JP2893653B2

JP2893653B2 - ナチュラルキラー細胞刺激因子

Info

Publication number: JP2893653B2
Application number: JP2501209A
Authority: JP
Inventors: トリンチェリ、ジョルジオ; ペルシア、バイス; コバヤシ、ミチコ; クラーク、スティーブン・シー; ウォング、ゴードン・ジー; ヒューウィック、ロッドニー・エム
Original assignee: UISUTAA INST ZA; Genetics Institute LLC
Current assignee: UISUTAA INST ZA; Genetics Institute LLC
Priority date: 1988-11-10
Filing date: 1989-11-09
Publication date: 1999-05-24
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: MX9203294A; DE68926859D1; WO1990005147A1; DE68926859T2; JP2001245678A; CA2002607A1; JPH11215993A; AU638430B2; EP0441900B1; ATE140483T1; JP3261124B2; CA2002607C; EP0441900A1; AU4667389A; CA2441636A1; JPH04502151A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、係属中の米国特許出願第07/269945号（1
988年11月10日出願）の一部継続出願である。

この発明は、ナチュラルキラー細胞およびその他の免
疫系細胞の機能を刺激する新規サイトカイン、および該
因子を均質な形で入手する方法、ならびに組換え遺伝子
工学手法によってこれを生産する方法に関するものであ
る。

［発明の背景］ナチュラルキラー（NK）細胞は免疫系で活性なリンパ
球のサブセットであり、ヒト末梢血単核細胞の平均15％
を占める［G.トリンキエリ、B.ペルッシア、ラボラトリ
ー・インベスティゲーション、50巻、489頁（1984
年）］。ヒトNK細胞の同定に使用される表面マーカー
は、IgG抗体のFc断片へ低親和性で結合するFc−γ−レ
セプターIIIまたはCD16抗原のようなレセプターである
［B.ペルッシアら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、
133巻、180頁（1984年）］。NK細胞は、生体内で腫瘍、
腫瘍転移、ウイルス感染等の防御に重要な役割を演じ、
また正常および悪性造血を調節していることが証明され
ている。

免疫系細胞間のシグナルを伝達する調節タンパク質の
系統群が多数確認されてきた。これらの調節分子はサイ
トカインとして知られている。多くのサイトカイン類
は、造血系および免疫系細胞の増殖、発育、および生物
学的活性を調節することが判明した。これらの調節分子
は、コロニー刺激因子（GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−CSFお
よび多能性CSF、またはインターロイキン−３）、イン
ターロイキン類（IL−１〜IL−７）、インターフェロン
類（α、βおよびγ）、腫瘍壊死因子（αおよびβ）、
および白血球遊走阻止因子（LIF）等のすべてを含む。
これらのサイトカイン類は、骨髄、末梢血、胎児性肝
臓、およびその他のリンパ系または造血系器官由来の標
的細胞で広汎な生物活性を示す［例えばG.ウォング、S.
クラーク、イムノロジー・トゥデイ、９巻（５）、137
頁（1988年）、参照］。

ある種のサイトカイン類の生化学的ならびに生物学的
同定、およびその特性決定は、天然供給源、例えば血液
および尿から入手し得る天然に存在する少量の因子によ
って妨害される。最近、多数のサイトカイン類が、分子
クローニングされ、異種的に発現され、均質に精製され
るようになった［D.メトカーフ、「ザ・モレキュラー・
バイオロジー・アンド・ファンクションズ・オブ・ザ・
グラニュロサイト・マクロファージ・コロニー・スティ
ミュレーティング・ファクターズ」、ブラッド、67巻、
（２）、257〜267頁（1986年）］。これらのサイトカイ
ン類は、γ−インターフェロン、ヒトおよびマウスのGM
−CSF、ヒトのＧ−CSF、ヒトのCSF−１、およびヒトお
よびマウスのIL−３である。GM−CSF、Ｇ−CSF、IL−
３、およびIL−２等、精製したこれらの因子の幾つか
は、生体内で、造血系および免疫系に調節的作用を表す
ことが判明した。

その他のタンパク質についても、天然供給源またはそ
の他の入手源から精製することによって、免疫応答を刺
激し、または増強することができる医薬用として好適な
均質な形で生産する技術上の必要性がなお存在する。

［発明の簡単な要旨］この発明は、一態様として、他の哺乳動物のタンパク
質を実質上含有していないNKSFと呼ばれる新規ヒト・ナ
チュラルキラー細胞刺激因子を提供する。活性なNKSFは
約70kdの見掛けの分子量を有する。NKSFの精製標品には
２つのポリペプチドの存在が認められ、これらは、結合
すると活性なNKSFを生成するサブユニットであると予測
される。現在のところ、NKSFは、大きいサブユニットと
小さいサブユニットが１またはそれ以上のジスルフィド
結合を介して互いに結合することによって生成したヘテ
ロ２量体であると推定される。この見掛けのヘテロ２量
体構造は、２つの個々のサブユニットの結合により、あ
るいは例えばインスリンの場合のように、単一の前駆体
ポリペプチドのタンパク質分解による切断によって生じ
るのであろう。あるいはNKSFの活性型は、大きい方のサ
ブユニットのホモ２量体、または小さい方のサブユニッ
トのホモ２量体である可能性もある。

活性な約70〜80kdのNKSFは、さらに後記の第Ｉ表に示
したアミノ酸配列の全部または一部を含んでいることを
特徴とする。またNKSFサブユニットの大きい方または小
さい方のいずれかの一次配列には、下記のアミノ酸配列
（１文字略記法）の１またはそれ以上が存在する。カッ
コ内は確実に同定できなかったアミノ酸を示す。

NKSFの大きい方のサブユニットポリペプチドは40kdの
見掛けの分子量を有することを特徴とする。このサブユ
ニットは、さらに下記の配列と同一または実質上同一の
アミノ末端配列を有することを特徴とする。

この大きい方のポリペプチドは、さらに後記の第Ｉ表
に示した長いクローン化配列の全部または一部を含んで
いる特徴を有する。

NKSFの小さい方のポリペプチドサブユニットは、約30
〜35kdの見掛けの分子量を有し、さらに下記の配列と同
一または実質上同一のアミノ末端配列を有することを特
徴とする。

（Ｘ）は小さい方のサブユニット配列の最初の残基を
測定できなかったことを表す。

NKSFは、試験管内で、ヒト末梢血リンパ球（PBLs）に
よるγ−インターフェロン生産を誘発する生物学的活性
を示す。NKSFは均質な形で、後に詳述するようなγ−イ
ンターフェロン誘発検定で、1mg当たり１×10⁷希釈単位
より大きい比活性を示す特徴を有する。

PBLsにおけるγ−インターフェロン誘発活性以外に
も、NKSFは、下記のように（１）PBLsによる顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子（GM−CSF）誘発検定における生物学的活性、（２）白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させるナチ
ュラルキラー（NK）細胞を活性化する生物学的活性、（３）フィトヘマグルチニン（PHA）活性化Ｔリンパ球
による腫瘍壊死因子（TNF）誘発検定における生物学的
活性、（４）末梢血Ｔリンパ球のマイトジェン誘起作用等の生物学的活性を示す。

この発明はもう一つの態様として、ヒトNKSFポリペプ
チド、およびヒトNKSFの大きい方のサブユニットポリペ
プチドおよびヒトNKSFの小さい方のサブユニットポリペ
プチド発現を暗号化しているcDNA配列を含むDNA配列を
提供する。そのような配列は、上記の１またはそれ以上
のサブユニットおよびペプチド配列を暗号化しているヌ
クレオチド配列を含んでいる。

この発明はまた、発現調節配列と機能的に結合させた
NKSFまたはNKSFサブユニットを暗号化しているDNA配列
を含んでいるベクターを提供する。またこの発明は、組
換え体NKSFまたはその組換え体サブユニットの生産に使
用するため、そのようなベクターで形質転換した宿主細
胞を提供する。

またこの発明は、組換え体NKSFタンパク質を提供す
る。このタンパク質は他の哺乳動物のタンパク質様物質
を含有せず、上記の物理的、生化学的、または生物学的
な活性または形質の１またはそれ以上を含有する、１ま
たはそれ以上の上記のサブユニットまたはペプチド断片
を暗号化しているDNA配列の存在によって特徴付けられ
る。

この発明のもう一つの態様は、均質または組換え体NK
SFの治療的有効量、またはNKSFサブユニットの一方また
は双方、またはそのペプチド断片の１またはそれ以上の
有効量を含有してなる医薬組成物を提供する。これらの
医薬組成物は、γ−インターフェロンおよびGM−CSF産
生が昂進している状態が存在することに起因するガンお
よびその他の疾患状態の処置方法に使用される。すなわ
ちこの因子は、一般に造血細胞数またはその活性水準の
欠乏を特徴とする疾患の処置に使用される。

したがってこの発明は、もう一つの態様として、好適
な医薬担体とともに、NKSF、またはそのサブユニットの
一方または双方、またはそのペプチド断片の治療的有効
量を患者に投与することにより、ナチュラルキラー細胞
機能の増強によって効果が期待できるガンおよび／また
はその他の病的状態を処置する方法を提供する。これら
の治療方法は、NKSF、またはそのサブユニット、または
そのペプチド断片の１またはそれ以上とともに、少なく
とも１種類のその他のサイトカイン、造血促進因子、イ
ンターロイキン、成長因子、または抗体の有効量を、同
時または順次に投与することを包含し得る。

