JP2896520B2 - Purification of fibroblast growth factor protein - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、線維芽細胞成長因子（Fibroblast growth
factor,以下FGFと略称することもある。）蛋白質の精製
法に関する。The present invention relates to a fibroblast growth factor (Fibroblast growth factor).
factor, hereinafter sometimes abbreviated as FGF. ) The present invention relates to a method for purifying a protein.

従来の技術 FGFは、当初BALB/c3T3細胞などの線維芽細胞に対して
強い増殖促進作用を示す因子として分離された［ゴスポ
ダロヴィッツ，ネイチャー（Nature）:249巻,123頁（19
74年）］。現在では、FGFが、中胚葉由来のほとんどす
べての細胞に対して増殖促進作用を有することが知られ
ている。FGFは、その等電点に基づいて、塩基性FGF（以
下、bFGFと略称する。）および酸性FGF（以下、aFGFと
略称する。）の２つに大別される。これらのFGFは、血
管内皮細胞に対して強い増殖促進作用やプラスミノゲン
アクチベーター誘導作用を有するため、血管新生促進
剤，創傷治療薬，抗血栓薬，抗動脈硬化剤などの予防治
療薬としての用途が期待されている。2. Description of the Related Art FGF was initially isolated as a factor having a strong growth promoting effect on fibroblasts such as BALB / c3T3 cells [Gospodarovitz, Nature: 249, 123 (19)
74)]. At present, it is known that FGF has a growth promoting effect on almost all cells derived from mesoderm. FGF is roughly classified into two, based on its isoelectric point, basic FGF (hereinafter abbreviated as bFGF) and acidic FGF (abbreviated as aFGF). Since these FGFs have a strong growth promoting action on vascular endothelial cells and a plasminogen activator-inducing action, they are used as prophylactic and therapeutic agents such as angiogenesis promoters, wound remedies, antithrombotics, and anti-atherosclerotic agents Is expected.

従来から、FGFは動物由来の臓器、たとえばウシ脳下
垂体、から単一にまで精製されていたが、その供給量に
は限度があり、また異種動物由来であるために抗原性が
懸念されるなどの問題点を有していた。また、種々の動
物細胞株の培養上清からも得られているが、その供給量
には限度があった。最近、組換えDNA技術を用いて、ク
ローン化されたヒトFGF遺伝子を微生物や動物細胞で発
現させることにより、FGFを大量に生産する方法が開発
された（フェブス・レターズ（FEBS Letters），第213
巻,189−194頁（1987年）；ヨーロッパ特許出願公開
（以下、EP公開と略称することもある。）第237,966号
公報参照）。Conventionally, FGF has been purified from an animal-derived organ, such as bovine pituitary gland, to a single substance, but its supply is limited, and antigenicity is a concern because it is derived from a different animal. There was a problem such as. It has also been obtained from culture supernatants of various animal cell lines, but its supply was limited. Recently, a method has been developed to produce FGF in large quantities by expressing the cloned human FGF gene in microorganisms and animal cells using recombinant DNA technology (FEBS Letters, 213).
Vol., Pages 189-194 (1987); European Patent Application Publication (hereinafter sometimes abbreviated as EP Publication), No. 237,966).

FGFの精製取得方法としては、ヘパリンアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーが用いられている（サイエ
ンス，第223巻,1296−1299頁（1984年）；ザ・ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第261巻,19
24−1928頁（1986年））。この方法により、ウシおよび
ヒト脳，ウシ脳下垂体，ウシ網膜，ウシ，ヒトおよびニ
ワトリ軟骨，ラットコンドロサルコーマ培養上清，ヒト
メラノーマ培養上清，ヒトヘパトーマ培養上清などを出
発材料としてFGFが精製されている（ザ・ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第261巻,1924−
1928頁（1986年））。Heparin affinity column chromatography is used as a method for purifying and obtaining FGF (Science, Vol. 223, pp. 129-1299 (1984); The Journal of Biological Chemistry, Vol. 261, 19).
24-1928 (1986)). By this method, FGF is purified from bovine and human brain, bovine pituitary, bovine retina, bovine, human and chicken cartilage, rat chondrosarcoma culture supernatant, human melanoma culture supernatant, human hepatoma culture supernatant, etc. (The Journal
Of Biological Chemistry, Vol. 261, 1924-
1928 (1986)).

一方、組換えDNA技術を用いて作られるFGFの精製にも
ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーが使
われている（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ，第146頁,470−4
77頁（1987年））。On the other hand, heparin affinity column chromatography is also used for purifying FGF produced using recombinant DNA technology (Biochemical and Biophysical Research Communications, pp. 146, 470-4).
77 (1987)).

本発明が解決しようとする課題 ところが、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーに使用される担体、たとえば架橋アガロースと
ヘパリンとの縮合物には、（１）．担体（架橋アガロー
ス）からヘパリンが遊離しやすい、（２）．担体の劣化
が大きく、繰り返しの使用に耐えない、等の欠点がある
ので、工業的大規模での精製には不都合である。Problems to be Solved by the Invention However, a carrier used for heparin affinity column chromatography, for example, a condensate of cross-linked agarose and heparin includes (1). Heparin is easily released from the carrier (crosslinked agarose), (2). It has disadvantages such as large deterioration of the carrier and inability to withstand repeated use, which is inconvenient for industrial large-scale purification.

