JP2884096B2 - Plant regeneration promoter - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の組織とか器官もしくはこれらの一部
あるいは培養細胞を培養するにあたって使用する植物体
再生促進剤に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plant regeneration promoter used for culturing plant tissues or organs, a part thereof, or cultured cells.

（従来の技術とその課題） 一般に、植物組織培養においては、植物の組織や器官
あるいは培養細胞を、生長に必要な無機塩類、ビタミ
ン、糖などのほかに植物ホルモン（オーキシン類、サイ
トカイニン類、ジベレリン類、エチレン等）を加えた培
地を用いて培養し、カルスをつくらせたり、そのカルス
を植え継いで培養を続け有用物質を得たり、またはその
カルスから植物体を再生（復元）させたりしている。(Prior art and its problems) Generally, in plant tissue culture, plant hormones (auxins, cytokinins, gibberellins, etc.) are added to plant tissues, organs or cultured cells in addition to inorganic salts, vitamins and sugars necessary for growth. Cultivation using a culture medium supplemented with various types of ethylene, etc.) to produce calli, to continue the cultivation by inheriting the callus and to obtain useful substances, or to regenerate (restore) plants from the callus ing.

植物組織培養技術を用いて植物体を再生させる方法と
しては、出発材料により脱分化系と分化系の２種に大き
く分けられる。脱分化系はカルスや液体培養細胞などの
脱分化した状態を経由して植物体を再生させる方法で、
具体的にはクラスターカルスから多くのシュートを発生
させ、発生した各々のシュートから発根させ幼植物体を
再生させる方法や細胞に直接不定胚（体細胞胚）を形成
させ幼植物体にまで再生させる方法がある。不定胚を経
由して植物体を再生させる場合においては、不定胚の生
長は、その段階によって球状胚、心臓型胚、魚雷型胚、
成熟胚の順に生長していくことが知られている。一方、
分化系では成長点を含む茎頂、休眠芽、側芽、胚、種子
などが出発材料になり、さらに成長点を含まない胚軸、
子葉、茎なども用いられる。この系では上述した植物組
織にマルチプルシュートを形成させ、ついでこれらを切
除した単一シュートから連続的にマルチプルシュートを
発生させる連続シュート生産システムを確立し、最終的
に切除したシュートから発根させ幼植物を再生させる方
法がある。Methods for regenerating a plant using a plant tissue culture technique are roughly classified into two types, a dedifferentiation system and a differentiation system, depending on a starting material. The dedifferentiation system is a method of regenerating plants through dedifferentiated states such as callus and liquid cultured cells,
Specifically, a method of generating a large number of shoots from cluster calli, rooting from each generated shoot and regenerating young plants, or regenerating seedlings by forming somatic embryos (somatic embryos) directly on cells There is a way to make it happen. In the case of regenerating a plant body through an adventitious embryo, the growth of the adventitious embryo depends on the stage, such as globular embryo, heart embryo, torpedo embryo,
It is known that mature embryos grow in order. on the other hand,
In the differentiation system, the shoot apex containing the growth point, dormant bud, lateral bud, embryo, seed, etc. are the starting materials, and the hypocotyl without the growth point,
Cotyledons, stems and the like are also used. In this system, a multiple shoot is formed in the above-mentioned plant tissue, and then a continuous shoot production system for continuously generating multiple shoots from a single shoot that has been excised is established. There are ways to regenerate plants.

脱分化系からの植物体再生においては、培養細胞を長
期間継代培養していると、一般に分化能が低下すること
が多く、培養細胞からの不定胚の形成率やカルスからの
シュート、根の形成率は低くなる。また、人為的に不定
胚を誘導する場合、培地の無機塩類組成もさることなが
ら、植物ホルモンであるオーキシンやサイトカイニンの
種類、濃度、組合せについて検討することが一般的な手
順になっている。しかし、オーキシンやサイトカイニン
の処理だけでは不定胚形成やカルスからのシュートや根
の形成を誘導できない植物種も多い。特に不定胚は、魚
雷型胚まで生長すると理由は定かではないが、生長を停
止して植物体にまで再分化する率が極めて低下するとい
う現象が起こる。一方、分化系での植物体再生では、種
々の植物や種々の組織を用いて脱分化系と同様にオーキ
シンやサイトカイニンなどの植物ホルモンの種類、濃
度、組合せや、培地の無機塩類、微量有機成分組成など
について検討されているが、未だに植物や組織によって
はシュート・根の形成をしないものもある。また、脱分
化系、分化系のいずれにおいても、植物ホルモンを用い
て植物組織培養する場合には、植物ホルモンの種類やそ
の添加量によっては、増殖や分化を阻害する等の問題が
あった。従って、各種の植物組織や器官あるいは培養細
胞からの不定胚形成率を高め、さらには不定胚の生長や
植物体への再生を効果的に促進させる方法が望まれると
ころである。In plant regeneration from a dedifferentiated system, if the cultured cells are subcultured for a long period of time, the differentiation ability generally decreases in many cases, and the rate of adventitious embryo formation from the cultured cells, shoots from callus, roots Is low. Further, when artificially inducing somatic embryos, it is a general procedure to study the types, concentrations, and combinations of auxins and cytokinins, which are plant hormones, in addition to the inorganic salt composition of the medium. However, there are many plant species which cannot induce somatic embryo formation or shoot and root formation from callus only by treatment with auxin or cytokinin. In particular, it is not clear why the somatic embryo grows to a torpedo type embryo, but the phenomenon occurs in which the growth is stopped and the rate of redifferentiation to a plant is extremely reduced. On the other hand, in plant regeneration in a differentiation system, the types, concentrations and combinations of plant hormones such as auxins and cytokinins, as well as inorganic salts and trace organic components in a medium, are used in the same manner as in the dedifferentiation system using various plants and various tissues. Although the composition and the like have been studied, some plants and tissues still do not form shoots and roots. In addition, in any of the dedifferentiation system and the differentiation system, when plant tissue is cultured using plant hormones, there is a problem that growth and differentiation are inhibited depending on the type of plant hormones and the amount of plant hormones added. Therefore, there is a need for a method of increasing the rate of adventitious embryo formation from various plant tissues, organs, or cultured cells, and effectively promoting the growth of adventitious embryos and regeneration into plants.