この発明はまた、NKSF、またはそのサブユニットを産
生するヒト細胞系を他のタンパク質およびポリペプチド
と混合することによって、それらの細胞系から均質なNK
SF、またはそのサブユニットを生産する方法を提供す
る。この発明が提供するこの生産方法は、NKSF、そのサ
ブユニット、またはそのペプチド断片産生能を有する選
ばれた細胞を培養して、ならし培地を得、５段階の基本
的な精製段階を経てこのならし培地を精製することから
なる。

この発明は、もう一つの態様として、組換え体ヒトNK
SFタンパク質、そのサブユニット、またはそのペプチド
断片を生産する新規プロセスにベクターおよび形質転換
細胞を使用する。このプロセスでは、発現NKSFタンパク
質、そのサブユニット、またはそのペプチド断片を暗号
化しているDNA配列で形質転換した細胞系をその発現調
節配列と機能可能に組合わせて培養する。上記のプロセ
スでは、ポリペプチド発現のための宿主細胞として、多
数の既知細胞を使用し得る。現在、好ましい細胞系は、
哺乳動物細胞系および細菌細胞である。

この発明のその他の態様および有利性は、以下の好ま
しい実施態様に関する詳細な説明を見れば明らかであ
る。

［発明の詳細な説明］この発明が提供する新規ヒトナチュラルキラー細胞刺
激因子（NKSF）は、他の哺乳動物のタンパク質様物質を
実質上伴っていない均質なタンパク質またはタンパク質
様組成物である。

ナチュラルキラー細胞刺激因子は、ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
で非還元条件下に測定した約70〜80kdの見掛けの分子量
を有する。この70〜80kdのペプチドは、γ−インターフ
ェロン誘発検定で有効である。

この70〜80kdバンドは、SDS−PAGEで還元条件下に40k
d（大きい方のサブユニット）および約30〜35kd（小さ
い方のサブユニット）の見掛けの分子量を有する２つの
小サブユニットを生じる。どちらのサブユニットとも、
同一のγ−インターフェロン誘発検定による生物学的活
性で、天然の70〜80kd種の活性に比較して実質的に低下
する。40kdに低下した種および30〜35kdに低下した種か
ら、上述のように同定したアミノ末端配列が測定され、
したがって、これらは前記のNKSFヘテロ２量体のサブユ
ニットであると考えられる。現在、NKSFは、大きい方の
サブユニットと小さい方のサブユニットがジスルフィド
結合したヘテロ２量体であると考えられる。

NKSFは、少なくとも一部、陰イオン性の糖タンパク質
である。等電点電気泳動により、NKSFの２つの種は4.3
および4.8の等電点を有することが認められる。現在、
２つの種は糖鎖形成パターンを異にしているものと推測
される。

NKSFは、まず実施例８で詳細に説明するγ−インター
フェロン誘発検定で生物学的活性を有する特徴を有す
る。その他の活性としては、ヒト末梢血リンパ球による
GM−CSF産生誘発能が挙げられる（GM−CSFに関する追加
的な情報は、例えば公開されたPCT出願WO86/00639参
照）。またNKSFは、末梢血Ｔリンパ球に対するレクチン
およびホルボールジエステルのような各種マイトジェン
の***促進活性に対して増強効果を有し、また活性化さ
れたヒト扁桃Ｂ細胞に対する増殖促進効果を有する。

またNKSFは、自然細胞障害検定および抗体依存性細胞
障害（ADCC）検定により、試験管内で白血病細胞および
腫瘍由来細胞を致死させるNK細胞の機能を増強すること
が認められた。

自然細胞障害検定について簡単に付言すれば、NKSFの
存在でヒト末梢血リンパ球または精製したNK細胞を８〜
18時間インキュベートする。ついで標準的な⁵¹Cr−放出
検定を用いて、リンパ球およびNK細胞を、白血病細胞
系、腫瘍由来細胞系またはウイルス感染繊維芽細胞のよ
うな標的細胞を溶解する細胞溶解能について検定する。
NKSFは、NK細胞細胞障害活性の既知の活性化因子である
インターフェロンαおよびIL−２で得られた成績に匹敵
する水準で、そのような標的細胞を溶解するNK細胞の溶
解能を劇的に増強する［例えばG.トリンキエリら、ジャ
ーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン、147
巻、1314頁（1978年）、およびG.トリンキエリら、ジャ
ーナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン、160
巻、1146頁（1984年）、参照］。

ADCC検定では、NK細胞のFcレセプターに対して結合能
を有する抗体（例えばIgG_2a、IgG₃等）で標的ガン細胞
を被覆する。予備的なADCC検定で、NKSFの存在は、被覆
した腫瘍細胞に対するNK細胞の細胞致死活性を増強する
ようである［例えば、L.M.ワイナーら、キャンサー・リ
サーチ、48巻、2568〜2573頁（1988年）、P.ハーゼイ
ら、キャンサー・リサーチ、46巻、6083〜6090頁（1988
年）、ADCCに関する追加的な情報は、C.J.ハンシクら、
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、83巻、7893
〜97頁（1986年）参照］。

ビーズ結合したヤギ抗ヒトIgM抗体（抗−μ）で刺激
した正常なヒトＢ細胞を使用するＢ細胞増殖因子検定に
おけるNKSFの予備的な分析で、NKSFは、Ｂ細胞増殖因子
活性を示す特徴を有する。この検定で、Ｂ細胞表面上の
IgM免疫グロブリンに対する抗体は、Ｂ細胞を活性化し
てＢ細胞増殖因子と反応を起こさせる［Ｃ−T K.ツェン
グら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、140巻、2305
〜2311頁（1988年）］。そのような抗体は商業的に入手
し得る。

NKSFは、リンホカイン混合物を産生する商業的に入手
可能な細胞系であるヒト細胞系RPMI8866（ユニバーシテ
ィー・オブ・ペンシルバニア・セル・センター）のなら
し培地で最初に検出された。またこの因子は、他のエプ
スタイン−バーウイルスで形質転換したリンパ芽球様細
胞系、またはその他のヒト細胞系からも生産され得る。
天然にNKSFを産生する細胞からこれを得るために採用す
る精製技術では、下記の段階を用いる。これらの段階
は、例えばQAEゼータ調製用カートリッジ（LKBファルマ
ケア社）のようなイオン交換カラムによる精製を含み、
これによってNKSFタンパク質が陰イオン性であることが
分かる。第２の精製段階は、レンチル−レクチンカラム
であり、このことは、NKSFが少なくとも一部糖タンパク
質であることを示している。レンチル−レクチンカラム
からの溶出物を、さらにヒドロキシルアパタイトカラム
へ通し、つづいてヘパリン−セファロースカラムおよび
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）モノＱ
カラムで精製する。RPMI8866から得られたNKSFは、後段
の３つのカラムからそれぞれ単一のピークとして溶出し
た。残存する約37kdのタンパク質混入物を、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー単独または逆層HPLCおよびゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって除去する。精製して得られた
均質なNKSFを、実施例８に示したγ−インターフェロン
誘発検定によって生物学的活性を検定し、1mg当たり１
×10⁷希釈単位より大きい比活性を証明した。

すなわち実施例２で詳細に説明するが、RPMI8866のな
らし培地、またはその他のヒトNKSF供給源へ、上記の精
製手段を適用することによって均質なNKSFを入手し得
る。RPMI8866細胞系は該因子を自然に産生し得るが、細
胞系をホルボールジブチレートのようなホルボールエス
テル類で処理することによって生産水準を増強すること
ができる。細胞は48時間血清が存在しなくても、なおNK
SFを他のリンホカインと一緒に産生する。RPMI8866（実
施例１参照）またはその他のNKSF供給源細胞の培養方法
は、当業者で既知の方法である。

NKSF、またはそのサブユニットの一方または双方、ま
たはそのペプチドは、組換え技術によっても生産し得
る。クローン化したNKSF、またはそのサブユニットの一
方または双方のためのDNA配列を得るため、均質なポリ
ペプチドのトリプシン消化物を調製する。例えばNKSFの
サブユニットで認められた９種類のトリプシン消化物で
は、下記のが同定される。またNKSFの大きい方のサブユニットおよ
び小さい方のサブユニットのアミノ末端配列は前述のよ
うに同定した。

NKSFのこれらのトリプシン消化生産物のアミノ酸配列
を暗号化している可能性のあるすべての配列を予測した
遺伝暗号を用いて、オリゴヌクレオチドプローブを合成
する。さらにこれと同じ方法を用いて、上述のように同
定したNKSFの２つのサブユニットのアミノ末端配列から
プローブを組立て得る。これらのプローブを使用してNK
SF遺伝子またはサブユニット遺伝子を同定し、ヒトゲノ
ムライブラリーを選別することができる。別法として、
RPMI8866またはNKSFのその他の細胞供給源からのmRNAを
使用してcDNAライブラリーを作成し、これをプローブで
選別して、NKSFポリペプチド、または大きいサブユニッ
トおよび小さいサブユニットのポリペプチドを暗号化し
ているcDNAを同定することができる。cDNAを同定した
ら、それらを各種の発現ベクターの任意の一つへ同時導
入し、NKSF、または一方または双方のサブユニットの発
現系を作成することができる。