課題を解決するための手段 本発明者らは、以上の事情に鑑み鋭意研究を進めた結
果、架橋ポリサッカライド硫酸エステルが本目的すなわ
ちFGFの工業的規模での精製のためにきわめて優れた担
体であることを発見し、これに基づいてさらに研究した
結果、本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in view of the above circumstances, and as a result, the crosslinked polysaccharide sulfate is an extremely excellent carrier for this purpose, that is, for purification of FGF on an industrial scale. After discovering that there was some further research based on this, the present invention was completed.

本発明は、線維芽細胞成長因子（FGF）蛋白質含有物
を架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いて精製する
ことを特徴とするFGF蛋白質の精製法である。The present invention is a method for purifying a fibroblast growth factor (FGF) protein, which comprises purifying an FGF protein-containing substance using a crosslinked polysaccharide sulfate.

本発明で用いられるFGF蛋白質としては、塩基性のも
の（以下、bFGFと略称することもある。）でもよく、酸
性のもの（以下、aFGFと略称することもある。）でもよ
い。特にbFGFが好ましい。The FGF protein used in the present invention may be basic (hereinafter sometimes abbreviated as bFGF) or acidic (hereinafter sometimes abbreviated as aFGF). Particularly, bFGF is preferable.

本発明においてFGF蛋白質としては、FGF活性を有する
ポリペプチドもしくは蛋白質が挙げられる。In the present invention, examples of the FGF protein include polypeptides and proteins having FGF activity.

本発明のFGF蛋白質は、哺乳動物由来のものが挙げら
れる。該哺乳動物としては、ヒト，サル，ブタ，ウシ，
ヒツジ、ウマなどが挙げられる。The FGF proteins of the present invention include those derived from mammals. Such mammals include humans, monkeys, pigs, cattle,
Sheep, horses and the like.

該FGF蛋白質としては、脳や下垂体などの既にその存
在が明らかにされている各種臓器から抽出されるものが
挙げられる。Examples of the FGF protein include those extracted from various organs, such as the brain and the pituitary gland, whose presence is already known.

また、該FGF蛋白質としては、組換えDNA技術により得
られるFGFが挙げられる（PCT国際公開No.WO/87/01728号
公報；フェブス・レターズ，第213巻,189−194頁（1987
年）；ヨーロッパ特許出願公開第237,966号公報）。Examples of the FGF protein include FGF obtained by recombinant DNA technology (PCT International Publication No. WO / 87/01728; Feves Letters, Vol. 213, pp. 189-194 (1987).
Year); European Patent Application Publication No. 237,966).

本発明で用いられるFGF蛋白質としては、たとえばヨ
ーロッパ特許出願公開第281,822号公報，バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Biochemical and Biophysical Research C
ommunication）第151巻第701〜708頁（1988年），ヨー
ロッパ特許出願公開第326,907号公報に記載のムテイン
が挙げられる。Examples of the FGF protein used in the present invention include, for example, European Patent Application Publication No. 281,822, Biochemical and Biophysical Research Communications.
muteins described in Vol. 151, pp. 701-708 (1988), and EP-A-326,907.

たとえば、本発明におけるFGFムテインとしては、本
来、元のペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異
したものであり、したがって該変異としては、アミノ酸
の付加，構成アミノ酸の欠損，他のアミノ酸への置換が
挙げられる。For example, the FGF mutein in the present invention originally has a mutation in the amino acid sequence of the original peptide or protein. Therefore, the mutation includes addition of an amino acid, deletion of a constituent amino acid, and substitution with another amino acid. Can be

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ
酸が付加しているものが挙げられる。Examples of the addition of the amino acid include those in which at least one amino acid is added.

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のFG
F構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。The deletion of the constituent amino acids includes at least one FG
Those in which the F-constituent amino acid is deleted can be mentioned.

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個の
FGF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。The substitution with the other amino acid includes at least one
One in which the amino acid constituting FGF is substituted with another amino acid is exemplified.

FGFに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
インにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものであ
る。The at least one amino acid in the mutein in which at least one amino acid has been added to FGF does not include methionine caused by the initiation codon used in expressing the peptide and a signal peptide.

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１
個であるが、FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
さらに好ましくは、FGFと相同性（ホモロジー）が認め
られており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配列
の一部あるいはすべてが挙げられる。The number of added amino acids should be at least 1
The number may be any number as long as the characteristics of FGF are not lost.
More preferably, a part or all of the amino acid sequence of a protein which has homology (homology) with FGF and shows the same activity can be mentioned.

FGFの少なくとも１個のFGF構成アミノ酸が欠損してい
るムテインにおける欠損している構成アミノ酸の数とし
ては、FGFの有する特徴を失わない限り何個でもよい。The number of missing constituent amino acids in a mutein in which at least one FGF constituent amino acid of FGF is deleted may be any number as long as the characteristics of FGF are not lost.

FGFの少なくとも１個のFGF構成アミノ酸が別のアミノ
酸で置換されているムテインにおける置換される前の少
なくとも１個のFGF構成アミノ酸の数としては、FGFの特
徴を失わない限り何個でもよい。The number of at least one FGF-constituting amino acid before substitution in a mutein in which at least one FGF-constituting amino acid of FGF is substituted by another amino acid may be any number as long as the characteristics of FGF are not lost.

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイ
ン，シスチンなどが挙げられるが、システインが特に好
ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシステイン
以外のものとしては、アスパラギン酸，アルギニン，グ
リシン，バリンなどが挙げられる。Examples of the constituent amino acids before substitution include cysteine and cystine, and cysteine is particularly preferred. Examples of constituent amino acids other than cysteine before substitution include aspartic acid, arginine, glycine, valine and the like.

