JP2845386B2 - 内分岐大環状サイクロデキストリンを含む大環状サイクロデキストリン混合物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はサイクロデキストリン
（以下、ＣＤと略すことがある。）合成酵素により生産
されたＣＤ製品から内分岐大環状ＣＤを含む大環状ＣＤ
混合物を製造する方法に関し、詳しくは澱粉類にＣＤ合
成酵素を作用させて各種ＣＤの混合物を得た後、グルコ
アミラーゼを作用させてＣＤ以外の糖類をグルコースに
まで分解し、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤを複合
体形成沈澱により除去し、次いで逆相カラムにより、内
分岐大環状ＣＤを含む大環状ＣＤ混合物を製造する方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のＣＤは６個のグルコースがα−
１，４結合で環状に連結したα−ＣＤ、７個のβ−Ｃ
Ｄ、８個のγ−ＣＤであり、バチルス・マセランス(Bac
illus macerans) などＣＤ合成酵素（CGTase）の反応に
よって澱粉，その他の関連基質から生産されることは良
く知られている。

【０００３】これらのＣＤの他に、同族に属する９個の
グルコース環以上のδ−，ε−，ζ−，η−ＣＤなどの
大環状ＣＤやＣＤ環にグルコース，マルトースなどの枝
が付いた分岐ＣＤが知られている。

【０００４】分岐ＣＤについては、特にＣＤ環内にα−
１，６結合をもつ内分岐ＣＤは、古くはフレンチらによ
り内分岐α−およびβ−ＣＤの存在が予想されている。

【０００５】これまでの大環状ＣＤの製造方法について
は、小林らの方法（日本農芸化学会大会、講演要旨集、
p649(1986)）がある。本法は市販ＣＤ粉飴にβ−アミラ
ーゼ，プルラナーゼおよび酵母を同時に作用させて大環
状ＣＤを効率的に調製するものであった。

【０００６】しかし、最近の研究結果から、グルコアミ
ラーゼまたはβ−アミラーゼとプルラナーゼを共同作用
させると、大環状ＣＤの生成率が著しく低下することが
分かり、プルラナーゼにより環状構造が切断されること
が予想された。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
αからγ−ＣＤには内分岐ＣＤは存在せず環に歪みがか
かる大環状ＣＤにその存在の可能性を予想し、さらにプ
ルラナーゼを用いず、グルコアミラーゼのみを用いた大
環状ＣＤの調製を試み、グルコアミラーゼの作用を受け
ず、枝切り酵素の作用によりグルコース９個以上のα−
１，４グルカンを産生することを確認し、内分岐大環状
ＣＤの存在を明確にして本発明を完成したのである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は澱粉
類にサイクロデキストリン合成酵素を作用させて得たサ
イクロデキストリン製品にグルコアミラーゼを作用させ
ることを特徴とする内分岐大環状サイクロデキストリン
を含むサイクロデキストリン混合物の製造方法に関す
る。

【０００９】澱粉類にサイクロデキストリン合成酵素を
作用させてサイクロデキストリン製品を製造する場合の
原料や反応条件等には特に制限がなく、既知の手法を適
用することができる。以下に本発明の方法の１例を示
す。市販のＣＤ粉飴（商品名デキシパールＫ−５０、塩
水港精糖製）４００ｇを原料とし、過剰の市販グルコア
ミラーゼ酵素（生化学工業製）６０００ＩＵ（国際単
位）を加え、基質濃度３０％，ｐＨ５．４，５０℃で２
日間反応させ、ＣＤ以外のデキストリンを可及的完全に
グルコースにまで加水分解し、糖液組成をグルコースと
ＣＤとした後、脱タンパク，脱イオン化後、ブロモベン
ゼン，テトラクロロエタンの複合体形成試薬を加え、１
晩低温撹拌によりαからγまでのＣＤを沈澱させた。

