JP2843048B2 - Novel recombinant lymphotoxin derivatives - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な組換リンホトキシン誘導体とその生産
に係る遺伝子組換技術並びに該誘導体を含有する医薬組
成物に関する。従って、本発明は医療用医薬品の分野に
おいて利用することができる。The present invention relates to a novel recombinant lymphotoxin derivative, a gene recombination technique relating to its production, and a pharmaceutical composition containing the derivative. Therefore, the present invention can be used in the field of prescription drugs.
生体中には生体防禦機構に係わる種々の液性因子が存
在しており、これらは主として白血球、リンパ球、マク
ロファージなどが刺激に反応して産生する微量生理活性
物質であって、例えばインターフェロン(IFN−α,
β,γ)、インターロイキン(IL1,2,3,4)、リンホト
キシン(LT)、癌壊死因子(TNF)、コロニー刺激因子
(G−,GM−CSF)を挙げることができる。これらのうち
リンホトキシン、TNFは新生細胞系統に対し直接的な抗
細胞活性を示すポリペプチドとして確認されており、リ
ンホトキシンはリンパ球から、またTNFはマクロファー
ジから、それぞれマイトージエンによる刺激により産生
される。There are various humoral factors involved in the body's defense mechanisms in living organisms, and these are trace bioactive substances mainly produced by leukocytes, lymphocytes, macrophages, etc. in response to stimuli, such as interferon (IFN). −α,
β, γ), interleukin (IL1,2,3,4), lymphotoxin (LT), cancer necrosis factor (TNF), and colony stimulating factor (G-, GM-CSF). Of these, lymphotoxin and TNF have been identified as polypeptides that exhibit direct anticellular activity against neoplastic cell lines. Lymphotoxin is produced from lymphocytes and TNF is produced from macrophages upon stimulation with mitogen.
さて、リンホトキシンおよびTNFの遺伝子をクローニ
ングし、該遺伝子を組込んだベクターにより形質転換さ
れた大腸菌を培養することによって、リンホトキシンお
よびTNFを生産することはすでに報告されている(ネイ
チャー,312,721−724,1984(Nature,312,721−724,198
4)。そして大腸菌で生産されたリンホトキシンおよびT
NFはin vivoの実験でも移植癌に対する壊死効果を有す
ることが証明されており、例えばマウスに移植したMeth
A Sarcomaによる癌はリンホトキシンあるいはTNFの静
脈内投与または局所投与により顕著に治癒されることが
認められている(J.Immunology,M.A.PALLADINO et al,1
38 4023(1987))。It has already been reported that lymphotoxin and TNF are produced by cloning the gene for lymphotoxin and TNF and culturing Escherichia coli transformed with a vector having the gene incorporated therein (Nature, 312 , 721-). 724,1984 (Nature, 312,721-724,198
Four). And lymphotoxin and T produced in E. coli
NF has also been shown to have a necrotic effect on transplanted cancer in in vivo experiments, such as Meth transplanted into mice.
A Sarcoma-induced cancer has been found to be significantly cured by intravenous or local administration of lymphotoxin or TNF (J. Immunology, MAPALLADINO et al, 1).
38 4023 (1987)).
しかしこれらリンホトキシンおよびTNFは全ての癌細
胞を特異的に傷害するわけではなく、まったく作用を受
けない癌細胞も多数存在することが明らかとなってきた
(Sugarman et al Science,230,943(1985),Watanabe
et al,J.Cancer Res.(Gann)76 1115(1985))。例え
ばヒト膀胱癌T−24,ヒト悪性黒色腫G−361,結腸腺癌L
S174−T,ヒト咽頭癌HEp2,ヒト線維内腫HT1080などはin
vitroでの実験では傷害作用を受けにくい。However, it has been revealed that these lymphotoxins and TNF do not specifically damage all cancer cells, and that many cancer cells have no effect at all (Sugarman et al Science, 230 , 943 (1985)). , Watanabe
et al, J. Cancer Res. (Gann) 76 1115 (1985)). For example, human bladder cancer T-24, human melanoma G-361, colon adenocarcinoma L
S174-T, human pharyngeal carcinoma HEp2, human fibroma HT1080, etc.
It is less susceptible to damaging effects in in vitro experiments.
ところでリンホトキシンおよびTNFは抗腫瘍作用以外
にも広範な作用を示すことが明らかとなり、リポプロテ
インリパーゼ阻害作用,ILI誘発作用、プロスタグランジ
ン誘導作用、血液凝固促進作用等がこれまでに報告され
ている。リンホトキシンあるいはTNFを臨床で使用する
場合、これらの作用が副作用として露見してくることが
予想され、事実TNFの臨床第一相試験では発熱、悪寒、
戦慄、血圧低下、GOT/GPT上昇、全身倦怠感、ALP上昇が
認められている(癌と化学療法,13,3491,1986)。By the way, it has been clarified that lymphotoxin and TNF show a wide range of actions other than antitumor action, and lipoprotein lipase inhibitory action, ILI inducing action, prostaglandin inducing action, blood coagulation promoting action, etc. have been reported so far. . When using lymphotoxin or TNF clinically, it is expected that these effects will be exposed as side effects.In fact, in a phase I clinical trial of TNF, fever, chills,
Horror, blood pressure lowering, GOT / GPT rise, general malaise, ALP increase has been observed (cancer and chemotherapy, 13, 3491,1986).
さて、リンホトキシンは分子量、荷電、耐熱性の違い
からα(分子量70000〜90000),β(分子量25000〜500
00),γ(分子量10000〜20000),コンプレックス(分
子量200000<)の4つのクラスに分けられており(ポー
ル エフ.トーレンス,バイオロジカル リスポンス
モディファイヤース 293,1985(Paul F.Torrence,Biolo
gical Response Modifiers,293,1985)、さらにα,β
クラスは電荷によってサブクラスに分類することができ
る。すなわち、リンホトキシンは種々のヘテロな物質の
総称として用いられている。By the way, lymphotoxin has α (molecular weight of 70,000 to 90,000) and β (molecular weight of 25,000 to 500)
00), γ (molecular weight 10,000-20,000), and complex (molecular weight 200,000 <) (Paul F. Torrance, Biological Response)
Modifiers 293,1985 (Paul F. Torrence, Biolo
gical Response Modifiers, 293, 1985), and α, β
Classes can be divided into subclasses by charge. That is, lymphotoxin is used as a general term for various heterogeneous substances.
Aggarwalらはリンホトキシンのアミノ酸構造を報告し
(ジェー.ビー.シー,260 2334(1985)(J.B.C.260,
2334(1985))、またGaryらによってリンホトキシン遺
伝子構造も報告されるとともに、リンホトキシンのヘテ
ロの原因の一部分は、同リンホトキシンのアミノ酸残基
数および会合形成の違いによって説明できると考えられ
ている。Aggarwal et al. Reported the amino acid structure of lymphotoxin (JBC, 260 2334 (1985) (JBC260,
2334 (1985)), and the gene structure of lymphotoxin is also reported by Gary et al., And it is thought that a part of the cause of the heterogeneity of lymphotoxin can be explained by differences in the number of amino acid residues and the association formation of the lymphotoxin.
他方、Grangerらはこのリンホトキシンと免疫交差を
示さないリンホトキシンが存在することを報告しており
(ジェー.インムュノロジー137,1878,1986(J.Immunol
ogy 137,1878,1986)、これはすでに構造解明されたリ
ンホトキシンとは抗細胞活性に関するスペクトラムが異
なるとしている。また、抗腫瘍細胞活性を有する因子と
して報告されているヒト腫瘍壊死因子(TNF)はアミノ
酸構造においてヒト リンホトキシンと28%の類似性を
示し、腫瘍細胞表面上のレセプターが共通であることが
報告されているにもかかわらず、抗腫瘍細胞活性スペク
トラムは多少異なると考えられている。On the other hand, Granger et al. Have reported that there is a lymphotoxin that does not show an immunological cross with this lymphotoxin (J. Immunol 137 , 1878, 1986 (J. Immunol).
ogy 137 , 1878, 1986), which allegedly has a different spectrum of anticellular activity from the previously elucidated lymphotoxin. In addition, human tumor necrosis factor (TNF), which has been reported as a factor having antitumor cell activity, shows 28% similarity in amino acid structure to human lymphotoxin, and is reported to have a common receptor on the tumor cell surface. Nevertheless, the spectrum of antitumor cell activity is believed to be somewhat different.
以上の知見を背景にして本発明者は当該リンホトキシ
ンより種々のポリペプチドを作り、抗腫瘍作用を示すre
gionのアミノ酸配列を見出すことおよび抗腫瘍作用の増
強を課題として検討した。Based on the above findings, the present inventor has made various polypeptides from the lymphotoxin to exhibit an antitumor effect.