置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合
には、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とてば、グリシン，バリン，アラニン，ロイシン，イソ
ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，
トリプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなど
が挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is cysteine, the substituted amino acid is preferably, for example, a neutral amino acid. Specific examples of the neutral amino acid include, for example, glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, histidine,
Tryptophan, serine, threonine, methionine and the like. Particularly, serine and threonine are preferred.

置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもの
である場合には、置換された別のアミノ酸としては、た
とえば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点
で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつもの
を選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてア
スパラギン，スレオニン，バリン，フェニルアラニン，
アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，ア
ルギニンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is other than cysteine, another substituted amino acid is, for example, an amino acid before substitution in terms of hydrophilicity, hydrophobicity or charge of the amino acid. Choose one with different properties. Specifically, when the amino acid before substitution is aspartic acid, the amino acids after substitution are asparagine, threonine, valine, phenylalanine,
Although arginine etc. are mentioned, especially asparagine and arginine are preferable.

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。When the amino acid before substitution is arginine, the amino acids after substitution are glutamine, threonine,
Leucine, phenylalanine and aspartic acid are exemplified, and glutamine is particularly preferred.

置換される前の構成アミノ酸がグルシンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，セリン，グルタミン酸，
アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好まし
い。When the constituent amino acid before substitution is glycine, the amino acid after substitution is threonine,
Leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid,
Arginine and the like can be mentioned, and threonine is particularly preferable.

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン，
アラニン，ロイシン，スシテイン，グルタミン，アルギ
ニン，アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニン
が好ましい。When the constituent amino acid before substitution is serine, the amino acid after substitution is methionine,
Alanine, leucine, succinine, glutamine, arginine, aspartic acid and the like can be mentioned, with methionine being particularly preferred.

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，ロイ
シン，プロリン，グリシン，リジン，アスパラギン酸な
どが挙げられ、特にセリンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is valine, examples of the amino acid after substitution include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred.

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラ
ギン酸，アルギニン，グリシン，セリン，バリンが好ま
しい。As the original constituent amino acids before substitution, aspartic acid, arginine, glycine, serine, and valine are preferable.

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン，
グルタミン，アルギニン，スレオニン，メチオニン，セ
リン，ロイシンが好ましい。Amino acids after substitution include asparagine,
Glutamine, arginine, threonine, methionine, serine, leucine are preferred.

置換されたムテインの最も好ましいものとしては、構
成アミノ酸であるシステインがセリンに置換されたもの
が挙げられる。The most preferred substituted muteins include those in which the constituent amino acid cysteine is replaced by serine.

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なっ
てもよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換さ
れるのが好ましい。In the above substitution, two or more substitutions may be performed simultaneously. In particular, it is preferred that two or three constituent amino acids are substituted.

該ムテインは、上記した付加，欠損，置換の２つまた
は３つが組み合わさったものでもよい。The mutein may be a combination of two or three of the addition, deletion, and substitution described above.

該ムテインとしては、少なくとも１個のヒト塩基性FG
F構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテイ
ンが好ましい。特にヒトbFGFの70位および88位のシステ
インがそれぞれセリンに置換されたrhbFGFムテインCS23
が好ましい。なお、上記ヒトbFGFのアミノ酸の位置は、
EP公開第281,822号公報の第１図のアミノ酸配列におい
てＮ末端のMetを第１番目として数えるものとする。The mutein includes at least one human basic FG
Muteins in which the F constituent amino acids have been replaced with another amino acid are preferred. In particular, rhbFGF mutein CS23 in which cysteines at positions 70 and 88 of human bFGF have been substituted with serine, respectively.
Is preferred. Incidentally, the amino acid position of the human bFGF,
In the amino acid sequence of FIG. 1 of EP Publication No. 281,822, the N-terminal Met is counted as the first.

該ムテインを製造するためには、特定部位指向性変異
誘発技術（Site−directed mutagenesis）が採用され
る。該技術は周知であり、アールエフ・レイサー（Lath
er,R.F.）及びジェイ・ピー・レコック（Lecoq,J.
P.），ジェネティック・エンジニアリング（Genetic En
gineering）、アカデミックプレス社（1983年）第31−5
0頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指示され
た変異誘発はエム・スミス（Smith,M.）及びエス・ギラ
ム（Gillam,S.）、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）３巻 １
−32頁に示されている。In order to produce the mutein, a site-directed mutagenesis technique is employed. The technology is well known and is available from
er, RF) and J. P. Lecoq (Lecoq, J.
P.), Genetic Engineering
gineering), Academic Press (1983) 31-5
Page 0. Oligonucleotide-directed mutagenesis is described in M. Smith and M. Gillam, S., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981), vol. 3, 1
-See page 32.

該ムテインをコードする構造遺伝子を製造するために
は、たとえば、 （ａ）FGFの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖DNAを突
然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形成させ
る（この１本鎖で代替えすべきシステイン用コドン、又
は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセンス・
トリプレットを包含する領域に対して上記プライマーは
相補的なものである。但し、当該コドンの他のアミノ酸
暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・トリプ
レットとの不一致はこの限りでない。）、 （ｂ）DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体（heteroduplex）を形成させ
る、及び （ｃ）この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。In order to produce the structural gene encoding the mutein, for example, (a) a single-stranded DNA consisting of a single strand of the FGF structural gene is hybridized with a mutant oligonucleotide primer (with this single-stranded DNA). A cysteine codon to be replaced or, if appropriate, an antisense
The primer is complementary to the region encompassing the triplet. However, this does not apply to a mismatch between the codon and another codon for amino acid encoding, or in some cases, an antisense triplet. And (b) extending the primer with a DNA polymerase,
Forming a mutated heteroduplex, and (c) replicating the mutated heterodimer.

