JP2865298B2 - Optical heterodyne fluorescence microscope - Google Patents
Optical heterodyne fluorescence microscopeInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、光ヘテロダイン螢光顕微鏡に関する。さ
らに詳しくは、この発明は、生体のような散乱試料に励
起用レーザ光を照射し、散乱試料から発せられる蛍光を
参照用レーザ光と光混合してヘテロダイン検波し、高分
解能で蛍光像を得られるようにする光ヘテロダイン螢光
顕微鏡に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to an optical heterodyne fluorescence microscope. More specifically, the present invention irradiates a scattering sample such as a living body with a laser beam for excitation, mixes the fluorescence emitted from the scattering sample with a reference laser beam, performs heterodyne detection, and obtains a fluorescence image with high resolution. And a light heterodyne fluorescence microscope.
（背景技術） 蛍光像の観察は生物試料等の情報を得る重要な手段と
なっており、そのために従来より蛍光顕微鏡が用いられ
ている。(Background Art) Observation of a fluorescent image is an important means for obtaining information on a biological sample or the like, and a fluorescent microscope has been conventionally used for that purpose.
蛍光顕微鏡としては、一般に、落射方式で試料に励起
光を照射し、試料が発する蛍光を照射光軸と同軸に設置
した励起光カットフィルターを通して観察するものが使
用されている。このような蛍光顕微鏡の光学系において
は、第４図に示すように、タングステンフィラメント等
の光源（１′）から発せられた励起光がコンデンサーレ
ンズ（L0）で集光され、試料（Ｓ）を視野全域にわたっ
て照射し、その照射により試料（Ｓ）が発する蛍光が対
物レンズ（L0）によって観察像（Ｉ）を結像するように
なっている。In general, a fluorescence microscope that irradiates a sample with excitation light in an epi-illumination system and observes fluorescence emitted from the sample through an excitation light cut filter installed coaxially with an irradiation optical axis is used. In the optical system of such a fluorescence microscope, as shown in FIG. 4, excitation light emitted from a light source (1 ') such as a tungsten filament is condensed by a condenser lens (L 0 ), and the sample (S) Is irradiated over the entire visual field, and the fluorescence emitted from the sample (S) by the irradiation forms an observation image (I) by the objective lens (L 0 ).
しかしながら、このような蛍光顕微鏡では、通常の顕
微鏡に比べれば明瞭な観察像が得られるものの、蛍光の
重なり合いにより像にぼけが生じ、低い分解能しか得ら
れない。また試料の特定面の観察像を鮮明に得ることも
困難となっている。However, with such a fluorescence microscope, although a clear observation image can be obtained as compared with a normal microscope, the image is blurred due to the overlapping of the fluorescence, and only a low resolution can be obtained. It is also difficult to obtain a clear observation image of a specific surface of the sample.
これに対して、近年、蛍光の重なり合いによる分解能
の低下を改善し、特定面での観察像も鮮明に得られるよ
うにするものとして、共焦点型レーザ蛍光顕微鏡が提案
されている。この共焦点型レーザ蛍光顕微鏡の光学系
は、第５図に示すように、集束光学系が常に光軸上の光
線からなるように構成し、収差による像の歪みを解消し
たものである。また、この光学系においては、励起光が
試料（Ｓ）の測定面全域を同時に照射するのではなく、
試料（Ｓ）の一点を照射し走査するため、不必要な散乱
光やフレアーによるコントラストの低下も防止される。
さらに、検出器（Ｄ）の前面に配置したピンホール
（Ｐ）により解像能を向上させ、また対物レンズ（L0）
内の不要な錯乱光をほぼ完全に排除することもできるよ
うになる。On the other hand, in recent years, a confocal laser fluorescence microscope has been proposed as a means for improving a reduction in resolution due to overlapping of fluorescence and enabling a clear observation image on a specific surface to be obtained. As shown in FIG. 5, the optical system of the confocal laser fluorescence microscope is configured such that the focusing optical system always includes light rays on the optical axis, thereby eliminating image distortion due to aberration. In this optical system, the excitation light does not irradiate the entire measurement surface of the sample (S) at the same time.
Since one point of the sample (S) is irradiated and scanned, a decrease in contrast due to unnecessary scattered light and flare is also prevented.
Further, the resolution is improved by a pinhole (P) arranged in front of the detector (D), and the objective lens (L 0 )
It is also possible to almost completely eliminate unnecessary confusion light inside.