【００１０】濾過後、濾液を濃縮（濾過濃縮液）し、Ｏ
ＤＳシリカ（日本オルガノ製）を詰めたカラムに負荷
し、最初水で溶出した後、０から２０％のエタノール濃
度勾配溶出して水溶出画分とエタノール画分を得た。

【００１１】図１は、濾過濃縮液の液クロチャートを示
したものである。図から明らかなように、この段階では
グルコース（Ｇ1 ），マルトース（Ｇ2 ），α−、β
−、γ−ＣＤ（Ａ，Ｂ，Ｃ）が多量に含まれている。

【００１２】グルコアミラーゼ処理により生成した、グ
ルコースとマルトースを酵母を加えて処理すると、９０
％以上が除去され、ＣＤ成分の量比に全く変化はなかっ
た。

【００１３】これをＯＤＳシリカカラムに通すと、図２
のように、水溶出画分にはグルコース，マルトース，Ｅ
ピーク以上の各ピークが含まれエタノール画分にはＡか
らＥピークまでが含まれ、エタノール濃度の上昇にとも
なってＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｂの順に溶出された。また、Ｅ
ピークは水溶出画分とエタノール画分両方におのおの５
０％溶出された。

【００１４】このように、ＯＤＳカラムにより、Ａ（α
−ＣＤ），Ｂ（β−ＣＤ），Ｃ（γ−ＣＤ）は水で溶出
されず、δ−ＣＤ（Ｄピ−ク）以上の大環状ＣＤは、水
で溶出されるので、分離はきわめて簡単、明確であっ
た。

【００１５】得られた水溶出画分中のＥ，Ｆ，Ｇ，Ｈピ
ークを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用
い、カラム：メルク社製の分析用カラム、リクロスフェ
アＮＨ₂ 、５μm 、２連装、溶媒流量：0.９mL/min、カ
ラム温度：20℃で分取した。ＯＤＳカラム・エタノール
画分中のＤピークは、分取用カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ
Ｃ18（ＹＭＣ社製）により分取した。液クロの条件は溶
媒：３％エタノール、流速：３mL/min、カラム温度：４
０℃である。

【００１６】このようにして得られた各ピークはＨＰＬ
Ｃ的に単一であり、ペーパークロマトグラムでも単一ス
ポットを示し、大環状ＣＤの各成分は純化されたものと
思われた。

【００１７】各ピークのサンプルは、１％Ｗ／Ｗに調整
し、４００μL に市販結晶プルラナーゼ（株式会社林原
生化学研究所製）を０．８ＩＵ加えて、３０℃で２０時
間反応させた後、ＨＰＬＣにより生成糖を分析した。Ｈ
ＰＬＣ条件は溶媒：５５％アセトニトリル、カラム：メ
ルク社製の分析用カラム・リクロスフェアＮＨ₂ 、５μ
m 、流速：０．８mL/min、カラム温度：２０℃である。

【００１８】Ｅピーク画分をプルラナーゼと反応させた
ときのＨＰＬＣチャートでは、２０時間後にはＥピーク
と、新たに保持時間の長いＥ’のピークが現われた。
Ｅ’の保持時間は、本ＨＰＬＣ条件下で、マルトオリゴ
糖シリーズ標準品のマルトデカオース（Ｇ₁₀）と完全に
一致し、さらに、β−アミラーゼを作用させると、全て
マルトースに変換された。したがって、Ｅ’はＧ₁₀であ
り、Ｅはプルラナーゼで切断されない環状糖（ε−Ｃ
Ｄ）と、環内にα−１，６結合を１個もつ内分岐大環状
ＣＤ（ＩＢｒ−ε−ＣＤ）の混合物であることが明かに
された。

【００１９】ε−ＣＤの構造については、α−アミラー
ゼを作用させたとき、反応初期にＧ10が生成し、これが
β−アミラーゼにより全てマルトースに変換されること
からもα−１、４結合のみをもつ大環状ＣＤであること
は明確である。