そこで本発明は、植物組織や培養細胞などを増殖ある
いは分化させたり植物体を再生させたりするにあたって
使用するときわめて効果的な植物体再生促進剤を提供す
ることを目的とする。Therefore, an object of the present invention is to provide a plant regeneration promoter that is extremely effective when used in growing or differentiating plant tissues or cultured cells or regenerating plants.

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記課題の解決のために光合成原核微
生物に着眼して種々検討を加えてきたが、その培養濾液
や抽出物中の特定の画分、具体的には、核酸画分，蛋白
質画分，多糖画分が特に効果的であることを知見し、本
発明を完成させるに到った。即ち、本発明は、植物の組
織とか器官もしくはこれらの一部あるいは培養細胞を培
養するにあたって使用する植物体再生促進剤であって、
光合成原核微生物の培養濾液及び／又は抽出物中の、核
酸画分・蛋白質画分・多糖画分の少なくとも一画分を含
有してなる植物体再生促進剤を要旨とする。(Means for Solving the Problems) The present inventors have focused on photosynthetic prokaryotic microorganisms in order to solve the above-mentioned problems, and have made various studies. However, specific fractions in the culture filtrate or extract, Specifically, they have found that a nucleic acid fraction, a protein fraction, and a polysaccharide fraction are particularly effective, and have completed the present invention. That is, the present invention is a plant regeneration promoter used in culturing plant tissues or organs or a part thereof or cultured cells,
The gist of the present invention is a plant regeneration promoter comprising at least one of a nucleic acid fraction, a protein fraction, and a polysaccharide fraction in a culture filtrate and / or extract of a photosynthetic prokaryotic microorganism.

本発明で利用できる光合成原核微生物としては、シア
ノバクテリア類（「R.Rippka and R.Y.Stanier:J.Gen.M
icrobiol.,111,1−61（1979）」により種々分類されて
いる）や光合成細菌類などがある。シアノバクテリア類
としては、例えば、クロログレオピシス属（Chlorogloe
opisis sp.）、デルモカルパ属（Dermocarpa sp.）、ノ
ストック属（Nostoc sp.）、シネココッカス属（Synech
ococcus sp.）、オスシラトリア属（Oscillatoria s
p.）があり、具体例としては、クロログレオピシス属
（Chlorogloeopisis sp.）ATCC27181、デルモカルパ属
（Dermocarpa sp.）ATCC29371、ノストック属（Nostoc
sp.）ATCC27895、シネココッカス属（Synechococcus s
p.）ATCC27192、ATCC29404、ATCC29534、ATCC27170、オ
スシラトリア属（Oscillatoria sp.）ATCC27906などが
挙げられ、また、光合成細菌類としては、例えば、ハロ
バクテリウム属（Halobacterium sp.）、ロドシュード
モナス属（Rhodopseudomonas sp.）、ロドスピリラム属
（Rhodospirillum sp.）があり、具体例としては、ハロ
バクテリウム・クチルブルム（Halobacterium cutirubr
um）ATCC33170、ハロバクテリウム・メディテラネイ（H
alobacterium mediterranei）ATCC33500、ハロバクテリ
ウム・サッカルホルム（Halobacterium saccharovoru
m）ATCC29252、ハロバクテリウム・サリナリウム（Halo
bacterium salinarium）ATCC19700、ハロバクテリウム
・ソドメンセ（Halobacterium sodomense）ATCC33755、
ロドシュードモナス・アシドフィラ（Rhodopseudomonas
acidophila）ATCC25092、ロドシュードモナス・ルティ
ラ（Rhodopseudomonas rutila）ATCC33872、ロドシュー
ドモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroi
des）ATCC17024、ロドシュードモナス・ビリディス（Rh
odopseudomonas viridis）ATCC19567、ロドシュードモ
ナス・ブラスティカ（Rhodopseudomonas blastica）ATC
C33485、ロドスピリラム・モリシアナム（Rhodospirill
um molischianum）ATCC14031、ロドスピリラム・ホトメ
トリクム（Rhodospirillum photometricum）ATCC2787
1、ロドスピリラム・ルブラム（Rhodospirillum rubru
m）ATCC277、ATCC17031、ロドスピリラム・テヌエ（Rho
dospirillum tenue）ATCC25093などが挙げられる。Examples of photosynthetic prokaryotic microorganisms usable in the present invention include cyanobacteria (R. Rippka and RYStanier: J. Gen. M.
icrobiol., 111, 1-61 (1979) ") and photosynthetic bacteria. As the cyanobacteria, for example, genus Chlorogloe (Chlorogloe)
opisis sp., Dermocarpa sp., Nostoc sp., Synechococcus (Synech)
ococcus sp.), Oscillatoria s
p.), and specific examples include the genus Chlorogloeopisis sp. ATCC27181, the genus Dermocarpa sp. ATCC29371, and the genus Nostock (Nostoc).
sp.) ATCC27895, Synechococcus genus (Synechococcus s.
p.) ATCC27192, ATCC29404, ATCC29534, ATCC27170, Oscillatoria sp. ATCC27906, etc. Examples of the photosynthetic bacteria include, for example, genus Halobacterium (Halobacterium sp.) and genus Rhodopseudomonas sp. ), Rhodospirillum sp., And specific examples include Halobacterium cutirubr.
um) ATCC33170, Halobacterium mediterranei (H
alobacterium mediterranei ATCC33500, Halobacterium saccharovoru
m) ATCC29252, Halobacterium salinarium (Halo)
bacterium salinarium) ATCC19700, Halobacterium sodomense ATCC33755,
Rhodopseudomonas
acidophila) ATCC25092, Rhodopseudomonas rutila ATCC33872, Rhodopseudomonas spheroi
des) ATCC17024, Rhodes Pseudomonas viridis (Rh
odopseudomonas viridis) ATCC19567, Rhodopseudomonas blastica ATC
C33485, Rhodospirill
um molischianum) ATCC14031, Rhodospirillum photometricum ATCC2787
1. Rhodospirillum rubru
m) ATCC277, ATCC17031, Rhodospirillum tenue (Rho
dospirillum tenue) ATCC25093.