しかしながら、このように蛍光の空間的重なり合いの
分別能が向上し、従来の蛍光顕微鏡に比べて高い分解能
を達成することができる共焦点型のレーザ蛍光顕微鏡に
よっても、周波数帯域の重なった蛍光を分別することは
できない。そのため、蛍光の周波数域が重なり合うこと
の多い生体系の種々の散乱物質の分析に対しては、満足
できるものとはなっていないのが実状である。However, the ability to discriminate the spatial overlap of fluorescence is improved in this way, and even confocal laser fluorescence microscopes that can achieve higher resolution than conventional fluorescence microscopes can distinguish fluorescence with overlapping frequency bands. I can't. Therefore, in reality, it is not satisfactory for the analysis of various scattered substances in a biological system in which the frequency ranges of fluorescence often overlap.
（発明の目的） この発明は、以上の通りの事情を踏まえてなされたも
のであり、空間的に重なり合った蛍光だけでなく周波数
域が重なり合った蛍光も高い分解能で分別できるように
し、周波数域が重なり合うことの多い生体系等の散乱物
質に対しても詳細な蛍光分析が行えるようにすることを
目的としている。(Object of the Invention) The present invention has been made in view of the above circumstances, and enables not only fluorescent light having a spatial overlap but also fluorescent light having a frequency overlap to be able to be separated with high resolution. It is an object of the present invention to enable a detailed fluorescence analysis to be performed on a scattering material such as a biological system which often overlaps.
（発明の開示） この発明は、上記の目的を実現するため、散乱試料に
励起用レーザ光を照射して蛍光を発生させる試料照射手
段と、散乱試料から発せられた蛍光を分光し、この分光
した波長と同じ波長の参照用レーザ光を光混合し、ヘテ
ロダイン検波する検出手段とを有する光ヘテロダイン螢
光顕微鏡を提供する。DISCLOSURE OF THE INVENTION In order to achieve the above object, the present invention provides a sample irradiation means for irradiating a scattering sample with an excitation laser beam to generate fluorescence, and spectroscopy the fluorescence emitted from the scattering sample. An optical heterodyne fluorescence microscope is provided, which has a detection means for optically mixing a reference laser beam having the same wavelength as the selected wavelength and performing heterodyne detection.
この蛍光顕微鏡は、分析すべき光を参照用レーザ光と
光混合してヘテロダイン検波し、高分解能検出を可能と
する光ヘテロダイン・レーザ顕微鏡の原理を蛍光分析に
応用し、周波数域が重なり合った蛍光であっても高い分
解能で分析できるようにしたものである。This fluorescence microscope mixes light to be analyzed with a reference laser beam, performs heterodyne detection, and applies the principle of an optical heterodyne laser microscope that enables high-resolution detection to fluorescence analysis. Even so, analysis can be performed with high resolution.
このようなこの発明の蛍光顕微鏡は、さらに、空間的
に重なり合った蛍光の分別能が高い共焦点型レーザ蛍光
顕微鏡の原理を兼ね備えることもできる。そのように構
成した場合の具体的態様として、この発明は、上記の光
ヘテロダイン螢光顕微鏡において、試料照射手段と検出
手段が共焦点光学系を構成するように、散乱試料に励起
用レーザ光をスポット照射する試料照射手段と、散乱試
料の照射スポットから発せられた蛍光を、参照用レーザ
光との光混合前または光混合後に点像に結像し、アパー
チャのピンホールを介して検出する検出手段とを有する
光ヘテロダイン螢光顕微鏡を提供する。Such a fluorescence microscope of the present invention can also have the principle of a confocal laser fluorescence microscope having a high ability to discriminate spatially overlapped fluorescence. As a specific embodiment in the case of such a configuration, the present invention provides the optical heterodyne fluorescence microscope described above, in which a laser beam for excitation is applied to the scattering sample so that the sample irradiation unit and the detection unit constitute a confocal optical system. A sample irradiating means for irradiating a spot, and a fluorescent light emitted from an irradiating spot of a scattered sample is formed into a point image before or after light mixing with a reference laser beam, and detected through a pinhole in an aperture. And an optical heterodyne fluorescence microscope comprising:
この発明の蛍光顕微鏡においては、散乱試料に励起用
レーザ光を照射して蛍光を発生させる試料照射手段は、
従来の共焦点型レーザ蛍光顕微鏡の試料照射手段と同様
に、励起用レーザ構成光源や励起光の集光照射用のレン
ズ系等から構成することができ、また、散乱試料からの
蛍光に参照用レーザ光を光混合し、ヘテロダイン検波す
る検出手段は、試料から発せられた蛍光を分光して、あ
る波長だけの成分を取出しその波長と同じ波長の参照用
レーザ光を光混合する。その後は、従来の光ヘテロダイ
ン・レーザ顕微鏡と同様に、光混合器、二乗検波器、増
幅器等から構成することができる。In the fluorescence microscope of the present invention, the sample irradiating means for irradiating the scattering sample with excitation laser light to generate fluorescence,
As with the sample irradiating means of a conventional confocal laser fluorescence microscope, it can be composed of a laser component light source for excitation, a lens system for condensing and irradiating excitation light, etc. Detection means for mixing the laser light and heterodyne detection disperses the fluorescence emitted from the sample, extracts a component having a certain wavelength, and mixes the reference laser light having the same wavelength as the wavelength. After that, similarly to the conventional optical heterodyne laser microscope, it can be constituted by an optical mixer, a square detector, an amplifier and the like.
