はまた、スペーサーアームを介して固体支持体
の個別の領域に共有結合により結合したオリゴヌクレオ
チドプローブを含んで成る測定試薬に関し、このプロー
ブは試験サンプル中の異る分析対象核酸にハイブリダイ
ズするように又は測定条件の有効性を試験する異る（陽
性又は陰性）対照条件を示すように、設計された配列を
有する。この測定試薬はかなりの商業的インパクトを与
え、大規模な自動化された製造方法に理想的に適合し、
そして長い商品寿命を有するであろう。この試薬は、標
的配列の数が被験サンプルの数を越える場合に特に有用
であることが証明されよう。一般に、標的配列の数、そ
してそれ故に固定化されたプローブの数が多くなるに従
って、従来法に比べての本発明の改良が大きくなるであ
ろう。PCRで増幅されたDNAサンプルを用いて、単一の固
体支持体上で50を越える特定の配列について単純な測定
を容易に行うことができる。本発明のアイソトープを用
いない検出の観点はPCRにより生じた標的配列に特によ
く適合し、この方法は、着色された色素又は蛍光色素の
及び結合成分例えばビオチンの、着色又は蛍光の及び結
合成分例えばビオチン、ジゴキシン及び特異的核酸配列
のすべての標的分子への共有結合による結合を可能にす
る。本発明の方法及び試薬はまた、好ましくはないがア
イソトープでラベルされた核酸の検出にも適合する。

本発明の重要な観点は、大量生産に特に適当でありそ
して最大のプローブの持続及びハイブリダイゼーション
効率を可能にする方法により固体支持体にオリゴヌクレ
オチドプローブを結合させるための特定の化学に関す
る。この化学は、プローブへのポリヌクレオチド（好ま
しくはポリ−dT）テイルの共有結合による付加、及びこ
の光反応性のテイルを有するプローブの紫外線照射によ
る−級又は二級アミンを担持する固体支持体（例えば、
ナイロン膜）への固定を含む。しかしながら本発明は、
支持体にプローブを結合させるための前記の方法に代る
非−光化学的方法を提供し、この場合プローブをスペー
サーに、及びスペーサーを固体支持体にいずれかの反応
順序でタップリングさせるために親電子的試薬が使用さ
れ、そしてスペーサーは多くの種類の有機ポリマー又は
長鎖化合物のいずれであってもよい。

本発明の他の観点はDNA配列検出キットに関し、この
キットは安定な試薬、特に、スペーサーアームを介して
共有結合したオリゴヌクレオチドを有する固体支持体を
含む。このキットはまた、オリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズすることができるDNA配列の増幅のために選択
されたPCRプライマーを含めてのPCR試薬を含む。

本発明の理解及び記載を助けるため、次の用語を定義
する。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（AS
O）は、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下での
ハイブリダイゼーションにより特定の対立遺伝子の所与
の対立遺伝子変異を他のすべての対立遺伝子変異を区別
するために使用し得るプローブに関する。

「DNA多形」は、同一の交雑集団（same interbreedin
g population）中にヌクレオチド配列の２以上の変異体
が存在する状態を意味する。

「遺伝子疾患」とは、疾患状態に関連する生物体のゲ
ノム性DNA中の特定の欠失及び／又は変異を意味し、そ
して鎌形赤血球貧血、のう胞性繊維症、α−サラセミ
ア、β−サラセミア等を含む。

「ラベル」とは、検出可能な（好ましくは定量可能
な）シグナルを提供するために使用することができ、そ
して核酸又は蛋白質に結合させることができる任意の原
子又は分子を意味する。ラベルは、蛍光、放射能、色、
Ｘ−線回折又は吸収、磁気、酵素活性等により検出する
ことができるシグナルを提供することができる。適当な
ラベルには蛍光物質、発色物質、放射性原子（特に³²P
及び¹²⁵I）、電子密度試薬、酵素、及び特異的結合パー
トナーを有するリガンドが含まれる。酵素は典型的には
その活性により検出される。例えばHRPはジアミノベン
ジジン（しかしながら、さらに好ましくはTMBが使用さ
れる）を分光光度計によって定量できる青色色素に変換
するその能力によって検出することができる。同一のラ
ベルが幾つかの異る態様で機能することができるので、
上記の記載は種々のラベルを別個のクラスに分類するこ
とを意味するものではないと理解すべきである。例え
ば、¹²⁵Iは放射性ラベルとして又は電子密度剤として機
能することができる。HRPは酵素として、又は抗体例え
ばモノクローナル抗体（MAb）に対する抗原として機能
することができる。さらに、所望の効果のために種々の
ラベルを組合わせることができる。例えば、MAb及びア
ビジンをラベルして本発明の実施のために用いることが
できる。プローブをビオチンによりラベルしそしてその
存在を¹²⁵Iによりラベルされたアビジンにより検出し、
あるいはHRPでラベルされた抗−ビオチンMAbにより検出
することができる。あるいは、dsDNA（又はハイブリダ
イズしたRNA）に対するラベルされたMAbを用い、そして
核酸をラベルすることなく、ハイブリダイゼーションの
存在を直接検出することができる。他の置換及び可能性
が当業者には容易に明らかであり、そして本発明の範囲
内であると考えられる。

「オリゴヌクレオチド」はプライマー、プローブ、オ
リゴマー断片、オリゴマー対照及び未ラベルのブロッキ
ングオリゴマーに関し、２個以上のデオキシリボヌクレ
オチド又はリボヌクレオシドから成る分子である。オリ
ゴヌクレオチドはまたヌクレオチド類似体、例えばホス
ホロチネート、及びアルキルホスホネート、並びに誘導
体化された（すなわち、ラベルされた）ヌクレオチドを
含有することができる。オリゴヌクレオチドの正確なサ
イズは多くの因子に依存し、これらの因子は今度はオリ
ゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途に依存するであ
ろう。

「プライマー」は、核酸鎖に対して相補的なプライマ
ー延長生成物の合成が起ることができる条件下におかれ
た場合に合成の開始点として機能することができる天然
の又は合成により製造されたオリゴヌクレオチドを意味
する。プライマーは好ましくはオリゴデオキシリボヌク
レオチドでありそして増幅における最大効率のためには
単鎖であるが、しかし二本鎖であることもできる。二本
鎖である場合には、プライマーは、延長生成物の調製の
ために使用される前にその鎖を分離するために処理され
る。プライマーはポリメラーゼの存在下で延長生成物の
合成をプライムするために十分に長くなければならない
が、しかしプライマーの正確な長さは多くの因子に依存
するであろう。例えば、診断的用途のため、オリゴヌク
レオチドプライマーは典型的には15〜25ヌクレオチドを
含有する。短いプライマー分子は一般に鋳型と共に十分
に安定なハイブリド複合体を形成するためには低い温度
を必要とする。増幅のための適当なプライマーは、当業
者により知られた手段により、例えば適切な配列のクロ
ーニング及び制限酵素処理、直接化学合成、及び商業的
供給者からの購入により用意される。プライマー合成の
ための化学的方法には、Narangら、1979,Meth.Enzymol.
68:90及び米国特許No.4,356,270に記載されているホス
ホトリエステル法;Brownら、1979,Meth.Enzymol.68:109
に開示されているホスホジエステル法;Beaucageら、198
1,Tetrahedron.Lett. 22:1859−1862に記載されているジ
エチルホスホラミダイト法；並びに米国特許No.4,458,0
66に開示されている固体支持体法が含まれる。プライマ
ーもまた所望によりラベルされてもよい。

「制限酵素断片長多形」とは、制限酵素認識部位にお
けるDNA多型を意味する。多形性部位に特異的な制限酵
素を用いてサンプルDNAを消化することができ、そして
消化されたDNAが電気永動により分画され、そして必要
であれば可視化のために処理される場合、サンプル中に
存在する特定の多形性配列に依存して異る制限エンドヌ
クレアーゼパターンを生成する。

「配列特異的ハイブリダイゼーション」は、ハイブリ
ダイゼーションが起こるためにプローブとサンプル標的
配列との間の正確な相補性が要求される厳格なハイブリ
ダイゼーション条件を意味する。この様な条件は当業者
により容易に認識され、そしてプローブの長さ及び塩基
組成に依存する。一般に、「正確な一致」が存在しない
場合にプローブが実質的にハイブリダイズしない条件を
得るためにハイブリダイゼーション溶液の温度、pH、イ
オン強度、及びチャオトロピック剤（chaotropic agen
t）の濃度を変えることができる。結合したDNAへのプロ
ーブのハイブリダイゼーションのため、標準的条件（0.
9M NaCl）下で最適温度を推定するための実験式は、Ｔ（℃）＝４（N_G＋N_C）＋２（N_A＋N_T）−５℃ であり、ここでN_G，N_C，N_T及びN_Aはプローブ中のG,C,A
及びＴ塩基の数である（J.Meinkothら、1984,Analyt.Bi
ochem., 138:267−284である。しかしながら当業者は、
この計算は単に最適温度についておよその値を与えるに
過ぎず、従って真の最適温度を得るためには実験的に試
験されるべきであることを認識する。配列特異的ハイブ
リダイゼーションにおいて使用されるプローブは「配列
特異的オリゴヌクレオチド」（SSO）と称し、これはま
た対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）でもあ
り得る。プローブと標的との間の１個のミスマッチが不
安定化するために、プローブのハイブリダイズする領域
は比較的短かくなくてはならず、一般に約23塩基より長
くなく、そして通常約17〜23塩基の長さである、ことを
当業者は認識する。

