JP2884063B2 - Amphiphilic polymer - Google Patents
Amphiphilic polymerInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
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Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、分子中に親水性部
と疎水性部の両方を含有する両親媒性重合体に関するも
のである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an amphiphilic polymer containing both a hydrophilic part and a hydrophobic part in a molecule.
【０００２】[0002]
【従来の技術】アセチルコリンやγ−アミノ酪酸は生体
における神経伝達物質として知られており、その受容体
は、医薬やセンサー等の技術開発への応用が期待されて
いる。アセチルコリン受容体を初めとする膜蛋白質を工
学的に利用するためには、生体からその活性を保持し、
高純度で抽出、精製しなければならない。膜蛋白質の抽
出、精製は、従来、組織中の膜蛋白質を可溶化材により
可溶化し、得られる可溶化膜蛋白質中の対象蛋白質を、
アフィニティークロマトグラフィー法、電気泳動法等に
より精製している。これらの手法は手順が煩雑であり、
精製途中での蛋白質の変性の恐れがあるのみでなく、ア
フィニティークロマトグラフィー法においては、溶離液
に種々の組成の溶液を用いることから、経済性の面で満
足できるものでないばかりか、環境汚染の懸念ももたれ
る。2. Description of the Related Art Acetylcholine and γ-aminobutyric acid are known as neurotransmitters in living organisms, and their receptors are expected to be applied to the development of technologies such as drugs and sensors. In order to utilize membrane proteins such as acetylcholine receptor in engineering,
It must be extracted and purified with high purity. Conventionally, membrane protein extraction and purification have been carried out by solubilizing a membrane protein in a tissue with a solubilizing agent and subjecting the target protein in the resulting solubilized membrane protein to
Purified by affinity chromatography, electrophoresis and the like. These procedures are complicated procedures,
In addition to the risk of protein denaturation during purification, affinity chromatography uses solutions of various compositions as eluents, which is not only economically satisfactory but also reduces environmental pollution. There are also concerns.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、膜蛋白質の
抽出手段として有用な水中でミセル形成能を有する両親
媒性重合体を提供することをその課題とする。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide an amphiphilic polymer having a micelle-forming ability in water, which is useful as a means for extracting a membrane protein.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に至った。即ち、本発明によれば、一般式Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have completed the present invention. That is, according to the present invention,
【化１】 （式中、Ｒ1は低級アルキレン基を示し、ｍはゼロ又は
１の数を示す）で表される繰返し構造単位を有し、その
数平均重合度ｎが１００〜１０００の範囲にある重合体
において、その重合体中に含まれるアミノ基の一部が一
般式Embedded image (Wherein, R 1 represents a lower alkylene group, m represents zero or a number of 1), and has a number average polymerization degree n in the range of 100 to 1,000. In the above, a part of the amino group contained in the polymer has a general formula
【化２】 〔式中、Ｘはカルボキシル基、水酸基、チオール基及び
アミノ基（置換アミノ基を含む）から選択された親水基
を示し、Ｒ2は低級アルキレン基を示し、ｐは数平均重
合度 を示し、１５〜１００の数を示す〕で表される親
水性置換アミノ基に変換され、その重合体中に含まれる
アミノ基の一部が一般式Embedded image [ Wherein , X represents a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group and
Indicates a hydrophilic group <br/> selected from an amino group (including substituted amino group), R 2 represents a lower alkylene group, p is indicates the number average polymerization degree, tables in the number of 15 to 100] The amino group contained in the polymer is converted into a hydrophilic substituted amino group represented by the general formula
【化３】 −ＮＨＣＯＲ3 （３） （式中、Ｒ3は炭素数６以上の脂肪族炭化水素基を示
す）で表される疎水性置換アミノ基に変換され、水中に
おいてミセル形成能を有することを特徴とする両親媒性
重合体が提供される。-NHCOR 3 (3) (wherein R 3 represents an aliphatic hydrocarbon group having 6 or more carbon atoms), and has a micelle-forming ability in water. An amphiphilic polymer is provided.
【０００５】[0005]
【発明の実施の形態】本発明の両親媒性重合体は、下記
一般式（１）で表される繰返し構造単位を有する側鎖に
アミノ基を持つ重合体を基材として用いて製造される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The amphiphilic polymer of the present invention is produced using a polymer having an amino group in a side chain having a repeating structural unit represented by the following general formula (1) as a base material. .
【化１】 前記式中、Ｒ1は低級アルキレン基を示し、その炭素数
は１〜６、好ましくは１〜４である。ｍはゼロ又は１を
示す。ｍがゼロを示す場合、ＮＨ2は主鎖の炭素原子に
直接結合する。前記繰返し構造単位を有する重合体は、
従来公知のものである。このような重合体は、アリルア
ミン、ビニルアミン等の側鎖にアミノ基を有するビニル
モノマーを重合させることにより製造される。前記側鎖
アミノ基を有する重合体において、その数平均重合度
は、１００〜１０００、好ましくは１５０〜６００であ
る。また、その重合体中の窒素原子数と炭素原子数の比
Ｎ／Ｃは、０．０７〜０．５、好ましくは０．２〜０．
５である。Embedded image In the above formula, R 1 represents a lower alkylene group, having 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms. m represents zero or one. If m represents zero, NH 2 is bonded directly to a carbon atom of the main chain. The polymer having the repeating structural unit,
It is conventionally known. Such a polymer is produced by polymerizing a vinyl monomer having an amino group in a side chain such as allylamine and vinylamine. The number average degree of polymerization of the polymer having the side chain amino group is 100 to 1,000, preferably 150 to 600. The ratio N / C of the number of nitrogen atoms to the number of carbon atoms in the polymer is 0.07 to 0.5, preferably 0.2 to 0.5.