ただし、散乱試料から発せられた蛍光を参照用レーザ
光と光混合させるに際しては、散乱試料からの蛍光を分
光して時間コヒーレンジーを高めるだけでなく空間コヒ
ーレンジーを高めた後に光混合させるのがより高い分解
能を得るために好ましい。そのように光混合する光学系
の例としては、散乱試料から発せられた蛍光を、検出手
段のアパーチャとレンズ系から定める回折限界の視野の
光束にして光混合するものをあげることができる。However, when mixing the fluorescence emitted from the scattering sample with the reference laser beam, it is necessary not only to increase the time coherence by spectrally separating the fluorescence from the scattering sample but also to mix the light after increasing the spatial coherence. Preferred for obtaining higher resolution. As an example of such an optical system for mixing light, there can be cited one that mixes fluorescent light emitted from a scattering sample into a light beam having a field of view of a diffraction limit determined by an aperture of a detection means and a lens system.
このような、インコヒーレント光とコヒーレント光の
レーザとのヘテロダイン検出の基本技術は、すでに実施
されており（応用物理、1988,第57巻，第３号,p.341〜3
46）、その技術を応用すればよい。Such a basic technique of heterodyne detection between an incoherent light and a coherent light laser has already been implemented (Applied Physics, 1988, Vol. 57, No. 3, p. 341-3).
46), Apply that technology.
また、この発明の蛍光顕微鏡においては、参照用レー
ザ光の周波数を変化させることにより、変化させた周波
数ごとの蛍光画像が得られ、その周波数幅の分解能が得
られることとなるが、参照用レーザ光の周波数を変化さ
せる態様としては、参照用レーザ光の周波数が、発振周
波数の調整により変化するようにすることができる。ま
た、周波数変化の幅を小さくして、より高分解の画像を
得られるようにする場合には、参照用レーザ光の周波数
が周波数変換器によりシフト変化するようにすることが
できる。Further, in the fluorescence microscope of the present invention, by changing the frequency of the reference laser light, a fluorescence image for each changed frequency is obtained, and the resolution of the frequency width is obtained. As a mode of changing the frequency of the light, the frequency of the reference laser light can be changed by adjusting the oscillation frequency. Further, when the width of the frequency change is reduced to obtain a higher resolution image, the frequency of the reference laser light can be shifted by the frequency converter.
また、この発明においては、散乱試料の検出点を３次
元方向に走査し、散乱試料の検出点の位置信号と参照用
レーザ光の周波数と共にその検出点ごとの検出結果を、
コンピュータに蓄積し、CRTに画像化するが、このよう
な顕微鏡の走査についても従来の光ヘテロダイン蛍光顕
微鏡あるいは共焦点型レーザ蛍光顕微鏡と同様にするこ
とができる。Further, in the present invention, the detection points of the scattering sample are scanned in a three-dimensional direction, and the position signal of the detection points of the scattering sample and the frequency of the reference laser beam are detected together with the detection result for each detection point.
The data is stored in a computer and is imaged on a CRT. Scanning of such a microscope can be performed in the same manner as a conventional optical heterodyne fluorescence microscope or confocal laser fluorescence microscope.
以下、この発明を実施例に基づいて具体的に説明す
る。Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples.