そのような組換え技術を用いることによって、NKSFポ
リペプチド、またはその大きいおよび／または小さいサ
ブユニットのポリペプチドを暗号化しているDNA配列を
得る。これらの配列はトリプシン消化断片、または前述
のようにして同定したアミノ末端配列の１またはそれ以
上を暗号化したDNA配列を含んでいる。

pNK−６と命名したそのようなNKSFクローンの一つ
は、少なくとも下記のDNAおよびアミノ酸配列を有し、
大きい方のNKSFサブユニットの全部または一部を暗号化
している。

プラスミドpNK−６でクローン化したこの配列は、受
け入れ番号40545のもとに、ジ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（12301、パークローン・ド
ライブ・ロックビル、マリーランド）へ1989年２月３日
に寄託した。追加的なクローン体が得られ、これらが配
列決定されれば、NKSFの大きい方のサブユニットおよび
／または小さい方のサブユニットの配列のカルボキシ末
端配列を提供することが期待される。

また前記のペプチド配列および大きい方のサブユニッ
トを暗号化しているDNA配列の対立遺伝的変異体、およ
びその類似体または誘導体もこの発明に包含される。

すなわち、この発明は、他の霊長類タンパク質を暗号
化しているDNA配列を全く伴わず、NKSFの大きいサブユ
ニットおよび小さいサブユニットを含め、NKSFポリペプ
チドの発現を暗号化している新規DNA配列を包含する。
これらのDNA配列は、上記の同定されたDNA、およびペプ
チド配列、およびそれらの配列を緊縮ハイブリッド形成
条件下に［T.マニアティスら、モレキュラー・クローニ
ング（ア・ラボラトリー・マニュアル）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（1982年）、387〜3
89頁参照］、DNA配列へハイブリッド形成した１または
それ以上を含んでいるDNA配列である。そのような緊縮
ハイブリッド形成条件の１例を示せば、４×SSCで65℃
でハイブリッド形成し、ついでこれを0.1×SSCで65℃で
１時間洗浄する。別の緊縮ハイブリッド形成条件を例示
すれば、50％ホルムアミド中、４×SSCで42℃で行う。

また緩和条件下に、その配列へNKSFまたはそのサブユ
ニットをハイブリッド形成し、NKSF生物学的特性を有す
るNKSFペプチドの発現を暗号化しているDNA配列も、新
規NKSFポリペプチドを暗号化している。そのような非緊
縮ハイブリッド形成条件の例は、４×SSCで50℃、また
は30〜40％ホルムアミドで42℃でハイブリッド形成す
る。例えばNKSFの配列と有意な相同領域（例えば、グリ
コシル化部位またはジスルフィド結合）を共有し、１ま
たはそれ以上のNKSF生物学的特性を有するタンパク質を
暗号化しているDNA配列は、たとえそのようなDNA配列が
NKSF配列へ緊縮ハイブリッド形成しないとしても、明ら
かにNKSFポリペプチドを暗号化している。

同様にNKSF配列によって暗号化されたNKSFポリペプチ
ドを暗号化し、ただし遺伝暗号の縮重または対立遺伝的
変異体のために、コドン配列を異にするDNA配列（アミ
ノ酸変化をもたらし、またはもたらし得ない種集団に天
然に存在する塩基変化）もまたこの発明に包含される。
点突然変異により、あるいは活性、半減期、または暗号
化されたポリペプチドの生産を増強するために誘導され
た修飾によって生じたNKSFのDNA配列における変異体も
またこの発明に包含される。

またNKSFポリペプチドは、既知の通常の化学合成によ
っても生産し得る。合成手段によるこの発明のポリペプ
チドの組立て方法は、当業界で既知の技術である。合成
的に組立てられたNKSFポリペプチド配列は、１次、２
次、もしくは３次構造およびコンホーメーション上の特
徴をNKSFポリペプチドと共有しているから、NKSFと共通
の生物学的特性を有し得る。すなわち、これらは生物学
的有効物質として、または免疫学的代替物として天然の
精製したNKSFポリペプチドの代わりに治療的および免疫
学的処理に使用し得る。

また本明細書で提供するNKSFは、精製した均質な組換
え体NKSFタンパク質、またはサブユニットポリペプチド
の配列と類似し、ただし天然に修飾され、または意図的
に操作して修飾を加えた配列によって暗号化された因子
を含む。

ペプチドまたはDNA配列における修飾は当業界で既知
の技術により実施できる。NKSF配列における重要な修飾
は、暗号配列中の選ばれたアミノ酸残基の置換、挿入ま
たは欠失を含み得る。そのような置換、挿入または欠失
のための突然変異手法は当業界で既知のものである（例
えば、米国特許第4518584号、参照）。

本明細書で報告するNKSFポリペプチドまたはサブユニ
ットポリペプチド配列のその他の特殊な突然変異は、糖
鎖結合部位の修飾を含み得る。グリコシル化が存在せ
ず、または一部だけがグリコシル化された状態は、アス
パラギン連鎖した任意のグリコシル化認識部位またはＯ
−連鎖した炭化水素の付加によって修飾された任意の分
子部位のアミノ酸置換または欠失によりもたらされる。
アスパラギン連鎖したグリコシル化認識部位は、好適な
細胞性グリコシル化酵素によって特異的に認識されるト
リペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列
は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン
−Ｘ−セリン（ここでＸは通常任意のアミノ酸である）
のいずれかである。グリコシル化認識部位の１番目また
は３番目のアミノ酸位置の一方または双方におけるさま
ざまなアミノ酸置換または欠失（そして／または２番目
の位置のアミノ酸欠失）は、修飾されたトリペプチド配
列に非グリコシル化をもたらす。

そのように変化したヌクレオチド配列を発現すると、
その位置でグリコシル化されていない変異体が生産され
る。

NKSF活性の全部または一部を保有していると期待され
得るNKSFまたはそのサブユニットの配列のその他の類似
体または誘導体も、当業者であればこの発明の報告によ
って容易に作成し得る。そのような修飾の１つは、存在
するリシン残基へのポリエチレングリコールの付着、ま
たは付着を可能にするリシン残基の通常の技術による配
列への挿入であり得る。そのような修飾もこの発明の範
囲に包含される。

この発明はまた、NKSFポリペプチドの生産方法を提供
する。この発明の方法は、既知の調節配列の制御下に、
サブユニットポリペプチドを含め、NKSFポリペプチドの
発現を暗号化しているDNA配列で形質転換した、好適な
細胞または細胞系の培養を含む。好適な細胞または細胞
系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）または3
T3細胞のような哺乳動物細胞であり得る。好適な哺乳動
物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増強、選
別、および生産物の生産ならびに精製方法は、当業界で
既知のものである［例えば、ゲッシングおよびサムブル
ック、ネーチャー、293巻、620〜625頁（1981年）、ま
たは別法としてカウフマンら、モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー、５巻（７）、1750〜1759頁
（1985年）、またはハウレイら、米国特許第4419446
号、参照］。２つの異なったcDNAをCHO細胞で同時発現
する方法は、例えば公開されたPCT国際特許出願WO88/08
035に報告されている。その他の好適な哺乳動物細胞系
は、サルCOS−１細胞系、およびウイスター・インステ
ィチュート（フィラデルフィア、ペンシルバニア）で最
初に開発されたCV−１細胞系である。

同様にこの発明に好適な宿主細胞系として有用なもの
は、細菌性細胞である。例えばエシェリキア・コリの多
数の株（例えばHB101、MC1061、および後述の実施例に
使用した株）はバイオテクノロジーの分野で宿主として
既知のものである。バシラス・サブチリス、シュードモ
ナス、およびその他の桿菌類等の多数の株もこの発明に
使用し得る。

当業界で既知である酵母細胞の多数の株もこの発明の
ポリペプチド発現のための宿主細胞として入手可能であ
る。また所望により、昆虫細胞もこの発明の方法の宿主
細胞として利用し得る［例えば、ミラーら、ジェネティ
ック・エンジニアリング、８巻、277〜298頁（プレナム
・プレス社、1986年）、参照］。

この発明はまた、新規NKSFポリペプチドを発現する方
法に使用するベクター類を提供する。これらのベクター
は、サブユニットポリペプチドを含め、NKSFポリペプチ
ドを暗号化している新規NKSFのDNA配列を含んでいる。
別法として、前述のように修飾した配列を挿入したベク
ターもまたこの発明の実施態様であり、NKSFポリペプチ
ドの生産に有用である。この方法に使用するベクター類
も、この発明のDNA暗号配列と機能的に組合わせて、選
ばれた宿主細胞での複製および発現を指令し得る選ばれ
た調節配列を含んでいる。