The purpose of this study was to find the amino acid sequence of gion and to enhance its antitumor effect.
種々の検討の結果、137個のアミノ酸残基からなるア
ミノ酸配列に抗腫瘍作用があることを見出し、該配列の
NH2側に任意のアミノ酸配列を連続するか、または該配
列中の特定のアミノ酸を変換することによってさらに強
い抗腫瘍作用のある、あるいはリンホトキシン抵抗性癌
細胞に対しても傷害作用のある新規ポリペプチドが得ら
れることを知り、本発明を完成するに至った。As a result of various studies, it was found that the amino acid sequence consisting of 137 amino acid residues has an antitumor effect,
Either continuous any amino acid sequence NH 2 side, or a stronger anti-tumor effect by converting the specific amino acid in the sequence, or a new poly with cytotoxic action against lymphotoxin resistant cancer cells Knowing that a peptide could be obtained, the present invention was completed.
すなわち、本発明は抗腫瘍作用の増強および抗腫瘍作
用スペクトラムの拡大を目的として、137個のアミノ酸
残基から構成されるアミノ酸配列であって、該配列中の
特定のアミノ酸に数種のバリエーションがあるものを含
有する新規なリンホトキシン誘導体を開示している。し
かるに該誘導体は遺伝子組換技術の利用によって効果的
に達成されるので、本発明は上記アミノ酸配列を含有す
る組換リンホトキシン誘導体の提供を要旨とするもので
ある。That is, the present invention is an amino acid sequence composed of 137 amino acid residues for the purpose of enhancing the antitumor effect and expanding the spectrum of the antitumor effect, and a specific amino acid in the sequence has several kinds of variations. Novel lymphotoxin derivatives containing certain are disclosed. However, since the derivative can be effectively achieved by using a gene recombination technique, the gist of the present invention is to provide a recombinant lymphotoxin derivative containing the above amino acid sequence.
以下に本発明を構成および方法の項に分けて詳細に説
明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail by dividing into sections of configuration and method.
構成 本発明組換リンホトキシン誘導体はその分子中に下記
一次構造式で示されるアミノ酸配列(以下本発明に係る
アミノ酸配列と呼ぶ)を含有し、これらは優れた抗腫瘍
作用が示される。Structure The recombinant lymphotoxin derivative of the present invention contains, in its molecule, an amino acid sequence represented by the following primary structural formula (hereinafter referred to as the amino acid sequence according to the present invention), which exhibits excellent antitumor activity.
(式中、A1はPro又はValを表す) 上記本発明に係るアミノ酸配列のNH2側およびCOOH側
に連結する他のアミノ酸配列の選択は自由であり、特に
制限はない。NH2側に連結するアミノ酸として、例えば
次の〜を挙げることができる。 (In the formula, A 1 represents Pro or Val) Other amino acid sequences linked to the NH 2 side and the COOH side of the amino acid sequence according to the present invention can be freely selected and are not particularly limited. Examples of amino acids linked to the NH 2 side include the following (1) to (3).
本発明の最終目的物質は遺伝子組換技術によって生産
することができる。従って本発明組換リンホトキシン誘
導体をコードするcDNA、該cDNAを外来遺伝子として含
み、かつ選択した宿主内で制禦および発現が可能となる
ように連続して得られた発現プラスミドはいずれも本発
明の最終目的物質の生産のために必要な中間物質であ
り、同一の課題を解決する意味において発明としては共
に一体となることができる。発現プラスミドの具体例と
して、pEH6084,pEH7084,pEH8084,pBRD8050,pEH5050によ
って識別表示されるプラスミドを挙げることができ、こ
れらはいずれも後記実施例において示される。また発現
プラスミドによって形質転換された宿主もcDNAおよび発
現プラスミドと同様に発明としては共に一体となること
ができ、宿主としては大腸菌や動物細胞、とりわけBHK
細胞が使用される。形質転換した大腸菌の例として、JM
83−pEH6084,JM83−pEH7084,JM83−pEH8084,RR1−pBRD8
050によって識別表示される大腸菌を挙げることがで
き、これらはいずれもそれぞれ後記実施例において示さ
れ、かつそれぞれの表示をもって微工研に寄託されてい
る。各受託番号は上記順序に対応してFERM P−10041,同
P−10040,同P−10042,同P−10253である。 The final target substance of the present invention can be produced by gene recombination technology. Accordingly, the cDNA encoding the recombinant lymphotoxin derivative of the present invention, and the expression plasmid containing the cDNA as a foreign gene and continuously obtained so as to be capable of regulation and expression in a selected host are all of the present invention. It is an intermediate substance necessary for the production of the final target substance, and can be integrated as an invention in the sense of solving the same problem. Specific examples of expression plasmids include plasmids identified by pEH6084, pEH7084, pEH8084, pBRD8050, and pEH5050, all of which are shown in the Examples below. Also, the host transformed with the expression plasmid can be integrated as the invention like the cDNA and the expression plasmid, and the host may be Escherichia coli or animal cells, especially BHK.
Cells are used. As an example of transformed E. coli, JM
83-pEH6084, JM83-pEH7084, JM83-pEH8084, RR1-pBRD8
Escherichia coli identified by 050 can be mentioned, all of which are shown in the Examples below and deposited with the respective companies with the respective designations. The accession numbers are FERM P-10041, P-10040, P-10042, and P-10253 corresponding to the above order.
最終目的物質である本発明組換リンホトキシン誘導体
は天然リンホトキシンが変異したものであるにもかかわ
らず、後記実験例によって示されるごとく天然リンホト
キシンの活性、すなわち抗腫瘍活性を天然リンホトキシ
ンと同程度およびそれ以上に有している。従って天然リ
ンホトキシンが医薬組成物の必須の有効成分となって、
その活性を利用する医療目的に提供されるのと同様に、
本発明組換リンホトキシン誘導体もその活性を利用する
治療目的のための医薬組成物の必須の有効成分となるこ
とができる。後記実験例によって示されるごとく、本発
明組換リンホトキシン誘導体の例えばヒト肺癌由来細胞
(PC−10)に対する活性は天然リンホトキシンのそれに
比べて50〜80倍大きい。Despite the fact that the recombinant lymphotoxin derivative of the present invention, which is the final target substance, is a mutant of natural lymphotoxin, the activity of natural lymphotoxin, that is, the antitumor activity, that is, the antitumor activity is comparable to or higher than that of natural lymphotoxin as shown in the experimental examples described below Have. Therefore, natural lymphotoxin is an essential active ingredient of the pharmaceutical composition,
Just as provided for medical purposes that take advantage of its activity,
The recombinant lymphotoxin derivative of the present invention can also be an essential active ingredient of a pharmaceutical composition for therapeutic purposes utilizing its activity. As shown by the experimental examples described later, the activity of the recombinant lymphotoxin derivative of the present invention on, for example, cells derived from human lung cancer (PC-10) is 50 to 80 times greater than that of the natural lymphotoxin.
この場合に該医薬組成物は主として注射剤であり、静
脈内投与される。注射剤として製造されるためには、微
量生理活性物質を注射剤とするときの常法に従っておこ
なえばよい。従って例えば本発明組換リンホトキシン誘
導体を単独あるいは適当な賦形剤、溶解剤と共に水溶液
とし、無菌濾過して充填し、凍結乾燥し、他方溶解用水
溶液を添付して用時溶解型注射剤とすればよい。In this case, the pharmaceutical composition is mainly an injection and is administered intravenously. In order to produce it as an injection, it may be carried out according to a conventional method when a trace amount of a physiologically active substance is used as an injection. Therefore, for example, the recombinant lymphotoxin derivative of the present invention may be used alone or in an aqueous solution together with a suitable excipient and dissolving agent, aseptically filtered and filled, lyophilized, and attached with an aqueous solution for dissolution to prepare a ready-to-use injection. I just need.
方法 本発明物質の製造方法および測定方法について説明す
る。Method The production method and the measurement method of the substance of the present invention will be described.
まず、本発明物質を製造するために必要なリンホカイ
ンのcDNAライブラリーは適当な細胞からmRNAを取り出
し、発現系においてリンホトキシン活性を示すものをス
クリーニング、逆転写し、適当なプラスミドとして大腸
菌を形質転換して得られる(ネイチャー,312,721−72
4,1984(Nature,312,721−724,1984))。例えば後記実
施例に示されるごとくDaudi細胞からmRNAを分画し、ア
フリカツメガエルの卵母細胞に注入し、その培養上清に
ついてリンホトキシン活性を測定して、目的のmRNAをス
クリーニングし、得られたmRNAを常法により逆転写し、
得られたDNAから常法によりプラスミドを調製し、大腸
菌X1776株を形質転換すればよい。First, a lymphokine cDNA library required for producing the substance of the present invention is obtained by extracting mRNA from a suitable cell, screening for a substance showing lymphotoxin activity in an expression system, performing reverse transcription, and transforming E. coli as a suitable plasmid. (Nature, 312 , 721-72
4,1984 (Nature, 312,721-724,1984)). For example, as shown in Examples below, mRNA is fractionated from Daudi cells, injected into Xenopus oocytes, lymphotoxin activity is measured on the culture supernatant, and the target mRNA is screened, and the obtained mRNA is obtained. Is reverse-transcribed by a standard method,
A plasmid may be prepared from the obtained DNA by a conventional method and transformed into Escherichia coli X1776.