第１図は、この発明の光ヘテロダイン螢光顕微鏡の一
実施例の光学配置図である。FIG. 1 is an optical layout diagram of one embodiment of the optical heterodyne fluorescence microscope of the present invention.
この蛍光顕微鏡においては、励起用レーザ光（L1）が
励起用レーザ光源（１）より射出し、ミラー（２）とハ
ーフミラー（３）によりレンズ（４）に入射して集束
し、散乱試料（５）をスポット照射するようになってい
る。In this fluorescence microscope, an excitation laser beam (L 1 ) is emitted from an excitation laser light source (1), is incident on a lens (4) by a mirror (2) and a half mirror (3), is focused, and is scattered. (5) is spot-irradiated.
この励起用レーザ光（L1）の照射により散乱試料
（５）は蛍光（L2）を発するが、その蛍光（L2）はレン
ズ（６）により結像してアパーチャのピンホール（７）
上に点像となり、そのアパーチャのピンホール（７）を
透過していくようになっている。アパーチャのピンホー
ル（７）を透過した蛍光（L2）は、レンズ（８）により
平行光束（L3）にしてビームスプリッタ（９）に入射さ
せ、そこで参照用レーザ光と光混合するようにしてあ
る。その際、コヒーレント性を高めた状態で光混合して
高分解能が得られるようにするために、平行光束（L3）
は、レンズ（８）とアパーチャのピンホール（７）の径
により定まる回折限界の径となるようにしてある。Scattering sample by irradiation of the excitation laser beam (L 1) (5) Fluorescent (L 2) to emit, but its fluorescence (L 2) is imaged by a lens (6) aperture pinholes (7)
It becomes a point image on the upper side and is transmitted through the pinhole (7) of the aperture. The fluorescence (L 2 ) transmitted through the pinhole (7) of the aperture is converted into a parallel light beam (L 3 ) by a lens (8) and is incident on a beam splitter (9), where it is mixed with a reference laser beam. It is. At this time, in order to obtain high resolution by mixing the light with high coherence, a parallel beam (L 3 )
Is set to have a diffraction-limited diameter determined by the diameter of the lens (8) and the pinhole (7) of the aperture.
一方、参照用レーザ光（L4）は、参照用レーザ光源
（10）から波長調整器（11）の制御により所定の発振周
波数（波長λ１）で射出するようになっており、ミラー
（12）、レンズ（13）、レンズ（14）により上記の回折
限界の径の平行光束（L5）に変換され、ビームスプリッ
タ（９）に入射し、そこで散乱試料が発した蛍光の平行
光束（L3）と光混合するようになっている。On the other hand, the reference laser light (L 4 ) is emitted from the reference laser light source (10) at a predetermined oscillation frequency (wavelength λ 1 ) under the control of the wavelength adjuster (11). ), A lens (13), and a lens (14), which are converted into a parallel light beam (L 5 ) having the above-mentioned diffraction-limited diameter, and are incident on the beam splitter (9) where the parallel light beam (L 5 ) of the fluorescent light emitted by the scattering sample is emitted. 3 ) and light mixing.
このように光混合した両光束（L3,L5）は、回折格子
駆動装置（15）で角度調整した回折格子（16）により回
折して分光帯域外の不要な光成分が除去され、レンズ
（17）で集光されて光電検出器（18）に入射する。そし
てその光電検出器（18）による検出信号は、増幅器（1
9）と選択レベル測定器（20）により所定の周波数成分
のみがCRT（21）に選別出力されるようになっている。The thus mixed light beams (L 3 , L 5 ) are diffracted by the diffraction grating (16) whose angle is adjusted by the diffraction grating driving device (15) to remove unnecessary light components outside the spectral band. The light is condensed at (17) and enters the photoelectric detector (18). The detection signal from the photoelectric detector (18) is output to the amplifier (1
Only predetermined frequency components are selectively output to the CRT (21) by 9) and the selection level measuring device (20).