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージDN
Aを単離し、プラスミドへ組み込む。Next, the phage DN carrying the mutated gene
A is isolated and integrated into a plasmid.

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形
質転換し、得られた形質転換体を培地に培養することに
より、ムテインを製造することができる。By transforming a suitable host with the thus obtained plasmid and culturing the obtained transformant in a medium, mutein can be produced.

本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルとしては、架橋セルロース硫酸エステル，架橋アガロ
ース硫酸エステルまたは架橋デキストラン硫酸エステル
が挙げられる。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention includes crosslinked cellulose sulfate, crosslinked agarose sulfate or crosslinked dextran sulfate.

上記セルロースとしては、グルコースがβー1,4−結
合をした多糖であり、分子量が約５万〜200万のものが
好ましい。その具体例としては、たとえば結晶セルロー
スアビセル（旭化成工業株式会社製），セルロファイン
（チッソ株式会社製）などが挙げられる。The cellulose is preferably a polysaccharide in which glucose has a β-1,4-linkage and has a molecular weight of about 50,000 to 2,000,000. Specific examples thereof include crystalline cellulose Avicel (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and Cellulofine (manufactured by Chisso Corporation).

上記アガロースとしては、寒天の主成分をなす多糖で
あり、［Ｄ−ガラクトシル−（β１→４）−3,6−アン
ヒドロ−Ｌ−ガラクトシル−（α１→３）］の繰り返し
構造をもつ。分子量約１万〜500万のものが好ましい。
その具体例としては、たとえばセファロース2B,4B,セフ
ィロース6B（ファルマシア社製（スエーデン））などが
挙げられる。The agarose is a polysaccharide which is a main component of agar, and has a repeating structure of [D-galactosyl- (β1 → 4) -3,6-anhydro-L-galactosyl- (α1 → 3)]. Those having a molecular weight of about 10,000 to 5,000,000 are preferred.
Specific examples thereof include Sepharose 2B, 4B and Sephirose 6B (Pharmacia (Sweden)).

上記デキストランとしては、たとえばシュークロース
からロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconosto
c mesenteroides）などの微生物の作用によって生成す
るα（１→６）結合を主体とするＤ−グルコース重合体
であり、平均分子量は、約1000〜4000万のものが好まし
い。Examples of the dextran include sucrose and Leuconostoc mesenteroides.
C-mesenteroides) are D-glucose polymers mainly composed of α (1 → 6) bonds generated by the action of microorganisms, and preferably have an average molecular weight of about 10 to 40 million.

本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルは、上記のデキストラン，アガロース，セルロースな
どのポリサッカライドを、自体公知の架橋剤、たとえば
エピクロルヒドリンや2,3−ジブロモプロパノールなど
の架橋剤を用いて自体公知の方法で架橋して得られる架
橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得られるもの
である。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention can be obtained by converting the above-mentioned polysaccharides such as dextran, agarose and cellulose with a known crosslinking agent such as epichlorohydrin or 2,3-dibromopropanol. It is obtained by subjecting a crosslinked polysaccharide obtained by crosslinking by a method to sulfate esterification.

架橋ポリサッカライドは、市販されており、たとえば
セファデックスＧ−10,G−15,G−25,G−50,G−100（架
橋デキストラン），セファロースCL−2B,CL−4B,CL−6B
（架橋アガロース）などの商品名でファルマシア社（ス
エーデン）から購入できる。また、セルロファイン（架
橋セルロース）の商品名でチッソ株式会社から購入でき
る。これらの架橋ポリサッカライドに自体公知の硫酸エ
ステル化剤、たとえばクロルスルホン酸や無水硫酸エス
テルなどを作用させて目的の架橋ポリサッカライド硫酸
エステルを合成することができる。架橋セルロース硫酸
エステルとしては、たとえば硫酸化セルロファイン（架
橋セルロース硫酸エステル）の商品名で生化学工業株式
会社から発売されている。Crosslinked polysaccharides are commercially available, such as Sephadex G-10, G-15, G-25, G-50, G-100 (crosslinked dextran), Sepharose CL-2B, CL-4B, CL-6B
(Cross-linked agarose) and can be purchased from Pharmacia (Sweden). It can be purchased from Chisso Corporation under the trade name of Cellulofine (crosslinked cellulose). The desired crosslinked polysaccharide sulfate can be synthesized by reacting these crosslinked polysaccharides with a known sulfuric esterifying agent such as chlorosulfonic acid or sulfuric anhydride. The crosslinked cellulose sulfate is marketed, for example, by Seikagaku Corporation under the trade name of sulfated cellulofine (crosslinked cellulose sulfate).

架橋デキストラン硫酸エステルとしては、たとえば硫
酸化セファデックスが挙げられる。Examples of the cross-linked dextran sulfate include sulfated Sephadex.

架橋アガロース硫酸エステルとしては、たとえば硫酸
化セファロースが挙げられる。Examples of the cross-linked agarose sulfate include sulfated sepharose.