なお、Daudi細胞は人のBurkitt lymphomaであり、ATC
C CCL 213として一般に入手することができる(キャ
ンサー リサ.28,1300−1310,1968(Cance Res.28,130
0−1310,1968))。In addition, Daudi cells are human Burkitt lymphoma, ATC
It is generally available as C CCL 213 (Cancer Lisa. 28 , 1300-1310, 1968 (Cance Res. 28 , 130).
0-1310, 1968)).
次にcDNAライブラリーからリンホトキシンをコードす
るcDNAを含むプラスミドをコロニーハイブリダイゼーシ
ョンによって選別する。コロニーハイブリダイゼーショ
ンはWallaceの方法(Nucleic Acids Res.,9,879,198
1)に準じて行い、プローブとしてリンホトキシンのC
端の8個のアミノ酸配列に対応する下記DNAを合成し、
精製して使用する。Next, a plasmid containing a cDNA encoding lymphotoxin is selected from the cDNA library by colony hybridization. Colony hybridization was performed by the method of Wallace (Nucleic Acids Res., 9 , 879, 198).
Performed according to 1), and probed C
The following DNA corresponding to the eight amino acid sequences at the ends is synthesized,
Purify and use.
陽性コロニーについてプラスミドを調製し、塩基配列
を決定し、リンホトキシンのcDNAを含むプラスミドを選
別すればよい。 A plasmid may be prepared for a positive colony, the nucleotide sequence may be determined, and a plasmid containing a lymphotoxin cDNA may be selected.
次にリンホトキシンのcDNAを含むプラスミドから本発
明組換リンホトキシン誘導体をコードするDNAを得るに
は公知の遺伝子組換操作を適宜組み合わせて行えばよ
い。本発明ではもっぱら特定位置のアミノ酸配列を除去
および特定位置のアミノ酸の置換が行われる関係で特に
Zoller and Smithの部位特異的変異誘発(site−di−re
cted mutagenesis)を利用することができる。すなわ
ち、リンホトキシンのcDNAをM13の如きファージベクタ
ーに組み込み、その結果得られる二本鎖M13 DNAで形質
転換した大腸菌の培養液から一本鎖DNAを用意し、これ
に所定の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてア
ニーニングし、変異を誘発すればよい。部位特異的変異
誘発を行った後は、得られた反応液で大腸菌を形質転換
し、これを培養して得られるプラークについて放射標識
した合成オリゴヌクレオチドをハイブリッドしてスクリ
ーニングすれば、目的物質をコードする所定のcDNAを外
来遺伝子として含む二本鎖M13 ファージDNAを得ること
ができる。必要により該ファージDNAから所定のcDNAを
切り出し、これを宿主に応じて使用される適当な発現ベ
クターに連結することは常法に従って適宜行えばよい。Next, in order to obtain DNA encoding the recombinant lymphotoxin derivative of the present invention from a plasmid containing the cDNA of lymphotoxin, known gene recombination operations may be appropriately combined. In the present invention, the amino acid sequence at a specific position is exclusively removed and the amino acid at a specific position is substituted,
Zoller and Smith site-directed mutagenesis (site-di-re
cted mutagenesis) can be used. That is, the lymphotoxin cDNA was incorporated into a phage vector such as M13, and a single-stranded DNA was prepared from a culture solution of E. coli transformed with the resulting double-stranded M13 DNA, and a predetermined synthetic oligonucleotide was used as a primer thereto. Anneal and induce mutation. After performing site-directed mutagenesis, Escherichia coli is transformed with the obtained reaction solution, and plaques obtained by culturing the resultant are hybridized with radiolabeled synthetic oligonucleotides and screened to encode the target substance. A double-stranded M13 phage DNA containing the desired cDNA as a foreign gene can be obtained. If necessary, a predetermined cDNA may be cut out from the phage DNA and ligated to an appropriate expression vector used depending on the host, according to a conventional method.
なお、発現ベクターとしては市販の発現ベクター、例
えばpKK 233−2,pUC 12,pUC 18(ファルマシア),PUG 1
30,PUG 131,(M13tg130,131のポリリンカー部位をpUC 1
2,13に置き換えたプラスミド)を使用すればよいが、以
下に示すように所要のプロモーターおよびターミネータ
ーを選定して連結し、特別の発現ベクターを用意して、
これを使用してもよい。すなわち、一般に哺乳動物由来
の遺伝子を大腸菌、酵母、動物細胞の中で発現させるた
めには蛋白合成開始シグナルであるATG(Met)の上流に
プロモーターを配し、蛋白合成終止コドン(TAA,TGA,TA
G)の下流にターミネーターを連結させなければならな
い。プロモーターとしては大腸菌ではlac,trp,tac,trc,
sac,PL等が、酵母ではα−factor,TPI,suc,GAL,PGI等
が、そして動物細胞ではメタロチオネイン、SV 40 earl
y、LTR等が通常使用される。特に大腸菌で効率よく遺伝
子を発現させるためにはプロモーター、シャインダルガ
ーノ配列(SD配列)およびATGを正確に連結し、しかもS
D配列からATGに至るまでの塩基数を至適に選定する必要
がある。こうした点を配慮して、後記実施例では大腸菌
発現ベクターとしてtrcプロモーター、SD配列およびATG
をこの順序に連結し、しかもSD配列から塩基数で11個だ
け下流にATGが来るように調整し、さらにATGの直前にBg
l II siteが挿入されるように構築したものを用意し、
これを使用している。As the expression vector, a commercially available expression vector, for example, pKK233-2, pUC12, pUC18 (Pharmacia), PUG1
30, PUG 131, (M13tg130,131
Plasmids replaced with 2,13) may be used, but the necessary promoter and terminator are selected and ligated as shown below, and a special expression vector is prepared.
This may be used. That is, generally, in order to express a gene derived from a mammal in Escherichia coli, yeast, or animal cells, a promoter is arranged upstream of ATG (Met) which is a protein synthesis initiation signal, and a protein synthesis stop codon (TAA, TGA, TA
A terminator must be connected downstream of G). As a promoter, lac, trp, tac, trc,
sac, PL, etc., α-factor, TPI, suc, GAL, PGI, etc. in yeast, and metallothionein, SV 40 earl in animal cells.
y, LTR, etc. are usually used. In particular, in order to express a gene efficiently in E. coli, the promoter, Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) and ATG must be accurately ligated.
It is necessary to optimally select the number of bases from the D sequence to ATG. In consideration of these points, in Examples described later, trc promoter, SD sequence and ATG were used as E. coli expression vectors.
In this order, and adjust so that ATG is located 11 bases downstream from the SD sequence.
l Prepare the one constructed to insert the II site,
I'm using this.
以上の製造プロセスの中間段階で利用される個々の遺
伝子組換操作はほとんど公知であるので、文献あるいは
簡単な記述によって以下に説明する。Since the individual recombination operations used in the intermediate stages of the above-mentioned production process are almost known, they will be described below in the literature or a brief description.
制限酵素によるプラスミドの切断および切断して得ら
れるDNA断片のアガロースゲル電気泳動またはポリアク
リルアミドゲル電気泳動による分離と回収と結合につい
ては、マニアティス,ティー,エタール,モレキュラー
クローニング,ア ラボラトリー マニュアル,コール
ド スプリング ハーバーラボラトリー1982(Maniati
s,T,et al,.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory 1982)の記述が参照さ
れる。Cleavage of plasmid with restriction enzymes and separation, recovery and binding of DNA fragments obtained by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis are described in Maniatis, Tee, Etal, Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982 (Maniati
s, T, et al, .Molecular Cloning, A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Laboratory 1982).
例えば天然リンホカインをコードするcDNAを含むプラ
スミドおよびM13ファージベクターを各々切断し、断片
を結合してcDNAの組込まれた二本鎖M13 DNAを得る場合
に応用される。For example, the present invention is applied to the case where a plasmid containing a cDNA encoding a natural lymphokine and an M13 phage vector are each cut, and fragments are ligated to obtain a double-stranded M13 DNA into which the cDNA is integrated.
プラスミドの大腸菌への形質転換は、DNAクローニン
グ第1巻第6章ディー.エム.クロバー編,アイアール
エル プレス1985(DNA cloning Vol.1,Chap.6,ed.D.M.