このような検出信号の出力は、散乱試料（５）の分析
点ごとに出力されるので、散乱試料（５）の所定範囲の
分析を行うに際しては、この散乱試料（５）の分析点を
試料設置台（22）を動かして走査する。この走査は、ド
ライバー（24）で制御しつつ、試料設置台移動モータ
（23）で試料設置台（22）をｘ−ｙ−ｚの３軸方向に移
動して行うようになっている。また、散乱試料（５）の
分析点は、ドライバー（24）からCRT（21）に伝達され
るようになっている。Since the output of such a detection signal is output for each analysis point of the scattering sample (5), when analyzing a predetermined range of the scattering sample (5), the analysis point of the scattering sample (5) is used as the sample. Scan by moving the mounting table (22). This scanning is performed by moving the sample setting table (22) in the x, y, and z axes directions by the sample setting table moving motor (23) while controlling with the driver (24). The analysis point of the scattering sample (5) is transmitted from the driver (24) to the CRT (21).
この散乱試料（５）の分析点の情報と上記の蛍光の検
出信号とから、CRT（21）は蛍光像を上記の周波数（波
長λ１）の場合の像として表示し、また、フレームメモ
リ（25）に伝達してその蛍光像が蓄積されるようにして
いる。From the information of the analysis point of the scattering sample (5) and the above-mentioned fluorescence detection signal, the CRT (21) displays the fluorescence image as an image at the above-mentioned frequency (wavelength λ 1 ), 25) so that the fluorescent image is accumulated.
このような蛍光顕微鏡において、参照用レーザ光
（L4）の発振周波数が異なる場合の蛍光像は、上記の波
長調整器（11）を制御し、参照用レーザ光源（10）に異
なる発振周波数（波長λ２）を発振させて得ることがで
きる。そしてこのようにして得た各波長での検出データ
をフレームメモリー（25）に蓄積し、それをモニター
（26）に表示させ、蛍光像を参照用レーザ光（L4）のス
ペクトル幅の分解能で周波数（波長）分析することを可
能としている。In such a fluorescence microscope, the fluorescence image when the oscillation frequency of the reference laser beam (L 4 ) is different is controlled by the above-mentioned wavelength adjuster (11), and the different oscillation frequency (L 4 ) is transmitted to the reference laser light source (10). It can be obtained by oscillating the wavelength λ 2 ). The detection data at each wavelength thus obtained is then stored in the frame memory (25), it is displayed on a monitor (26), with a resolution of the spectral width of the reference laser beam a fluorescent image (L 4) It enables frequency (wavelength) analysis.
なお、実視野での観察は、ランプ（27）、レンズ（2
8）、ハーフミラー（29）による照明と、レンズ
（４）、プリズム（30）、接眼レンズ（31）の光学系に
より行うことができる。Observation in the actual visual field was performed using a lamp (27) and a lens (2
8), illumination by the half mirror (29) and the optical system of the lens (4), the prism (30), and the eyepiece (31).
第２図は、この発明の他の実施例の光学配置図であ
る。FIG. 2 is an optical arrangement diagram of another embodiment of the present invention.
この実施例の蛍光顕微鏡は、第１図に示した実施例が
参照用レーザ光（L4）の周波数を参照用レーザ光源（1
0）の発振周波数を変えることにより可変としているの
に対し、参照用レーザ光源（10）に周波数変換器（1
1′）を接続してその周波数をシフトさせるようにした
ものである。すなわち、参照用レーザ光源（10）から周
波数ωｎ（波長λｎ）で発振された参照用レーザ光
（L4）を、周波数変換器（11′）で周波数ωｎ＋Δωｎ
に変換し、Δωｎだけ変化させるようにしたものであ
り、これにより蛍光波長λｎ近傍での蛍光像の高分解分
析を可能にするものである。The fluorescence microscope of this embodiment is different from the embodiment shown in FIG. 1 in that the frequency of the reference laser beam (L 4 ) is
0) is changed by changing the oscillation frequency, while the reference laser light source (10) is connected to the frequency converter (1).
1 ') is connected to shift the frequency. That is, the reference laser light (L 4 ) oscillated at the frequency ω n (wavelength λ n ) from the reference laser light source (10) is converted into the frequency ω n + Δω n by the frequency converter (11 ′).
, And is changed by Δω n , thereby enabling high-resolution analysis of the fluorescence image near the fluorescence wavelength λ n .
第３図は、さらに異なるこの発明の実施例の光学配置
図である。FIG. 3 is an optical layout diagram of still another embodiment of the present invention.