本発明において用いられる架橋ポリサッカライド硫酸
エステルは、塩の形となっていてもよい。該塩として
は、たとえばナトリウム，カリウム，アンモニウム，ト
リメチルアンモニウムなどが挙げられる。特にナトリウ
ム塩が好ましい。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention may be in the form of a salt. Examples of the salt include sodium, potassium, ammonium, trimethylammonium and the like. Particularly, a sodium salt is preferable.

本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルは、水不溶性であり、水和状態でゲル状となったもの
を用いるのが好ましい。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention is preferably a water-insoluble, hydrated gelled material.

本発明において、架橋ポリサッカライド硫酸エステル
を使用してFGF蛋白質を精製取得する方法としては以下
に記載するアフイニティクロマトグラフィーに付す方法
が挙げられる。In the present invention, as a method for purifying and obtaining an FGF protein using a crosslinked polysaccharide sulfate, a method for affinity chromatography described below can be mentioned.

FGF蛋白質含有液としては、動物細胞から抽出する工
程により得られたFGF蛋白質含有液，組換えDNA技術によ
って得られたFGF蛋白質含有液のいずれでも良く、予め
自体公知の方法により部分精製したものであっても良
い。The FGF protein-containing solution may be either an FGF protein-containing solution obtained by the step of extracting from animal cells or an FGF protein-containing solution obtained by recombinant DNA technology, which is partially purified by a method known per se in advance. There may be.

FGF蛋白質含有液としては、水性媒体にFGF蛋白質を含
有せしめたものである。水性媒体としては、水，水を主
体としたものが挙げられ、FGF蛋白質の失活を招かない
ようにするため緩衝液，たとえばリン酸緩衝液，クエン
酸緩衝液，トリス−塩酸緩衝液などでpHを約３〜10に調
整したものが好ましい。The FGF protein-containing liquid is an aqueous medium containing the FGF protein. Examples of the aqueous medium include water and a water-based medium, and a buffer such as a phosphate buffer, a citrate buffer, and a Tris-hydrochloride buffer for preventing the inactivation of the FGF protein. It is preferable to adjust the pH to about 3 to 10.

次に、FGF蛋白質含有液のpHを約5.0から9.0の範囲に
修正し、その電導度を になるように必要に応じて蒸留水で希釈する。得られた
FGF蛋白質含有液と架橋ポリサッカライド硫酸エステル
ゲルとを接触させる。このためには、バッチ法あるいは
カラム法のいずれを用いても良いが、カラム法の方が操
作の簡便性からより適当である。カラム法の場合は、予
め架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルをカラムに充
てんしたあと、たとえば0.4MのNaClを含む50mMクエン酸
緩衝液（ph7.0）などの適当な緩衝液を用いてカラムを
十分に洗浄し平衡化する。使用するゲルの量は負荷する
FGF蛋白質含有液の種類によって異なるが、FGF蛋白質1m
gあたりおおよそ１〜50mlの範囲が望ましい。Next, the pH of the FGF protein-containing solution was adjusted to a range of about 5.0 to 9.0, and the conductivity was adjusted. If necessary, dilute with distilled water. Got
The solution containing the FGF protein is brought into contact with the crosslinked polysaccharide sulfate gel. For this purpose, either the batch method or the column method may be used, but the column method is more suitable because of the simplicity of the operation. In the case of the column method, a cross-linked polysaccharide sulfate gel is previously filled in the column, and then the column is sufficiently filled with an appropriate buffer such as a 50 mM citrate buffer (ph 7.0) containing 0.4 M NaCl. Wash and equilibrate. Load the amount of gel used
Although it depends on the type of FGF protein-containing solution, FGF protein 1m
A range of approximately 1 to 50 ml per g is desirable.

次いで上述のFGF蛋白質含有液をカラムに負荷する。
負荷速度はSV＝約0.1〜5.0の範囲内で選択できる。負荷
後、カラムを十分に洗浄し、常法に従って緩衝液のイオ
ン強度を高めてFGF蛋白質を溶出，回収する。イオン強
度を高めるためには、電導度を より好ましくは になるように、NaClなどの塩類を添加するか高濃度の緩
衝液を用いる。溶出の方法としてはバッチ法もしくは濃
度勾配溶出法のいずれでも良い。濃度勾配溶出法の場合
は、たとえばNaClを約０から2.0Mまで徐々に上昇させて
溶出、回収する。このようにして、きわめて高純度のFG
F蛋白質を収率よく取得することができる。Next, the above-mentioned FGF protein-containing solution is loaded on the column.
The load speed can be selected within a range of SV = about 0.1 to 5.0. After the loading, the column is sufficiently washed, and the FGF protein is eluted and recovered by increasing the ionic strength of the buffer according to a conventional method. To increase ionic strength, increase the conductivity. More preferably Add a salt such as NaCl or use a high concentration buffer. The elution method may be either a batch method or a concentration gradient elution method. In the case of the concentration gradient elution method, for example, NaCl is gradually eluted from about 0 to 2.0 M to elute and recover. In this way, extremely high-purity FG
F protein can be obtained with good yield.