「特異的結合パートナー」とは、例えば抗原とそれに
対して特異的な抗体又はMAbの場合のように、高い特異
性をもってリガンド分子に結合することができる蛋白質
を意味する。他の特異的結合パートナーには、ビチオン
及びアビジン、ストレプトアビジン、又は抗−ビオチン
抗体;IgG及びプロテインA;並びに当業界において知られ
ている多くの受容体−リガンドのカップルを含む。

本発明の理解のため、幾つかの図が本発明の記載と共
同する。これらの図は下記のごとく簡単に説明される。

第１図はUV暴露の関数としてプローブ結合のプロット
を示す。

第２図はUV暴露の関数としてハイブリダイゼーション
効率のプロットを示す。

第３図は正常β−グロビン又は鎌形細胞β−グロビン
の存在を示す、サンドイッチ測定により得られる一連の
ドットブロットを示す。

第４図は正常β−グロビン又は鎌形赤血球β−グロビ
ンの存在を示す、直接測定により得られた一連のドット
ブロットを示す。

第５図はHLA DQα遺伝子型分類を示す一連のドットブ
ロックを示す。

第６図はβ−サラセミアタイプ分けを示す一連のドッ
トブロットを示す。

本発明は、相補的核酸配列のハイブリダイゼーション
を許容する条件下でサンプルと固定化されたオリゴヌク
レオチドプローブとを接触せしめることによりサンプル
中の特定のヌクレオチド配列の存在を検出する方法を提
供する。本方法の１つの態様においては、サンプルを、
１又は複数の標的配列（「分析対象」）に対して特異的
な固定化されたプローブ、すべての試験サンプル中に存
在すべき陽性対照配列に対するプローブ、及び任意に、
すべての試験サンプル中に存在しない陰性対照配列に対
するプローブがその上に固定化されている固体支持体…
各異るプローブは前記固体支持体上の異る領域に固定化
されている…に接触せしめる。陰性対照領域で分析シグ
ナルが検出される場合、又は陽性対照領域において分析
シグナルが検出されない場合、分析領域における応答の
有効性は疑わしく、そしてサンプルは再試験されるべき
である。他の好ましい態様においては、多くの異る分析
対象特異的プローブが固体支持体の異る領域に共有結合
により結合され、単一のハイブリダイゼーション反応に
おいて所与の遺伝子座の対立遺伝子変異について試験す
ることができる。他の好ましい態様においては、種々の
分析対象特異的プローブが種々の微生物中に存在する核
酸配列に相補的である。

固定化されたプローブもまた本発明の重要な観点であ
る。プローブは２つの部分、すなわち約10〜50ヌクレオ
チド（nt）のヌクレオチド配列から構成されるハイブリ
ダイズする領域、及び該ハイブリダイズする領域と少な
くとも同じ長さを有するスペーサーアームを含んで成
り、このスペーサーアームは固体支持体に共有結合によ
り結合しておりそして「スペーサー」として機能するこ
とにより、プローブのハイブリダイズする領域が固体支
持体から離れこれによってプローブのハイブリダイゼー
ション効率を改良することを可能にする。好ましい態様
において、スペーサーアームは「テイル」と称されるヌ
クレオチドの配列であり、これは、プローブのテイル内
のヌクレオチドと固体支持体マトリクス内の反応性基と
の間の共有結合を介してプローブを固体支持体につなぎ
留めるために役立つ。

一層十分に後記するように、本発明の固定化されたプ
ローブは、固定化されたプローブを用いる従来技術の検
出法に内在する問題点を回避する。これらの問題点には
感度の不足が含まれ、プローブを固定化するための多く
の従来技術の方法については、プローブのハイブリダイ
ズする領域が固体支持体に結合することとなりそしてそ
れ故にサンプル中の相補的配列にハイブリダイズする自
由が低下するという結果をもたらす。さらに、スペーサ
ーを合成しそしてそれをプローブ及び固体支持体に結合
せしめるための従来技術の方法は複雑であり、長時間を
要し、そしてしばしば毒性試薬の使用を含む。非常に対
照的に、プローブを合成しそして固定化するための本発
明の好ましい方法は、容易に入手可能な比較的非毒性の
試薬を用い、そして実際上化学的操作を伴わないで、迅
速に完了する。本発明のポリヌクレオチドテイルは、酵
素により又は市販の核酸合成機によりハイブリダイズす
る領域に結合されたヌクレオチドから構成される。本発
明のテイルは同様に問題のない方法、すなわち紫外線
（UV）光への暴露により固体支持体に結合される。

当業者は、核酸ハイブリダイゼーション医療診断及び
法医学における多くの重要な技法の基礎として役立つこ
とを認識している。さらに、核酸ハイブリダイゼーショ
ンは多くの多様な分野における科学的進歩が起こる実験
室における重要な道具として役立つ。本発明は、核酸に
基礎を置く診断をなお一層強力で且つ有用なものとする
際の重要な段階を代表する。上記のように、PCRはこれ
らの産業及び実験室において重要な役割を演じており、
そして本発明はしばしばPCRにより増幅された核酸を含
有するサンプルに対して行われる。本発明の種々の有用
な具体例を下に記載するが、しかし本発明の全範囲は、
核酸に基く診断の種々の多様な実施者により理解されそ
して使用される時に実現され得る。

本発明の１つの非常に重要な用途は、感染性疾患、遺
伝子異常、及び癌を含めての細胞性異常と関連する特定
の核酸配列の検出及び特徴付けに関する。本発明のこれ
らの具体例において、特に分析のために利用できる核酸
の量が非常に少ない場合、例えば胎児細胞から得られる
DNAを用いての鎌形赤血球貧血の出生前診断において、
標的配列の増幅がやはり有用である。

本来鈍感な非−放射性検出技法を用いて小サンプルに
対して分析が行われる場合、又は放射性技法が用いられ
るが迅速な検出が好ましい場合、増幅は特に有用であ
る。

本発明により提供される固定化されたプローブは感染
性疾患及び病的異常の検出のために有用であるのみなら
ず、病的状態と必ずしも関連するわけではないDNA多形
性の検出においても有用である。法医学なる語は最もし
ばしば法的議論又は論争に関する文脈において使用され
る。DNAタイプに基く個体の識別はこの観点において一
層重要な役割を演じている。例えば、DNAタイプ分けは
生物学的な父を同定するために使用することができ、そ
してそのために父系試験のための重要な道具として役立
つ。生物学的タイプ分けはまた、犯罪の現場に残された
生物学的証拠と犯罪を行ったことが疑われている個体か
ら得た生物学的サンプルとをマッチさせるためにも用い
ることができる。同様にして、DNAタイプ分けはまた、
残留物が犯罪活動の結果であるか又はなんらかの非犯罪
活動の結果であるか、生物学的残留物を同定するために
使用することができる。法医学の実施は今や日常的に、
本発明を用いることによりより効率的にされ得る方法に
おいてDNAプローブの使用を含む。

本発明の重要な且つ多様な利点を達成するため、まず
固体支持体に固定されるべきプローブを合成しなければ
ならない。プローブ配列は任意のオリゴヌクレオチドと
同様にして合成することができ、そして種々の適当な合
成法がPCRプライマーの検討において上に記載されてい
る。本発明のプローブのハイブリダイズする領域は典型
的には約10〜50ntの長さを有し、そしてしばしば17〜23
ntの長さを有するが、しかし言うまでもなくハイブリダ
イズする領域の正確な長さはプローブの使用目的に依存
する。しばしば、当業者に自明の理由により、プローブ
のハイブリダイズする領域は検出されるべき標的配列と
の完全な相補性を有するように設計されるであろうが、
しかしながらやはり、プローブと標的との間の相補性の
程度は本発明にとって幾分付随的である。しかしなが
ら、本発明のプローブは好ましくは、本発明により提供
される利点を得るにあたり本質的な役割を演ずるオリゴ
ヌクレオチド配列による「テイル」を有する。

本発明のプローブのこのテイルはリボヌクレオチド又
はデオキシリボヌクレオチド（例えば、dT,dC,dG及びd
A）から成る。テイルのヌクレオチドは、標準的方法に
よりターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼを用いてプローブのハイブリダイズする領域に結合
させることができる。さらに、テイルを有する完全なプ
ローブを、化学的方法により、最も便利には市販の核酸
合成機を用いて合成することができる。また、テイル及
びハイブリダイズする領域を別々に合成し、そして次に
これら２つの成分を連結することができる。例えば、テ
イルを調製し（そしてビーズのごとき固体支持体に結合
させ）、そして次にハイブリダイズする領域の調製物に
結合させることができる。