この実施例は、上記第１図および第２図に示した実施
例と異なり、散乱試料からの蛍光（L2）を参照用レーザ
光（L4）とを光混合した後に点像に結像し、アパーチャ
のピンホールを介して検出するようにしたものである。
この場合、散乱試料からの蛍光（L2）を点像に結像させ
る光学系としては、第１図あるいは第２図のレンズ
（６）の代わりに、凹面回析格子（16′）が機能する。
また、アパーチャのピンホール（７）は光電検出器（1
8）の前面に設置したものとなっている。This embodiment is different from the embodiment shown in FIGS. 1 and 2 in that the fluorescence (L 2 ) from the scattering sample is mixed with a reference laser beam (L 4 ) and then formed into a point image. The detection is performed through a pinhole of the aperture.
In this case, instead of the lens (6) in FIG. 1 or FIG. 2, a concave diffraction grating (16 ') functions as an optical system for forming fluorescent light (L 2 ) from the scattering sample into a point image. I do.
The aperture pinhole (7) is connected to the photoelectric detector (1
8) Installed in front of
このような実施例においては、散乱試料からの蛍光
（L2）と参照用レーザ光（L4）とは、双方とも球面波と
して光混合することとなる。In such an embodiment, the fluorescence (L 2 ) from the scattering sample and the reference laser beam (L 4 ) are both optically mixed as spherical waves.
また、この実施例では、選択レベル測定器（20）から
の出力を同期検波器（32）で同期検波し、それに基づい
て散乱試料からの蛍光（L2）の射出光路をチョッパー
（33）で開閉することにより背景光の影響を除けるよう
になっている。以上、３種の実施例について説明した
が、この発明の実施例はこれらに限られるものではな
く、種々の態様をとることができる。Further, in this embodiment, the output from the selected level measuring device (20) is synchronously detected by the synchronous detector (32), and based on this, the emission optical path of the fluorescent light (L 2 ) from the scattering sample is detected by the chopper (33). By opening and closing, the influence of the background light can be eliminated. Although the three embodiments have been described above, the embodiments of the present invention are not limited to these embodiments, and may take various forms.
（発明の効果） この発明の蛍光顕微鏡によれば、散乱試料に励起用レ
ーザ光を照射して蛍光を発生させ、その蛍光を参照用レ
ーザ光と光混合し、ヘテロダイン検波して検出するの
で、従来分別が困難であった蛍光帯域の重なった生体の
ような散乱物質の蛍光分析を高い分解能で行えるように
なる。特に、この蛍光顕微鏡を共焦点型光学系に構成し
た場合には、解像力を一層向上させ、また不要な散乱光
を除去することもできるので、より高精度に鮮明な蛍光
像を得ることができるようになる。(Effects of the Invention) According to the fluorescence microscope of the present invention, the scattered sample is irradiated with the excitation laser light to generate fluorescence, and the fluorescence is mixed with the reference laser light, and detected by heterodyne detection. Fluorescence analysis of a scattered substance such as a living body having overlapping fluorescent bands, which has conventionally been difficult to separate, can be performed with high resolution. In particular, when the fluorescence microscope is configured as a confocal optical system, the resolution can be further improved, and unnecessary scattered light can be removed, so that a clear fluorescent image can be obtained with higher precision. Become like
第１図〜第３図は、それぞれこの発明の光ヘテロダイン
蛍光顕微鏡の光学配置図である。 第４図は、従来の蛍光顕微鏡の原理を示す光学配置図で
ある。 第５図は、従来の共焦点型の蛍光顕微鏡の原理を示す光
学配置図である。 （L1）励起用レーザ光 （L2）蛍光 （L3）平行光束 （L4）参照用レーザ光 （１）励起用レーザ光源 （２）ミラー （３）ハーフミラー （４）レンズ （５）試料 （６）レンズ （７）アパーチャのピンホール （８）レンズ （９）ビームスプリッタ （10）参照用レーザ光源 （11）波長調整器 （16）回折格子 （16′）凹面回折格子 （18）光電検出器 （19）増幅器 （20）選択レベル測定器 （21）CRT （24）ドライバー （25）フレームメモリ （26）モニター1 to 3 are optical arrangement diagrams of the optical heterodyne fluorescence microscope of the present invention. FIG. 4 is an optical layout diagram showing the principle of a conventional fluorescence microscope. FIG. 5 is an optical layout showing the principle of a conventional confocal fluorescence microscope. (L 1 ) Excitation laser light (L 2 ) Fluorescence (L 3 ) Parallel light flux (L 4 ) Reference laser light (1) Excitation laser light source (2) Mirror (3) Half mirror (4) Lens (5) Sample (6) Lens (7) Aperture pinhole (8) Lens (9) Beam splitter (10) Laser light source for reference (11) Wavelength adjuster (16) Diffraction grating (16 ') Concave diffraction grating (18) Photoelectric Detector (19) Amplifier (20) Select level measuring instrument (21) CRT (24) Driver (25) Frame memory (26) Monitor