本発明の方法によれば、パイロジェンを含まない純度
99％以上の精製FGF蛋白質を80〜100％の回収率で得るこ
とができる。また、本発明の担体は安価であり、劣化が
なく長期間の繰り返し使用に耐えるなどの利点を有して
おり、工業的規模でのFGF蛋白質の精製方法としてきわ
めて優れている。本発明により得られるFGF蛋白質はパ
イロジェンを含まずきわめて高純度であるので、そのま
ま、あるいは他の薬理学的に許容され得る担体、賦形
剤，希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤，錠剤，カ
プセル剤，溶剤，軟膏）としての製剤化を行ない、温血
動物（例、ヒト，ウシ，クマ，ブタ，イヌ，ネコ，ウサ
ギ，ラット，マウス）に対して非経口的または経口的に
安全に投与することができる。According to the method of the present invention, pyrogen-free purity
99% or more of purified FGF protein can be obtained with a recovery of 80 to 100%. Further, the carrier of the present invention has advantages such as being inexpensive, not deteriorated and enduring repeated use for a long period of time, and is extremely excellent as a method for purifying an FGF protein on an industrial scale. Since the FGF protein obtained by the present invention does not contain pyrogen and is extremely high in purity, it can be used as it is or in combination with other pharmacologically acceptable carriers, excipients, and diluents. , Capsules, solvents, ointments) and are parenterally or orally safe to warm-blooded animals (eg, humans, cows, bears, pigs, dogs, cats, rabbits, rats, mice) Can be administered.

該製剤としては、たとえば、注射剤，注射投与に用い
るための溶液，凍結品もしくは凍結乾燥品などの形態に
するのが好ましい。The preparation is preferably in the form of, for example, an injection, a solution to be used for injection administration, a frozen product or a lyophilized product.

医薬組成物としての製剤化にあたっては、公知の製剤
学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容され得る
添加剤，希釈剤，賦形剤などを用いる。In formulating a pharmaceutical composition, pharmaceutically acceptable additives, diluents, excipients, and the like are used as required according to a known pharmaceutical manufacturing method.

たとえば、注射用水溶液剤とする場合は、水性溶剤
（例、蒸留水），水溶性溶剤（例、生理的食塩水，リン
ゲル液），油性溶剤（例、ゴマ油，オリーブ油）等の溶
剤，または所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナト
リウム，酢酸ナトリウム），緩衝剤（例、クエン酸ナト
リウム，グリセリン），等張化剤（例、ブドウ糖，転化
糖），安定剤（例、ヒト血清アルブミン，ポリエチレン
グリコール），保存剤（例、ベンジルアルコール，フェ
ノール），無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム，塩酸
プロカイン）等の添加剤を用いて、常套手段により製造
される。For example, in the case of an aqueous solution for injection, a solvent such as an aqueous solvent (eg, distilled water), a water-soluble solvent (eg, physiological saline, Ringer's solution), an oily solvent (eg, sesame oil, olive oil), or as desired Solubilizing agents (eg, sodium salicylate, sodium acetate), buffers (eg, sodium citrate, glycerin), tonicity agents (eg, glucose, invert sugar), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol) It is manufactured by a conventional method using additives such as a preservative (eg, benzyl alcohol, phenol) and a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride).

また、たとえば固型状注射用製剤とするには、希釈剤
（例、蒸留水，生理的食塩水，ブドウ糖），賦形剤
（例、カルボキシメチルセルロース（CMC），アルギン
酸ナトリウム），保存剤（例、ベンジルアルコール，塩
化ベンザルコニウム，フェノール），無痛化剤（ブドウ
糖，グルコン酸カルシウム，塩酸プロカイン）等を混合
し、常套手段により、固型状注射用製剤に製造すること
ができる。For example, to prepare a solid injection preparation, a diluent (eg, distilled water, physiological saline, glucose), an excipient (eg, carboxymethyl cellulose (CMC), sodium alginate), a preservative (eg, Benzyl alcohol, benzalkonium chloride, phenol), soothing agents (glucose, calcium gluconate, procaine hydrochloride) and the like can be mixed to produce a solid injection preparation by conventional means.

さらに、製剤化にあたっては、ブドウ糖などの単糖類
や、アミノ酸，各種塩類，ヒト血清アルブミンなどを添
加しても良く、その他に等張化剤、pH調節剤，無痛化
剤，防腐剤などを加えて安定で有効なFGF蛋白質の製剤
を調製することができる。In addition, in formulating, monosaccharides such as glucose, amino acids, various salts, human serum albumin, etc. may be added. In addition, isotonicity agents, pH regulators, soothing agents, preservatives, etc. Thus, a stable and effective preparation of FGF protein can be prepared.

上記の方法により得られる精製FGF蛋白質は線維芽細
胞の増殖を促進させる作用等を有し、安定性が高く、毒
性は低いので、火傷，創傷，術後組織などの治癒促進
剤，あるいは血管新生作用による血栓症や動脈硬化症な
どの治療薬として用いることができる。The purified FGF protein obtained by the above method has an action of promoting the proliferation of fibroblasts, etc., and has high stability and low toxicity. Therefore, the agent for promoting healing of burns, wounds, postoperative tissues, etc., or angiogenesis. It can be used as a therapeutic agent for thrombosis or arteriosclerosis due to the action.

また，細胞培養を促進させるための試薬として用いる
ことができる。Further, it can be used as a reagent for promoting cell culture.

本発明の方法により得られる精製FGF蛋白質を上記し
た医薬として用いる場合には、たとえば上記した温血動
物に、投与ルート，症状などを考慮して、FGF蛋白質の
量として１日量約1ngないし100μg/kgの中から適当量を
選んで投与される。When the purified FGF protein obtained by the method of the present invention is used as the above-mentioned medicine, for example, the above-mentioned warm-blooded animal may be administered in an amount of about 1 ng to 100 μg / day in terms of the amount of FGF protein in consideration of the administration route, symptoms and the like. / kg is selected and administered.