Glover IRL press 1985)に従えばよい。Transformation of the plasmid into Escherichia coli is described in DNA Cloning Volume 1, Chapter 6, De. M. Clover, IR L Press 1985 (DNA cloning Vol.1, Chap.6, ed.DM
Glover IRL press 1985).
例えば天然リンホカインをコードするcDNAの組込まれ
た二本鎖M13 DNAあるいは変異リンホカインをコードす
るcDNAの組込まれた発現プラスミドを大腸菌への形質転
換に供するときに応用される。For example, it is applied when transforming Escherichia coli with a double-stranded M13 DNA containing a cDNA encoding a natural lymphokine or an expression plasmid containing a cDNA encoding a mutant lymphokine.
変異誘発用およびスクリーニング用のオリゴヌクレオ
チドのphosphoamidite法による合成および5′末端の標
識はそれぞれ、エス.エル.ビューケージ,エタノー
ル.,:テトラヘドロンレット.,22 1859,(1981)(S.L.B
eaucage,etal.,Tetrahedron Lett.,22 1859(1981))
およびエー.マキサム アンド ダブリュ.ギルバー
ド,メソッズ イン エンチモロジー,65巻499−560頁
アカデミックプレス1980(A.Maxam and W.Gilbert,Me
thods in Enzymology,Vol.65 p499−560 Academic Pres
s 1980)によればよい。Synthesis of oligonucleotides for mutagenesis and screening by the phosphoamidite method and labeling at the 5 'end are described in S.D. El. View cage, ethanol.,: Tetrahedron let., 22 1859, (1981) (SLB
eaucage, etal., Tetrahedron Lett., 22 1859 (1981))
And A. Maxam and W. Gilbird, Methods in Enchimology, Vol. 65, pp. 499-560, Academic Press 1980 (A. Maxam and W. Gilbert, Me.
thods in Enzymology, Vol. 65 p499−560 Academic Pres
s 1980).
DNA塩基配列の決定は、エフ.サンガー エタール.,
ピー.エヌ.エー,エス.74 5463,1977(F.Sanger et
al.,P.N.A.S 74 5463,1977)に従いdideoxy法により行
えばよい。The determination of the DNA base sequence is performed by F.S. Sanger Ethal.,
P. N. A, S. 74 5463, 1977 (F. Sanger et
al., PNAS 74 5463, 1977).
例えば変異誘発し、スクリーニングした一本鎖M13 DN
Aについて塩基配列を決定し、目的とする変異が誘発さ
れているか否かを確認する場合に応用される。For example, mutagenized and screened single-stranded M13 DN
It is applied when determining the nucleotide sequence of A and confirming whether or not the desired mutation has been induced.
二本鎖および一本鎖のM13 ファージDNAは以下のよう
に調製される。Double-stranded and single-stranded M13 phage DNA are prepared as follows.
すなわち、形質転換した大腸菌を、ジェー.メッシン
グ,メソッズ イン エンチモロジー101,20−78 1983
(J.Messing,Method in Enzymology 101,20−78 1983)
に記載の方法により培養し、さらに振盪培養し、遠心分
離する。沈澱部の大腸菌からは、マニアティス,ティ
ー,エタール.,モレキュラークローニング,ア ラボラ
トリーマニュアル.コールドスプリング ハーバーラボ
ラトリー1982(Maniatis.T,et al.,Molecular Cloning,
A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory
1982)に記載の方法により二本鎖M13 DNAを得る。また
上澄液からは、その1.3mlに260μの2.5M NaCl−20%P
EG 6000混合溶液を加え、混合物をエッペンドルフミク
ロチューブで遠心分離し、得られるペレットを120μ
の10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.9,0.1mM EDTA)に懸濁
し、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、70%エ
タノールで洗浄し、乾燥後30μの10mMトリス塩酸緩衝
液(pH7.9,0.1mA EDTA)に再び懸濁して一本鎖M13 DNA
を得る。That is, the transformed E. coli was transformed into Meshing, Methods in Enchimology 101 , 20-78 1983
(J. Messing, Method in Enzymology 101, 20-78 1983)
And culturing with shaking, followed by centrifugation. From the Escherichia coli in the precipitate, Maniatis, Tea, Etal., Molecular Cloning, Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory 1982 (Maniatis. T, et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
1982) to obtain double-stranded M13 DNA. Also, from the supernatant, 1.3 μl of 260 μM of 2.5 M NaCl-20% P
Add the EG 6000 mixed solution, centrifuge the mixture in an Eppendorf microtube, and pellet the resulting
Was suspended in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 mM EDTA), extracted with phenol, precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol, dried, and dried, and 30 μl of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9, 0.1 resuspend in single-stranded M13 DNA
Get.
部位特異的変異誘発反応は、ゾラー アンド スミ
ス,メソッズ インエンチモロジー 100 468−500,19
83(Zoller and Smith,Methods in Enzymology,100 468
−500,1983)に従って行われる。Site-directed mutagenesis reactions are described in Zoller and Smith, Methods In Entology 100 468-500,19.
83 (Zoller and Smith, Methods in Enzymology, 100 468
-500, 1983).
すなわち非放射性リン酸で末端標識した変異誘発用合
成オリゴヌクレオチド(プライマー)20p molに一本鎖M
13 DNA 1μg、アニーリング用緩衝液(50mMトリス塩
酸,pH8.0,0.25mM MgCl2)2μ、B緩衝液(0.2Mトリ
ス塩酸、pH7.5,0.1M MgCl2,0.1M ジチオスレイトー
ル)8μ,dATP,dGTP,dCTP,dTTP各2.5mMずつの混合物
4μ,5mM rATP 2μ、蒸溜水1μ,T4DNA リガー
ゼ5単位、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメント5単
位を加え、最終全液量を20μとして14℃3時間反応さ
せる。That is, a single-stranded M was added to 20 pmol of a synthetic oligonucleotide (primer) for mutagenesis end-labeled with non-radioactive phosphate.
13 μg of DNA, 2 μm of annealing buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.25 mM MgCl 2 ), 8 μm of B buffer (0.2 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M MgCl 2 , 0.1 M dithiothreitol) A mixture of 2.5 μm each of dATP, dGTP, dCTP and dTTP was added at 4 μm, 2 μm of 5 mM rATP, 1 μm of distilled water, 5 units of T 4 DNA ligase, and 5 units of DNA polymerase I Klenow fragment. Let react for hours.
次に反応混合液を用いて変異誘発を受けたDNAで大腸
菌を形質転換するためには、クレーマー エタール.,セ
ル38 879−887,1984(Kramer et al.,Cell 38 879−88
7,1984)に従って行い、さらにグルンスタイン アンド
ホグネス,ピー.エヌ.エー.エス.ユーエスエー 72
3961,1975(Grunstein and Hogness,P.N.A.S.USA 72 3
961,1975)に従って形質転換した大腸菌を大腸菌JM 103
とまぜて寒天培地上に拡げ、37℃で一夜培養し、形成す
るプラークをニトロセルロースフィルター上に写しと
る。E. coli in then the reaction mixture was subjected to mutagenesis using the DNA to be transformed, Kramer Ettal., Cell <br/> Le 38 879-887,1984 (Kramer et al., Cell 38 879- 88
7, 1984), followed by Grunstein and Hogness, P. N. A. S. US 72
3961, 1975 (Grunstein and Hogness, PNASUSA 72 3
961, 1975) and E. coli JM103.
Mix, spread on an agar medium, incubate overnight at 37 ° C, and transfer the formed plaque onto a nitrocellulose filter.
ニトロセルロースフィルター上に写しとったプラーク
についてのスクリーニングは以下のように行う。Screening for plaques transferred on nitrocellulose filters is performed as follows.
ニトロセルロースフィルターを6倍のSSC(1倍のSSC
は150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム),10倍のDenhar
d's(1倍のDenhardt'sは0.02%ポリビニルピロリドン,
0.02%フィコール,0.02%ウシ血清アルブミン),50μg
超音波処理サケ***DNAの中に加えて65℃3時間処理
し、予備ハイブリッドを形成させる。次いでフィルター
を放射標識した変異誘発用合成オリゴヌクレオチドと同
一緩衝液条件下で混合し65℃で一夜放置してハイブリッ
ドを形成させる。フィルターを6倍のSSCで洗浄し、水
分をきった後、増感スクリーンを重ね、X線フィルムに
露出して目的のプラークを選出する。Filter nitrocellulose filter 6 times SSC (1 times SSC
Is 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 10 times Denhar
d's (1x Denhardt's is 0.02% polyvinylpyrrolidone,
0.02% ficoll, 0.02% bovine serum albumin), 50μg
The sonicated salmon sperm DNA is added and treated at 65 ° C. for 3 hours to form a preliminary hybrid. The filter is then mixed with the radiolabeled synthetic oligonucleotide for mutagenesis under the same buffer conditions and left at 65 ° C. overnight to form a hybrid. After the filter is washed with 6 times SSC to remove moisture, an intensifying screen is overlaid and exposed to an X-ray film to select a target plaque.