このように細胞供給源から均質に精製され、あるいは
組換え技術または合成的に生産されたNKSFは、NK細胞活
性の増強またはγ−インターフェロンまたはGM−CSFの
生体内生産の増大に反応するガンまたはその他の疾患状
態を処置する医療用調製品または医薬製剤として使用し
得る。そのような病的状態は、疾病、放射線照射または
薬物投与によって発生し、例えば、白血球減少、細菌ま
たはウイルスによる感染、貧血、骨髄移植に伴う免疫細
胞または造血細胞欠乏を含むＢ細胞またはＴ細胞欠乏等
が挙げられる。これらのNKSFポリペプチド組成物による
ガンおよびその他の疾患の治療的処置は、今日入手可能
な薬物処置によって起こる不快な副作用を回避し得る。

またNKSFのサブユニットポリペプチドの一方または双
方、またはそのペプチド断片をそのような医薬製剤に使
用することも可能であり得る。

またこの発明のポリペプチド類は、単独または他のサ
イトカイン類、造血促進因子類、インターロイキン類、
成長因子類、または抗体と組合わせてガンまたはその他
の疾患状態の処置に使用し得る。これらの新規ポリペプ
チド類のその他の用途は、診断または治療的用途のた
め、標準的な方法によって生じるモノクローナル抗体お
よびポリクローナル抗体の開発である。

したがってこの発明のもう一つの態様として、上述の
状態を処置するための方法および治療的組成物を提供す
る。そのような組成物は、この発明のNKSFタンパク質ま
たはサブユニットポリペプチドの治療的有効量、または
その断片の治療的有効量を製薬上許容し得る担体と混合
して含有する。この組成物は非経口的に全身投与するこ
とができる。別法として、組成物を静脈内に投与し得
る。また所望により、組成物を皮下投与し得る。全身投
与する場合、この発明に使用する治療的組成物は、発熱
物質を含有しない非経口的に許容し得る水溶液形態をと
る。pH、等張性、安定性等の点を十分考慮したそのよう
な製薬上許容し得るタンパク質の溶液製剤は当業界で周
知のものである。

上述の状態を処置する方法に組込まれる投与計画は、
薬物の作用を修飾する各種の要素、例えば病状、体重、
患者の性別および規定食、感染の重篤度、投与時間、そ
の他、臨床的な要素を考慮して、主治医により決定され
る。１日の投与計画は、一般にNKSFタンパク質またはサ
ブユニット１〜1000μｇ、または体重1kg当たりタンパ
ク質50〜5000単位（１単位/mlはγ−インターフェロン
誘発検定で50％最大刺激をもたらすタンパク質濃度を表
す）であるべきである。

またこの発明の治療方法および組成物は、その他のヒ
トの因子との併用を含み得る。そのような用途のための
代表的なサイトカイン類および造血促進因子類は、特に
IL−１、IL−２、およびIL−６等である（例えばPCT公
開WO85/05124、WO88/00206、およびヨーロッパ特許出願
第0188864号、参照）。NKSF治療に加え得るその他の可
能性ある候補は、IL−４、Ｇ−CSF、CSF−１、GM−CS
F、IL−３、またはエリスロポエチンである。またＢ細
胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、または好酸球分化因子の
ような増殖因子類も、NKSFと併用するのに有用であり得
る。

これと同様に、NK細胞のFcレセプターへの結合能を有
する抗体の投与と一緒にまたはその前に、NKSFまたはそ
のサブユニットまたはその断片を投与することは、腫瘍
に対するADCC療法を増強し得る。その場合の投与量は、
治療用組成物中のそのような追加成分の量を考慮して調
節すべきである。処置患者の経過は通常の方法によって
監視することができる。

以下に実施例を挙げて、この発明の均質なヒトNKSFの
精製および特性決定、およびその他の方法および生産物
について例示的に説明する。これらの実施例は発明を説
明するためのものであって、発明の範囲を限定する目的
をもつものではない。

［実施例１］無血清RPMI8866細胞のならし培地の調製加熱失活させた５％ウシ胎児血清（FCS）を含有するR
PMI1640培地で、ヒトＢリンパ芽球様細胞系RPMI8866を
維持した。無血清ならし培地を調製するには、細胞を洗
浄し、これを10^-7Mホルボール−12−13−ジブチレート
（PdBU）を含有する無血清RPMI1640培地に浮遊し（10⁶
細胞/ml）、５％CO₂気流中で37℃で48時間培養した。0.
2μｍフィルター［デュラポア（商標）親水性カートリ
ッジ型フィルター、ミリポアー社、ベッドフォード、M
A］濾過によって無細胞上清を回収し、ツイーン−20お
よびフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を、
それぞれ0.02％および0.1mMずつ添加した。ついで細胞
ならし培地を、限外濾過カートリッジ（スパイラル−ウ
ーンド、S1、アミコン社、ダンバーズ、MA）を使用して
減圧下に50倍濃縮した。

［実施例２］ NKSFのならし培地からの精製下記の方法は、実施例１で報告したRPMI8866ならし培
地から均質なNKSFタンパク質を得るため、現在使用され
ているものである。

a.アニオン交換カートリッジ−クロマトグラフィー粗製の濃縮ならし培地２リットルを、伝導率が6m Os/
cmとなるまで蒸留水で希釈して、1Mトリス−HCl緩衝液
（pH8）でpH8に調節した。ついで並列に連結し、0.1Mト
リス−HCl緩衝液（pH8）で流速150ml/分で予め平衡化し
たQAEゼータプレプ250型カートリッジ（ファルマシア
社）５個へ、濃縮物を適用した。特に説明しない場合、
精製に使用したすべての緩衝液は0.02％ツイーン−20お
よび0.1mM PMSFを含有している。カートリッジを0.1Mト
リス−HCl緩衝液（pH6.8）３リットルで洗浄し、ついで
0.5M NaClを含有する0.1Mトリス−HCl緩衝液（pH6.8）
1.5リットルで洗浄して、画分300mlを採取した。NKSF活
性を0.5M NaClを含有する洗浄液で溶出した。

b.レンチル−レクチンセファロース−クロマトグラフィ
ー２回分のQAEゼータプレプ溶出液から得たNKSF含有画
分を合わせて、20mMトリス−HCl緩衝液（pH7.2）で平衡
化したレンチル−レクチンセファロース4B（ファルマシ
ア社）のカラム（2.5×15cm）へ直接適用した。平衡化
緩衝液５カラム容量で洗浄したのち、0.2M α−メチル
−Ｄ−マンノピラノシド（シグマ社）および0.5M NaCl
を含有する20mMトリス−HCl緩衝液（pH7.2）３カラム容
量でカラムを溶出した。NKSF活性の約1/2がカラムに結
合し、α−メチル−Ｄ−マンノピラノシドで溶出した画
分に回収された。

c.ヒドロキシルアパタイト−クロマトグラフィーレンチル−レクチンセファロースカラムへ結合したNK
SF活性プールから濃縮した物質を、0.1mM CaCl₂および
0.15M NaClを含有する1mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.
8）に対して透析し、0.1mM CaCl₂を含有する1mMリン酸
カリウム緩衝液（pH6.8）で予め平衡化したバイオゲルH
T（バイオラド社）カラム（２×5cm）へ適用した。平衡
化緩衝液５カラム容量でカラムを洗浄し、0.15M NaClを
含有するリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）の1mM−400mM
直線濃度勾配100mlで溶出した。画分4mlを採取し、NKSF
活性を試験した。リン酸カリウム約200mM−300mMの画分
で、カラムから単一の活性ピークとして得られた。

d.ヘパリン−セファロース−クロマトグラフィーバイオゲルHTカラムから溶出したNKSF含有画分を合わ
せて20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）に対して透
析し、ヘパリン−セファロース（ピアス社、ロックフォ
ード、IL）カラム（１×10cm）へ適用した。20mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.2）５カラム容量でカラムを洗
浄し、1M NaClを含有するこれと同じ緩衝液で溶出し
た。画分3mlを採取し、NKSF活性を測定した。本質的に
すべての活性をヘパリンカラムで結合して、1M NaCl洗
浄で回収された。

e.モノＱ−クロマトグラフィーヘパリンセファロースカラムからプールした画分を、
１％エチレングリコールおよび0.1mM PMSFを含有する
（ただしツイーン−20を含有せず）20mMトリス−HCl緩
衝液（pH6.8）（バッファーＡ）に対して透析し、YM10
メンブランを備えた攪拌セル（アミコン社）で2mlに濃
縮した。試料をモノＱ（5/5）カラム（ファルマシア社
−FPLCアパラタス部門）へ適用し、バッファーＡ（pH6.
8）の0M−1M NaCl直線濃度勾配溶液で溶出した。画分0.
5mlを採取しNKSF活性を試験した。活性は約220mM−270m
M NaClの画分で単一のピークとして認められた。

f.ゲル濾過クロマトグラフィーモノＱカラムからプールしNKSF活性を含有する画分を
スピードバック・コンセントレーター（サバント社、フ
ァーミングデール、NY）で100μｌに濃縮し、これをFPL
Cスーパーローズ12カラムへ適用した。0.15M NaCl、１
％エチレングリコール、0.1mM PMSFを含有する50mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）でクロマトグラフィーを
実施した。流速を0.6ml/分とし、画分0.5mlを採取し
た。約37kdのタンパク質混入物からNKSFタンパク質（70
kd）を分離した。