5
【０００６】本発明の両親媒性重合体は、親水性部を得
るために、前記側鎖アミノ基を有する重合体のその側鎖
アミノ基の一部を、下記一般式（２）で表される親水性
置換アミノ基に変換させる。In the amphiphilic polymer of the present invention, in order to obtain a hydrophilic portion, a part of the side chain amino group of the polymer having a side chain amino group is represented by the following general formula (2). To a hydrophilic substituted amino group.
【化２】 前記式中、Ｒ2は低級アルキレン基を示し、Ｘは親水基
を示し、ｐは数平均重合度を示す。低級アルキレン基Ｒ
2において、その炭素数は、通常１〜４である。親水基
Ｘとしては、カルボキシル基、水酸基、チオール基、ア
ミノ基（置換アミノ基を含む）等が挙げられる。数平均
重合度ｐは、１５〜１００、好ましくは１５〜３０であ
る。Embedded image In the above formula, R 2 represents a lower alkylene group, X represents a hydrophilic group, and p represents a number average polymerization degree. Lower alkylene group R
In 2 , the number of carbon atoms is usually 1 to 4. Examples of the hydrophilic group X include a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, and an amino group (including a substituted amino group). The number average degree of polymerization p is 15 to 100, preferably 15 to 30.
【０００７】前記一般式（２）で表される親水性置換ア
ミノ基は、前記一般式（１）の繰返し構造単位を有する
重合体の側鎖アミノ基の一部に、親水基Ｘを有するα−
アミノ酸を重合反応させることにより形成させることが
できる。この場合の反応方法としては、ポリペプチド合
成に慣用されている方法を用いることができる。The hydrophilic substituted amino group represented by the general formula (2) is an α-amino group having a hydrophilic group X as a part of a side chain amino group of a polymer having a repeating structural unit represented by the general formula (1). −
It can be formed by polymerizing amino acids. As a reaction method in this case, a method commonly used for polypeptide synthesis can be used.
【０００８】前記アミノ酸としては、グルタミン酸やア
スパラギン酸等の酸性アミノ酸、セリンやトレオニン等
のオキシアミノ酸、リシンやアルギニン等の塩基性アミ
ノ酸の他、システィン等が挙げられる。The amino acids include acidic amino acids such as glutamic acid and aspartic acid, oxyamino acids such as serine and threonine, basic amino acids such as lysine and arginine, and cysteine.
【０００９】前記一般式（２）の親水性置換アミノ基の
割合は、前記一般式（１）の繰返し構造単位を有する重
合体中に含まれる全アミノ基の５０〜９５％、好ましく
は７０〜９５％である。The proportion of the hydrophilic substituted amino group of the general formula (2) is from 50 to 95%, preferably from 70 to 95%, of all amino groups contained in the polymer having the repeating structural unit of the general formula (1). 95%.
【００１０】本発明の両親媒性重合体は、疎水性部を得
るために、前記側鎖アミノ基を有する重合体のその側鎖
アミノ基の一部を、下記一般式（３）で表される疎水性
置換アミノ基に変換させる。 −ＮＨＣＯＲ3 （３） 前記式中、Ｒ3は炭素数６以上、好ましくは７〜１７、
より好ましくは１３〜１５の脂肪族炭化水素基を示す。
脂肪族炭化水素基には、アルキル基及びアルケニル基が
包含される。脂肪族炭化水素基としては、例えば、ヘキ
シル基、オクチル基、ドデシル基、テトラデシル基、ペ
ンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オク
タデシル基、エイコシル基、テトラデセニル基、ヘキサ
デセニル基、オクタデセニル基等が挙げられる。In the amphiphilic polymer of the present invention, in order to obtain a hydrophobic part, a part of the side chain amino group of the polymer having a side chain amino group is represented by the following general formula (3). To a hydrophobically substituted amino group. —NHCOR 3 (3) In the above formula, R 3 has 6 or more carbon atoms, preferably 7 to 17,
More preferably, it represents 13 to 15 aliphatic hydrocarbon groups.
The aliphatic hydrocarbon group includes an alkyl group and an alkenyl group. Examples of the aliphatic hydrocarbon group include a hexyl group, an octyl group, a dodecyl group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a hexadecyl group, a heptadecyl group, an octadecyl group, an eicosyl group, a tetradecenyl group, a hexadecenyl group, and an octadecenyl group.