変異リンホカインをコードするcDNAを二本鎖M13 DNA
から切り出し、これを発現ベクターに連結して得られる
発現プラスミドは宿主に応じてそれぞれ形質転換に使用
すればよいが、例えばBHK細胞の形質転換のためには、
ロイター エタール.,ピー.エヌ.エー.エス.ユーエ
スエー,79 422,1982(Loyter et al.,P.N.A.S.USA,79
422,1982)に従ってLoyterらの方法により行えばよい。
すなわち、得られた発現プラスミドを例えばpSV2−dhfr
と供にBHK570細胞株(ts,tk-)に形質転換する。なおpS
V2−dhfrについては、サブラマニ,エタール:モル.セ
ル.バイオロ.1 854−864,(1981)(Sabramani,et
al:Mol.Cell.Biol.1 854−864,(1981))が参照され
る。CDNA encoding mutant lymphokine is converted to double-stranded M13 DNA
The expression plasmid obtained by ligating this to an expression vector may be used for transformation depending on the host.For example, for transformation of BHK cells,
Reuters Ethal. N. A. S. USA, 79 422, 1982 (Loyter et al., PNASUSA, 79
422, 1982) according to the method of Loyter et al.
That is, the obtained expression plasmid is, for example, pSV2-dhfr
At the same time, transform into a BHK 570 cell line (ts, tk − ). Note that pS
For V2-dhfr, see Sabramani, etal: mol. cell. Violo. 1 854-864, (1981) (Sabramani, et.
al: Mol. Cell. Biol. 1 854-864, (1981)).
クローニングは限界希釈法(limiting dilution法)
を利用して以下のごとく行うことができる。Cloning is the limiting dilution method
Can be performed as follows using
形質転換の数日後より200nM Amethopterin含有ダルベ
コ変法イーグル培地(ダルベコ変法イーグル培地,ブド
ウ糖3.5%,炭酸水素ナトリウム7.5%,牛胎児血清(FC
S)5%,トラネキサム酸3mM,グルタミン2mM,(+)−A
methopterin 200nM)で2〜3日毎に1〜2週培地交換
しながら限界希釈して産生株を得る。次に産生株をロー
ラーボルトに用意した200nM Amethopterin含有ダブルベ
コ変法イーグル培地300mlに接種し、37℃で培養し、培
養開始より3〜4日後より毎日3〜4週間同量の培地で
培地交換し、培養上清を集めればよい。Several days after the transformation, modified Dulbecco's Eagle's medium containing 200 nM Amethopterin (Dulbeco's modified Eagle's medium, glucose 3.5%, sodium bicarbonate 7.5%, fetal calf serum (FC
S) 5%, tranexamic acid 3 mM, glutamine 2 mM, (+)-A
(methopterin 200 nM) and perform limiting dilution with medium exchange every 2-3 days for 1-2 weeks to obtain a production strain. Next, the produced strain was inoculated into 300 ml of a double becco modified Eagle medium containing 200 nM Amethopterin prepared in a roller bolt, cultured at 37 ° C., and 3 to 4 days after the start of the culture, the medium was replaced with the same amount of medium every day for 3 to 4 weeks. The culture supernatant may be collected.
後記実施例では大腸菌JW83を使用し、振盪培養した後
に菌体を破砕し、上清画文を集めた。In Examples described later, Escherichia coli JW83 was used, and the cells were disrupted after shaking culture, and the supernatant was collected.
精製はゲル濾過、色素吸着クロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、分画しリ
ンホトキシン活性によって所要の画分を得ればよい。Purification may be carried out by appropriately combining gel filtration, dye adsorption chromatography, high performance liquid chromatography and the like, fractionating and obtaining a required fraction by lymphotoxin activity.
リンホトキシン活性、すなわちリンホトキシンの抗腫
瘍作用活性は次の如く行う。The lymphotoxin activity, that is, the antitumor activity of lymphotoxin is performed as follows.
インジケーター細胞として例えばマウス線維芽細胞株
L Cellの亜株であってリンホトキシンに対する感受性の
高いLP3細胞を使用し、これに試料および最終濃度1μg
/mlのアクチノマイシンDを加え、CO2気流下で37℃12−
18時間培養する。ここで培地は10%非働化中胎児血清を
含むRPMI 1640を使用する。培養終了後死細胞を洗浄除
去し、付着残存している生細胞を0.5%クリスタルバイ
オレット(メタノール:水=1:4)液で固定染色してい
る。染色された細胞より色素を抽出し、その吸光値を測
定して生細胞の数を判定する。タイターはLP3細胞の50
%lysisを与えるときの試料希釈度によって表示する。
なお、この値は試料を加えたときのLP3細胞の増殖相に
よって変化するので、常にリンホトキシン標準力価試料
を対照に用いて、補正をする必要がある。Indicator cells such as mouse fibroblast cell lines
LP3 cells, which are a sub-strain of L Cell and are sensitive to lymphotoxin, were used, containing the sample and a final concentration of 1 μg.
/ ml of actinomycin D at 37 ° C under a CO 2 stream.
Incubate for 18 hours. The medium used here is RPMI 1640 containing 10% inactivated fetal serum. After completion of the culture, the dead cells are washed away, and the remaining living cells are fixed and stained with a 0.5% crystal violet (methanol: water = 1: 4) solution. A dye is extracted from the stained cells, and the absorbance is measured to determine the number of living cells. Titer is 50 of LP3 cells
It is indicated by the sample dilution when giving% lysis.
Since this value changes depending on the growth phase of LP3 cells when a sample is added, it is necessary to always correct using a lymphotoxin standard titer sample as a control.
無血清培地(DM−153培地)で継代している対数増殖
期のLP3細胞を用いて上記のアッセイを行うとき24時間
後に50% lysisを起こすLTの活性濃度を1U/mlと定義す
る。When the above assay is performed using logarithmic growth phase LP3 cells passaged in a serum-free medium (DM-153 medium), the active concentration of LT that causes 50% lysis after 24 hours is defined as 1 U / ml.
ヒト悪性腫瘍細胞株に対するLTの細胞傷害、増殖抑制
試験は以下の如く行う。The cytotoxicity and growth inhibition test of LT against human malignant tumor cell lines is performed as follows.
各種ヒト癌細胞株を0.5〜1×103wellの密度で90well
ミクロタイタープレートに添加し、1晩培養後、LT試料
を含む培地を添加する。その後約一週間湿潤,CO2存在下
で培養する。生存細胞は前記の方法と同様Crystal vio
letの抽出により判定する。90 wells of various human cancer cell lines at a density of 0.5-1 × 10 3 wells
After adding to a microtiter plate and culturing overnight, a medium containing the LT sample is added. Thereafter, the cells are cultured for about one week in the presence of CO 2 in a humid environment. The surviving cells were treated with Crystal vio as described above.
Judge by extracting let.
別法として、0.1μg/mlのアクチノマイシンDを共存
させてAssayすることも可能である。その場合、細胞株
を2〜5×104/wellの密度で添加し、LT試料およびアク
チノマイシンDを添加し、12〜15時間で生細胞数を判定
する。Alternatively, Assay can be performed in the presence of actinomycin D at 0.1 μg / ml. In that case, the cell line is added at a density of 2-5 × 10 4 / well, the LT sample and actinomycin D are added, and the number of viable cells is determined in 12 to 15 hours.