別法として、プールしたモノＱ画分を、上記の（ｆ）
段階の前に逆層HPLC（c8カラム）へ掛けて、活性な70kd
タンパク質からタンパク質混入物を分離し得る。

［実施例３］ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動ラエムリの方法［U.K.ラエムリ、ネーチチャー、227
巻、680〜685頁（1970年）］にしたがい、10％アクリル
アミド板状ゲル（厚さ0.75mm）を使用してSDS−PAGEを
実施した。電気泳動ののち、銀染色試薬（バイオラド）
を使用する銀−硝酸塩法によってゲルを染色するか、あ
るいは2mmのスライスとしてこれを切り出し、RPMI培地
0.5mlで24℃で４時間溶出して、NKSF活性について検定
した。標準タンパク質、ホスホリパーゼｂ（94kd）、ウ
シ血清アルブミン（67kd）、オボアルブミン（43kd）、
カルボニックアンヒドラーゼ（30kd）、大豆トリプシン
インヒビター（20kd）、およびラクトアルブミン（14.4
kd）によって見掛けの分子量を測定した。

NKSF活性の前に溶出する数種の画分で開始し、活性画
分を通じてずっと連続し、NKSF活性ピークの後に溶出す
る画分で終了するモノＱカラム画分（実施例２、（ｅ）
段階）のSDS−PAGE分析（非還元条件）から、２つのタ
ンパク質（70kdおよび37kd）の存在が、各種のモノＱ画
分におけるNKSF活性の存在と相関していることが判明し
た。別の非還元ゲルで活性画分を泳動させ、70kdおよび
37kdバンドに対応する領域からタンパク質を溶出して、
NKSF活性を試験した。活性はすべて70kd種と対応してお
り、このタンパク質がNKSFであることが明らかになっ
た。

70kd種をゲルから溶出し、クロラミンＴ（シグマ社、
セントルイス、MO）を使用してこれをヨウ素化し、還元
剤β−メルカプトエタノールの存在（10％）で２分間沸
騰させたのち、別のSDSゲルで再び泳動を行った。これ
らの条件下で、70kd種は分子量40kdおよび30kdの２つの
明瞭なサブユニットに分解し、この事実は、天然のNKSF
がこれらのサブユニットポリペプチドのジスルフィド結
合したヘテロ２量体であり得ることを示している。ある
いはNKSFは、大きい方のサブユニットまたは小さい方の
サブユニットの集合体によって生成された２量体であり
得る。天然の70kd NKSFの還元は、γ−インターフェロ
ンの末梢血リンパ球産生を誘発するNKSFの誘発能をすべ
て破壊するようである。

［実施例４］タンパク質の回収 RPMI8866の無細胞ならし培地500リットルから出発し
て、モノＱカラムからプールした目的の活性画分は、同
一ゲルで並行して分析した対照タンパク質の銀染色強度
から算定して、タンパク質約10μｇを含有していた。こ
の約６μｇが70kd NKSFタンパク質に対応した。算定さ
れた70kd NKSFの非活性は１×10⁷単位/mgであった。標
品中のNKSF活性の通算回収率は２％であった。

［実施例５］ NKSFタンパク質組成上記のSDS−PAGE実施例で報告したように、均質なNKS
Fを還元し、トリプシンで消化した。別法として非還元N
KSFを逆層HPLCカラムから得て、トリプシンで消化し得
る。下記のアミノ酸配列を有する９種類のトリプシン消
化断片を単離した（カッコ内は仮に同定したアミノ
酸）。

また実施例３で報告したように、還元後、単離したNK
SFの40kd種および30kd種から、NKSFの各サブユニットの
アミノ末端のアミノ酸配列を決定した。40kdのサブユニ
ットからのアミノ末端配列は、Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ
−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−
Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍであった。このアミノ末端配列、お
よび断片１、３、４、８、および９は、前記の第Ｉ表で
同定した大きい方のサブユニットのクローンのアミノ酸
配列から誘導されたものであることが分かった。

30kdの小さい方のサブユニットからのアミノ末端配列
は、下記のように、カッコ内のアミノ酸の同定が確定し
ていない、（Ｘ）−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−（Ｐ）−Ｐ−
Ｄ−Ｐ−（Ｓ）−Ｍ−Ｆ−Ｐであった。（Ｘ）は、この
配列の最初の残基が決定できなかったことを表す。

オリゴヌクレオチドのプール、または独特のオリゴヌ
クレオチドからなるプローブを、レーズの方法［R.レー
ズ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、
183巻（１）、１〜12頁（1985年）］により設計した。
オリゴヌクレオチドプローブは、自動DNA合成装置で合
成した。

遺伝暗号は縮重するので（１個以上のコドンが同一の
アミノ酸を暗号化できる）、トリプシン処理した断片の
アミノ酸配列を暗号化している可能性のすべてのあるヌ
クレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドの混合
物を合成しなければならない。ある種のコドンは、真核
遺伝子では希にしか利用されず、またジヌクレオチドCp
Gの相対頻度は真核性暗号配列では希である理由から
［J.J.ツールら、ネーチャー、312巻、342〜347頁（198
4年）参照］、ある場合には、コドン利用に基づいたプ
ローブ混合物のオリゴヌクレオチド数を減らすことが可
能である。プローブ設計に利用するアミノ酸配列の領域
は、できれば高度に縮重したコドンを避けることによっ
て選ばれる。オリゴヌクレオチドを自動DNA合成装置で
合成し、ついでプローブをポリヌクレオチドキナーゼお
よび³²P−ATPで放射能標識する。

ついでcDNAを、RPMI8866細胞系からポリアデニル化し
たRNAから合成し、これをラムダZAP（ストラタジーン・
クローニング・システムズ社、ラ・ジョラ、CA）または
その他、好適なベクターへ確立された手法を用いて（ツ
ールら、前掲）クローン化した。このライブラリーから
の組換え体を平板接種し、複製ニトロセルロース・レプ
リカをプレートから作成した。³²P−γ−ATPでオリゴヌ
クレオチドをリン酸化し、プローブの鎖長および塩基組
成から予測した温度で、標準的なハイブリッダイゼーシ
ョン溶液中で１夜、レプリカへハイブリッド形成した
［J.シンガー−サムら、プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・USA、80巻、802〜806頁（1983年）、およびS.V.
サグズら、「デベロップメンタル・バイオロジー・ユー
ジング・ピュアリファイド・ジーンズ」、ICN−UCLA・
シンポジウム・オン・モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー、D.D.ブラウンおよびC.F.フォックス
編、（アカデミック社、NY）、23巻、683〜693頁（1981
年）参照］。ついでオートラジオグラフィーに掛けるこ
とができる許容し得る水準にバックグラウンド放射能が
低下するまで、フィルターを0.5×SSCで同じ温度で洗浄
した。別法として、ハイブリッド形成および洗浄をテト
ラアルキルアンモニウム塩溶液の存在で実施し得る［K.
A.ヤコブスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、16
巻、4637〜4650頁（1988年）参照］。複製陽性物をプラ
ーク精製した。ヒトNKSFを暗号化するのに必要なヌクレ
オチド配列の一部または全部を含んでいるクローンが得
られた。この方法によって得られたクローンの１つは、
前述のようにATCC として寄託した。

［実施例６］組換え体ヒトNKSFの発現 NKSFを生産するため、そのサブユニットを暗号化して
いるcDNAを標準的な分子生物学的な手法により好適な発
現ベクターへ移入した。これらの発現ベクターに関して
は、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌発現のため
の多数の種類が当業界で既知である。哺乳動物細胞のそ
のようなベクターの１つはpXMである［Y.C.ヤングら、
セル、47巻、３〜10頁（1986年）］。このベクターは、
SV40複製開始点およびエンハンサー、アデノウイルム主
後期プロモーター、アデノウイルス３分節系先導配列の
cDNAコピー、短いハイブリッド介在配列、SV40ポリアデ
ニル化シグナルおよびアデノウイルスVAI遺伝子を、所
望のcDNAの高水準発現を哺乳動物細胞で指令する好適な
関係で含んでいる［例えばカウフマン、プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・オブ・ザ・USA、82巻、689〜693頁（1985
年）］。このpXMベクターをエンドヌクレアーゼ酵素Xho
Iで直線化し、続いてNKSFの各サブユニット発現の組立
て体を生じ得るXho I相補的末端を作り出す合成オリゴ
ヌクレオチド（コラボレーティブ・リサーチ、レキシン
トン、MA］を付加することによって、予め修飾したNKSF
サブユニットを暗号化しているcDNAへ、当モル量ずつ別
々にライゲーションした。２つのポリペプチドが２つの
異なったmRNAから誘導されたのであれば、２つの異なっ
たcDNAを同一宿主で同時に発現するか、あるいは異なっ
た宿主でそれぞれ独立して発現させ、サブユニットを別
々に精製しなければならない。目的の活性NKSFは、個々
のサブユニットを再生することによって組立てられる。