【００２０】環内にα−１，６結合が２個以上ある大環
状内複分岐ＣＤは未だ発見されていないが、その存在も
予想できる。

【００２１】他のピーク画分についても同様に検討して
内分岐ＣＤの含有量を求めた結果、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄは内
分岐ＣＤを含まず、Ｅは１３．１４％、Ｇは３３．４２
％、Ｈは２７．２５％であった。

【００２２】Ｆピーク画分は、原料中の含有率が０．０
６％と少なく、さらにＨＰＬＣの保持時間が隣接するＥ
ピークとＧピークに近いため、高純度画分を得ることが
困難であったが、粗Ｆピーク画分を同様にプルラナーゼ
に作用させると、Ｇ₁₁に相当するＦ’が生成した。

【００２３】Ｅピーク，Ｆピーク，Ｇピーク，Ｈピーク
は各々ε−、ζ−、η−、θ−ＣＤであり、各々ＣＤは
ＩＢｒ−ε−、ζ−、η−、θ−ＣＤを含有しているこ
とを明らかにした。

【００２４】以上の結果から、環に大きな歪みがかかる
大環状ＣＤにα−１、６結合を持つ内分岐ＣＤが存在
し、環に歪みがかからないか、小さな歪みがかかるα〜
δ−ＣＤには内分岐ＣＤが存在しないことが判明した。

【００２５】

【実施例】次に、本発明を実施例により説明する。 実施例１ 市販のＣＤ粉飴デキシパールＫ−５０（塩水港精糖製）
４００ｇを原料とし、過剰の市販グルコアミラーゼ酵素
（生化学工業製）６０００ＩＵを加え、基質濃度３０
％、ｐＨ５．４，５０℃で２４時間反応させ、ＣＤ以外
のデキストリンを可及的完全にグルコースにまで加水分
解し、糖液組成をグルコースとＣＤとした後、さらにパ
ン酵母２０ｇを加え、３０℃で２４時間反応を続行し
て、内分岐大環状ＣＤと大環状ＣＤを１０％以上に含む
ＣＤ混合物を得た。

【００２６】脱タンパク，脱イオン化後、ブロモベンゼ
ン，テトラクロロエタンの複合体形成試薬を加え、１晩
低温撹拌によりαからγまでのＣＤを沈澱させ、濾過後
濾液を濃縮（濾過濃縮液）し、δ以上の大環状ＣＤを７
０％以上に含むＣＤ混合物を大環状ＣＤ標品Ｉとして得
た。

【００２７】実施例２ 実施例１で得た大環状ＣＤ製品をＯＤＳシリカ（日本オ
ルガノ製）を詰めたカラムに負荷し、水溶出部分を集め
て濃縮してδ以上の大環状ＣＤを９０％以上に含むＣＤ
混合物を、大環状ＣＤ標品IIとして得た。

【００２８】実施例３ 実施例２で得た大環状ＣＤ標品IIにプルラナーゼを作用
させてＧ₁₀〜Ｇ₁₃の直鎖糖と大環状ＣＤを含む標品を得
た。また、ＨＰＬＣで分離したε−、η−、θ−ＣＤ画
分にプルラナ−ゼを作用させてＧ₁₀＋ε−ＣＤ、Ｇ₁₂＋
η−ＣＤ、Ｇ₁₃＋θ−ＣＤの標品を得た。

【００２９】

【発明の効果】本発明の方法では、ＣＤ合成酵素により
生産されたＣＤ製品からグルコアミラーゼを用いること
により、内分岐大環状ＣＤを含むＣＤ混合物を製造する
ことができる。さらに、酵母を作用させることによりグ
ルコースとマルトースは資化されるので、α−，β−，
γ−ＣＤを含む大環状ＣＤ混合物が得られる。用途によ
ってはこの状態でも商品化できるが、大環状ＣＤ含有量
を高めた製品を生産するには、ＯＤＳカラムを用いる。
すなわち、水溶出によりε環以上のＣＤが得られるの
で、これを濃縮して製品化すればよい。この際、グルコ
ース，マルトースなどの直鎖糖も同時に溶出されるの
で、大環状ＣＤの含有率を高めるには、これらを酵母処
理などで予め除去しておくことが望ましい。