【００１１】前記一般式（３）の疎水性置換アミノ基
は、前記一般式（１）の繰返し構造単位を有する重合体
の側鎖アミノ基の一部に、脂肪族カルボン酸もしくはそ
のハライドを反応させることにより形成させることがで
きる。この場合の反応は従来周知の反応であり、慣用の
方法により行うことができる。前記一般式（３）の疎水
性置換アミノ基の割合は、前記側鎖アミノ基を有する重
合体中に含まれる全アミノ基の５〜３０％、好ましくは
６〜１０％である。The hydrophobic substituted amino group of the general formula (3) is obtained by reacting an aliphatic carboxylic acid or a halide thereof with a part of the side chain amino group of the polymer having a repeating structural unit of the general formula (1). It can be formed by performing. The reaction in this case is a conventionally well-known reaction, and can be performed by a conventional method. The ratio of the hydrophobic substituted amino group of the general formula (3) is 5 to 30%, preferably 6 to 10% of all amino groups contained in the polymer having the side chain amino group.
【００１２】本発明の両親媒性重合体は、必要に応じ、
チオール基を含有することができる。このチオール基
は、膜蛋白質の選択的抽出に対して有効に作用する。チ
オール基を有する重合体は、前記側鎖アミノ基を有する
重合体のそのアミノ基の一部を、下記一般式で表される
チオール基を有する置換アミノ基に変換させることによ
り形成させることができる。The amphiphilic polymer of the present invention may optionally contain
It can contain a thiol group. This thiol group effectively acts on the selective extraction of membrane proteins. The polymer having a thiol group can be formed by converting a part of the amino group of the polymer having the side chain amino group into a substituted amino group having a thiol group represented by the following general formula. .
【化４】 前記式中、Ｒ4は低級アルキレン基を示し、ｑはゼロ又
は１を示す。ｑがゼロの場合には、Ｒ4は直接アミノ基
に結合する。低級アルキレン基Ｒ4の炭素数は１〜６、
好ましくは１〜４である。Embedded image In the above formula, R 4 represents a lower alkylene group, and q represents zero or 1. When q is zero, R 4 is directly attached to the amino group. The carbon number of the lower alkylene group R 4 is 1 to 6,
Preferably it is 1-4.
【００１３】前記一般式（４）のチオール基を有する置
換アミノ基は、前記一般式（１）の繰返し構造単位を有
する重合体の側鎖アミノ基の一部に、チオール基を有す
るアルキルモノハロゲン化物又はチオール基を有する脂
肪族カルボン酸もしくはそのハライドを反応させること
により形成させることができる。この場合の反応は周知
であり、慣用の方法により行うことができる。前記一般
式（４）のチオール基を有する置換アミノ基の割合は、
前記側鎖アミノ基を有する重合体中に含まれる全アミノ
基の０．５〜１０％、好ましくは１〜５％である。The substituted amino group having a thiol group represented by the general formula (4) is an alkylmonohalogen having a thiol group as a part of the side chain amino group of the polymer having a repeating structural unit represented by the general formula (1). Or a carboxylic acid having a thiol group or a halide thereof. The reaction in this case is well known and can be performed by a conventional method. The ratio of the substituted amino group having a thiol group of the general formula (4) is:
It is 0.5 to 10%, preferably 1 to 5%, of all amino groups contained in the polymer having a side chain amino group.
【００１４】本発明の両親媒性重合体においては、その
親水性置換アミノ基におけるポリアミノ酸鎖部分に有機
色素を導入することが好ましい。有機色素を導入したポ
リアミノ酸は、その二次構造転移を光により制御可能で
あることが知られており（Ｃｉａｒｄｅｌｉら、Ｂｉｏ
ｐｏｌｙｍｅｒ，２３，１４２３−１４３７（１９８
４）、木下ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０
８，６３３９−６４００（１９８６））、有機色素をポ
リアミノ酸鎖部分に導入した本発明の両親媒性重合体の
場合にも、同様に、そのポリアミノ酸部分の二次構造転
移を光により制御することが可能になる。In the amphiphilic polymer of the present invention, it is preferable to introduce an organic dye into the polyamino acid chain in the hydrophilic substituted amino group. It is known that a polyamino acid into which an organic dye has been introduced can control its secondary structure transition by light (Ciardelli et al., Bio).
Polymer, 23, 1423-1437 (198
4) Kinoshita et al. Am. Chem. Soc. , 10
8, 6339-6400 (1986)), similarly, in the case of the amphiphilic polymer of the present invention in which an organic dye is introduced into a polyamino acid chain portion, similarly, the secondary structure transition of the polyamino acid portion is controlled by light. It becomes possible.