もし２つのNKSFのサブユニットが単一のmRNAから誘導
されたのであれば（すなわち、それらが単一の前駆体ポ
リペプチドのタンパク質酵素分解切断によって生じたの
であれば）、前述と類似の態様で、ベクターを個々のcD
NAへ等モル量でライゲーションする。対応するcDNAは、
好適なベクターにより種々の宿主で発現することができ
る。

a.哺乳類細胞発現以下に説明する検定に使用するNKSFタンパク質の発現
を得るため、個々のサブユニットのためのcDNA（それら
が単一の前駆体から誘導されたものであれば、両方のサ
ブユニットを暗号化している単一のcDNA）を含んでいる
pXM組立て体を混合し、例えばこれをCOS細胞へトランス
フェクトする。トランスフェクトしたCOS細胞からのな
らし培地は、γ−インターフェロン誘発検定で測定され
るNKSF生物学的活性を含有している。

本明細書で報告する哺乳動物細胞発現ベクターは、当
業界で既知の技術によって合成し得る。このベクターの
構成（例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、
プロモーター等）は、既知の方法によって天然供給源か
らまたは合成によって入手し得る［カウフマンら、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、159巻、5
11〜521頁（1982年）、およびカウフマン、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・USA、82巻、689〜693頁（198
5年）参照］。代表的な哺乳動物宿主細胞は、形質転換
細胞系をも含め、特に霊長類細胞系およびゲッ歯類細胞
系である。また正常な２倍体細胞、一次組織および初代
外植片の試験管内培養から誘導された細胞株も好適であ
る。候補となる細胞は、選択遺伝子が優性に作用する限
り、選択遺伝子で遺伝子型的に欠損している必要はな
い。ベクターDNAの安定な組込み、および組込んだベク
ターDNAのその後の増幅には、いずれも通常の方法によ
り、CHO細胞を使用し得る。別法として、ベクターDNAは
ウシ乳頭腫ウイルスゲノム［ラスキーら、セル、36巻、
391〜401頁（1984年）参照］の全部または一部を含み、
安定なエピソーム要素としてC127マウス細胞のような細
胞系で実施し得る。その他の好適な哺乳動物細胞系とし
ては、ヒーラ細胞、COS−１サル細胞、マウスＬ−929細
胞、スイス、Balb−ｃまたはNIHマウスから誘導された3
T3系、BHKまたはHAKハムスター細胞系等が挙げられる
が、これに限定されるものではない。

NKSFタンパク質は２量体であるから、２つのサブユニ
ットが異なっている場合は（例えば大きいサブユニット
と小さいサブユニット）、これらを同一宿主で同時に発
現するか、または別々に発現させて、互いに再生し、活
性なNKSFを生産しなければならない。然し、もしNKSFサ
ブユニットが単一のcDNAによって暗号化されている前駆
体の切断によって生じるのであれば、少なくとも好適な
プロテアーゼを含んでいる哺乳動物細胞で、単一のcDNA
を発現させて機能的なNKSFを生産することができる。

２つのサブユニットを哺乳動物細胞で同時に発現する
ことが必要である場合は、２つの異なった選別可能な遺
伝子またはマーカーを用いて、２つのcDNAを細胞へ導入
しなければならない。実施例７で報告するように、これ
は、一方のマーカーとしてジヒドロ葉酸還元酵素（DHF
R）遺伝子を、他方のマーカーとしてアデノシンデアミ
ナーゼ（ADA）を使用して、CHO細胞で容易に達成でき
る。任意の哺乳動物細胞系で独立的に選別できる２つの
遺伝子の任意の組合わせがこの目的に有用である。例え
ばCHO細胞系でADAの選別下に、一方のサブユニットの発
現を独立的に生じさせ、別の細胞系でDHFRの選別下に、
他方のサブユニットの発現を生じさせる。２重選別のも
とに、細胞系をポリエチレングリコール中で融合して、
両方のサブユニットを発現する安定な系を生産する。別
法として、２つのDNAを同一の細胞へ同時にまたは順次
導入し、それによって活性なNKSFを発現する系を生産す
る。

ついで標準的な免疫学的、生物学的、または酵素的な
検定によって、生産物の発現について安定な形質転換体
を選別する。NKSFポリペプチドを暗号化しているDNAお
よびmRNAの存在は、サザンブロッティングおよびRNAブ
ロッティングのような標準的な方法によって検出し得
る。COS−１サル細胞のような好適な宿主細胞へ発現ベ
クターDNAを導入したのちの数日間、ポリペプチドを暗
号化しているDNAの一過性の発現が、培地中のタンパク
質活性または免疫検定によって無選別に測定される。

また当業者であれば、例えば好適な酵素で、対応する
プラスミドからNKSFサブユニットのDNA配列を挿入し、
周知の組換え遺伝子工学技術を用いて、pJL3およびpJL4
［ゴーら、EMBO・ジャーナル、４巻、645〜653頁（1985
年）］、およびpMT2（pMT2−VWFで始まる、ATCC＃6712
2、PCT出願PCT/US87/00033参照）］のようなその他の既
知のベクターを使用することにより、pXMベクターに匹
敵し得るその他の哺乳動物の発現ベクターを組立てるこ
とができる。両方のNKSFサブユニットとともにこれらの
ベクターを好適な宿主細胞へ形質転換することによっ
て、NKSFポリペプチドの発現を生じることができる。

b.細菌発現系同様に当業者であれば、暗号配列を挟んで隣接する任
意の哺乳動物性調節配列を除去し、細菌性調節配列を挿
入して、細菌細胞により、この発明のNKSFサブユニット
を細胞内または細胞外に発現する細菌性ベクターを作り
出すことによって、NKSFサブユニットを暗号化している
配列を操作することができる。当業界で既知のように、
NKSFポリペプチドを暗号化しているDNAをさらに修飾し
て、細菌性発現を最適化するさまざまなコドンを含有さ
せ得る。当業界で既知の方法により、好ましくは成熟NK
SFサブユニットを暗号化している配列を、成熟NKSFポリ
ペプチドの細菌発現、分泌およびプロセッシングを可能
にする分泌先導ポリペプチドが暗号化されているヌクレ
オチドへ、枠組みのまま機能的に結合する。そのような
分泌系を使用して、NKSFの両方のサブユニットをエシェ
リキア・コリで同時発現し、活性なヘテロ２量体の分泌
を生じることが期待される。この方法によって活性なキ
メラ抗体断片が得られた［例えばビッターら、サイエン
ス、240巻、1041〜1043頁（1988年）参照］。

別法として、細胞内に発現するベクターを使用して、
エシェリキア・コリで２つの異なったcDNAから個々のサ
ブユニットを別々に成熟した形で発現し、既知の方法に
よりサブユニットを別々に単離し、これを混合して再生
する（例えば米国特許第4512922号参照）。

どちらの経路を介しても、細菌宿主細胞で発現させた
化合物を、ついで回収し、精製し、そして／または物理
化学的、生化学的および／または臨床的な指標につい
て、すべて既知の方法により特性を決定する。

c.昆虫または酵母細胞発現同様の操作によって昆虫細胞でNKSFポリペプチドを発
現するための昆虫ベクターの組立てが実施できる（例え
ば公開されたヨーロッパ特許出願第155476号に報告され
た方法、参照）。NKSFサブユニットを単一のcDNAから誘
導したのであれば、このcDNAは昆虫細胞で発現され得
る。もしそうではなく、NKSFサブユニットが２つの異な
ったcDNAから誘導したのであれば、各サブユニットを昆
虫細胞ベクターへ別々に挿入し、得られた２つのベクタ
ーを昆虫細胞へ同時導入して、生物学的に活性なNKSFを
発現する。

同様に酵母調節配列を使用して酵母ベクターを組立
て、酵母細胞で個々のNKSFサブユニットを同時発現する
か、あるいはもし、タンパク質が単一の前駆体から誘導
されたのであれば、その前駆体を暗号化しているcDNAを
酵母細胞で発現して、細胞外に分泌される活性なNKSFヘ
テロ２量体を生産する。別法として、個々のサブユニッ
トを酵母で細胞内に発現し、個々のポリペプチドを単離
し、最後に互いに再生して活性なNKSFを得る（例えば、
公開されたPCT出願WO86/00639、およびヨーロッパ特許
出願EP123189に報告された方法を参照）。

［実施例７］高水準のNKSFを発現するCHO細胞系の組立てこの発明のNKSFタンパク質を哺乳動物細胞から高水準
で生産する１つの方法は、個々のNKSFサブユニットを暗
号化している２つのcDNAの多重コピーを含んだ細胞を組
立てるか、または、もしサブユニットが単一ポリペプチ
ドから誘導されるのであれば、NKSF前駆体を暗号化して
いるcDNAのコピーを含んだ細胞を組立てることを含む。

後者の場合、細胞が濃度増大するメトトレキセート
（MTX）を含有するように、例えばカウフマンおよびシ
ャープの方法により、単一のcDNAを増幅可能なマーカー
（例えばDHFR遺伝子）と同時トランスフェクトする［カ
ウフマンおよびシャープ、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー（1982年）、前掲］。この方法は多
数の異なった細胞型に使用できる。