本発明のテイルを有するプローブをDNA合成機を用い
て作る場合、早過ぎる鎖停止のためにハイブリダイズす
る領域を含有しない分子を有意な比率で作ることを回避
するための段階を採用すべきである。この様な段階の１
つは、まずプローブのハイブリダイズする領域を合成
し、こうして分子の３′−端にハイブリダイズする領域
を有するテイル付プローブを作製することである。早過
ぎる鎖停止の可能性は分子の長さと共に増加するので、
この段階は、鎖停止現象が起これば、これは単により短
いテイルをもたらすという可能性を増加せしめる。しか
しながら、ほとんどの早過ぎる鎖停止現象は合成分の
「鎖ブロック」の失敗の結果であるから、そして本発明
のプローブのテイル中の残基の数は本質的ではないか
ら、プローブのテイル領域の自動合成の間に、ブロック
段階及び脱ブロック段階を単に省略することができる。
これらの段階が省略されれば（テイル合成の間のみ）、
テイルをプローブの５′又は３′に同じ効率をもって置
くことができ、そして満足な結果が得られる。

前記のように、本発明のプローブの好ましいスペーサ
ーアームはヌクレオチドテイルから構成される。テイル
は固体支持体にプローブを結合させるのに役立つから、
本発明のプローブ中のテイルとして役立つ配列を選択す
るに当り、所与のオリゴヌクレオチドが固体支持体と反
応する相対効率は重要である。最もしばしば、テイルは
ホモポリマーであり、そして後記の第１図は、種々の長
さのホモポリマーテイルを有する合成オリゴヌクレオチ
ドがナイロンフィルターに共有結合する相対効率をUV暴
露の関数として示す。この図に示されるように、より長
いポリ−dTテイルを有するオリゴヌクレオチドは膜によ
り容易に固定され、ポリ−dTテイルを有するすべてのオ
リゴヌクレオチドは240mJ/cm²の254nmの照射によりその
最大値を達成した。これに対して、ポリ−dC（長さ400n
t）テイルは膜に架橋するためにより多くの照射を必要
とし、そして600mJ/cm²の暴露の後でさえ、同等のポリ
−dTテイルに匹敵しなかった。テイルを有しないオリゴ
ヌクレオチドはポリ−dCテイルを有するプローブのそれ
におよそ平行する態様でフィルターにより保持された。

従って、本発明のプローブは、好ましくは、10チミジ
ン（Ｔ）残基より多いポリ−dTテイルを含んで成る。通
常、テイルは少なくとも100T残基を含んで成り、そして
最も好ましくはテイルは少なくとも400dTヌクレオチド
を含んで成る。ポリ−dTテイルは主としてプローブを固
体支持体に結合せしめるために機能するので、前記のご
とくdTヌクレオチドの正確な数は重要ではない。当業者
は容易に認識するであろうが、テイルの組成は均一であ
る必要はないこと、すなわちヌクレオチドの混合物が使
用され得ることに注目すべきである。しかしながら好ま
しくは、テイルは有意な数のチミジン塩基を含有するで
あろう。なぜなら、Ｔは本発明の固定化されたプローブ
を作るのに好ましい方法により固体支持体と最も容易に
反応するからである。この方法は後でさらに十分に検討
する。配列特異的ハイブリダイゼーションにおいてプロ
ーブを用いることを望む場合、プローブのハイブリダイ
ズする領域に非常に類似した不均一テイル中のランダム
配列の形成により生ずる問題を知らなければならない。
不均一テイルが使用される場合、プローブがUV照射によ
り固体支持体に固定されるべきであれば、テイル当り15
0チミジン残基の分布を維持するのがなお好ましい。

テイルは常に、ハイブリダイズする領域より長くある
べきであり、そしてハイブリダイズする領域とテイルと
の間のサイズの不均衡が大きくなるに従って（テイルの
方が長い限り）、ハイブリダイズする領域ではなくむし
ろテイルが支持体と反応する可能性がより高くなり、好
ましい条件である。すなわち、より長いテイルは、テイ
ルのみが固体支持体との反応に関与しそしてそれにより
固体支持体に結合する可能性が増大する。テイルはまた
「スペーサー」として機能し、相補的配列が固体支持体
から、立体的相互作用を受けないでより容易にハイブリ
ダイズすることができる所に拡散することを可能にする
から、より長いテイルは二重に好ましい。しかしなが
ら、過剰に延びたテイルは不経済であり、そして極端に
なれば過剰なテイルは不都合な効果を有するであろう。

本発明のプローブを合成するための好ましい方法は次
の通りである。プローブをDNA合成機（Biosearchにより
市販されているModel 8700がこの目的のために好まし
い）で、β−シアノエチルN,N−ジイソプロピルホスホ
ラミダイトヌクレオシド（American Bioneticsから入手
可能）により、製造者により提供される方法を用いて合
成する。しかしながら、所望により、プローブのハイブ
リダイズする領域のみを装置で合成し、そして次に200p
molのプローブを、100mMカコジレート、25mM Tris−塩
基、1mM CoCl₂及び0.2mMジチオスレイトールを含有する
反応緩衝液（pH＝7.6）100μｌ中で、５〜160nmolのデ
オキシリボヌクレオチドトリホスフェート（dTTP）及び
60ユニット（50pmol）のターミナルデオキシリボヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ（Ratliff Biochemicalsか
ら入手可能）を用いて37℃にて60分間テイル形成する
（緩衝液の調製についてはRoydhoudhuryら、1980,Meth.
Enz. 65:43−62を参照のこと）。反応の停止は100μｌの
10mM EDTAの添加により行うのが便利である。テイルの
長さは、反応混合物中に存在するdTTP（又は他のヌクレ
オチド）の量を限定することにより調製することができ
る。例えば、上記の方法において80nmolのdTTPを用いる
ことにより400dT残基の名目長さが得られる。

本発明のテイルを有するプローブを合成した後、次に
プローブを固体支持体に結合せしめる。本発明の目的の
ために適当な固体支持体は、UVで活性化されたピリミジ
ン、特にチミジンと結合することができる遊離反応性一
級又は二級アミノ基を含有する（又は含有するように処
理され得る）であろう。本発明の目的のためには二級ア
ミノ基が好ましい。固体支持体（ナイロンである必要は
ない）が遊離の特に二級アミノ基を有することを保証す
るための多くの方法が存在する。本発明の目的のために
適当なアミノ担持固体支持体には、ポリエチレンイミン
（グルタルアルデヒド架橋を伴って又は伴わないでセル
ロース又はシリカのごとき任意の固体に化学吸着され
る）、及びPCR Inc.のProsil（商標）220,221,3128及び
3202試薬のごときアミン担持試薬によりシラン処理され
たガラス又はアルミナ又はシリカが含まれる。Manville
は、アミノアルキルシラン化のために適当な制御された
ポロシティーのガラスペーパー〔Biomat（商標）〕を販
売している。固定化された一級アミンをアルキル化する
ことができる（例えばハロゲン化メチル又はホルムアル
デヒド＋シアノボロヒドリドを用いて、Jentoffら、197
9,J.Biol.Chem. 254;4359−4365に記載されているように
して）。前記のように、ポリエチレンイミンが化学吸着
された固体支持体を用いることができる。PEI−負荷さ
れたシリカを含有するポリ塩化ビニルシートが市販され
ており〔Ameraceにより製造され、そしてICNによりProt
rans（商標）として、そしてPoly−SciencesによりPoly
/Sep（商標）として〕、そしてセルロースのPEI負荷は
よく知られている。

固体支持体、いわゆる基材、は棒、チューブ、ウエ
ル、浸漬棒、ビーズ、ELISA形プレート等を含めて種々
の形状で提供され得る。好ましい支持体材料はナイロン
であり、このものは反応性一級アミノ基を含有し、そし
てUV光を照射されたピリミジンと反応する。好ましい固
体支持体には荷電修飾されたナイロン、例えばplascoに
より販売されているGenetrans−45（商標）、及びBio−
Radにより販売されているZeta Probe（商標）膜が含ま
れる。

固体支持体を選択した後、テイルと固体支持体との共
有結合に好都合な条件下でテイルを有するオリゴヌクレ
オチドを固体支持体と反応せしめることにより本発明の
好ましい固定化プローブを作製する。好ましい態様にお
いて、固体支持体は膜であり、そしてプローブの結合は
膜上のプローブをUV照射に暴露することにより生じ、こ
のUV照射がテイル中のヌクレオチドを活性化しそして活
性化されたヌクレオチドが膜内の遊離アミノ基と反応す
る。適当な固体支持体上にスポットされた本発明のテイ
ルを有するプローブを注意深く乾燥することによっても
膜へのプローブの共有結合による結合を促進することが
できる。実施例１に記載する方法によりオリゴヌクレオ
チドと反応することができる反応性基の固体支持体中の
存在又は不存在を測定することができる。