上記した光合成原核微生物あるいはその変種や変異株
に限ることなく、天然から分離した海洋性、淡水性の光
合成原核微生物も本発明において利用できる。また、こ
れらの菌体を１種または２種以上併用してもよい。Marine and freshwater photosynthetic prokaryotic microorganisms isolated from nature can be used in the present invention, without being limited to the above-mentioned photosynthetic prokaryotic microorganisms or their variants and mutants. These cells may be used alone or in combination of two or more.

光合成原核微生物の培養は、通常、無機塩類等を含む
培地を用い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外
開放培養で行い得るが、本発明においては、目的とする
光合成原核微生物が天然にある程度豊富に存在するなら
ば、その菌体の生育存在する海水あるいは淡水を培養液
とすることができる。Culture of photosynthetic prokaryotic microorganisms can be usually performed using a medium containing inorganic salts and the like, and can be performed by tank culture or outdoor open culture using sunlight, but in the present invention, the intended photosynthetic prokaryotic microorganisms are naturally rich to some extent. , The seawater or freshwater in which the cells grow can be used as the culture solution.

光合成原核微生物の培養濾液は、上述した培養法で得
られる培養液を遠心分離あるいは濾過などを行って取得
されるが、更に、この培養濾液を減圧濃縮などにより濃
縮してもよい。The culture filtrate of the photosynthetic prokaryotic microorganism is obtained by centrifuging or filtering the culture solution obtained by the above-described culture method, and the culture filtrate may be further concentrated by vacuum concentration or the like.

また、光合成原核微生物の抽出物は、例えば、前記の
ようにして得られた菌体を必要に応じて適宜破砕し、こ
れを常温または加熱した適当な溶媒と接触させて行い得
る。ここで、溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を
単独または複数併用してもかまわないが、一般的には水
性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水単独あるいは
酸、塩基、塩類、または有機溶媒を溶解した水溶液など
が使用できる。また、メタノール、エタノール、酢酸エ
チルエステル、エーテル等の有機溶媒で抽出後、有機溶
媒を除去し水に溶解させてもよい。The extract of photosynthetic prokaryotic microorganisms can be obtained, for example, by crushing the cells obtained as described above as necessary and contacting them with an appropriate solvent at room temperature or heated. Here, as the solvent, various solvents may be used alone or in combination depending on the cells, but an aqueous solvent is generally preferred. As the aqueous solvent, water alone or an aqueous solution in which an acid, a base, a salt, or an organic solvent is dissolved can be used. After extraction with an organic solvent such as methanol, ethanol, ethyl acetate or ether, the organic solvent may be removed and dissolved in water.

上述した光合成原核微生物の培養濾液あるいは抽出物
からの核酸、蛋白質、多糖の画分は、例えば、硫安塩
析、有機溶媒沈殿などの分別沈殿法、ゲル濾過による精
製法、陰イオン交換体，陽イオン交換体などのイオン交
換体を用いての精製法、活性炭，シリカゲルなどの吸着
力利用による精製法といった一般的な分画法を必要に応
じて適宜組合せ活用して得ることができる。このように
して得られた核酸、蛋白質、多糖の画分を促進剤として
使用にするにあたっては、これら画分をそのまま使用し
てもよいし、また、適宜濃縮あるいは希釈して使用して
もよいし、更には、これらの分画液を減圧乾燥、凍結乾
燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉末としたものを必要に応
じて適宜タブレット化したりして使用してもよいし、更
にまた、これら各画分を混合したものとしたり、通常の
培養に使用される植物ホルモン、ココナッツミルク、カ
ゼイン分解物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて含有
させてもよいし、状態としても、ゲル状その他の適宜に
なすことができる。培地と一体化しておくことも可能で
あり、人工胚乳用物として準備しておけば、高い発芽率
の人工種子ともなる訳である。The fractions of nucleic acids, proteins, and polysaccharides from the culture filtrate or extract of the photosynthetic prokaryotic microorganism described above can be obtained, for example, by fractional precipitation methods such as ammonium sulfate precipitation and organic solvent precipitation, purification methods by gel filtration, anion exchangers, and cation exchangers. A general fractionation method such as a purification method using an ion exchanger such as an ion exchanger, a purification method using an adsorption force such as activated carbon, silica gel, or the like can be appropriately combined and utilized as needed. In using the nucleic acid, protein, and polysaccharide fractions thus obtained as a promoter, these fractions may be used as they are, or may be used after being appropriately concentrated or diluted. Further, these fractionated liquids may be dried and dried under reduced pressure, freeze-dried, spray-dried, or the like to obtain a powder, which may be appropriately tableted or used as necessary. It may be a mixture of fractions, or may contain plant hormones, coconut milk, casein hydrolyzate, yeast extract, etc. used in normal culture depending on the purpose, or may be in a gel form. Other appropriate changes can be made. It can be integrated with the medium, and if prepared as an artificial endosperm material, it can be an artificial seed having a high germination rate.