また、本発明方法により得られる精製FGF蛋白質を細
胞培養を促進させるための試薬として用いる場合、FGF
蛋白質の量として培地１あたり約0.01〜10μｇ、さら
に好ましくは約0.1〜10μｇとなるように培地に加える
ことが好ましい。When the purified FGF protein obtained by the method of the present invention is used as a reagent for promoting cell culture, FGF
It is preferable to add the protein to the medium so that the amount of the protein is about 0.01 to 10 μg, more preferably about 0.1 to 10 μg per medium.

後述の参考例１で用いられた形質転換体は、財団法人
発酵研究所（IFO）および通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所（FRI）に寄託されている。それらの受
託番号および受託日を次の表１に示す。なお、FRIへの
寄託については、当初国内寄託がなされFERM P番号で示
される受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基
づく寄託に切換えられて、FERM BP番号で示される受託
番号が付され、同研究所（FRI）に保管されている。The transformant used in Reference Example 1 described below has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) and the Research Institute of Microorganisms and Technology (FRI), Ministry of International Trade and Industry. Table 1 below shows their accession numbers and accession dates. The deposit with the FRI is initially made in Japan and a deposit number indicated by the FERM P number is attached.The deposit is switched to a deposit based on the Budapest Treaty, and a deposit number indicated by the FERM BP number is attached. And stored at the Institute for Research and Development (FRI).

参考例１ 菌体抽出液の調製と部分精製rhbFGFムテインCS23標品
の調製： EP公開第281,822号公報の実施例７（１）において得
られた形質転換体エシエリヒア・コリ（Escherichia co
li）MM294/pTB762（IFO 14613,FERM BP−1645）を、１
％グルコース,0.4％カザミノ酸、８μg/mlテトラサイク
リンを含むM9培地で培養し、Klett値が約200の時点で３
−βインドリル−アクリル酸を25μg/mlになるように添
加し、さらに４時間培養した。培養後、菌体を集め、そ
の300gを2mMジチオスレイトール（DTT）,0.1mMフェニル
メチルスルホニルフルオライド（PMSF）,0.1mM（ｐ−ア
ミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライド（APMS
F）を含む25mMリン酸緩衝液（pH6.0）1.5lに懸濁し、５
℃でガラスビーズ（直径0.25〜0.5mm）を用いて破砕し
て菌体抽出液を得た。この抽出液を、14000r.p.m.（ベ
ックマン遠心機、JA−14ローター）で30分間遠心し、そ
の上清を1N−NaOHでpH8に修正して、25mMリンン酸緩衝
液（pH7.6）で平衡化したDEAE−トヨパールカラム（5cm
φ×27cm,530ml,東ソー株式会社）に通した。カラムか
らの素通り液および25mMリン酸緩衝液pH7.6でカラムを
洗浄した洗液とを合わせて集めた。この画分を1N−HCl
でpH6.1に修正し、生成した沈澱を14000r.p.m.（ベック
マン遠心機、JA−14ローター）で30分間遠心して除去し
た。この上清を、25mMリン酸緩衝液（pH6.0）で３倍希
釈後、25mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したCM−ト
ヨパールカラム（10cmφ×12cm,950ml,東ソー株式会
社）にかけた。カラムを25mMリン酸緩衝液（pH6.0）で
洗浄した後、1MのNaClを含む25mMリン酸緩衝液（pH6.
0）を用いてrhbFGFムテインCS23を含む粗画分を溶出
し、部分精製rhbFGFムテインCS23標品とした。 Reference Example 1 Preparation of cell extract and preparation of partially purified rhbFGF mutein CS23 preparation: The transformant Escherichia coli obtained in Example 7 (1) of EP Publication No. 281,822 was used.
li) MM294 / pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645)
% Glucose, 0.4% casamino acid, and 8 μg / ml tetracycline in an M9 medium.
-Β-Indolyl-acrylic acid was added to a concentration of 25 µg / ml, and the cells were further cultured for 4 hours. After the culture, the cells were collected, and 300 g of the cells were collected and 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.1 mM (p-amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride (APMS)
F) and suspended in 1.5 l of 25 mM phosphate buffer (pH 6.0).
C. and crushed using glass beads (diameter 0.25 to 0.5 mm) to obtain a cell extract. This extract is centrifuged at 14000 rpm (Beckman centrifuge, JA-14 rotor) for 30 minutes, the supernatant is adjusted to pH 8 with 1N-NaOH, and equilibrated with 25 mM phosphate buffer (pH 7.6). DEAE-Toyopearl column (5cm
φ × 27 cm, 530 ml, Tosoh Corporation). The flow-through from the column and the washings that washed the column with 25 mM phosphate buffer pH 7.6 were combined and collected. This fraction is 1N-HCl
Was adjusted to pH 6.1, and the resulting precipitate was removed by centrifugation at 14000 rpm (Beckman centrifuge, JA-14 rotor) for 30 minutes. This supernatant was diluted three-fold with a 25 mM phosphate buffer (pH 6.0), and then equilibrated with a 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) (10 cmφ × 12 cm, 950 ml, Tosoh Corporation). ). After washing the column with 25 mM phosphate buffer (pH 6.0), the column was washed with 25 mM phosphate buffer (pH 6.
Using 0), a crude fraction containing rhbFGF mutein CS23 was eluted to obtain a partially purified rhbFGF mutein CS23 standard.