前記から明らかな通り、本発明の固定化されたプロー
ブを製造するための好ましい方法は、UV照射によりオリ
ゴヌクレオチドプローブをポリ−dTテイルを用いてナイ
ロン膜に固定化することを含んで成る。ポリ−dTテイル
は本発明の方法により固体支持体に非常に効率的に反応
するが、オリゴヌクレオチドと膜との反応の効率は必然
的にハイブリダイゼーション効率と相関するわけではな
い。従って、固体支持体への固定化の後に所与のオリゴ
ヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション効率を
決定することが望まれるであろう。種々のテイル付きプ
ローブのハイブリダイゼーションがUV量の関数として測
定される場合、第２図に示すように、最適暴露はポリ−
dTテイルの長さと共に変化する。最適暴露は800ntポリ
−dTについて20mJ/cm²であり、そして400ntポリ−dTテ
イルについては約40mJ/cm²である。

60mJ/cm²の暴露において、より長いテイルを有するオ
リゴヌクレオチドは、フィルターと反応しそしてそれに
結合するプローブの追加量によって説明できるのよりも
一層効率的にハイブリダイズする。この増加した効率は
空間効果によるものと信じられる。すなわち、膜と固定
化されたプローブのハイブリダイズする領域との間の距
離の増加がプローブのハイブリダイゼーション効率を上
昇せしめる。すなわち、固定化中の多過ぎるUV照射はプ
ローブ中のヌクレオチドを損傷するのみならず平均スペ
ーサー長さを短縮しそしてハイブリダイゼーション効率
を低下せしめる。dCテイルは（dTテイルに比べて）膜と
効率よく反応しないから、ポリ−dCテイルを有するプロ
ーブのハイブリダイゼーション効率はプラトーに達し、
ここではUV損傷によるロス及びテイルの短縮が膜への新
たな分子の固定と釣り合う（第１図及び第２図を参照の
こと）ことに注目すべきである。UV照射が注意深く調節
できない場合、ポリ−dCテイルのこの特徴はこのテイル
を好ましいものとするであろう。

プローブのテイルの塩基含量がどうであれ、本発明の
方法に従って支持体へのプローブの結合を自動化するこ
とができる。陽性荷電ナイロン膜のための好ましい半自
動化結合法は次の通りである。市販の「ドットブロッ
ト」装置をPerkin−Elmer/Cetus Pro/Pett（商標）自動
ピペッティングステーションに適合するように変更する
ことができる。次に、膜をドットブロット装置の上に置
きそして真空を適用する。膜が真空下でくぼみ、適用さ
れた小体積（５〜20μｌ）のプローブが一貫したドット
を形成し、その縁はくぼみの直径により定められる。膜
を置きそして置き換えるために装置の分解を必要とせ
ず、膜が適用され、プローブによりスポットされそして
除去される間に真空を一定に保つことができる。

プローブを膜にスポットした後、このスポットされた
膜をプローブの固定化のために処理する。プローブをナ
イロン膜に共有結合により結合せしめるための好ましい
方法は次の通りである。TE緩衝液〔10mM Tris−HCl（pH
＝8.0）及び0.1mM EDTA〕中のテイルを有するオリゴヌ
クレオチドを、Bio Dot（商標）（Bio−Rad）スポット
用マニホルドによりGenetrans−45（商標）（Plasco）
膜に適用する。次に「フィルター」とも呼ばれる湿った
膜をTE緩衝液に浸漬されたペーパーパッド上に置き、そ
してパッド及びフィルターをUV光ボックス〔この目的の
ためにStratageneにより製造されたStratalinker 1800
（商標）ライトボックスが適当である〕に入れ、そして
調節された暴露レベルのもとに254nmにて照射する。UV
量は特定のUV光源への暴露の時間により、あるいはさら
に好ましくは放射UVエネルギーを測定ユニットにより測
定することによって調節することができる。暴露時間は
典型的には約0.1〜10分間であり、最もしばしば２〜３
分間である。好ましくは支持体は照射の間湿っている
が、しかし支持体が最初に乾燥しているときはより短い
UV照射暴露を用いることができる。照射されたフィルタ
ーは、５×SSPE（１×SSPEは180mM NaCl,10mM NaH₂P
O₄、及び1mM EDTA,pH＝7.2）及び0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）から成る多量の溶液中で約0.5時間55℃
にて洗浄し、未反応のオリゴヌクレオチドを除去する。
次に、フィルターを水中ですすぎ、空気乾燥し、そして
必要なときまで室温にて貯蔵することができる。

ヌクレオチドのUV照射がピリミジンの光化学的二重体
化を惹起することが知られており、これは本発明の目的
のためには好ましくない。UV照射中の二重体化を減少さ
せるために多くの段階を採用することができ、これには
オリゴヌクレオチドプローブを９以上、好ましくは10以
上の高pHにおいて膜に適用すること；プローブを０〜0.
01の非常に低いイオン強度にて膜に適用すること；所望
のシグナル強度を提供する最低プローブ濃度を用いるこ
と；及び250nmより長い波長を含まない、好ましくは240
nmより長い波長の光を含まない光により照射すること、
が含まれる。しかしながら、これらの段階がプローブの
固定化を害する程度は試験されていない。一般に、膜へ
のプローブのスポット及び結合はプローブ中の塩基対合
及び塩基スタッキングを最少にする温度において且つそ
のような溶剤中で行われるべきである。

本発明の新規な固定化プローブを作製した後、これら
のプローブを本発明の有用な核酸配列検出法においてす
ぐに用いることができる。この発明の好ましい態様にお
いては、標的核酸配列を含有することが予想されるサン
プルをPCRにより標的配列を増幅するために適当な条件
下で処理する。なお、単鎖DNAの生成のための、Gyllens
ten及びErlich,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA．85:7652
−7656、により記載されている「非対称」PCR法を用い
てサンプル核酸を増幅することもできる。ハイブリダイ
ズしたプライマー含有配列のその後の検出のためにPCR
プライマーをビオチン化する。非対称PCRが増幅のめに
使用されない限り増幅反応混合物を変性し、そして次に
ハイブリダイゼーション（最もしばしば配列特異的ハイ
ブリダイゼーション）が生ずるのに適当な条件下で本発
明の膜に適用する。ハイブリダイズしたプローブは、ビ
オチン化DNAへのストレプトアビジン−西洋ワサビパー
オキシダーゼ（SA−HRP、種々の化学業者から入手可
能）の結合、及びこれに続くTMBのごとき基質を用いて
の簡単な発色反応により検出される。次に、膜上の着色
されたドットの外観を単に見ることによりある種の配列
がサンプル中に存在するか否かを決定することができ
る。

本発明の特に好ましい態様においては、固定化された
オリゴヌクレオチドを含有するフィルターを、５×SSP
E,0.5％SDS及び100ng/ml SA−HRP〔Cetus及びEastman K
odakによりSeeQuence（商標）として市販されている〕
を含有するハイブリダイゼーション溶液中に入れる。PC
Rにより増幅されたサンプルDNAを熱により又はNaOH及び
EDTAの添加により変性し、そして存在するすべてのNaOH
を中和するのに十分なSSPEを含有するハイブリダイゼー
ション溶液にすぐに加える。次に、サンプルをハイブリ
ダイゼーションが生ずるのに適当な温度においてインキ
ュベートする（典型的には、下に例示するように55℃に
て30分間）。このインキュベーションの間に、固定化さ
れたオリゴヌクレオチドへの生成物のハイブリダイゼー
ション及びビオチン化された生成物へのSA−HRPの結合
が起こる。フィルターを２×SSPE及び0.1％SDS中室温に
て短時間すすぎ、次に同じ溶液中で55℃にて10分間洗浄
し、そして２×PBS〔１×PBSは137mM NaCl,2.7mM KCl,
1.5mM KH₂PO₄及び8mMNa₂HPO₄，（pH＝7.4）〕中で室温
にて手早く２回すすぐ。フィルターを赤色ロイコ色素又
はTMB中で室温にて５〜10分間インキュベートすること
により発色を行う。

上記の検出方法は好ましいが、本発明の固定化された
プローブを種々の検出方式において使用し得ることを当
業者は認識する。この様な方式の１つは、サンプル核酸
ではなく固定化されたプローブ自体をラベルすることを
含む。プローブがそのハイブリダイズする配列の末端又
はその近傍（固体支持体へのプローブの結合の位置から
離れている）においてラベルされれば、潜在的にハイブ
リダイズしたサンプルDNAを適切な制限酵素、すなわち
プローブのハイブリダイズする領域中に存在する配列に
おいて二本鎖核酸のみを開裂せしめる制限酵素により処
理することができ、この結果制限酵素反応がハイブリダ
イゼーションの検出のためにプローブ（及び膜）からラ
ベルを放出する。適当なラベルにはパーオキシダーゼ酵
素、酸性ホスファターゼ、放射性原子又は分子（例え
ば、³²P，¹²⁵I等）、蛍光物質、色素、ビオチン、それ
に対する特異的モノクローナル抗体が入手可能なリガン
ド等が含まれる。固定化されたプローブではなく、PCR
増幅において使用されるプライマー又は１もしくは複数
のdNTP（例えば、Loら、1988,Nuc.Acids Res, 16:8719に
より記載されているビオチン化dUTP誘導体）がラベルさ
れている場合、前記のごとく、膜に結合したラベルの存
在についてのアッセイによりハイブリダイゼーションを
検出することができる。