【００１５】ポリアミノ酸鎖部分に対する有機色素の導
入は、ポリアミノ酸鎖部分に含まれている親水基Ｘの反
応性を利用して行うことができる。ポリアミノ酸鎖部分
に色素を導入するには、例えば、ポリアミノ酸部分に含
まれる親水基Ｘが、カルボキシル基の場合には、カルボ
キシル基と反応性を示す官能基、例えば、アミノ基や、
ハロゲン等を有する色素を反応させればよい。親水基Ｘ
がアミノ基の場合には、アミノ基と反応性を示す官能
基、例えば、カルボキシル基やスルホン酸基等を有する
色素を反応させればよい。親水基Ｘが水酸基やチオール
基の場合には、それらの官能基と反応性を示す官能基、
例えば、カルボキシル基、スルホン酸基、ハロゲン等を
有する色素を反応させればよい。The introduction of the organic dye into the polyamino acid chain can be carried out by utilizing the reactivity of the hydrophilic group X contained in the polyamino acid chain. To introduce a dye into the polyamino acid chain portion, for example, when the hydrophilic group X contained in the polyamino acid portion is a carboxyl group, a functional group reactive with the carboxyl group, for example, an amino group,
A dye having a halogen or the like may be reacted. Hydrophilic group X
Is an amino group, a dye having a functional group reactive with the amino group, such as a carboxyl group or a sulfonic acid group, may be reacted. When the hydrophilic group X is a hydroxyl group or a thiol group, a functional group showing reactivity with those functional groups,
For example, a dye having a carboxyl group, a sulfonic acid group, a halogen, or the like may be reacted.
【００１６】有機色素としては、従来公知の各種のもの
が用いられるが、特に、アゾ色素や、ロイコ系色素の使
用が好ましい。有機色素の導入率は、ポリアミノ酸部分
に含まれる親水基Ｘの５〜１００％、好ましくは１０〜
５０％程度である。As the organic dye, various types of conventionally known organic dyes are used. In particular, the use of an azo dye or a leuco dye is preferable. The introduction ratio of the organic dye is 5 to 100% of the hydrophilic group X contained in the polyamino acid portion, preferably 10 to 10%.
It is about 50%.
【００１７】[0017]
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
【００１８】実施例１ ポリアリルアミン塩酸塩（日東紡績株式会社製、数平均
分子量１００００）１８．７ｇを１Ｍの水酸化ナトリウ
ム水溶液２００ｍＬに溶解させた。この溶液に塩化パル
ミトイル５．５ｇを徐々に滴下し、室温で６時間撹拌し
た。反応後、反応液のｐＨを水酸化ナトリウムによりｐ
Ｈ１０．０とし、透析膜スペクトラポアー（スペクトラ
ムメディカルインスツルメンツ製ＭＷＣＯ：３５００）
を用い、５０℃で１日透析し、パルミトイル基を側鎖に
有するポリアリルアミン（ＰＡＡＰＡ７）を得た。パル
ミトイル基の置換率は、ＰＡＡＰＡ７中の未反応アミノ
基の定量より見積もった。具体的には、第一アミンと特
異的に反応し、強い蛍光を発する４−フルオロ−７−ニ
トロベンゾフラザンを用い、その蛍光強度から置換度７
％を得た。次に、ＰＡＡＰＡ７、１０ｇを２００ｍＬの
イオン交換水に溶解し、水酸化ナトリウムを用いｐＨ
８．０に調整した。この溶液にＮ−スクシンイミジル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート０．３ｇを
加え、室温で３時間反応させた。反応後、先と同様に室
温で１日透析し、側鎖に２−ピリジル−ジスルフィド基
を有するＰＡＡＰＡ７（ＳＳＰＡＡＰＡ７）を得た。２
−ピリジル−ジスルフィド基の置換率は、ピリジル基の
吸光度より０．９％を得た。側鎖へのポリアミノ酸鎖の
導入は、ＳＳＰＡＡＰＡ７の側鎖アミノ基を開始点とし
たポリアミノ酸重合により行った。脱水処理したＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド１００ｍＬにＮ−カルボキシ−
γ−メチルＬ−グルタメート２ｇを溶解させ、ＳＳＰＡ
ＡＰＡ７を４０ｍｇ加えた。室温で２４時間反応させた
後、反応液を５００ｍＬのイオン交換水中に注ぎ沈殿を
濾別した。この沈殿をイオン交換水を用い再沈精製し、
側鎖にポリメチルグルタメートを有するＳＰＡＡＰＡ７
（ＳＳＰＡＡＰＡ７ＰＭＧ）を得た。側鎖ポリメチルグ
ルタメートの数平均重合度は、４−フルオロ−７−ニト
ロベンゾフラザンを用いた末端アミノ基の定量より、３
１．７を得た。また、そのポリメチルグルタメート鎖を
有する置換アミノ基の置換率は９２．１％であった。Example 1 18.7 g of polyallylamine hydrochloride (Nitto Boseki Co., Ltd., number average molecular weight 10,000) was dissolved in 200 mL of a 1M aqueous sodium hydroxide solution. 5.5 g of palmitoyl chloride was gradually added dropwise to the solution, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. After the reaction, the pH of the reaction solution is adjusted to pH with sodium hydroxide.
H10.0, dialysis membrane spectropore (MWCO: 3500, manufactured by Spectrum Medical Instruments)
Was dialyzed at 50 ° C. for 1 day to obtain polyallylamine (PAAPA7) having a palmitoyl group in a side chain. The substitution rate of the palmitoyl group was estimated from the quantification of the unreacted amino group in PAAPA7. Specifically, 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan, which specifically reacts with a primary amine and emits strong fluorescence, is used.