また、各画分の基本培地への添加量は、用いる菌、培
養条件、抽出液量等の条件で変動するとともに、各種分
画操作後の有効成分の回収率、液量の増減など不確実な
要因も多いので、一概に規定することは困難であるが、
有効な添加量は実験により容易に決めることができる。
例えば、シネココッカス属（Synechococcus sp.）ATCC2
7192（前述）やロドシュードモナス・ブラスティカ（Rh
odopseudomonas blastica）ATCC33485（前述）を用いる
場合には、培養濾液については100倍に濃縮したもの、
抽出液については3g乾燥菌体を100ml抽出用液で抽出し
たものから上述したような適宜方法で各画分の凍結乾燥
物を調製し、それぞれ植物組織培養用の基本培地に対し
て1000ppm位までの適宜の濃度範囲で添加するなどでき
る。ここで、高添加濃度であることが必ずしも好ましい
とは限らない。In addition, the amount of each fraction added to the basic medium varies depending on conditions such as the bacterium to be used, culture conditions, and the amount of the extract, and uncertainties such as the recovery rate of the active ingredient after various fractionation operations and the increase and decrease of the liquid volume. There are many factors, so it is difficult to specify in a unified manner,
The effective amount can be easily determined by experiment.
For example, Synechococcus sp. ATCC2
7192 (above) and Rhodoseumonas blastica (Rh
odopseudomonas blastica) When using ATCC33485 (described above), the culture filtrate was concentrated 100 times,
For the extract, 3 g of dried cells was extracted with 100 ml of the extract for extraction to prepare a freeze-dried product of each fraction by an appropriate method as described above, up to about 1000 ppm with respect to the base medium for plant tissue culture. Can be added in an appropriate concentration range. Here, a high additive concentration is not always preferable.

尚、植物組織培養に使用する基本培地や培養方法など
は通常の植物組織培養におけるものと同様である。即ち
基本培地としては、ムラシゲ＆スクーグ（Murashige ＆
Skoog）培地（1962）（以下「MS培地」と略記する）を
代表的なものとして挙げられるが、その他の植物組織培
養に適した種々の培地、あるいはそれらの改変培地を適
宜選択することもできる。The basic medium and culture method used for plant tissue culture are the same as those used in normal plant tissue culture. That is, as the basic medium, Murashige & Skoog
Skoog) medium (1962) (hereinafter abbreviated as “MS medium”) as a representative one, but various other media suitable for plant tissue culture or their modified media can also be appropriately selected. .

本発明において培養の対象となる植物の種類は、分化
全能性を有し組織培養が可能であれば特に制限はなくど
んな植物でも適用可能である。これらは植物の組織、器
官、あるいはそれらの一部、あるいは培養細胞を培養に
供することができるが、これらを初代培養あるいは継代
培養したものも培養可能である。従って、不定胚を形成
させたり、植物体を再生させたり、また、植物体を再生
させるにあたって、カルスを培養したり、不定胚を培養
したり、プロトコーム状球体を培養したりすることがで
きる。In the present invention, the type of plant to be cultured is not particularly limited as long as it has totipotency and allows tissue culture, and any plant can be applied. These can be used for culturing plant tissues and organs, or a part thereof, or cultured cells, and those obtained by primary or subculture of these can also be cultured. Therefore, in forming an adventitious embryo, regenerating a plant, or regenerating a plant, it is possible to culture a callus, an adventitious embryo, or a protocorm-like sphere.

（実施例） 実施例１ シネココッカス属（Synechococcus sp.）ATCC27192を
ATCC指定の培養条件にて培養後、培養液を遠心濾過して
濾液を得、エバポレイターで100倍に濃縮し、この濃縮
液を0.45μｍのメンブランフィルターを用いて濾過し、
培養濾液とした。(Example) Example 1 Synechococcus sp. ATCC27192
After culturing under the culture conditions specified by ATCC, the culture solution was centrifugally filtered to obtain a filtrate, which was concentrated 100-fold with an evaporator, and the concentrated solution was filtered using a 0.45 μm membrane filter,
A culture filtrate was used.

この培養濾液50mlをビスカゼ（VISKASE）社の透析用
セルロースチューブ（商品名：セルロースチューブ30/3
2）を用いて蒸留水１に対して透析し、得た透析内液
に蛋白質分解酵素プロテアーゼＫ（シグマ社製）を加え
て蛋白質を低分子化し、これをトヨパールHW-55（東ソ
ー株式会社製）を用いたゲル濾過法により分子量分画し
て核酸画分を得、更に、凍結乾燥を行って得たものを促
進剤とした。50 ml of this culture filtrate is used for a dialysis cellulose tube (trade name: Cellulose tube 30/3) manufactured by VISKASE.
Dialysis against distilled water 1 using 2) and adding proteinase protease K (manufactured by Sigma) to the resulting dialysate to reduce the protein to a low molecular weight, which is then treated with Toyopearl HW-55 (manufactured by Tosoh Corporation) ) Was subjected to molecular weight fractionation by a gel filtration method using) to obtain a nucleic acid fraction, which was further freeze-dried to obtain an accelerator.