本発明の固定化されたプローブはまた、プローブ及び
プライマーのいずれもラベルされない検出方式において
も使用することができる。この様な方式においては、ハ
イブリダイゼーションはラベルされた「第二プローブ」
を用いて検出され得る。第二プローブは、標的DNA中に
存在するがしかし結合したプローブの配列とはオーバー
ラップしない配列に対して相補的であり、第二プローブ
のハイブリダイゼーションの後、固定化されたプロー
ブ、第二プローブ及び標的配列が核酸の「サンドイッ
チ」を形成し、このサンドイッチの存在が膜上の第二プ
ローブのラベルの存在により示される。さらに、ラベル
された核酸を用いない検出方式において、二本鎖DNA
（例えばdsDNA）に結果的に結合することができるモノ
クローナル抗体（又は他のDNA結合蛋白質）を用いるこ
とができる。本発明の固定化されたプローブの１つの重
要な利点は、少なくともほとんどの検出方式において、
ハイブリダイズした複合体を変性し、サンプルDNAを溶
出し、そして支持体を処理（例えば、洗浄漂白等）して
残留するすべての痕跡の外来DNA、ラベル、発色液及び
固定化された色素を除去することにより、支持体に結合
したプローブを再循環することができる（米国特許No.
4,789,630,及びPCT出願No.88/0287を参照のこと；引用
によりこれらを本明細書に組み入れる）ことであること
を当業者は認識するであろう。

当業者は本発明の固定化されたプローブの多くの且つ
多様な用途を認識するであろう。これらの固定化された
プローブの１つの既存の用途は、幾つかのDNA配列の同
時的増幅（「多重」PCR）の技法との組合わせである。
この様な同時的増幅は、単一の膜を用いて多くの異る遺
伝子座におけるタイプ分けにおいて用いることができ
る。例えば、^Gγ遺伝子における多形性HindIII部位（Je
ffreys,1979,Cell，18:1−10を参照のこと）、低密度リ
ポプロテイン受容体遺伝子中の多形性AvaII部位（Hobbs
ら、1987,Nuc.Acids Res.，15:379を参照のこと）、及
びHLA DQα遺伝子中の多形性について、同時に、単一の
PCRにおいて３個すべての遺伝子座を増幅しそして増幅
された材料を本発明の固定化されたプローブの適切なセ
ットに適用することによりタイプ分けすることができ
る。この技法によってその分析が単純化される他の遺伝
子標的には、ras遺伝子（６個の遺伝子座及び66の可能
な対立遺伝子が存在する;Verlaan−de Vriesら、1986,G
ene, 50:313−320を参照のこと）中の体細胞変異の検出;
HLADP遺伝子座におけるDNA多形性のタイプ分け；中東人
集団におけるβ−サラセミアの検出（本来の変異のほか
に地中海及びアジア・インド変異が有意な頻度で存在す
る）；並びに環境調査における微生物の検出が含まれ
る。

これらの用途の多くにおいて、同じ配列特異的ハイブ
リダイゼーションのもとでハイブリダイズすることがで
きる異る配列に対して特異的な多様なオリゴヌクレオチ
ドのセットをその上に固定した膜を得るのが好ましい。
必要であれば、この状況はプローブの長さ、位置、及び
鎖特異性を調整することにより、あるいは膜に適用され
るプローブの量を変えることにより、あるいはテトラメ
チルアンモニウムクロリドのごとき塩をハイブリダイゼ
ーション緩衝液に加えて塩基組成の差により生ずる固定
化されたオリゴヌクレオチド間の差異を最小にすること
により、（Woodら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 82:1
585−1588を参照のこと）達成される。

下記の実施例は本発明の種々の有用な具体例を説明し
そして当業者をして本発明をより十分に理解させるもの
であり本発明の範囲を制限するものと解すべきでない。

実施例1. プローブの保持及びハイブリダイゼーション効率ナイロンへのポリ−dTテイル付プローブ配列の安定な
結合をテイルの長さ及びUV暴露の関数として下記のよう
に試験した。19−塩基オリゴヌクレオチド（RS18:5′CT
CCTGAGGAGAAGTCTGC）をその５′−末端においてγ−³²P
−ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼによりラベルし
た（Saikiら、1986,Nature,324:163−166）。次に、キ
ナーゼ処理されたプローブの部分に、Roydhoudhuryらに
より記載されたようにしてdTTP及びターミナルトランス
フェラーゼ（TdT）によりテイル形成した。RS18は２μ
M,TdT（Ratliff Biochemicals,ロスアラモス,NM）は600
U/ml、そしてdCTP又はdTTPは０μM,50μM,100μM,200μ
M,400μＭ又は800μＭのいずれかの濃度において存在せ
しめ、分子当り約0,25,50,100,200,400又は800dT塩基又
は400dC塩基のdC又はdTテイルを有する構成物を調製す
るようにした。反応混合物を37℃にて60分間インキュベ
ートし、そして等容量の10mM EDTAの添加によって停止
せしめた。

100μｌのTE緩衝液に稀釈した各サンプル４μmolを９
の二連のフィルター（Genetrans−45ナイロン、Plasco,
Woburn,Mass）にスポットし、種々の時間にわたりUV照
射し、洗浄して未結合のオリゴヌクレオチドを除去し、
そして次に各スポットをシンチレーション計数により測
定してナイロン膜に架橋されたプローブの量を決定し
た。第１図にプロットされた値は照射されない、洗浄さ
れない対照フィルター（100％保持）に関する。UV照射
は、フィルターをStratalinker 1800（商標）UV光ボッ
クスに入れそしてフィルターを254nmにて照射すること
により行った。照射量は装置の内部計測ユニットを用い
て調節した。次に、フィルターを５×SSPE,0.5％SDS中
で55℃にて30分間洗浄して安定に結合していないDNAを
除去した。第１図にプロットされた結果が示すところに
よれば、テイルを有しないプローブでも膜により保持さ
れたが、テイルを有しないプローブの保持はUV照射によ
って大きく改良されなかった。400−dTテイルを有する
プローブは適当な照射の後＞90％の保持を示した。

しかしながら、高い保持が高いハイブリダイゼーショ
ン効率と必然的に相関するわけではない。従って、ハイ
ブリダイゼーション効率を次の様にして測定した。ポリ
−dTテイルを有するプローブを上記のようにして調製し
たが、しかし未ラベルRS18を用いた。プローブをフィル
ター上にスポットしそしてUV照射し、そして膜を５×SS
PE,0.5％SDS中で55℃にて30分間インキュベートするこ
とにより過剰のプローブを膜から洗い落した。次に、膜
を５×SSPE及び0.5％SDSを含有する溶液（10ml）中で5p
molの相補的³²P−キナーゼラベルされた40−mer（RS24:
5′−CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG、比
活性1.5μCi/pmol）と、配列特異的ハイブリダイゼーシ
ョン条件である55℃にて20分間ハイブリダイズせしめ
た。次に、膜をまず２×SSPE,0.1％SDS（３×100ml）に
より約25℃にて２分間、次に２×SSPE,0.1％SDS中で55
℃にて５分間洗浄した。個々のスポットを切り出し、カ
ウントし、第２図に示すようにカウントをUV暴露に対し
てプロットした。プロットされた値は膜にハイブリダイ
ズしたRS24の量fmolである。この結果が示すところによ
れば、適用されたRS18は50％という多くが膜に結合され
るべきであるのにテイルを有しないプローブは使用され
た条件下でハイブリダイズすることができなかった。テ
イルを有するプローブのすべてがハイブリダイズするこ
とができ、ハイブリダイゼーション効率はテイルの長さ
の増加と共に増加した。最適UV暴露は約60〜120ml/cm²
であった。

実施例2. 鎌形赤血球貧血のサンドイッチアッセイ２種類の対立遺伝子特異的プローブを調製した。一方
は正常β−グロビン対立遺伝子に対するものであってRS
18と称し、他方は鎌形赤血球貧血に対するものであって
RS21（５′CTCCTGTGGAGAAGTCTGC）；であった。各プロ
ーブは400ntのポリ−dTテイルを有していた。所望によ
り、次の配列:5′CTCCTAAGGAGAAGTCTGCを有するヘモグ
ロビンＣ対立遺伝子に対するプローブを調製した。８組
の二連のフィルターを用意し、そして実施例１に記載し
た方法を用いて4,2,1及び0.5pmolの各テイルを有するプ
ローブをスポットし、そして次にフィルターをDNA側を
下にして直接TM−36 Transilluminator UV光ボックス
（U.V.Products,San Gabriel,CA）に５分間置くことに
よりUV照射した。４個の１μｇのゲノムDNA〔セルライ
ンMolt4（β^Aβ^A）,CS−１（β^Sβ^S）,MtS（β^Aβ^S）、
及びGM2064（β^Δβ^Δ）βグロビン欠失変異体、からの
もの〕を、プライマー対PCO3（５′ACACAACTGTGTTCACTA
GC）及びKM38（５′TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG）を用いて
30回のPCR増幅サイクルにかけた。