%. Next, PAAPA7 and 10g were dissolved in 200 mL of ion exchanged water,
It was adjusted to 8.0. N-succinimidyl-
0.3 g of 3- (2-pyridyldithio) propionate was added and reacted at room temperature for 3 hours. After the reaction, dialysis was performed at room temperature for 1 day in the same manner as above to obtain PAAPA7 having a 2-pyridyl-disulfide group in a side chain (SSPAAPA7). 2
The substitution rate of the pyridyl-disulfide group was 0.9% based on the absorbance of the pyridyl group. The introduction of the polyamino acid chain into the side chain was carried out by polyamino acid polymerization starting from the side chain amino group of SSPAAPA7. Dehydrated N, N
-N-carboxy in 100 mL of dimethylformamide
Dissolve 2 g of γ-methyl L-glutamate and add SSPA
40 mg of APA7 was added. After reacting at room temperature for 24 hours, the reaction solution was poured into 500 mL of ion-exchanged water, and the precipitate was separated by filtration. This precipitate is purified by reprecipitation using ion-exchanged water,
SPAAPA7 having polymethyl glutamate in side chain
(SSPAAPA7PMG) was obtained. The number average degree of polymerization of the side chain polymethylglutamate was determined to be 3 based on the quantification of terminal amino groups using 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan.
1.7 was obtained. The substitution rate of the substituted amino group having a polymethylglutamate chain was 92.1%.
【００１９】次に、前記のようにして得られたＳＳＰＡ
ＡＰＡ７ＰＭＧ側鎖メトキシ基の脱離を次のようにして
行った。ＳＳＰＡＡＰＡ７ＰＭＧの１ｇを１，２−ジク
ロロエタン２０ｍＬに溶解し、０．３ｇの水酸化ナトリ
ウムを含む体積比１：２：２のイオン交換水、メタノー
ル、イソプロパノールの混合溶液３６ｍＬを１５分間か
けゆっくり滴下し、室温で１０時間撹絆した。酢酸でｐ
Ｈを７にし、反応を停止した。析出した沈殿を濾別後、
メタノールで十分洗浄した後、１００ｍＬのイオン交換
水に分散させた。さらに、１．４ｍＬの１０Ｎ塩酸をゆ
っくり滴下し、３日間室温で攪拌した。得られた沈殿を
濾別し、側鎖にポリグルタミン酸鎖を有するＳＳＰＡＡ
ＰＡ７（ＳＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡ）を得た。メトキシ基
の脱離は、ＳＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡの1Ｈ−ＮＭＲ測定
より、メトキシ基のプロトンに帰属される３．８８ｐｐ
ｍのピークが消失したことより、メトキシ基の１００％
が脱離したことを確認した。次に、ＳＳＰＡＡＰＡ７Ｐ
ＧＡの側鎖チオール基の保護基である２−ピリジル−ス
ルフィド基の脱離を行った。即ち、ＳＳＰＡＡＰＡ７Ｐ
ＧＡ０．５ｇをｐＨ４．５に調整した２５ｍＭのジチオ
スレイトール水溶液５０ｍＬに溶解し、１日攪拌するこ
とで行った。反応後透析により、ジチオスレトール及び
ピリジン−２−チオールを除去し、側鎖に疎水性のパル
ミトイル基、親水性のポリグルタミン酸鎖及びチオール
基を有する両親媒性重合体（ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡ）を
得た。この両親媒性重合体の構造式を示すと、次の通り
である。Next, the SSPA obtained as described above
The methoxy group on the side chain of APA7PMG was eliminated as follows. 1 g of SSPAAPA7PMG was dissolved in 20 mL of 1,2-dichloroethane, and 36 mL of a mixed solution of 0.32 g of sodium hydroxide containing ion-exchanged water, methanol and isopropanol in a volume ratio of 1: 2: 2 was slowly added dropwise over 15 minutes. Stir at room temperature for 10 hours. With acetic acid
H was set to 7 and the reaction was stopped. After separating the deposited precipitate by filtration,
After sufficiently washing with methanol, the resultant was dispersed in 100 mL of ion-exchanged water. Further, 1.4 mL of 10N hydrochloric acid was slowly dropped, and the mixture was stirred at room temperature for 3 days. The obtained precipitate is separated by filtration, and SSPAA having a polyglutamic acid chain in a side chain.
PA7 (SSPAAPA7PGA) was obtained. The elimination of the methoxy group was determined by 1 H-NMR measurement of SSPAAPA7PGA to give 3.88 pp attributed to the methoxy group proton.
100% of the methoxy group
Was confirmed to have desorbed. Next, SSPAAPA7P
The 2-pyridyl-sulfide group, which is a protecting group for the side chain thiol group of GA, was eliminated. That is, SSPAAPA7P
0.5 g of GA was dissolved in 50 mL of a 25 mM dithiothreitol aqueous solution adjusted to pH 4.5, and the solution was stirred for one day. After the reaction, dithiothreitol and pyridine-2-thiol were removed by dialysis to obtain an amphiphilic polymer (SPAAPA7PGA) having a hydrophobic palmitoyl group, a hydrophilic polyglutamic acid chain and a thiol group in the side chain. The structural formula of this amphiphilic polymer is as follows.