実施例２ 実施例１において、透析内液に蛋白質分解酵素を加え
る代わりに核酸分解酵素リボヌクレアーゼＡ（シグマ社
製）を加えて核酸を低分子化し、これによって蛋白質画
分を得るようにした以外、全て実施例１と同様にした。Example 2 The procedure of Example 1 was repeated, except that nucleolytic enzyme ribonuclease A (manufactured by Sigma) was added to the dialysis solution to reduce the molecular weight of the nucleic acid instead of adding the protease, thereby obtaining a protein fraction. All operations were the same as in Example 1.

実施例３ 実施例１において、透析内液に蛋白質分解酵素プロテ
アーゼＫ（前述）とともに核酸分解酵素デオキシリボヌ
クレアーゼＩ（シグマ社製）とリボヌクレアーゼＡ（前
述）とを加えて核酸も低分子化し、これによって多糖画
分を得るようにした以外、全て実施例１と同様にした。Example 3 In Example 1, nucleolytic enzymes deoxyribonuclease I (manufactured by Sigma) and ribonuclease A (described above) were added to the inner dialysis solution together with proteases K (described above) to reduce the molecular weight of the nucleic acids. All procedures were the same as in Example 1, except that a polysaccharide fraction was obtained.

実施例４〜６ 実施例１〜３において、シネココッカス属（Synechoc
occus sp.）ATCC27192の培養濾液を得る代わりに、同菌
体を集菌後凍結乾燥し、水に対して３％になるように菌
体を懸濁させ、100℃で60分間熱水抽出し、遠心分離し
て上澄液を0.45μｍメンブランフィルターを用いて濾過
して抽出物を得、この抽出物50mlを用いて透析以後の処
理をなした以外、全て各実施例と同様にした。Examples 4 to 6 In Examples 1 to 3, the genus Synechococcus (Synechoc
occus sp.) Instead of obtaining a culture filtrate of ATCC27192, the cells were collected, freeze-dried, suspended at 3% in water, and extracted with hot water at 100 ° C for 60 minutes. Then, the supernatant was centrifuged, and the supernatant was filtered through a 0.45 μm membrane filter to obtain an extract. All the procedures were the same as in each Example except that 50 ml of the extract was used for post-dialysis treatment.

実施例７〜12 実施例１〜６において、シネココッカス属（Synechoc
occus sp.）ATCC27192の代わりにロドシュードモナス・
ブラスティカ（Rhodopseudomonas blastica）ATCC33485
を用いた以外、全て各実施例と同様にした。Examples 7 to 12 In Examples 1 to 6, the genus Synechococcus (Synechoc
occus sp.) instead of ATCC27192
Blastica (Rhodopseudomonas blastica) ATCC33485
All were the same as in each example except that was used.

上記各例で得たものを用いてニンジン培養細胞を培養
した結果を表−１に示す。ショ糖３％と2,4−Ｄを0.11m
g/lを含むMS培地に各例で得たものを画分濃度が100ppm
となるように添加した培地を用い、ニンジン培養細胞を
25℃、暗条件下で12日間液体振盪培養し、細胞数を調べ
たもので、各例で得たものを添加することなく培養した
ものを比較例としてある。尚、ニンジン培養細胞の作製
は、以下の通りとした。Table 1 shows the results of culturing carrot cultured cells using those obtained in the above examples. 0.11m of 3% sucrose and 2,4-D
g / l MS medium containing fractions of 100 ppm
Using a medium added to make carrot cultured cells
Liquid shaking culture was performed under dark conditions at 25 ° C. for 12 days, and the number of cells was examined. The culture obtained without adding the cells obtained in each example was used as a comparative example. The carrot cultured cells were prepared as follows.

ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が10cm位に
生長したものを約1cm位に切断し、下記培地中で25℃、
暗条件下で培養した。培地は基本培地としてMS培地を使
用し、これにショ糖３％、オーキシン類の植物ホルモン
である2,4−Ｄ（2,4−ジクロロフェノキシ酢酸）1mg/l
を添加しpH5.5〜pH5.7に調整した。約１ヶ月の培養後、
培地中の2,4−Ｄ濃度を0.11mg/lに減少させた培地に移
植し、振盪速度90回／分のレシプロ式シェーカーを用い
て振盪培養した。その後、１週間に１回の割合で2,4−
Ｄを0.11mg/l含む培地に植え継いでニンジン培養細胞を
得た。In the germination of carrot aseptic seeds, the hypocotyl that grew to about 10 cm was cut to about 1 cm, and 25 ° C in the following medium.
Cultured under dark conditions. The medium used was an MS medium as a basic medium, to which 3% of sucrose and 1 mg / l of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), an auxin plant hormone.
Was added to adjust the pH to 5.5 to 5.7. After about one month of culture,
The medium was transplanted to a medium in which the 2,4-D concentration was reduced to 0.11 mg / l, and cultured with shaking using a reciprocating shaker at a shaking speed of 90 times / min. After that, once a week, 2,4-
Carrot cultured cells were obtained by subculture into a medium containing 0.11 mg / L of D.

p38に準じて下記のように測定した。また、表の値は100
万が単位である。セルラーゼ・オノズカＲ−10を２％、
マルセロチームＲ−10を１％ドリセラーゼを２％、塩化
カルシウム（CaC12・2H₂Ｏ）を0.5％、マンニトールを
0.7Mそれぞれ用いて、30℃、60分間、振幅７、振盪回数
90回／分で振盪し、次に50回／分の振盪を90分間行な
い、遊離してきたプロトプラストの数を0.1の深さのヘ
モサイトメーターを用いて計測し細胞を測定した。 It measured as follows according to p38. Also, the value in the table is 100
Ten thousand is a unit. 2% Cellulase Onozuka R-10,
Marcelo Team R-10 1% Driselase 2%, calcium chloride (CaC12 · 2H ₂ O) 0.5%, mannitol
Using 0.7M each, 30 ° C, 60 minutes, amplitude 7, number of times of shaking
The cells were shaken at 90 times / min and then at 50 times / min for 90 minutes, and the number of released protoplasts was counted using a 0.1-deep hemocytometer to measure the cells.