PCRはSaikiら、1988,Science，239:1350−1354により
記載されている方法に実質的に従って行った。50mM KC
l,10mM Tris−HCl（pH＝8.4）,1.5mM MgCl₂,100μg/ml
ゼラチン、200μＭずつのdATP,dCTP,dGTP及びdTTP,0.2
μＭの各プライマー、並びに2.5ユニットのTaq DNAポリ
メラーゼ（perkin−Elmer/Cetus Instruments）を含有
する反応緩衝液100μｌ中でDNAサンプルを増幅した。ス
テップ−ライクルプログラムを用いて95℃にて15秒間加
熱（変性）、55℃にて15秒間冷却（アニール）及び72℃
にて30秒間インキュベート（延長）にセットされたPECI
から入手可能なプログラム可能なヒートブロックDNA Th
ermal Cycler上でサイクル反応を行った。30サイクルの
後、サンプルをさらに５分間で72℃にてインキュベート
した。

各増幅生成物（18μｌ）を１μｌのTE中で95℃にて５
分間加熱することにより変性し、そして次に氷上で停止
した。6.25×SSPE,6.25×Denhardt及び0.625％SDSの溶
液（4ml）を1mlの各変性PCR生成物と混合し、フィルタ
ーの１枚と55℃にて15分間ハイブリダイズせしめ、２×
SSPE,0.1％SDS（３×100ml）により約25℃にて２分間洗
浄し、そして次に２×SSPE,0.1％SDS（１×100ml）によ
り55℃にて５分間洗浄した。

次に、膜を２×SSPE,0.1％（v/v）Triton X−100（10
0ml）中で約25℃にて３分間平衡化することによりSDSを
除去した。次に、すべてのフィルターを同じ緩衝液中で
西洋ワサビ・パーオキシダーゼ（HRP）でラベルされた1
5−merのRS111（５′−GCAGGTTGGTATCAA）とハイブリダ
イズさせた。これはPC03/KM38増幅生成物に対して特異
的であり、PCT公開WO89/02931及び89/02932に開示され
ている方法により調製されたものである。この開示を引
用により本明細書に組み入れる。

これらの方法は、一端にホスホラミダイト成分を有し
そして他端に保護されたスルヒドリル成分を有する親水
性ポリマー鎖（例えば、ポリオキシエチレン）を含んで
成る線状連結分子を用いて核酸プローブを誘導体化する
ことを本質上含む。ホスホラミダイト成分は当業界にお
いて良く知られている反応（例えば、Beaucageら、198
1,Tetrahedron Lett., 22:1859−1962）により核酸プロ
ーブにカップリングし、他方脱保護されたスルヒドリル
基は蛋白質、例えばHRPとジスルフィド結合又は他の共
有結合を形成することができる。HRPはＮ−マレイミド
−６−アミノカプロイル基を介して連結分子に接合され
る。ジメチルホルムアミド中１当量のジシクロヘキシル
カルボジイミドの存在下でＮ−マレイミド−６−アミノ
カプロン酸を４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスル
ホン酸ナトリウムによりエステル化することによりラベ
ルが調製される。精製の後、生成物をHRP含有リン酸緩
衝液に、HRP対エステルの重量比8:1において加える。オ
リゴヌクレオチドプローブはDNA合成機中で合成し、ホ
スホラミダイト合成条件を用いて構造：（C₆H₅）₃CS−
（CH₂CH₂O）₄−Ｐ（CH₂CH₂CN）〔Ｎ（ｉ−Pr）₂〕を有
する連結分子を結合させる。トリチル基を除去し、そし
てHRP誘導体及びプローブ誘導体を一緒に混合し、そし
て反応させてラベルされたプローブを形成せしめる。ビ
オチンによりラベルされたプローブを類似の方法で調製
することができる。

膜を、５×SSPE,5×Denhardt及び0.5％Triton X−100
を含有する溶液（8ml）中で4pmolのRS111と共にインキ
ュベートする。インキュベーションに続き、膜を２×SS
PE,0.1％Triton X−100（３×100ml）により約25℃にて
２分間洗浄する。

第３図に示すように、この反応に続きTMB/H₂O₂により
発色せしめる（Sheldonら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA，83:9085−9089）。膜を100mlの発色緩衝液Ｂ〔CDB
−B:327mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH₂PO₄,8.0mM Na₂HPO
₄（pH7.5）,5％（v/v）Triton X−100,1M尿素、及び１
％硫酸デキストラン〕中に浸漬し、次に２×100mlのCDB
−Ｃ〔100mMのクエン酸ナトリウム、pH5.0〕により室温
にて２分間洗浄する。CDB−Ｃ溶液を100mlのCDB−Ｄ〔1
00mMのクエン酸ナトリウム（pH5.0）,0.1mg/mlの3,3′,
5,5′−テトラメチルベンジジン〕と置換し、50μｌの
３％H₂O₂を加え、そして発色を30分間許容することによ
り発色を行う。増幅されたDNAサンプルのβ−グロビン
遺伝子型はフィルターから容易にわかり、そして0.5pmo
lのスポットからでさえ良好なシグナル強度が得られ
た。

実施例3. 鎌形赤血球貧血の直接アッセイ第二セットのDNA（前記実施例２に記載されている）
をPC03及びBW19を用いて増幅した。BW19は５′CAACTTCA
TCCACGTTCACCを有し、そして５′−末端においてビオチ
ンの分子に結合している。これらの増幅生成物のそれぞ
れを実施例２に記載したようにして変性し、4mlのハイ
ブリダイゼーション緩衝液（6.25×SSPE,6.25×Denhard
t及び0.625％SDS）に加え、そして膜に結合したプロー
ブ（前記実施例２からの残りの４枚のフィルター）と共
に55℃にて15分間インキュベートした。次に、膜を２×
SSPE,0.1％SDS（３×100ml）にて３分間室温にて洗浄
し、そして２×SSPE,0.1％SDS（１×100ml）にて５分間
55℃にて洗浄した。

膜を一緒にプールし、そして100mlのCDB−Ａ中で25℃
にて５分間平衡化した〔CDB−A:237mM NaCl,2.7mM KCl,
1.5mM KH₂PO₄,8.0mM Na₂HPO₄（pH7.3）及び５％Triton
X−100〕。次に、膜を10mlのCDB−Ａ及びSee−Quence
（商標）SA−HRP接合体（Cetus Corp.Emeryville,CA）
を0.3μg/mlで入れた熱シールバッグ中に入れ、そして
約25℃にて10分間おだやかに振とうした。CDB−Ａ（３
×100ml,25℃にて３分間）、CDB−Ｂ（１×100ml,25℃
にて５分間）及びCDB−Ｃ（２×100ml,25℃にて３分
間）により洗浄することにより過剰の接合体を除去し
た。次に、膜をCDB−Ｄ（100ml）中で室温にて５分間平
衡化し、次に50μｌの３％H₂O₂を加えた。おだやかに振
とうしながら30分間発色させ、次に脱イオン水で10分間
洗浄した。発色後の４枚のフィルターを第４図に示す。
この方法により検出されたシグナルの強度及び特異性は
サンドイッチハイブリダイゼーションにより得られたそ
れと有利に匹敵する。GM2064における弱いシグナルはそ
のDNAサンプル中のβ−グロビン汚染によるものであ
る。

実施例4. HLA DQα遺伝子型決定 DQα試験はPCRに基くオリゴヌクレオチドダイプ分け
系に由来し、これはDQα遺伝子座における多形性変異体
を４つの主要タイプDQA1,DQA2,DQA3及びDQA4、３つのSQ
A4サブタイプDQA4.4,DQA4.2及びDQA4.3、並びにDQA1サ
ブタイプDQA1.1,DQA1.2及びDQA1.3に分ける（Higuchi
ら、1988,Nature,332:543−546、及びSailiら、1986,Na
ture,324:163−166を参照のこと）。

主要タイプに対して特異的な４種のオリゴヌクレオチ
ド、サブタイプを特徴付ける４種のオリゴヌクレオチド
及びすべての対立遺伝子DQα配列にハイブリダイズする
対照オリゴヌクレオチド400ntのポリ−dTテイルを付与
し、12の二連ナイロンフィルターにスポットした。各ス
ポットに２〜10pmolのプローブを置いた。

しかしながら、スポットされるプローブの量につい
て、より少量のRH54及びGH64を用いるのが望ましい場合
がある。すなわち、スポット当り0.035pmolのRH54が好
ましい。これらのプローブは増幅についての陽性対照プ
ローブであり、そして記載される条件のもとですべての
DQα対立遺伝子にハイブリダイズする。膜上の陽性対照
プローブの量を減らすことにより、陽性対照プローブを
膜上の最低感度のプローブとすることができる。こうし
て、不十分に増幅されたDQα DNAが膜に与えられれば、
陽性対照プローブは反応しないか又は非常に弱くのみ反
応するので、問題を認識することができる。他方、不十
分なサンプルDNAが膜に適用された場合、幾つかのプロ
ーブは他のものより低い効率でハイブリダイズするの
で、ヘテロ接合型をホム接合型と読み違える場合があ
る。