例えばNKSF前駆体遺伝子を含んでいるpMXベクター
（実施例６）を、この前駆体遺伝子の発現を可能にする
他のプラスミド配列と機能的に組合わせて、pAdD26SVpA
3のようなDHFR発現プラスミド［カウフマン、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、82巻、689〜693頁（1
985年）］と一緒に、リン酸カルシウム共沈およびトラ
ンスフェクションによって、DHFR欠乏CHO細胞DUKX−B I
Iへ導入する。透析したウシ胎児血清によるα培地にお
ける増殖によって、DHFR発現形質転換体を選別する。生
物検定、免疫検定、またはRNAブロッティングにより、
形質転換体をNKSF発現について検査し、つぎに陽性プー
ルを、MTXの濃度増大（0.02、0.2、1.0、５μＭの段階
系列）による増殖の増幅について選別する［カウフマン
ら、モレキュラー・セル・バイオロジー、５巻、1750頁
（1983年）］。増幅された系をクローン化し、NKSFタン
パク質発現をγ−インターフェロン誘発検定によってモ
ニターする。MTX耐性水準の増大とともにNKSF発現が増
大することが期待される。

もし２つのNKSFポリペプチドがそれぞれ別のmRNAから
誘導されるのであれば、それぞれ対応するcDNAをCHO細
胞で同時発現する。例えばDHFRおよびADAのような２種
の異なった選別可能なマーカーを使用し得る。cDNAの一
つは、NKSFサブユニットの１つを発現するDHFR系（例え
ばベクターpXM）を使用して発現し、また単一前駆体NKS
Fタンパク質の際に報告したように、pAdD26SVpA3を使用
してDHFRを発現する。第２のサブユニットもベクターpX
Mを使用して発現されるが、このマーカーはプラスミドp
SV2ADAとの同時トランスフェクトを介して得られ［カウ
フマンら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、8
3巻、3136頁（1986年）］、哺乳動物細胞でADAの発現を
指令する。第２のサブユニットを含んだpXMベクター組
立て体を、pSV2ADAと一緒にDHFR欠乏CHO DUKX−B II細
胞へトランスフェクトする。トランスフェクトされた細
胞を２′−デオキシコフォルマイシン（dCF）の0.01μ
ｇ〜40μｇの段階的に増大する濃度で、増殖について選
別する。個々のcDNAの発現（一方のサブユニットは１細
胞系でDHFR選別下に、他方のサブユニットは別の細胞系
でADA選別下に）を、転写を試験するmRNAブロッティン
グおよびタンパク質生産を試験する免疫検定の組合わせ
によって実施する。最後に、ADA選別下にサブユニット
の１つを発現する細胞とDHFR選別下に他方のサブユニッ
トを発現する細胞とを、当業界で十分確立された方法を
用いてポリエチレングリコール中で融合し、dCFおよびM
TXのいずれにも耐性で、両方のサブユニットを発現する
単一細胞系を生産し、生物学的に活性なNKSFを生産す
る。

どちらかの薬物の選別下に、どちらかのサブユニット
を発現する細胞系を生成することもできる。つぎに他方
のサブユニットを発現するcDNAを第２の薬物の選別下に
導入し、両方のサブユニットを同時に発現する細胞を生
産し得る（例えば公開されたPCT国際出願WO88/08035
の、DHFRへ結合した第１の遺伝子とADA遺伝子へ結合し
た第２の遺伝子を別個に増幅する例示的な報告を参
照）。

また両方のNKSFサブユニットを発現する２つのpMX組
立て体を、DHFRを発現するプラスミドおよびADAを発現
するプラスミドと混合し得る。両方の薬物を組合わせた
選別を使用して、形質転換体をNKSF活性について直接試
験し、ヘテロ２量体を発現する細胞系を得ることができ
る。

上述の発現系のいずれの場合でも、得られた細胞系を
好適な薬物選別によってさらに増幅し、得られた細胞系
を再クローン化して、本明細書で報告するγ−インター
フェロン誘発検定を使用して発現水準を評価することが
できる。

［実施例８］ヒトNKSFの生物学的活性下記の検定は、実施例２で報告した均質なNKSF、また
は部分的に精製したNKSF変異体のいずれかを使用して実
施した。分子の組換え変異体は、これらの同一の検定ま
たはその他の検定でNKSFの生物学的特性を有することが
期待される。

新たに調製したヒト末梢血の単核球細胞（PBMC）、ま
たはフィトヘマグルチニン（PHA）で誘発した芽球をNKS
Fとともに培養すると、上清中に有意なγ−インターフ
ェロン量が検出される。さらにNKSFは、γ−インターフ
ェロン生産誘発においてIL−２、ホルボールジブチレー
ト（PdBu）、およびPHAと相乗的に作用する。ノーザン
ブロット分析で、NKSFは単独または他の因子と組合わせ
て、γ−インターフェロンmRNAの蓄積を誘発することが
分かった。γ−インターフェロン伝達情報は、精製した
Ｔ細胞集団およびNK細胞集団のどちらでも見いだされ
た。タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（CHX）と
ともに前温置したのち、NKSFで刺激するとγ−インター
フェロンmRNAの超誘発を生じる。HLA−DR（＋）補助細
胞はＴ細胞およびNK細胞によるγ−インターフェロン産
生に必要である。γ−インターフェロンmRNAの誘発は、
PHA芽球のNKSF処理後１時間以内に検出できる。以下に
この検定の詳細を報告する。

a.γ−インターフェロン誘発検定ヒト末梢血リンパ球（PBLs）培養におけるγ−インタ
ーフェロン（γ−IFN）発現誘発によって、NKSF活性を
測定した。この検定では、10％加熱失活させたFCSを加
えたRPMI1640培地に浮遊したヒトPBLs（10⁷細胞/ml）10
0μｌを微量検定プレート（Ｕ−ボトム、96−ウエル、
コスター社、ケンブリッジ、MA）で試験試料100μｌへ
添加し、５％CO₂気流中、37℃で18時間インキュベート
した。試験試料は、精製したNKSF、48時間ホルボールジ
エステルで刺激したRPMI8866細胞から透析した無細胞上
清、および組換え体IL−２（ジェネティック・インスチ
チュート社、PCT出願WO85/05124参照）を含有してい
る。インキュベーションしたのち、各ウエルから無細胞
上清100μｌを棄て、産生されたγ−IFN量を放射線免疫
検定（セントコール・γ−インターフェロン・ラジオイ
ムノアッセイ、セントコール社、マルバーン、PA）によ
り測定した。1ml当たりのNKSF1単位は、NKSFの至適濃度
の存在で生産される最大γ−IFN量の1/2を生産するのに
必要な濃度である。

各ウエルで生産されるγ−IFN量と培養内のNKSF量と
の間にはプラスの相関がある。

γ−IFN以外にも、NKSFは、Ｔ細胞およびNK細胞のGM
−CSFおよび腫瘍壊死因子生産を誘発する。上述のよう
にこれらのサイトカイン生産の検定を実施し、上清をサ
イトカイン類の存在について特異的な生物学的検定また
は放射線免疫検定によって検定した［カチュリら、ジャ
ーナル・オブ・エキスペリメンタル・メジシン、165
巻、1581〜1594頁（1987年）］。別法として、サイトカ
イン遺伝子の誘発はNKSF処理したリンパ球内の３種のサ
イトカインのmRNA転写物の蓄積を評価することによって
測定する。リンパ球をNKSFと４〜18時間培養し、確立さ
れた方法によってRNAを抽出し、アガロースゲル電気泳
動によって分画し、ニトロセルロースでブロットし、³²
P−標識cDNAプローブで、γ−IFN、GM−CSF、または腫
瘍壊死因子遺伝子に対して形質転換する（ノーザンブロ
ッティング）。形質転換の程度はオートラジオグラフィ
ーおよびデンシトメトリーによって測定する。