エンザイム イムノアッセイ(EIA)による比活性の
推定は以下のように行う。LTを免疫して得られたウサギ
抗ヒトLT抗体、もしくは免疫マウスの脾細胞より細胞融
合法により得られたハイブリドーマの産生するモノクロ
ーナル、抗ヒトLT抗体を用い、サンドイッチ法により試
料中のLTの量を推定する。すなわち、プラスチック製We
llに抗ヒトLT抗体(モノクローナルあるいはポリクロー
ナル)を吸着させた後、LTを添加し結合させる。更に一
次抗体とは確認部位の異なるモノクローナル抗体もしく
はポリクローナル抗体を添加する。この二次抗体は予め
ビチオンを結合させておいたものを用いる。これによ
り、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したア
ジピンを添加すればアジピンと二次抗体のビチオンの特
異的反応により、LTと結合した二次抗体の量に比例して
ペルオキシダーゼがwellに固定される。ここに、例えば
オルトフェニレンジアミン及び過酸化水素の如き、基質
を添加すれば、ペルオキシダーゼにより定量的に発色が
みられ、その吸光度より試料中のLT濃度を推定できる。
すなわち、未知量のLTを含む試料と、予め精製しアミノ
酸分析により決定した含有濃度既知のLTのEIA値を比較
すればよい。また、前者の抗腫瘍活性をL−P3細胞をイ
ンジケーターとして前記の如く調べれば、その比活性が
求まる。Estimation of specific activity by enzyme immunoassay (EIA) is performed as follows. Using a rabbit anti-human LT antibody obtained by immunization with LT, or a monoclonal or anti-human LT antibody produced by a hybridoma obtained by cell fusion from spleen cells of an immunized mouse, the amount of LT in a sample by a sandwich method Is estimated. That is, plastic We
After adsorbing an anti-human LT antibody (monoclonal or polyclonal) to the II, LT is added and allowed to bind. Further, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody having a different confirmation site from the primary antibody is added. As this secondary antibody, one to which bition is previously bound is used. Thereby, after that, if adipine to which horseradish peroxidase is bound is added, peroxidase is fixed to the well in proportion to the amount of the secondary antibody bound to LT by a specific reaction between adipine and the secondary antibody bition. Here, if a substrate such as orthophenylenediamine and hydrogen peroxide is added, color development is quantitatively observed by peroxidase, and the LT concentration in the sample can be estimated from the absorbance.
That is, a sample containing an unknown amount of LT may be compared with an EIA value of LT having a known content concentration, which is previously purified and determined by amino acid analysis. When the former antitumor activity is examined using L-P3 cells as an indicator as described above, its specific activity can be determined.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
実施例 1 mRNAの調整 Daudi細胞2×108個を4Mグアニジウムチオシアネー
ト,0.5%N−ラウロイルザルコシンナトリウム,25mMク
エン酸ナトリウムpH7.0、0.1Mメルカプトエタノール,0.
1%アンチホルム(シグマ)溶液10mlに懸濁させ、ポリ
トロンによりホモジナイズした。このホモジネートを0.
1M EDTAを含む5.7Mセシウムクロライド水溶液上に重層
し、超遠心分離機(SRP28Aローター,日立)を用い2600
0rpmで20℃下28hr遠心分離した。沈澱したRNAを10mMト
リス塩酸pH7.4 10mlに溶解した後2.5倍量のエタノール
を加え、−70℃下1時間放置した。次に、遠心により沈
澱させたRNAを10mMトリス塩酸pH7.4 14mlに溶解し、4M
塩化カリウム2mlをさらに加えた。このRNA溶液をオリゴ
(T)セルロースカラム(φ2×15cm)に付し、0.5M塩
化カリウム、10mMトリス塩酸pH7.4で十分に洗浄後、10m
Mトリス塩酸pH7.4水溶液でmRNAを溶出させた。Example 1 Preparation of mRNA 2 × 10 8 Daudi cells were treated with 4 M guanidium thiocyanate, 0.5% sodium N-lauroyl sarcosine, 25 mM sodium citrate pH 7.0, 0.1 M mercaptoethanol, 0.1 M mercaptoethanol.
The cells were suspended in 10 ml of a 1% antiform (Sigma) solution and homogenized with a polytron. Add this homogenate to 0.
Overlaid on a 5.7M cesium chloride aqueous solution containing 1M EDTA, and used an ultracentrifuge (SRP28A rotor, Hitachi) for 2600
The mixture was centrifuged at 0 rpm at 20 ° C. for 28 hours. The precipitated RNA was dissolved in 10 ml of 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, added with 2.5 volumes of ethanol, and left at -70 ° C for 1 hour. Next, the RNA precipitated by centrifugation was dissolved in 14 ml of 10 mM Tris-HCl pH 7.4, and 4M
An additional 2 ml of potassium chloride was added. This RNA solution was applied to an oligo (T) cellulose column (φ2 × 15 cm), washed thoroughly with 0.5 M potassium chloride, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, and then washed with 10 mM
The mRNA was eluted with M Tris-HCl pH 7.4 aqueous solution.
mRNAの精製 Daudi細胞由来mRNA 500μgを50mMTrisHCl pH7.4,0.2
MNaCl,1mM EDTAを含む10%から28%sucrose濃度勾配を
形成させた溶液15mlに重層し、超遠心分離機(SRP28Aロ
ーター,日立)を用い26000rpmで20℃下16hr遠心した。
次に500μずつ分画し各分画にエタノールを加えmRNA
を沈澱させた。各分画mRNAは滅菌水で溶解し、mRNA濃度
1μg/uに調整した。Purification of mRNA 500 μg of Daudi cell-derived mRNA is 50 mM TrisHCl pH 7.4, 0.2
The solution was layered on 15 ml of a solution containing MNaCl and 1 mM EDTA and having a concentration gradient of 10% to 28% sucrose, and centrifuged at 26,000 rpm at 20 ° C. for 16 hours using an ultracentrifuge (SRP28A rotor, Hitachi).
Next, fractionate 500μ each, add ethanol to each fraction, and mRNA
Was precipitated. Each fractionated mRNA was dissolved in sterile water and adjusted to an mRNA concentration of 1 μg / u.
mRNAのスクリーニング アフリカツメガエルの雌(生後1年以上のもの)に血
清性性腺刺激ホルモン(ピーメックス:三共)を200U注
射した。一晩経過後、卵母細胞を取り出し、modified b
arth saline medium(MBS)中に保存した。次に先のmRN
Aの各分画50〜100ng/eggを卵に注入し、1mM phenyl met
hyl sulfonyl fluoride(PMSF)を含むMBS中で25℃,36h
r培養した。上清を除去した後、卵母細胞をホモジネー
トし、1mM PMSF含有MBSで抽出し、mRNAの各画分ごとの
試料とした。各試料についてリンホトキシン活性を測定
し、リンホトキシン活性を示すmRNAの画分をスクリーニ
ングした。mRNA Screening Xenopus females (one year old or older) were injected with 200 U of serum gonadotropin (Pimex: Sankyo). After one night, remove the oocytes and add modified b
It was stored in arth saline medium (MBS). Next mRN
Inject 50-100 ng / egg of each fraction of A into eggs and add 1 mM phenyl met
25 ℃, 36h in MBS containing hyl sulfonyl fluoride (PMSF)
r was cultured. After removing the supernatant, the oocytes were homogenized, extracted with MBS containing 1 mM PMSF, and used as a sample for each fraction of mRNA. Lymphotoxin activity was measured for each sample, and the fraction of mRNA showing lymphotoxin activity was screened.
cDNAライブラリーの作成 アフリカツメガエルの卵母細胞によるmRNA発現系にお
いてリンホトキシン活性を示したmRNA画分の5μgを5m
M TrisHCl pH8.37μに溶解し、65℃5分間incubateし
た後、pcDVI DNA(ファルマシア)14μgを加え、次の
条件で反応を行った。50mM TrisHCl pH8.3mM MgCl2,30m
MKCl,0.3mM DTT,2mM dNTP,reversetranscriptease 5U,
反応液量20μ。Preparation of cDNA library 5 μg of the mRNA fraction showing lymphotoxin activity in a Xenopus oocyte mRNA expression system
After dissolving in M TrisHCl pH 8.37μ and incubating at 65 ° C for 5 minutes, 14μg of pcDVI DNA (Pharmacia) was added, and the reaction was performed under the following conditions. 50mM TrisHCl pH8.3mM MgCl 2 , 30m
MKCl, 0.3mM DTT, 2mM dNTP, reversetranscriptease 5U,
Reaction liquid volume 20μ.
37℃で60分間反応を行った後、0.25M EDTA 2μを加
え反応を止めた。フェノールクロロホルム処理を行った
後、4M NH4OAc 20μ,EtOH 80μを加え、−70℃で放
置し、次に遠心して上清を除いた後、同様の操作を繰り
返した。75%EtOH水で沈澱を洗浄し乾燥した後、10mM s
odium cacodylate,2.5mM HEPES pH7.6,0.1mM dCTP,poly
(A)0.2μg/uの反応液に調整し、terminal deoxynu
cleotidyl transferase(TdT)10Uを加え、最終的に20
μとした。37℃で10分間反応を行った後、0.25M EDTA
1μを加え反応を止め、以下常法に従い後処理を行っ
た。After performing the reaction at 37 ° C. for 60 minutes, 2 μm of 0.25 M EDTA was added to stop the reaction. After phenol-chloroform treatment, 4 M NH 4 OAc 20 μ and EtOH 80 μ were added, the mixture was allowed to stand at −70 ° C., then centrifuged to remove the supernatant, and the same operation was repeated. The precipitate was washed with 75% EtOH water and dried, and then dried at 10 mM s.
odium cacodylate, 2.5mM HEPES pH7.6,0.1mM dCTP, poly
(A) Adjust to 0.2 μg / u reaction solution, and add terminal deoxynu
Add 10 U of cleotidyl transferase (TdT) and finally add 20
μ. After reacting at 37 ° C for 10 minutes, 0.25M EDTA
1 μm was added to stop the reaction, and post-treatment was performed according to a conventional method.