スポットした後、膜を40mJ/cm²で照射する。得られる
固体化されたプローブのハイブリダイズする領域の配列
を次に示す。

プローブのほとんどが１つのDQAタイプのみに特異的
であるが、２種類のDQA1サブタイププローブは幾つかの
DNAタイプと交叉ハイブリダイズする。GH89はDQA1.2,1.
3及び４タイプに共通な配列にハイブリダイズし、そし
てプローブGH76はDQA1.3以外のすべてのDQAタイプを検
出する。GH76プローブはDQA1.3/1.3ホモ接合体からDQA
1.2/1.3ヘテロ接合体を区別するために必要である。さ
らに、プローブの長さ及び鎖特異性は、それらのハイブ
リダイゼーション効率及び対立遺伝子の区別のためのス
トリジェンシー要求がおよそ同じであるように調製され
た。これら８種のプローブは21の可能性あるDQA二倍体
組合せのそれぞれについてユニークなハイブリダイゼー
ションパターンをもたらす。

DQα DNAタイプを定める配列変化は単一の242bp PCR
増幅生成物内に含まれ得る第二エクソンの比較的小さい
超可変領域内に位置する（Hornら、1988,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA，85:6012−6016を参照のこと）。これらのプ
ライマーを次に示す。

ビオチン化PCRプライマーを用いて、幾つかのゲノムD
NAサンプル、すなわち６種のホモ接合型細胞系及び６種
のヘテロ接合型個体からの前記の242bp DQα配列を増幅
した。

ビオチン化プライマーは次の様にして合成した。Cool
lら、1986,Tetrahedron Lett.,27:3991−3994、及びCon
nolly,1987,Nuc.Acids Res.，15:3131−3139に記載され
ている方法の変法によりプライマーの５′−末端に一級
アミノ基を導入した。要約すると、テトラエチレングリ
コールを、トリフェニルホスフィン及びジイソプロピル
アゾジカルボキシレートの存在下でフタリミドとの反応
によりモノ−フタリミド誘導体に転換した（Mitsunobu,
1981,Synthesis,1〜28頁を参照のこと）。Sinhaら、198
4,Nuc.Acids Res.，12:4539に記載されているようにし
てモノフタリミドを対応するβ−シアノエチルジイソプ
ロピルアミノホスホラミダイトに転換した。生ずるホス
ファリミドイミダイトを、自動DNA合成の最終サイクル
の間に標準的カップリング条件を用いてオリゴヌクレオ
チドの５′−末端に加えた。DNAの通常の脱保護（濃ア
ンモニア水により55℃にて５時間）の間にホスファリミ
ド基は一級アミンに転換され、これは次に適当なビオチ
ン活性エステルによりアシル化された。LC−NHS−ビオ
チン（Pierce）をその水溶性及び立体障害の欠失のため
に選択した。ビオチン化を粗製の脱保護されたオリゴヌ
クレオチドに対して行い、そして混合物をゲル濾過と逆
相HPLCとの組合せにより精製した（Levensonら、1989,P
CR Protocols and Aplications A Laboratory Manual,I
nnisら編、Academic Press,NY）により精製した。

増幅されたDNAの膜へのハイブリダイゼーション及び
発色の後、第５図に示すように、これらのサンプルのDQ
α遺伝子型は容易に明らかである。第５図において、各
固定化されたプローブの特異性をフィルターの頂部に示
し、そして各サンプルのDQA遺伝子型を対応するフィル
ターの右に示す。

本発明の固定化されたキットはHLA DQα遺伝子座にお
けるDNAタイプ分け方法を促進するのでタイプ分け用キ
ットは商業的に重要である。これらのキットは種々の形
をとることができるが、このキットの好ましい態様を次
に詳細に記載する。この記載の後に、このキットを用い
ての単純化されたタイプ分け法を記載する。

好ましいキットは、あらかじめ分割され「無菌化され
た」（下記参照のこと）DQα PCR増幅混合物の１又は複
数のバイアルを含んで成り、これは典型的には濃縮され
た（２×が好ましい）形でありそして50μｌに分割され
ている。各50μｌのアリコートは５μmol KCl,1μmol T
ris−HCl（pH＝8.3）,250nmol Mgcl₂,15pmolのビオチン
化RS134,15pmolのビチオン化RS134,18.75nmolづつのdGT
P,dATP,dTTP及びdCTP、並びに2.5ユニット〜50ユニット
の組換Taqポリメラーゼ（PECI）を含有するであろう。d
TNPはストック溶液（pH＝７）から調製されるであろ
う。下記するごとく、殺菌法も非常に低レベルの不活性
化されたDNAse及びNaClを導入する。

上に言及した「無菌化された」試薬は、サンプルに由
来しない核酸配列による試薬の汚染を回避する必要性に
関する。PCRは強力な増殖法であるから汚染分子が誤着
を導く場合がある。この汚染問題を回避するため、本発
明は新規な殺菌法を提供する。この方法は、PCR反応混
合物のバッチから低レベルのDNA汚染を除去するためDNA
se、好ましくは膵臓DNAseを用いる。DNAプライマーはこ
の酵素に対して感受性であるから、DNAseが熱変性にり
不活性化されるまでプライマーはバッチから除去され
る。しかしながら、RNAプライマーがPCR混合物中に用い
られる場合、プライマーは殺菌中に存在することができ
る。さらに、DNAseに対して耐性を有するオリゴヌクレ
オチドを作るために、誘導体化されたヌクレオチドを用
いることができ、例えば、DNAseに対して耐性のオリゴ
ヌクレオチドを調製するためにホスホロチオエートのご
ときチオ置換オリゴヌクレオチドを用いることができる
（Sitzer及びEckstein,1988,Nuc.Acids Res.，16:11,69
1を参照のこと）。同等の殺菌方法が増幅標的中に存在
する配列を開裂せしめる制限酵素を使用し、なんらかの
汚染標的が存在すれば制限酵素が汚染物を開裂させそれ
を増幅のために利用できなくすることを当業者は認識す
る。

しかしながら好ましい殺菌法においては、2.5mlの10
×Taq緩衝液〔100mM Tris−HCl（pH＝8.3）,500mM KC
l、及び25mM MgCl₂〕をオートクレーブ殺菌し、そして2
5mMの各dNTPを含有する溶液0.19ml,5U/μｌ濃度のTaq D
NAポリメラーゼ0.13ml、及び8.75mlのガラス蒸留水に加
える。これらの試薬の混合を50mlポリプロピレンチュー
ブ中で便利に行うことができる。混合物を調製した後、
650UのDNAseI（Cooper Biomedicals;150mM NaCl中2500U
/ml、凍結保存）を加え、そして得られる溶液を37℃に
て15分間インキュベートする。混合物を93℃にて10分間
インキュベートすることによりDNAseを不活性化する。
次に、10μＭの各プライマー0.38mlを無菌化された試薬
に加え、次にこれを好ましくは「使いすて」ピペッター
を用いてそして層流フードの保護された境界に分ける。

キットは任意に上記のPCR試薬を含むことができる
が、しかし本発明の固定化されたプローブを含まなけれ
ばならず、これは前記のようにブロッティング及び自動
化ピペッティング装置により調製することができる。固
体支持体は絹紗スクリーン捺染法により印を付けること
ができる。キットはまた、250nmol/ml SAに相当する20
μg/ml HRPの濃度でSA−HRPを含むことができる。SA−H
RPは、10mM ACES,2M NaCl（pH＝6.5）から成る緩衝液に
入れて提供される。キットはさらに発色物質、例えばロ
イコ色素〔Sure−Cell（商標）診断キットとしてKodak
により市販されている〕又はTMBの濃溶液（５×〜20
×）を含有することができる。

キットはまた、容易に従うことができる指示書が含ま
れておれば一層好結果をもたらすであろう。本明細書の
検出方法の好ましい態様のための典型的な指示は次の通
りである。約２（ハイブリダイゼーションがシールされ
たバッグ中で行われる場合）〜３（ハイブリダイゼーシ
ョンがトラフ中で行われる場合）mlのハイブリダイゼー
ション溶液〔５×SSPE,0.5％SDS、及び幾つかの場合に
は１％硫酸デキストラン（M.W.500,000、但し他のM.W.
形も役立つ）色保持助剤〕を使用し先立って55℃に予備
加熱する。サンプルDNAをビオチン化プライマーを用い
てPCRにより増幅し、そしてビオチン化生成物を95℃に
て３〜５分間加熱してDNAを変性せしめる。変性はま
た、100μｌのPCR生成物に５μｌの5M NaOHを添加する
（最終NaOH濃度250mM）ことによっても達成され得る。
次に、約15mlのSA−HRPストック（20μg/ml,4℃にと貯
蔵、凍結してはならない）を２〜3mlのハイブリダイゼ
ーション溶液に加え、そして次に20μｌの熱いままの変
性PCR生成物をその混合物に加える。アルカリ変性が用
いられた場合、熱変性により達成されるのと同じレベル
の感度を保持するためにより多くのPCR生成物を使用す
る必要がある。典型的には、25〜50μｌのPCR生成物が2
0〜40μｌのSA−HRPストック溶液と共に使用される。ス
トレプトアビジン及びビオチンがおよそ等モルである場
合、すなわち、ハイブリダイゼーションのために使用さ
れるビオチン化PCR生成物6pmol当り約300ngのSA−HRP
（HRPで測定）が使用される場合、最良の結果が得られ
る。PCR生成物は常に最後にそして変性の直後に添加さ
れる。