【化５】 Embedded image
【００２０】前記式５において、チオール基を含む置換
アミノ基の置換率ａは０．９％、ポリアミノ酸鎖を有す
る置換アミノ基の置換率ｂは９２．１％及びパルミトイ
ル基を有する置換アミノ基の置換率ｃは７％であった。
また、ポリアミノ酸鎖の数平均重合度ｄは３１．７であ
った。In the above formula 5, the substitution rate a of the substituted amino group containing a thiol group is 0.9%, the substitution rate b of the substituted amino group having a polyamino acid chain is 92.1%, and the substituted amino group having a palmitoyl group is 92.1%. Was 7%.
The number average degree of polymerization d of the polyamino acid chain was 31.7.
【００２１】さらに、ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡが水溶液中
で形成するミセルの表面極性を評価するために、媒体の
極性に応じその蛍光特性（蛍光波長・蛍光強度）が変化
するアニリノナフタレンをＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡに導入
した。この場合の反応は、０．１ｇのＳＰＡＡＰＡ７Ｐ
ＧＡをｐＨ７．５に調整した水溶液１００ｍＬに溶解さ
せ、１０-3ＭのＮ−（１−アニリノナフチル−４）マレ
イミドの１０-3Ｍエタノール溶液２０μＬを加え、氷冷
下一時間反応させた。反応後、透析により精製し、アニ
リノナフチル基を有するＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡ（ＡＮＳ
ＰＡＡＰＡ７ＰＧＡ）を得た。この場合のアニリノナフ
チル基は、側鎖チオール基と反応し、そのイオウ原子に
結合している。アニリノナフチル基の導入率はその蛍光
強度より、ポリアリルアミン中に含まれる全アミノ基に
対し、０．０４％であった。Further, in order to evaluate the surface polarity of micelles formed by the SPAAPA7PGA in an aqueous solution, anilinonaphthalene whose fluorescence characteristics (fluorescence wavelength and fluorescence intensity) change according to the polarity of the medium was introduced into the SPAAPA7PGA. The reaction in this case was 0.1 g of SPAAPA7P
GA was dissolved in an aqueous solution 100mL was adjusted to pH 7.5, 10 -3 M of N-(1-Anirinonafuchiru -4) to 10 -3 M ethanol solution 20μL of maleimide was added and reacted under ice cooling for one hour . After the reaction, the reaction product is purified by dialysis, and SPAAPA7PGA having an anilinonaphthyl group (ANS
PAAPA7PGA) was obtained. The anilinonaphthyl group in this case reacts with the side chain thiol group and is bonded to the sulfur atom. Based on the fluorescence intensity, the rate of introduction of the anilinonaphthyl group was 0.04% based on all amino groups contained in the polyallylamine.
【００２２】両親媒性共重合体ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡの
ミセル形成能を評価するため、ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡ１
ｍｇを５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液に加え、超音波照
射により分散させた。ＳＰＰＡＰＡ７ＰＧＡはｐＨ３以
上の溶液中で分散可溶化し、直径０．０５μｍ程度の粒
子として存在することを原子間力顕微鏡観察より確認し
た。この粒子がミセルであること、すなわち疎水場を形
成していることを確認するために、疎水性色素であるア
ニリノナフタレンの取り込み実験を行った。アニリノナ
フタレンの濃度はｌ０-5Ｍとした。ｐＨ３．０から１
１．０のすべての測定範囲において、アニリノナフタレ
ンはアセトンとへキサンの間に相当する疎水場に取り込
まれたことがわかる（図１）。すなわち、ＳＰＡＡＰＡ
７ＰＧＡはこのｐＨ範囲内においてミセルを形成するこ
とがわかった。なお、図１に示した波線は、それぞれ、
ヘキサン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
及び水中でのアニリノナフタレンの最大蛍光波長を示す
ものである。一方、白丸はＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡミセル
を含む水溶液中でのアニリノナフタレンの最大蛍光波長
を示すものである。In order to evaluate the micelle forming ability of the amphiphilic copolymer SPAAPA7PGA, SPAAPA7PGA1
mg was added to a 50 mM sodium chloride solution and dispersed by ultrasonic irradiation. It was confirmed by atomic force microscopy that SPPAPA7PGA was dispersed and solubilized in a solution having a pH of 3 or more and existed as particles having a diameter of about 0.05 μm. In order to confirm that the particles were micelles, that is, that they formed a hydrophobic field, an incorporation experiment of anilinonaphthalene, a hydrophobic dye, was performed. The concentration of anilinonaphthalene was 10 -5 M. pH 3.0 to 1
It can be seen that in all measurement ranges of 1.0, anilinonaphthalene was incorporated into the hydrophobic field corresponding to between acetone and hexane (FIG. 1). That is, SPAAPA
7PGA was found to form micelles within this pH range. Note that the wavy lines shown in FIG.