得られたDNAの沈澱を8mM MgCl2,6mMメルカプトエタノ
ール,Hind III 10Uを含有する10mM Tris HCl pH7.4溶液
11μに溶解し、37℃で2hr反応させた。0.25M EDTA 1
μを加え、反応を止めた後、常法に従い後処理を行
い、10mM Tris HCl pH7.4,1mM EDTA溶液10μおよびEt
OH3μの混合溶液に溶解させた。A precipitate of the obtained DNA was dissolved in 10 mM Tris HCl pH 7.4 containing 8 mM MgCl 2 , 6 mM mercaptoethanol, and Hind III 10 U.
It was dissolved in 11 µ and reacted at 37 ° C for 2 hours. 0.25M EDTA 1
After stopping the reaction, post-treatment was performed according to a conventional method, and 10 mM Tris HCl pH 7.4, 1 mM EDTA solution 10 μ and Et were added.
OH was dissolved in a mixed solution of 3μ.
次に、DNA含有溶液11μにpL−1 DNA(ファルマシ
ア)77ngを加え10mM TrisHCl pH7.4,1mM EDTA,0.1M NaC
l溶液120μとした。65℃で5分間、42℃で30分間放置
した後、氷冷下、次の成分を加え液量を1.2mlとした。2
0mM Tris HCl pH7.5,4mH MgCl2,10mM(NH4)2SO4,0.1MK
Cl,0.1mM β−NAD,50μg/ml Bovine Serum Albumin,E.c
oli ligase 1μg 12℃で一晩反応を行った後、4mM dNTP 10μ,20mM
β−NAD 10μ,E.coli ligase 1μg,E.coli DNA polym
erase I 17.5U,RNase H 120Uを加え、12℃で1hr、25℃
でさらに1hr反応を行った後、この溶液を用いE.colix17
76株を形質転換させた。Next, 77 ng of pL-1 DNA (Pharmacia) was added to 11 µ of the DNA-containing solution, and 10 mM TrisHCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.1 M NaC was added.
The solution was 120 μm. After standing at 65 ° C. for 5 minutes and at 42 ° C. for 30 minutes, the following components were added under ice cooling to a volume of 1.2 ml. Two
0mM Tris HCl pH7.5,4mH MgCl 2, 10mM (NH 4) 2 SO 4, 0.1MK
Cl, 0.1mM β-NAD, 50μg / ml Bovine Serum Albumin, Ec
oli ligase 1μg After overnight reaction at 12 ° C, 4mM dNTP 10μ, 20mM
β-NAD 10μ, E. coli ligase 1μg, E. coli DNA polym
Add eraseI 17.5U, RNase H 120U, 12 ℃ for 1 hour, 25 ℃
The reaction was further performed for 1 hr at
76 strains were transformed.
すなわち、E.colix1776株をx1776 medium(Maniatis
et al,Molecular cloning)中、37℃で吸光度(550nm)
が0.2となるまで培養した後、集菌し以下Maniatis等の
方法でcompitent cellを調整した。このcompitent cell
に先のDNAを加えた後、E.colix1776株をtransformしてc
DNAライブラリーを作成した。That is, E.colix1776 strain was transformed into x1776 medium (Maniatis
et al, Molecular cloning) at 37 ° C (550nm)
After culturing until the cell concentration became 0.2, the cells were collected and a competent cell was prepared by the method of Maniatis et al. This competent cell
After adding the above DNA, transform E.colix1776 strain to c
A DNA library was created.
cDNAのスクリーニング 前項で得られたcDNAライブラリーの中から、リンホト
キシンをコードするcDNAを含むプラスミドを選別するた
め、リンホトキシンのC端8アミノ酸に対応するDNAを
合成しこれをプローブとしてコロニーハイブリダイゼー
ションを行った。Screening of cDNA In order to select a plasmid containing a cDNA encoding lymphotoxin from the cDNA library obtained in the preceding section, a DNA corresponding to the C-terminal 8 amino acids of lymphotoxin was synthesized, and colony hybridization was performed using this as a probe. Was.
合成プローブの構造はGTC TTC TTT GGA GCC TTC GCT
CTGであり、自動固相合成機(アプライドバイオシステ
ムズ社)により合成した後、HPLCにより精製した。ハイ
ブリダイゼーションはWallace等の方法(Nucleic Acids
Res,9 879,1981)に準じて行った。cDNAライブラリー
の約10万個のうち60個が陽性コロニーであり、その中の
3コロニーのプラスミドを調整し、塩基配列を決定した
ところ、1個がリンホトキシンcDNAを含むプラスミドで
あった。得られたリンホトキシンcDNAのアミの酸コーデ
ィング領域の塩基配列を図1に示す。The structure of the synthetic probe is GTC TTC TTT GGA GCC TTC GCT
CTG, which was synthesized by an automatic solid phase synthesizer (Applied Biosystems) and then purified by HPLC. Hybridization is performed by the method of Wallace et al. (Nucleic Acids
Res, 9 879, 1981). Out of about 100,000 cDNA libraries, 60 were positive colonies. Among them, plasmids of three colonies were prepared and their nucleotide sequences were determined. One of them was a plasmid containing lymphotoxin cDNA. FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the amino acid coding region of the resulting lymphotoxin cDNA.
発現ベクターの構築 前項で得たリンホトキシンcDNAを含むプラスミドをBa
mH1で消化し、リンホトキシンcDNAを含む約1.1kbpのフ
ラグメントをpUG131(pUC13(ファルマシア)のpoly li
nker部分をM13tg131(アマシャム)のpoly linker部分
と入れ換えたプラスミド)ノBamHI siteへ挿入した後
(プラスミド番号pMLT2000)、Hinc IIおよびBal Iで消
化して約1.1kbpのDNAフラグメントを得た。次に、pkk23
3−2(ファルマシア)をNco I消化した後にKlenow酵素
処理したベクターへ先の1.1Kbpフラグメントを挿入した
(プラスミド番号pMLT2100)。pKK233−2はtrcプロモ
ーター(tacプロモーターを改良したもの)を有し、IPT
Gにより誘導発現が可能である。次にpMLT2100をEcoR1お
よびHind IIIで消化し、リンホトキシンcDNAを含む約1.
5kbpフラグメントをM13mp10二本鎖DNA(ファルマシア)
へ挿入した。次に、E.coli JM103にtransfectionした
後、一本鎖DNAを常法に従って調整し、以下に示す合成
オリゴヌクレオチドを用いてin vitro mutagenesisを行
った。Construction of Expression Vector The plasmid containing the lymphotoxin cDNA obtained in the previous section was
After digestion with mH1, an approximately 1.1 kbp fragment containing the lymphotoxin cDNA was ligated with the poly li of pUG131 (pUC13 (Pharmacia)).
After inserting the nker portion into a BamHI site (plasmid in which the polylinker portion of M13tg131 (Amersham) was replaced) (plasmid number pMLT2000), it was digested with Hinc II and Bal I to obtain a DNA fragment of about 1.1 kbp. Then, pkk23
3-2 (Pharmacia) was digested with NcoI and then the 1.1 Kbp fragment was inserted into a vector treated with Klenow enzyme (plasmid number pMLT2100). pKK233-2 has a trc promoter (an improved version of the tac promoter),
Inducible expression is possible with G. Next, pMLT2100 is digested with EcoR1 and HindIII, containing approximately 1.
5 kbp fragment to M13mp10 double-stranded DNA (Pharmacia)
Inserted. Next, after transfection into E. coli JM103, single-stranded DNA was prepared according to a conventional method, and in vitro mutagenesis was performed using the following synthetic oligonucleotides.
部位特異的な変異発反応は基本的にZoller等の方法
(Method in Enzymology 100 468,1983)に従って行っ
た。すなわち、非放射性リン酸で末端標識した前記合成
オリゴヌクレオチド20pmolに1μgの鋳型DNA(一本鎖D
NA),2μの5×annealing buffer(50mM TrisHCl,pH
8.0,25mM MgCl2)、8μのB buffer(0.2M TrisHCl p
H7.5、0.1M MgCl2,0.1M DTT)、4μの2.5mM dNTP、
2μの5mM ATP、1μの蒸留水、5UのT4 DNA ligas
e,5UのDNA polymerase I Klenowフラグメントを加え全
量を20μとした。14℃で3hr反応を行った後、E.coli
JM103をtransformした(Kramer等、Cell 38 879,198
4)。 The site-specific mutagenesis reaction was basically performed according to the method of Zoller et al. (Method in Enzymology 100 468, 1983). That is, 1 μg of template DNA (single-stranded D) was added to 20 pmol of the synthetic oligonucleotide labeled with a non-radioactive phosphate.