実施例１ 参考例１で得られた部分精製rhbFGFムテインCS23標品
を含む溶液を蒸留水で、３倍希釈後、0.4MのNaClを含む
50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化した
硫酸化セルロファインカラム（2cmφ×25cm,80ml,生化
学工業株式会社）に負荷した。カラムを0.4MのNaClを含
む50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で洗浄後、
次のNaCl濃度直線勾配溶出を行なった。Example 1 A solution containing the partially purified rhbFGF mutein CS23 standard obtained in Reference Example 1 was diluted three-fold with distilled water, and then containing 0.4 M NaCl.
A sulfated Cellulofine column (2 cmφ × 25 cm, 80 ml, Seikagaku Corporation) equilibrated with 50 mM sodium citrate buffer (pH 7.0) was loaded. After washing the column with 50 mM sodium citrate buffer (pH 7.0) containing 0.4 M NaCl,
The following NaCl concentration linear gradient elution was performed.

緩衝液A:50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0） 緩衝液B:2.0M NaCl/50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.0） 溶出プログラム： ０分,20％B;10分,20％B;15分,30％B;90分,45％B;96
分,80％Ｂ 流 速:4.0ml/min 検出波長:280nm 溶出パターンを第１図に示す。第１図において、
（１）は試料のカラムへの負荷工程を、（２）はカラム
の洗浄工程を、（３）はrhbFGFムテンCS23のカラムから
の溶出工程をそれぞれ示す。Buffer A: 50 mM sodium citrate buffer (pH 7.0) Buffer B: 2.0 M NaCl / 50 mM sodium citrate buffer (pH
7.0) Elution program: 0 min, 20% B; 10 min, 20% B; 15 min, 30% B; 90 min, 45% B; 96
Min, 80% B Flow rate: 4.0 ml / min Detection wavelength: 280 nm The elution pattern is shown in FIG. In FIG.
(1) shows the loading step of the sample onto the column, (2) shows the washing step of the column, and (3) shows the elution step of rhbFGF muten CS23 from the column.

ピーク画分（溶出時間50〜60分，第１図参照）がrhbF
GFムテインCS23を含むことが分かったので、この画分を
分取した。ここで得られたrhbFGFムテインCS23はSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動的に単一の標品であり、
パイロジェンを含まず極めて高純度（純度99％）であっ
た。回収率は95％と算出された。The peak fraction (elution time 50-60 minutes, see Fig. 1) is rhbF
Since it was found to contain GF mutein CS23, this fraction was collected. The rhbFGF mutein CS23 obtained here is a single sample by SDS polyacrylamide gel electrophoresis,
Extremely high purity (99% purity) without pyrogen. The recovery was calculated to be 95%.

発明の効果 本発明の精製法においては、工業的規模でFGF蛋白質
をきわめて高純度に精製することができるので、本発明
方法により精製されたFGF蛋白質を有利に製剤化に付す
ことができる。Effect of the Invention In the purification method of the present invention, FGF protein can be purified to an extremely high purity on an industrial scale, and thus the FGF protein purified by the method of the present invention can be advantageously subjected to formulation.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、実施例１で得られた溶出パターンを示す。 FIG. 1 shows the elution pattern obtained in Example 1.

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continuation of the front page (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12P 21/00-21/02 C07K 14/50 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】線維芽細胞成長因子（FGF）蛋白質含有物
を架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いて、NaClを
0.6Mから0.78Mまで徐々に上昇させて溶出して精製する
ことを特徴とするFGF蛋白質の精製法。The present invention relates to a method for preparing a fibroblast growth factor (FGF) protein-containing substance by using a cross-linked polysaccharide sulfate to prepare NaCl.
A method for purifying an FGF protein, wherein the FGF protein is gradually eluted and eluted from 0.6 M to 0.78 M for purification. 【請求項２】FGF蛋白質が、少なくとも１個のヒト塩基
性FGF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているム
テインである請求項１記載の精製法。2. The method according to claim 1, wherein the FGF protein is a mutein in which at least one amino acid constituting human basic FGF is substituted with another amino acid. 【請求項３】FGF蛋白質が、ヒト塩基性FGF構成アミノ酸
の70位および88位のシステインがそれぞれセリンに置換
されたムテインである請求項１記載の精製法。3. The method according to claim 1, wherein the FGF protein is a mutein in which the cysteines at positions 70 and 88 of the amino acids constituting human basic FGF are each substituted with serine. 【請求項４】架橋ポリサッカライド硫酸エステルが、架
橋セルロース硫酸エステル、架橋アガロース硫酸エステ
ルまたは架橋デキストラン硫酸エステルである請求項１
記載の精製法。4. The crosslinked polysaccharide sulfate is a crosslinked cellulose sulfate, a crosslinked agarose sulfate or a crosslinked dextran sulfate.
Purification method as described. 【請求項５】架橋ポリサッカライド硫酸エステルが、架
橋セルロース硫酸エステルである請求項１記載の精製
法。5. The method according to claim 1, wherein the crosslinked polysaccharide sulfate is a crosslinked cellulose sulfate. 【請求項６】精製されたFGF蛋白質の純度が99％以上で
ある請求項１記載の精製法。6. The method according to claim 1, wherein the purity of the purified FGF protein is 99% or more.