Hexane, acetone, N, N-dimethylformamide,
3 shows the maximum fluorescence wavelength of anilinonaphthalene in water and in water. On the other hand, open circles indicate the maximum fluorescence wavelength of anilinonaphthalene in an aqueous solution containing SPAAPA7PGA micelles.
【００２３】ＳＰＰＡＰＡ７ＰＧＡミセル表面のポリグ
ルタミン酸鎖の二次構造を円偏光二色性スペクトルより
評価した。図２に各ｐＨにおけるスペクトルを示した。
ｐＨの増加に伴いα−へリックス構造に帰属される２０
８ｎｍおよび２２２ｎｍのモル楕円率が減少し、ランダ
ムコイル構造に転移していることがわかる。この二次構
造転移に伴うミセル表面の極性変化を評価するために、
側鎖にアニリノナフタレンを導入したＡＮＳＰＡＡＰＡ
７ＰＧＡを用い同様にミセルを形成し、その蛍光測定を
行った。ＡＮＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡの最大蛍光波長をｐ
Ｈに対しプロットしたところ、ｐＨ８付近を変曲点とし
て高波長側にシフトし、ミセル表面が親水化したことが
わかる（図３）。この変化は、ポリグルタミン酸鎖の二
次構造転移に依存し、ランダムコイル含率が増加するこ
とでミセル表面の極性が増加するものである。さらに、
この極性の変化を定量化するために、側鎖にアニリノナ
フタレンを有するポリアリルアミン（ＡＮＰＡＡ）を合
成し、種々の体積分率のアセトニトリル水溶液中でのＡ
ＮＰＡＡの最大蛍光波長とアセトニトリル含率とを対応
づけた（図３）。この結果、ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡミセ
ル表面の極性はｐＨを変えることにより、アセトニトリ
ル含率で１０から６０％程度の範囲の極性を制御できる
ことが示された。The secondary structure of the polyglutamic acid chain on the SPPAPA7PGA micelle surface was evaluated from the circular dichroism spectrum. FIG. 2 shows the spectrum at each pH.
20 assigned to α-helix structure with increasing pH
It can be seen that the molar ellipticities at 8 nm and 222 nm are reduced, and the structure has shifted to a random coil structure. In order to evaluate the polarity change of the micelle surface accompanying this secondary structure transition,
ANSPAAPA with anilinonaphthalene introduced into the side chain
Similarly, micelles were formed using 7PGA, and the fluorescence was measured. The maximum fluorescence wavelength of ANSPAAPA7PGA is p
When plotted against H, it can be seen that the pH shifted to higher wavelengths around pH 8 as an inflection point, and that the micelle surface became hydrophilic (FIG. 3). This change depends on the secondary structure transition of the polyglutamic acid chain, and the polarity of the micelle surface increases as the random coil content increases. further,
In order to quantify this change in polarity, polyallylamine (ANPAA) having anilinonaphthalene in the side chain was synthesized, and A in an acetonitrile aqueous solution having various volume fractions was synthesized.
The maximum fluorescence wavelength of NPAA was associated with the acetonitrile content (FIG. 3). As a result, it was shown that the polarity of the surface of the SPAAPA7PGA micelle can be controlled by changing the pH in the range of about 10 to 60% in acetonitrile content.
【００２４】[0024]
【発明の効果】本発明の両親媒性重合体は、親水性部と
疎水性部の両方を有し、水中においてミセルを形成する
ものである。水中において形成されたこの重合体のミセ
ルは、そのミセル表面に存在するポリアミノ酸鎖の外部
刺激による二次構造転移に伴い、ミセル表面の極性が可
逆的に変化する。本発明の両親媒性重合体は、その水中
に形成されるミセルが、前記のように、表面極性を外部
刺激により制御可能という特徴を有するものである。従
って、本発明の重合体のミセルを用いることにより、特
定蛋白質の抽出・放出を簡便に行うことができる。The amphiphilic polymer of the present invention has both a hydrophilic part and a hydrophobic part and forms micelles in water. In the polymer micelle formed in water, the polarity of the micelle surface reversibly changes with the secondary structural transition of the polyamino acid chain present on the micelle surface due to external stimulus. The amphiphilic polymer of the present invention is characterized in that micelles formed in the water can control the surface polarity by an external stimulus as described above. Therefore, by using the polymer micelle of the present invention, extraction and release of the specific protein can be easily performed.
【図１】図１は、アニリノナフタレンを１０-5Ｍ含むＳ
ＰＡＡＰＡ７ＰＧＡミセル水溶液の最大蛍光波長のｐＨ
に対するプロットを示す。図中、波線は、それぞれ、ヘ
キサン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び
水中でのアニリノナフタレンの最大蛍光波長を示すもの
である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows S containing 10 -5 M of anilinonaphthalene.
PH of maximum fluorescence wavelength of PAAPA7PGA micelle aqueous solution
2 shows plots for. In the figure, the wavy lines indicate the maximum fluorescence wavelengths of anilinonaphthalene in hexane, acetone, N, N-dimethylformamide and water, respectively.