また、各例で得たものを用いてニンジン培養細胞から
植物体を再生させた結果を表−２に示す。ショ糖３％を
含むMS培地に各例で得たものを画分濃度が75ppmとなる
ように添加した培地（比較例：無添加の培地）を用い、
前述のように作製したニンジン培養細胞を25℃、暗条件
下で30日間液体振盪培養し、形成された不定胚について
10日目、20日目、30日目に観察したものである。Table 2 shows the results of regenerating plants from carrot cultured cells using those obtained in each example. Using a medium (comparative example: medium without addition) obtained by adding the obtained in each example to an MS medium containing 3% sucrose so that the fraction concentration becomes 75 ppm,
Carrot cultured cells prepared as described above were subjected to liquid shaking culture at 25 ° C for 30 days in the dark, and the adventitious embryos formed
Observed on days 10, 20, and 30.

また、各例で得たものを用いてニンジン不定胚からの
植物体再生をさせた結果を表−３に示す。液体培養にて
継代培養した前述作製のニンジン培養細胞を2,4−Ｄを
含まない基本培地に移植して培養することにより、不定
胚形成し、425〜800μｍの大きさの不定胚をメッシュ選
別して使用し、得られた球状から魚雷型までの不定胚を
植物ホルモンを含まないMS培地に各例で得たものを画分
濃度が100ppmとなるように添加した培地（比較例：無添
加の培地）を用い、25℃、明条件（2000ルックス、16時
間照明；以下、「明条件」とあれば同一の条件を示す）
下で30日間液体振盪培養し、植物体の再生を調べたもの
である。 In addition, Table 3 shows the results of regenerating plants from carrot somatic embryos using those obtained in each example. By transplanting and culturing the carrot cultured cells prepared as described above subcultured in liquid culture into a basic medium not containing 2,4-D, somatic embryos are formed, and somatic embryos having a size of 425 to 800 μm are meshed. A medium in which the obtained adventitious embryos ranging from spherical to torpedo type were added to MS medium containing no plant hormone so that the fraction concentration became 100 ppm (Comparative Example: None) Medium (supplemented medium) at 25 ° C under light conditions (2000 lux, illumination for 16 hours; hereinafter, the same conditions will be used if “bright conditions”)
The culture was carried out under liquid shaking for 30 days and the regeneration of plants was examined.

また、各例で得たものを用いてカトレアのプロトコー
ム状球体から植物体を発生させた結果を表−４に示す。
材料は、カトレア類に属するレリオカトレア（Laelioca
ttleya）の側芽の生長点付近の***組織から誘導された
プロトコーム状球体（以下、「PLB」と略記する）であ
る。このPLBの培養培地として、ハイポネックス（Hypon
ex:6.5−６−19）にジャガイモジュース７％、炭素源と
してショ糖２％を含むものを使用した。初期誘導のPLB
から成熟したPLBを選び、更に各々の１個のPLBを４つに
分割し、供試用PLBを調製した。PLB培養培地に対して、
各例で得たものを画分濃度が50ppmとなるように添加し
た培地（比較例：無添加の培地）を用い、25℃、明条件
下で60日間培養し、40日後の置床PLBの状態と、60日後
の増殖したPLB数と、それからのシュート発生数を調べ
たものである。 In addition, Table 4 shows the results of generating plants from protocorm-like spheres of Cattleya using those obtained in each example.
The material is Leliocattleya (Laelioca) belonging to Cattleyas
This is a protocorm-like sphere (hereinafter, abbreviated as "PLB") derived from meristem near the growth point of the lateral bud of ttleya). As a culture medium for this PLB, Hyponex
ex: 6.5-6-19) containing 7% potato juice and 2% sucrose as a carbon source. Initial lead PLB
Was selected, and each one PLB was further divided into four to prepare test PLBs. For PLB culture medium,
The medium obtained in each case was added to the medium so that the fraction concentration became 50 ppm (comparative example: medium without addition), and cultured at 25 ° C. under light conditions for 60 days. And the number of PLBs that grew 60 days later and the number of shoots generated from them.

また、各例で得たものを用いてコチョウランのステム
カルチャーとプロトコーム状球体を発生させた結果を表
−5.1〜表−5.4に示す。 In addition, Table-5.1 to Table-5.4 show the results of the generation of phalaenopsis stem culture and protocorm-like spheres using those obtained in each example.

表−5.1は、コチョウラン（Phalaenopsis）のステム
カルチャーを行い幼植物体の成長度合を調べ、ついで成
長点および幼葉からのPLBの形成に与える影響を調べた
もので、腋芽から発生した幼植物体の成長を培養２ヶ月
後に観察した結果を示す。培地は基本的には２％ショ糖
とココナットミルク（150g/l）を含むベイシンとウエン
ト（Vacin ＆ Went）培地（以下、「VW培地」と略記す
る）を用いた。ステムを腋芽が真ん中にくるように５〜
7cm位に切りそろえ表面を殺菌し、各例で得たものを画
分濃度が50ppmとなるように添加した寒天培地（比較
例：無添加の培地）にこのステムの下端を差込み、26
℃、明条件下で培養したものである。Table 5.1 shows the growth of young plants by stem culture of phalaenopsis (Phalaenopsis), and then the effects on growth points and PLB formation from young leaves. 2 shows the results of observing the growth of E. coli 2 months after the culture. The medium used was basically a Basin and Wacin (Wacin & Went) medium (hereinafter abbreviated as “VW medium”) containing 2% sucrose and coconut milk (150 g / l). Stem 5 so that armpit buds are in the middle
Insert the lower end of this stem into an agar medium (comparative example: medium without addition) in which the surface obtained by cutting in 7 cm was sterilized and the surface obtained in each case was added so that the fraction concentration became 50 ppm.
Cultured under light conditions at ℃.