【００３０】大環状ＣＤの利用法としては、クロロフィ
ル，ステロイド，飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸，その他の
分子量の大きい疎水性物質の包接、普通環ＣＤでは包接
し難い不快臭の包接などがあり、さらに溶解性にも優れ
ているので、可溶化にも利用できる。その他、普通環Ｃ
Ｄ，分岐ＣＤと同様に、医薬，化粧品，化学工業等への
用途も考えられる。

【００３１】逆相カラムにより分離した大環状ＣＤ混合
物にプルラナーゼを作用させれば、Ｇ₁₀以上の直鎖糖と
大環状ＣＤにすることができる。また、大環状ＣＤと内
分岐大環状ＣＤの分離ができれば、各々を単品として利
用できるが、大環状ＣＤの単品は、内分岐ＣＤをプルラ
ナーゼとグルコアミラーゼの混合酵素系で処理した後、
カラムなどで分離すれば容易に得られる。

【００３２】Ｇ₁₀以上の直鎖糖はＨＰＬＣを用いても調
製が著しく困難であるが、ＩＢｒ−ε−、η−、θ−Ｃ
Ｄの分離は比較的容易である。したがって、Ｇ₁₀，
Ｇ₁₂，Ｇ₁₃などの調製に利用できる。さらに、内分岐Ｃ
Ｄを含まないε−、η−、θ−ＣＤにマルトースを過剰
に加え、ＣＤ合成酵素に作用させれば、そのcoupling作
用によりＧ₁₂〜Ｇ₁₅、Ｇ₂₂〜Ｇ₂₈などの、これまで単品
として得られていなかったメガロ糖の調製も可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、酵母処理前の大環状標品Ｉの糖組成を
示す液クロチャートである。 Ｇ₁ ：グルコース Ｇ₂ ：マルトース Ａ：α−ＣＤ Ｂ：β−ＣＤ Ｃ：γ−ＣＤ Ｄ：δ−ＣＤ Ｅ：ε−ＣＤ Ｆ：ζ−ＣＤ Ｇ：η−ＣＤ Ｈ：θ−ＣＤ Ｉ：ι−ＣＤ Ｊ：κ−ＣＤ ＨＰＬＣ条件は、カラム：リクロスフェアＮＨ₂ ５μm
、カラム温度：２０℃、溶出溶媒系：５５％アセトニ
トリル、流速：０．８mL/min

【図２】図２は、大環状標品IIの糖組成を示す液クロチ
ャートである。 Ａ：α−ＣＤ Ｂ：β−ＣＤ Ｃ：γ−ＣＤ Ｄ：δ−ＣＤ Ｅ：ε−ＣＤ Ｆ：ζ−ＣＤ Ｇ：η−ＣＤ Ｈ：θ−ＣＤ Ｉ：ι−ＣＤ Ｊ：κ−ＣＤ

【図３】図３は: 大環状標品ＩをＯＤＳカラムに負荷
し、水溶出後、２０％エタノールで溶出した部分を集め
て濃縮した糖液の糖組成を示した液クロチャートであ
る。 Ａ：α−ＣＤ Ｂ：β−ＣＤ Ｃ：γ−ＣＤ Ｄ：δ−ＣＤ Ｅ：ε−ＣＤ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 澱粉類にサイクロデキストリン合成酵素
   を作用させて得たサイクロデキストリン製品にグルコア
   ミラーゼを作用させることを特徴とする内分岐大環状サ
   イクロデキストリンを含むサイクロデキストリン混合物
   の製造方法。
2. 【請求項２】 サイクロデキストリン製品にグルコアミ
   ラーゼを作用させた後、逆相カラムにより内分岐大環状
   サイクロデキストリンを分離する請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 逆相カラムにより分離した大環状サイク
   ロデキストリン混合物にプルラナーゼを作用させ、直鎖
   糖を分離して大環状サイクロデキストリンを得る請求項
   ２に記載の方法。