NKSFは、精製したヒトNK細胞からのγ−IFNおよびTNF
生産を誘発する。（ａ）のγ−インターフェロン誘発検
定で報告した検定では、NK細胞は２つの作用機構によっ
て各種の標的細胞を溶解することができる。１つの作用
機構は、特異的な感作なしに白血病細胞系および固形腫
瘍由来細胞系、ウイルス感染細胞、およびある場合に
は、正常細胞を含む各種の標的細胞を一過性に溶解す
る。第２の作用機構はADCCである。予備的な根拠から、
NKSFは、NK細胞のFcレセプターへ結合可能なFc部分をIg
G抗体で被覆した標的細胞を、一層効率的に溶解するNK
細胞の細胞溶解能を増強し得ることが判明した。

b.NK検定 NKSFによるNK細胞の一過性細胞障害性の増強を検定す
るため、PBLsまたは精製したNK細胞（５×10⁶細胞/ml）
を10％加熱失活させたFCSを加えたRPMI1640培地で、NKS
Fの各種希釈度の存在で18時間インキュベートする。つ
いでPBLsを洗浄し、Ｕ−ボトム微量滴定板の10⁴ ⁵¹Cr−
標識した標的細胞へ、PBLsを、1:1〜100:1のPBL−標的
細胞比で添加する（最終容量200μｌ）。４時間後、プ
レートを遠心し、無細胞上清を採取して、細胞からの⁵¹
Cr−標識の放出によって標的細胞の溶解を評価する。標
的細胞として悪性造血細胞系（即ち、K562、ダウディ、
U937、HL−60、ML3、モルト４、ジャーカット、THP−
１）、固形腫瘍由来細胞系（横紋筋肉腫、黒色腫）、お
よび正常な***由来繊維芽細胞株について検定を行う
と、NKSFはNK細胞の細胞障害性を数倍増大する。NKSFに
よるNK細胞性細胞障害性の増強は、γ−IFN、腫瘍壊死
因子またはIL−２の産生による２次的なものではなく、
NKSFで処理したPBLによって生じたものである。細胞障
害性検定、NK細胞の精製方法、およびサイトカインによ
って増強されたNK細胞を介する増強の定量的な評価につ
いては、G.トリンキエリら、ジャーナル・オブ・エキス
ペリメンタル・メジシン、147巻、1314頁（1978年）、
G.トリンキエリら、ジャーナル・オブ・エキスペリメン
タル・メジシン、160巻、1147頁（1984年）、およびB.
ペルッシアら、ナチュラル・イミュニティー・アンド・
セル・グロウス・レギュレーション、６巻、171〜188頁
（1987年）］に詳細に報告されている。

c.ADCC検定標準的な抗体依存性細胞障害性の検定における予備的
な成績で、この発明の部分的に精製したNKSFは、抗体被
覆した腫瘍標的細胞のNK細胞致死作用を投与量に比例し
た形で増強することが判明した。NK細胞のFcレセプター
へ結合し得る抗体に対するNK細胞のADCC反応は、NKSFの
添加によって増強される。

d.NKSFの助マイトジェン効果 10％加熱失活させたヒトAB血清を加えたRPMI1640培地
200μｌでPBLs（0.5×10⁶/ml）を培養する。３日後およ
び６日後に、PBLsを³H−チミジンで６時間パルスし、ス
カトロン・セル・ハーベスターを使用してガラスフィル
ターに細胞を採取し、パッカード・トリカーブ・ベータ
・カウンターを使用する液体シンチレーションにより細
胞内の³H−チミジンを計数することにより、DNA合成
（増殖）を評価する。NKSFは、それ自身によるPBL増殖
効果はごく僅かであるが、フィトヘマグルチニンとの培
養６日目およびホルボールジエステル（TPA10^-8またはP
DBu10^-7）との培養３日目および６日目でいずれも強い
マイトジェン誘起効果を示す。細胞周期分析は、ロンド
ンらによる免疫蛍光染色［ロンドンら、ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー、137巻、3845頁（1986年）］をDNA染
色と組合わせた手技を使用するフローサイトメトリー
（サイトフルオログラフ50H、オルト・ダイアグノステ
ィックス社）によって実施する。この分析から、NKSFの
マイトジェン誘発効果によって影響されたPBLsはＴ細胞
のCD4またはCD8でいずれも陽性であることが判明した。

e.GM−CSF誘発検定ヒトPBLsの培養でGM−CSF発現の誘発を測定した。こ
の検定で、10％加熱失活させたFCSを加えたRPMI1640培
地に浮遊したヒトPBLs（10^-7細胞/ml）100μｌを、微量
滴定板（Ｕ−ボトム、96−ウエル、コスター社、ケンブ
リッジ、MA）で試験試料100μｌへ添加し、５％CO₂気流
中で37℃で18時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、各ウエルから無細胞上清100μｌを棄て、異な
ったエピトープを認識するヒトGM−CSFに対する２種の
マウスモノクローナル抗体（3/8.20.5および2/3.1、ジ
ェネティックス・インスチチュート社より提供）を使用
する酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）により、産生さ
れたGM−CSF量を測定した。組換え体ヒトGM−CSF（ジェ
ネティックス・インスチチュート社）を標準として使用
して、この検定の検出限界は50pg/mlであった。

この発明を実施することによって、多数の修飾および
変更を当業者へもたらすことが期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ前置審査 (72)発明者トリンチェリ、ジョルジオアメリカ合衆国19104 ペンシルベニア、ウィンウッド、ウィスター・ロード 355番 (72)発明者ペルシア、バイスアメリカ合衆国19146 ペンシルベニア、フィラデルフィア、ウェイバリー・ストリート 2302番 (72)発明者コバヤシ、ミチコ神奈川県横浜市港北区大豆戸町931―１大倉山Ｂ―513番 (72)発明者クラーク、スティーブン・シーアメリカ合衆国01890 マサチューセッツ、ウィンチェスター、ジョンソン・ロード 122番 (72)発明者ウォング、ゴードン・ジーアメリカ合衆国02130 マサチューセッツ、ジャマイカ・プレイン、アパートメント 10、ジャマイカ・ウェイ 40番 (72)発明者ヒューウィック、ロッドニー・エムアメリカ合衆国02173 マサチューセッツ、レキシントン、ウッドクリフ・ロード 16番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/24 C12N 15/19 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＬＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト末梢血リンパ球（PBL）においてイン
ビトロでγ−インターフェロンの生産を誘発することが
出来、他のタンパク性物質を実質上伴わないナチュラル
キラー細胞刺激因子（NKSF）タンパク質であって、SDS
PAGE非還元性条件下で見掛け分子量約70〜80kDを有
し、かつ（ａ）SDS PAGE還元性条件下で見掛け分子量
約40kDであって、Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ
−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−
Ｅ−Ｍを含むＮ末端アミノ酸配列を有する第１サブユニ
ットと（ｂ）SDS PAGE還元性条件下で見掛け分子量約3
0〜35kDであって、Ｘ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ｘ−Ｐ−
Ｄ−Ｐ−Ｘ−Ｍ−Ｆ−Ｐ（ここで、Ｘは任意アミノ酸で
ある。）を含むＮ末端アミノ酸配列を有する第２サブユ
ニットを含んでなるタンパク質。
【請求項２】化学的にからなるアミノ酸配列の１またはそれ以上を含んでい
る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】生物学的にγ−インターフェロン誘発検定
で1mg当たり１×10⁷希釈単位より大きい比活性を有す
る、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】次の特性の一つまたはそれ以上を有する、
請求項１に記載のタンパク質：（１）等電点ゲル電気泳動で4.3の等電点、（２）等電点ゲル電気泳動で4.8の等電点、（３）ヒドロキシルアパタイトカラムから単一のピーク
として溶出、（４）ヘパリン−セファロースカラムから単一のピーク
として溶出、（５）FPLCモノＱカラムから単一のピークとして溶出、（６）PBLによるGM−CSF誘発検定における生物学的活
性、（７）白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させる活性
化NK細胞における生物学的活性、（８）フィトヘマグルチニン活性化Ｔリンパ球を使用す
る腫瘍壊死因子誘発検定における生物学的活性、（９）末梢血Ｔリンパ球に対する共***促進活性。
【請求項５】RPMI8866から得たならし培地をQAEゼータ
調製用カートリッジ、レンチルレクチンカラム、ヒドロ
キシルアパタイトカラム、ヘパリンセファロースカラム
および高速タンパク質液体クロマトグラフィー・モノＱ
カラムを通して順次精製し、後段のカラムからNKSFタン
パク質が単一ピークとして溶出することによって生産さ
れた、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】RPMI8866から得たならし培地を、QAEゼー
タ調製用カートリッジ、レンチルレクチンカラム、ヒド
ロキシルアパタイトカラム、ヘパリンセファロースカラ
ムおよび高速タンパク質液体クロマトグラフィー・モノ
Ｑカラムを通して順次精製し、ここでNKSFタンパク質が
後段のカラムから単一ピークとして溶出されることから
なる、均質な請求項１に記載のNKSFタンパク質の生産方
法。
【請求項７】モノＱカラムの溶出物をさらにゲル濾過ク
ロマトグラフィーにかけることからなる、請求項６に記
載の方法。
【請求項８】ゲル濾過クロマトグラフィーの前に逆層HP
LC精製を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】請求項１に記載のNKSFタンパク質またはそ
のサブユニットの治療的有効量を製薬上許容し得る有効
な担体に含有させてなる感染症処置用医療組成物。
【請求項１０】サイトカイン、造血促進因子または成長
因子の治療的有効量を追加的にさらに含有してなる、請
求項９に記載の組成物。
【請求項１１】サイトカインがIL−１、IL−２、および
IL−６からなる群から選ばれたものである、請求項10に
記載の組成物。
【請求項１２】請求項１に記載のタンパク質の部分に対
応し、SDS PAGE還元性条件下で見掛け分子量約40kDで
あって、Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ
−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍを
含むＮ末端アミノ酸配列を有するサブユニット。
【請求項１３】請求項１に記載のタンパク質の部分に対
応し、SDS PAGE還元性条件下で見掛け分子量約30〜35k
Dであって、Ｘ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ｘ−Ｐ−Ｄ−Ｐ
−Ｘ−Ｍ−Ｆ−Ｐ（ここで、Ｘは任意アミノ酸であ
る。）を含むＮ末端アミノ酸配列を有するサブユニッ
ト。