また、表−5.2は、培養２ヶ月後の幼植物体由来の成
長点の活着率とPLBの増殖を調べた結果を示し、表−5.3
は、ステム腋芽からの成長点の結果を示す。得られた無
菌の幼植物体の頂芽及び側芽から成長点を摘出し、更に
開花前のステム腋芽からも無菌的に成長点を摘出し、各
例で得たものを画分濃度が50ppmとなるように添加した
寒天培地（比較例：無添加の培地）に置床し、26℃、明
条件下で培養したものである。Table-5.2 shows the results of examining the survival rate of PLs and the growth of PLB after 2 months of culture.
Shows results of growth points from stem axillary buds. The growth point is excised from the apical buds and lateral buds of the obtained aseptic seedlings, and the aseptic stalk is also aseptically extracted from the stem axillary bud before flowering, and the fraction concentration of the obtained in each case is 50 ppm. The medium was placed on an agar medium (comparative example: medium without addition) so as to be added, and cultured at 26 ° C. under light conditions.

更に、表−5.4は、培養３ヶ月後の葉片からのPLBの発
生率を示す。前述のステムカルチャーで得られた幼植物
体からの幼葉の葉柄近くの部位を約3mm角に切り出し葉
片培養に用いた。ナフタレン酢酸0.1ppm、ベンジルアデ
ニン0.1ppm添加した基本培地に各例で得たものを画分濃
度が100ppmとなるように添加した寒天培地（比較例：無
添加の培地）に、葉片を置床し、26℃で１ヶ月間、暗条
件下で培養し、その後、明条件下で培養したものであ
る。Furthermore, Table-5.4 shows the incidence of PLB from leaf pieces after 3 months of culture. A portion near the petiole of the young leaf from the young plant obtained by the stem culture was cut out into an approximately 3 mm square and used for leaf piece culture. Leaf pieces were placed on an agar medium (comparative example: medium without addition) obtained by adding each of those obtained in each example to a basic medium containing 0.1 ppm of naphthalene acetic acid and 0.1 ppm of benzyl adenine so that the fraction concentration became 100 ppm. The cells were cultured at 26 ° C for one month under dark conditions, and then cultured under light conditions.

また、タバコカルスから植物体を再生させた結果を表
−６に示す。材料は、タバコ（Nicotiana tabacum L.c
v.Bright Yellow）の茎の髄組織由来のカルスであり、
カルスの培養はMS培地を使用し、これに植物ホルモンと
してインドール酢酸（1mg/l）とカイネチン（0.1mg/l）
を添加した寒天培地上で継代培養した。また、芽の分化
誘導の基本培地としては、MS培地に植物ホルモンである
インドール酢酸（0.1mg/l）とカイネチン（1mg/l）を加
えた寒天培地を使用し、この基本培地に対して、各例で
得たものを画分濃度が50ppmとなるように添加した寒天
培地（比較例：無添加の培地）を作製し、それぞれの培
地に対して、継代培養されたカルスをカミソリの刃を用
いて5mm角の大きさに切断し、カルス切片を試験管１本
に１個の割合で移植したものを各25本用意し25℃、明条
件下で14日間培養したものである。 Table 6 shows the results of regenerating the plant from tobacco callus. The material is tobacco (Nicotiana tabacum Lc
v. Bright Yellow) callus derived from the medullary tissue of the stem,
Callus culture uses MS medium, which contains plant hormones indoleacetic acid (1 mg / l) and kinetin (0.1 mg / l)
Was subcultured on an agar medium supplemented with. As a basal medium for inducing differentiation of buds, an agar medium obtained by adding indoleacetic acid (0.1 mg / l) and kinetin (1 mg / l), which are plant hormones, to an MS medium is used. An agar medium (comparative example: medium without addition) to which the fraction obtained in each example was added so that the fraction concentration became 50 ppm was prepared, and the subcultured calli were cultivated for each medium with a razor blade. Was cut into 5 mm square pieces, and 25 callus pieces were transplanted into one test tube at a rate of one piece each, and cultured at 25 ° C. under light conditions for 14 days.

また、各例で得たものを用いてセントポーリア葉柄か
ら植物体を再生させた結果を表−７に示す。ナフタレン
酢酸（1mg/l）とカイネチン（1mg/l）を含むMS培地を基
本培地とし、各例で得たものを画分濃度が75ppmとなる
ように添加して300mg容の三角フラスコ中の寒天培地
（比較例：無添加の培地）を作製し、5mm位に切断した
セントポーリア葉柄を置床し、１週間は暗所培養し、そ
の後20℃、明条件で30日間培養したものである。 Table 7 shows the results obtained by regenerating plants from the petioles of Saintpaulia using those obtained in each example. The MS medium containing naphthaleneacetic acid (1 mg / l) and kinetin (1 mg / l) was used as the base medium, and the agar in a 300 mg Erlenmeyer flask was added by adding the one obtained in each example so that the fraction concentration became 75 ppm. A medium (Comparative Example: medium without any addition) was prepared, and a saintpaulia petiole cut to about 5 mm was placed on the plate, cultured for one week in a dark place, and then cultured at 20 ° C. under light conditions for 30 days.