ハイブリダイゼーションがシールされたバッグ中で行
われる場合、すべての気泡がバッグをシールする前に除
去されるべきである。ハイブリダイゼーションがトラフ
中で行われる場合、トラフ全体がガラスプレートにより
溶接に覆われるべきである。ハイブリダイゼーション
は、中〜高振とう速度、すなわち50〜200rpmにセットさ
れた振とう水浴中で55℃にて20分間行われる。洗浄溶液
（２×SSPE,0.1％SDS）はハイブリダイゼーション段階
の間55℃に予備加熱しておく。ハイブリダイゼーション
の後すべてのフィルターを、200〜300mlの予備加熱した
洗浄溶液を含むボールに入れ、そして55℃の振とう水浴
中で８〜10分間振とうする。

発色物資がTMBである場合、発色は通常次の様にして
振とう水浴中で次の様にして行われる。フィルターを20
0〜300mlの室温の洗浄液で５分間すすぎ、次に200〜300
mlの緩衝液Ｃ（100mMクエン酸ナトリウム,pH＝5.0）に
移して５分間すすぎ、そして2mlのTMB（100％のエタノ
ール中2mg/ml,4℃にて貯蔵）を含有する40mlの緩衝液Ｃ
中で５分間インキュベートし、次に４μｌの30％過酸化
水素を含有する新鮮な色素溶液（40mlの緩衝液Ｃ及び2m
lのTMBから成る）に移し、そして５〜15分間発色せしめ
る。フィルターを水で２回すすぐことにより発色を停止
させる。フィルターは光から保護すれば乾燥しそして貯
蔵することができる。タイプ分けが弱い（わずかなドッ
ト）場合、ハイブリダイゼーション段階の間に50μｌの
PCR生成物及び40μｌのSA−HRPを用いて前記方法を反復
する。TMBの代りにロイコ色素が使用される場合、緩衝
液Ｃによるすすぎに代えて200〜300mlの１×PBS中での
すすぎを行い、次にフィルターを色素と過酸化水素との
混合物〔Kodak,Sure−Cell（商標）キットと同じ配合〕
25mlに入れる。発色時間は５〜10分間であり、フィルタ
ーをPBS中で２回洗浄することにより発色を停止する。

実施例5. β−サラセミア変異の検出 β−サラセミアを生じさせ得るβ−グロビン遺伝子の
54を超える特徴付けられた変異が存在するが、この疾患
が流行している各人種群は限られた数の共通の変異を有
する（Kazazianら、1984,Nature 310:152−154;Kazazia
nら、1984,EMBOJ.，3:593−596;及びZhangら、1988,Hu
m.Genet.，78:37−40を参照のこと）。地中海人種群に
おいて、８種の変異がβ−サラセミア対立遺伝子の90％
以上を担当している。

これら８種類の変異の各々及びこれらの対応する正常
配列に対して特異的なプローブを合成した。プローブに
ターミナルトランスフェラーゼにより400ntのポリ−dT
テイルを与え、そして膜に適用した。種々の量の各プロ
ーブを12の二連ナイロンフィルターに適用し、40mJ/cm²
で照射し、ゲノムDNAサンプル中の増幅されたβ−グロ
ビン配列にハイブリダイズせしめ、そして発色せしめ
た。この結果を第６図に示す。この図において、各固定
化されたプローブ対により検出されるβ−サラセミア遺
伝子座をフィルターの頂部に記載する。各フィルターに
ついて、上列は正常配列に対して特異的なプローブを含
み、そして下列は変異体配列に対して特異的なプローブ
を示す。各サンプルのβ−グロビン遺伝子型は対応する
フィルターの右に示されている。各プローブの名称、膜
に適用された量（カッコ内にpmolで示す）、特異性及び
配列を下に記載する。

β−サラセミア変異はβ−グロビン遺伝子にわたって
分布しているので、単一1780bp増幅生成物の全体遺伝子
を増幅するビオチン化PCRプライマーを用いた。増幅に
用いたプライマーは次の通りである。

この増幅生成物は既知のすべてのβ−サラセミア変異
の位置を含む。ハイブリダイゼーション及び発色の後、
第６図に示すように、ハイブリダイゼーションのパター
ンに注目することによりβ−グロビン遺伝子型を決定す
ることができる。

DQαタイプ分け系とは異り、各変異を分析して、変異
／変異ホモ接合体から正常／変異ヘテロ接合体を区別す
るために２種類のプローブ…一方は正常配列に対して特
異的であり、そして他方は変異配列に対して特異的であ
る…が必要である。この分析における複雑な要素が、比
較的長いβ−グロビン増幅生成物の種々の部位におけ
る、プローブハイブリダイゼーションを阻害する見かけ
上の二次構造により起こる。この二次構造を最小にする
ために必要な比較的高いストリンジェンシーは、増幅さ
れたβ−グロビン断片を捕捉するためにより長い（19nt
のハイブリダイズする領域）プローブの使用を要求す
る。この拘束が異るハイブリダイゼーション効率を補償
するためにプローブの長さを変えることを許容しないで
あろうから、シグナル強度の均衡は膜に適用される各オ
リゴヌクレオチドの量を調製することにより行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】反応性基を有する固体支持体に固定化され
た少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブを含ん
で成る測定試薬であって、該プローブは検出されるべき
特定のヌクレオチド配列に相補的な約10〜50ヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列により構成されるハイブリダイズ
する領域及び検出されるべき前記特定のヌクレオチド配
列にハイブリダイズすることができないスペーサーアー
ムを含んで成り、該スペーサーアームは一端において前
記固体支持体に共有結合しておりそして他端において前
記ハイブリダイズする領域に結合しており、ここで、各
ハイブリダイズする領域は、約10〜50ヌクレオチドの前
記ヌクレオチド配列より長い前記スペーサーアームを介
して固定化され、そして前記ハイブリダイズする領域は
前記固体支持体から離れて存在することができる、こと
を特徴とする測定試薬。
【請求項２】前記スペーサーアームがポリヌクレオチド
テイルであり、前記反応性基が一級又は二級アミン基で
あり、そして前記ポリヌクレオチドテイルと前記固体支
持体との間の結合が紫外線照射により形成される、請求
項１に記載の測定試薬。
【請求項３】前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレ
オチドである請求項１又は２に記載の測定試薬。
【請求項４】前記テイルが200〜800ヌクレオチドを含有
する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項５】前記支持体がナイロンを含んで成る、請求
項１〜４のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項６】前記テイルが少なくとも150のピリミジン
ヌクレオチドを含んで成る、請求項１〜５のいずれか１
項に記載の測定試薬。
【請求項７】前記ピリミジンヌクレオチドがチミジンヌ
クレオチドである、請求項６に記載の測定試薬。
【請求項８】前記ハイブリダイズする領域が17〜23ヌク
レオチドの長さのヌクレオチドの配列である、請求項１
〜７のいずれか１項に記載の測定試薬。
【請求項９】１個の固体支持体上に固定化された複数の
プローブの１つのセットを含んで成り、該セットの各構
成員は該セットの他のすべての構成員と異るハイブリダ
イズする領域を有し、各構成員は該セットの他のすべて
のプローブと離れた別の位置において該固体支持体に固
定化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の
測定試薬。
【請求項１０】プローブの前記セットの各プローブがオ
リゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項９に記載
の測定試薬。
【請求項１１】前記セットの１つの構成員プローブが陽
性対照として役立つ、請求項９又は10に記載の測定試
薬。
【請求項１２】前記セットの前記構成員プローブが微生
物の核酸配列に対して、又は遺伝子座の異変対立遺伝子
に対して相補的である、請求項９〜11のいずれか１項に
記載の測定試薬。
【請求項１３】前記遺伝子剤がHLA遺伝子座である、請
求項12に記載の測定試薬。
【請求項１４】前記HLA遺伝子座がDQαである、請求項1
3に記載の測定試薬。
【請求項１５】請求項１〜14のいずれか１項に記載の測
定試薬の製造方法であって、（ａ）前記プローブを反応性基としてアミン基を含んで
成る固体支持体に接触せしめ；そして（ｂ）段階（ａ）において調製された支持体に紫外線を
照射する；ことを含んで成る方法。
【請求項１６】サンプル中の核酸配列の存在を検出する
方法であって、（ａ）該サンプルを相補的核酸配列のハイブリダイゼー
ションを許容する条件下で請求項１〜14のいずれか１項
に記載の測定試薬と接触せしめ；そして（ｂ）ハイブリダイゼーションが起ったか否かを決定す
る；ことを含んで成る方法。
【請求項１７】請求項１〜14のいずれか１項に記載の測
定試薬を含んで成るキット。