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 稲葉 文男 宮城県仙台市八木山南１丁目13―１ (56)参考文献 特開 昭61−219919（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−98072（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−212716（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−149043（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−110346（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−150747（ＪＰ，Ａ) 特許2644609（ＪＰ，Ｂ２) 特許2748269（ＪＰ，Ｂ２) 応用物理、ＶｏＬ．57（３) （1988）、ｐ．341−346 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｑｕｅ、ｖｏｌ．46 （11）、ｐ．1937−1948 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G02B 21/00 - 21/36 G01N 21/27────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Fumio Inaba 1-13-1 Yagiyama Minami, Sendai City, Miyagi Prefecture (56) References JP-A-61-219919 (JP, A) JP-A-51-98072 (JP, A) JP-A-60-212716 (JP, A) JP-A-55-149043 (JP, A) JP-A-2-110346 (JP, A) JP-A-2-150747 (JP, A) Patent 2644609 (JP) , B2) Patent 2748269 (JP, B2) Applied Physics, VoL. 57 (3) (1988), p. 341-346. Physique, vol. 46 (11), p. 1937-1948 (58) Field surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) G02B 21/00-21/36 G01N 21/27
Claims (5)
を発生させる試料照射手段と、散乱試料から発せられた
蛍光を分光し、この分光した波長と同じ波長の参照用レ
ーザ光を光混合し、ヘテロダイン検波する検出手段とを
有する光ヘテロダイン螢光顕微鏡。1. A sample irradiating means for irradiating a scattering sample with a laser beam for excitation to generate fluorescence, and dispersing the fluorescence emitted from the scattering sample, and irradiating a reference laser beam having the same wavelength as the separated wavelength. An optical heterodyne fluorescence microscope having detection means for mixing and heterodyne detection.
構成するように、散乱試料に励起用レーザ光をスポット
照射する試料照射手段と、散乱試料の照射スポットから
発せられた蛍光を、参照用レーザ光との光混合前または
光混合後に点像に結像し、アパーチャのピンホールを介
して検出する検出手段とを有する請求項（１）記載の光
ヘテロダイン螢光顕微鏡。2. A sample irradiating means for irradiating a scattered sample with a laser beam for excitation so that a sample irradiating means and a detecting means constitute a confocal optical system; 2. An optical heterodyne fluorescence microscope according to claim 1, further comprising: a detecting means for forming an image into a point image before or after the light mixing with the reference laser beam and detecting through a pinhole of the aperture.
のアパーチャとレンズ系から定まる回折限界の視野の光
束にして光混合する請求項（１）または（２）記載の光
ヘテロダイン螢光顕微鏡。3. The optical heterodyne fluorescence microscope according to claim 1, wherein the fluorescence emitted from the scattered sample is mixed into a light beam having a field of view of a diffraction limit determined by an aperture of a detection means and a lens system. .
調整により変化する請求項（１）または（２）記載の光
ヘテロダイン螢光顕微鏡。4. The optical heterodyne fluorescence microscope according to claim 1, wherein the frequency of the reference laser beam changes by adjusting the oscillation frequency.
によりシフト変化する請求項（１）または（２）記載の
光ヘテロダイン螢光顕微鏡。5. The optical heterodyne fluorescence microscope according to claim 1, wherein the frequency of the reference laser beam is shifted by a frequency converter.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30277588A JP2865298B2 (en) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | Optical heterodyne fluorescence microscope |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30277588A JP2865298B2 (en) | 1988-11-30 | 1988-11-30 | Optical heterodyne fluorescence microscope |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH02148012A JPH02148012A (en) | 1990-06-06 |
| JP2865298B2 true JP2865298B2 (en) | 1999-03-08 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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1988
- 1988-11-30 JP JP30277588A patent/JP2865298B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｐｈｙｓｉｑｕｅ、ｖｏｌ．４６（１１）、ｐ．１９３７−１９４８ |
| 応用物理、ＶｏＬ．５７（３）（１９８８）、ｐ．３４１−３４６ |
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| JPH02148012A (en) | 1990-06-06 |
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