また、各例で得たものを用いてニンジン不定胚を生長
させた結果を表−８に示す。前述のようにして形成した
不定胚から大きさ148〜200μｍの不定胚を選別したとこ
ろ、そのほとんどは球状から初期の心臓型不定胚であっ
たが、これを植物ホルモンを含まないMS培地で液体振盪
培養して生長させ、あるいは植物体にまで再生させたも
ので、その際、各例で得たものを画分濃度100ppmとなる
ように添加した培地（比較例：無添加の培地）を用い、
25℃、明条件下で12日間培養し、不定胚の生長状態を調
べたものである。 Table 8 shows the results of growing carrot somatic embryos using those obtained in each example. When somatic embryos having a size of 148 to 200 μm were selected from the somatic embryos formed as described above, most of them were spherical to early heart-type somatic embryos. A medium grown with shaking culture or regenerated to a plant body, using a medium (comparative example: medium without addition) to which the fraction obtained in each case was added to a concentration of 100 ppm. ,
Cultured at 25 ° C for 12 days under light conditions to examine the growth of somatic embryos.

尚、表−８中の項目は、以下のことを意味する。 The items in Table-8 mean the following.

全不定胚数：培地10ml当りの不定胚数（植物体を含む） 成熟不定胚形成率:800μｍのメッシュを通過しない成熟
不定胚の形成率 植物体形成率：グリーニングし、発芽発根しているもの
の形成率 また、各例で得たものを用いてニンジン不定胚を用い
た人工種子の発芽促進をさせた結果を表−９に示す。前
述のようにして形成した不定胚から大きさ200〜425μｍ
に生長した不定胚を選別したところ、そのほとんどは球
状から初期の心臓型不定胚であったが、これをMS培地25
ml中に懸濁し、包埋剤として３％（W/V）アルギン酸ナ
トリウムを含む75mlのMS培地と上記懸濁液とを混ぜ合わ
せ、混液100mlを得、この混液100mlに対して各例で得た
ものを画分濃度が100ppmとなるように添加（比較例：無
添加）し、得られた最終混液を、50mMの塩化カルシウム
溶液中に滴下することによって、アルギン酸カルシウム
からなる人工膜を有する球状の人工種子を得、これを、
無菌的に25℃、明条件下で25日間培養し、発根、発芽状
態を調べたものである。Total number of somatic embryos: Number of somatic embryos per 10 ml of culture medium (including plants) Mature somatic embryo formation rate: Rate of formation of mature somatic embryos that do not pass through an 800 μm mesh Plant formation rate: Greening, germination and rooting Formation rate Table 9 shows the results of promoting germination of artificial seeds using carrot somatic embryos using those obtained in each example. 200-425μm from somatic embryos formed as described above
When the somatic embryos that grew were selected, most of them were spherical to early heart-type somatic embryos.
The suspension is mixed with 75 ml of an MS medium containing 3% (W / V) sodium alginate as an embedding medium and the above suspension to obtain 100 ml of a mixed solution. Was added so that the fraction concentration became 100 ppm (comparative example: no addition), and the resulting final mixture was dropped into a 50 mM calcium chloride solution to form a spherical shape having an artificial membrane made of calcium alginate. Of artificial seeds,
The culture was aseptically cultured at 25 ° C under light conditions for 25 days, and rooting and germination were examined.

尚、表−９中、植物体再生率は、植物体を再生した人
工種子数を全体の個数で割った値（単位：％）を示す。In Table 9, the plant regeneration rate indicates a value (unit:%) obtained by dividing the number of artificial seeds regenerated from the plant by the total number.

（発明の効果） 以上述べたように、本発明の植物体再生促進剤を使用
すれば、植物の組織とか器官とかこれらの一部やあるい
は培養細胞といったものの培養、増殖を効果的に促進さ
せることができ、不定胚形成、植物体再生を促進させる
ことができるし、人工種子ならば発芽率の高いものたり
得る。 (Effect of the Invention) As described above, the use of the plant regeneration promoter of the present invention effectively promotes the culture and proliferation of plant tissues, organs, parts thereof, and cultured cells. Can promote somatic embryo formation and plant regeneration, and artificial seeds can have a high germination rate.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 梅津 博紀 埼玉県草加市吉町４―１―８ ぺんてる 株式会社草加工場内 (72)発明者 松永 是 東京都府中市幸町２―41―13 府中第三 住宅２―304 審査官 佐藤 修 (56)参考文献 特開 平２−131531（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A01N 63/00,63/02 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (72) Inventor Hiroki Umezu 4-1-8 Yoshimachi, Soka-shi, Saitama Pentel Inside the Grass Processing Plant (72) Inventor, Satoshi Matsunaga 2-41-13 Fuchu, Fuchu-shi, Tokyo Fuchu Third House 2-304 Examiner Osamu Satoh (56) References JP-A-2-1311531 (JP, A) (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) A01N 63/00, 63/02

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】植物の組織とか器官もしくはこれらの一部
あるいは培養細胞を培養するにあたって使用する植物体
再生促進剤であって、光合成原核微生物の培養濾液及び
／又は抽出物中の、核酸画分・蛋白質画分・多糖画分の
少なくとも一画分を含有してなる植物体再生促進剤。1. A plant regeneration promoter for use in culturing plant tissues or organs or a part thereof or cultured cells, wherein the nucleic acid fraction is contained in a culture filtrate and / or extract of a photosynthetic prokaryotic microorganism. -A plant regeneration promoter comprising at least one fraction of a protein fraction and a polysaccharide fraction.