【図２】図２は、ＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡミセル表面のポ
リグルタミン酸鎖の各ｐＨにおける円偏光二色性スペク
トルを示したものである。FIG. 2 shows circular dichroism spectra of polyglutamic acid chains on the surface of SPAAPA7PGA micelle at each pH.
【図３】図３は、ＡＮＳＰＡＡＰＡ７ＰＧＡミセル水溶
液の最大蛍光波長のｐＨに対するプロット（白丸）と、
ＡＮＰＡＡアセトニトリル水溶液の最大蛍光波長のアセ
トニトリル体積分率に対するプロット（黒丸）を示す。FIG. 3 is a plot (open circles) of the maximum fluorescence wavelength of the aqueous solution of ANSPAAPA7PGA micelles against pH;
A plot (solid circle) of the maximum fluorescence wavelength of the AMPAA acetonitrile aqueous solution against the acetonitrile volume fraction is shown.
Claims (3)
１の数を示す）で表される繰返し構造単位を有し、その
数平均重合度ｎが１００〜１０００の範囲にある重合体
において、その重合体中に含まれるアミノ基の一部が一
般式 【化２】 〔式中、Ｘはカルボキシル基、水酸基、チオール基及び
アミノ基（置換アミノ基を含む）から選択された親水基
を示し、Ｒ2は低級アルキレン基を示し、ｐは数平均重
合度 を示し、１５〜１００の数を示す〕で表される親
水性置換アミノ基に変換され、その重合体中に含まれる
アミノ基の一部が一般式 【化３】 −ＮＨＣＯＲ3 （３） （式中、Ｒ3は炭素数６以上の脂肪族炭化水素基を示
す）で表される疎水性置換アミノ基に変換され、水中に
おいてミセル形成能を有することを特徴とする両親媒性
重合体。1. A compound of the general formula (Wherein, R 1 represents a lower alkylene group, m represents zero or a number of 1), and has a number average polymerization degree n in the range of 100 to 1,000. In the above, a part of the amino groups contained in the polymer is represented by the general formula: [ Wherein , X represents a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group and
Indicates a hydrophilic group <br/> selected from an amino group (including substituted amino group), R 2 represents a lower alkylene group, p is indicates the number average polymerization degree, tables in the number of 15 to 100] is converted to a hydrophilic substituted amino groups, that in some of the amino groups contained in the polymer general formula 3] -NHCOR 3 (3) (wherein, R 3 is 6 or more aliphatic carbon An amphiphilic polymer which is converted into a hydrophobic substituted amino group represented by a hydrocarbon group) and has a micelle-forming ability in water.
ノ基の割合が重合体中に含まれる全アミノ基の５０〜９
５％であり、一般式（３）で表される疎水性置換アミノ
基の割合が重合体中に含まれる全アミノ基の５〜３０％
である請求項１の両親媒性重合体。2. The ratio of the hydrophilic substituted amino group represented by the general formula (2) is 50 to 9 of all amino groups contained in the polymer.
5%, and the ratio of the hydrophobic substituted amino group represented by the general formula (3) is 5 to 30% of the total amino groups contained in the polymer.
The amphiphilic polymer according to claim 1, which is
を有する重合体における側鎖アミノ基の一部が、一般式 【化４】 （式中、Ｒ4は低級アルキレン基を示し、ｑはゼロ又は
１を示す）で表されるチオール基を有する置換アミノ基
に変換されている請求項１又は２の両親媒性重合体。3. A side chain amino group in a polymer having a repeating structural unit represented by the general formula (1) is partially represented by the general formula: (Wherein R 4 represents a lower alkylene group, and q represents zero or 1). The amphiphilic polymer according to claim 1 or 2, which has been converted to a substituted amino group having a thiol group.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8112313A JP2884063B2 (en) | 1996-05-07 | 1996-05-07 | Amphiphilic polymer |
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|---|---|
| JPH09296012A JPH09296012A (en) | 1997-11-18 |
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| JP8112313A Expired - Lifetime JP2884063B2 (en) | 1996-05-07 | 1996-05-07 | Amphiphilic polymer |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2151249A1 (en) | 2008-07-28 | 2010-02-10 | Canon Kabushiki Kaisha | PH-sensitive probe comprising polymer and fluorescent dye |
| WO2022211006A1 (en) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 三洋化成工業株式会社 | Cross-linked polymer, method for separating substance, kit for separating substance, kit for testing for disease, and device for separating substance |
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|---|---|---|---|---|
| JP4600613B2 (en) * | 2000-03-28 | 2010-12-15 | オルガノ株式会社 | Fluorescently labeled polycarboxylic acid and method for producing the same |
-
1996
- 1996-05-07 JP JP8112313A patent/JP2884063B2/en not_active Expired - Lifetime
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| EP2151249A1 (en) | 2008-07-28 | 2010-02-10 | Canon Kabushiki Kaisha | PH-sensitive probe comprising polymer and fluorescent dye |
| WO2022211006A1 (en) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 三洋化成工業株式会社 | Cross-linked polymer, method for separating substance, kit for separating substance, kit for testing for disease, and device for separating substance |
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| JPH09296012A (en) | 1997-11-18 |
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