NA), 2μ of 5x annealing buffer (50mM TrisHCl, pH
8.0,25mM MgCl 2 ), 8μB buffer (0.2M TrisHCl p
H7.5, 0.1 M MgCl 2 , 0.1 M DTT), 4 μm of 2.5 mM dNTP,
2μ of 5mM ATP, 1μ of distilled water, 5U of T4 DNA ligas
e, 5 U of DNA polymerase I Klenow fragment was added to make the total amount 20 μm. After performing the reaction at 14 ° C for 3 hours, E. coli
Transformed JM103 (Kramer et al., Cell 38 879,198
Four).
形質転換した細菌をE.coli JM103とまぜ寒天培地上に
広げ37℃で一晩培養し、形成されたプラークをニトロセ
ルロース上に写しとった(Grunstein et al PNAS 72 3
961,1975)。次に32Pでラベルした合成オリゴヌクレオ
チドとハイブリダイゼーション試験を行い変異を誘発さ
れたファージプラークを選別した。以上のようにして選
びだしたファージプラークより二本鎖DNAを調整し、Eco
R1およびHind IIIで消化して得たDNAフラグメントをpKK
233−2のEcoR1およびHind III消化で調整したプラスミ
ドへ挿入した(プラスミド番号pMLT3020)。The transformed bacteria were cultured overnight at 37 ° C. spread on an agar medium mixed with E. coli JM103, the formed plaques were O'in duplicate onto nitrocellulose (Grunstein et al PNAS 72 3
961, 1975). Next, a hybridization test was performed with a synthetic oligonucleotide labeled with 32 P to select phage plaques in which the mutation was induced. Double-stranded DNA was prepared from the phage plaques selected as described above,
The DNA fragment obtained by digestion with R1 and Hind III was
233-2 was inserted into a plasmid prepared by digestion with EcoR1 and HindIII (plasmid number pMLT3020).
pMLT3020は、trcプロモーターのShine−Dargaro配列
より11ヌクレオチド下流のATGより蛋白合成が開始する
とともに、Bg1 II消化によりプロモーターの下流に任意
の遺伝子を挿入可能であり、BamH I消化すれば開始コド
ンであるATGの下流に遺伝子が挿入可能となる発現ベク
ターである。pMLT3020は本発明ポリペプチドのNH2末端
より7アミノ酸残基を欠失したポリペプチドをコードし
ており、NH2末端周辺のDNA配列を示すと次の如くにな
る。pMLT3020 starts protein synthesis from ATG 11 nucleotides downstream of the Shine-Dargaro sequence of the trc promoter, and can insert any gene downstream of the promoter by Bg1 II digestion, and is an initiation codon when digested with BamHI. An expression vector into which a gene can be inserted downstream of ATG. pMLT3020 encodes a polypeptide in which seven amino acid residues have been deleted from the NH 2 terminus of the polypeptide of the present invention. The DNA sequence around the NH 2 terminus is as follows.
なお、pMLT3020の構築工程図を図2に示す。 FIG. 2 shows a construction process diagram of pMLT3020.
pMLT3020をBamH1およびHind IIIで消化し約500bpのDN
Aフラグメントをアガロースゲル電気泳動で回収した。
また、下記に示すオリゴヌクレオチドを合成し、ポリヌ
クレオチド キナーゼ(NEB)、ATPにより5′末端をリ
ン酸化した後、先の500bp DNAフラグメントと共にpUG13
0をEcoRlおよびHind III消化して得たベクターと酵素的
に連結させた(プラスミド番号pUG5001)。pMLT3020 is digested with BamH1 and HindIII to obtain a DNA of about 500 bp.
The A fragment was recovered by agarose gel electrophoresis.
In addition, after synthesizing the oligonucleotide shown below and phosphorylating the 5 'end with polynucleotide kinase (NEB) and ATP, pUG13 was added together with the above 500 bp DNA fragment.
0 was enzymatically ligated with the vector obtained by digestion with EcoRl and HindIII (plasmid number pUG5001).
反応停止後、常法に従いE.coli JM83を形質転換し、
X−Gal入り寒天プレート上で白色コロニーを選別し
た。次に、プラスミドpUG5001をBal IIおよびHind III
で消化した後、約500bp DNAフラグメントをアガロース
電気泳動より回収し、pMLT3020をBgl IIおよびHind III
で消化して得た約4.6kbp DNAと合わせ酵素的に連結させ
た(プラスミド番号pMLT5001A)。 After stopping the reaction, E. coli JM83 was transformed according to a standard method,
White colonies were selected on agar plates containing X-Gal. Next, plasmid pUG5001 was replaced with Bal II and Hind III
After digestion, a DNA fragment of about 500 bp was recovered from agarose gel electrophoresis, and pMLT3020 was digested with Bgl II and Hind III.
Was combined with about 4.6 kbp DNA obtained by digestion with, and ligated enzymatically (plasmid number pMLT5001A).
構築工程図を図3に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
プラスミドpUC12をBamHlおよびPst Iで消化し約2.8kb
p DNAフラグメントを得、5′末端をリン酸化した下記
合成DNAを酵素的に連結してプラスミドpUC7692を得た。Plasmid pUC12 was digested with BamHl and PstI to about 2.8 kb
A pDNA fragment was obtained, and the following synthetic DNA phosphorylated at the 5 ′ end was enzymatically ligated to obtain a plasmid pUC7692.
プラスミドpUC7692をAcc IおよびAva IIで消化後、7
%ポリアクリルアミド電気泳動で約100bp DNAフラグメ
ントを回収し、プラスミドpMLT5001AをEcoR1およびAcc
I消化、Ava IIおよびHind III消化して得た各々約450b
p、約300bp DNAフラグメントとプラスミドpUG130をEcoR
lおよびHind III消化して得た約2.8kbpフラグメントと
酵素的に連結した(プラスミドpEH5123)。 After digestion of plasmid pUC7692 with AccI and AvaII, 7
% Polyacrylamide electrophoresis to recover a DNA fragment of about 100 bp, and plasmid pMLT5001A was transferred to EcoR1 and Acc.
About 450b each obtained by digestion with I, Ava II and Hind III
p, about 300 bp DNA fragment and plasmid pUG130
Enzymatically ligated with the approximately 2.8 kbp fragment obtained by digestion with l and Hind III (plasmid pEH5123).
構築工程図を図4に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
プラスミドpEH5123を制限酵素Acc III及びXho Iで切
断した後、Bacterial Alkalin Phosphataseにより5′
末端脱リン酸基の除去を行った。次に、0.8%アガロー
スゲル電気泳動により約3.5kbpフラグメントを回収し、
5′末端のリン酸化した下記合成DNAと酵素的に連結さ
せた(プラスミド番号pEH6084)。Plasmid pEH5123 was digested with restriction enzymes AccIII and XhoI, and then digested with Bacterial Alkalin Phosphatase.
The terminal dephosphorylation group was removed. Next, about 3.5 kbp fragment was recovered by 0.8% agarose gel electrophoresis,
It was enzymatically ligated to the following synthetic DNA phosphorylated at the 5 'end (plasmid number pEH6084).
構築工程図を図7に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
このpEH6084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
1に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、1−
62位及び118−123位のアミノ酸を欠失し、NH2末端にMet
−Lysが付加したリンホトキシン誘導体をコードするこ
とが確認された。As a result of the nucleotide sequence analysis, this pEH6084 plasmid was found to have 1-amino acid sequence of the lymphotoxin amino acid sequence shown in FIG.
62-position and lack the 118-123 amino acid position, Met the NH 2 -terminal
It was confirmed that -Lys encodes the added lymphotoxin derivative.
実施例 2 プラスミドpEH6084を制限酵素EcoR1及びBgl IIで切断
して得た約300bpフラグメントと、Sac II及びHind III
で切断して得た約500bpフラグメントと、5′末端のリ
ン酸化された下記合成DNAとをプラスミドpUG130のEcoR1
及びHind IIIサイトへ酵素的に挿入した(プラスミド番
号pEH7084)。Example 2 An approximately 300 bp fragment obtained by digesting plasmid pEH6084 with restriction enzymes EcoR1 and BglII, and SacII and HindIII
Approximately 500 bp fragment obtained by digestion with Escherichia coli and the following synthetic DNA phosphorylated at the 5 'end were ligated with EcoR1 of plasmid pUG130.
And into the Hind III site enzymatically (plasmid number pEH7084).
構築工程図を図8に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
このpEH7084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
1に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、1−
62位及び118−123位のアミノ酸を欠失し、NH2末端に−S
er−Thr−Leu−Lysが付加したリンホトキシン誘導体を
コードすることが確認された。As a result of the nucleotide sequence analysis, this pEH7084 plasmid was found to have 1-amino acid sequence of the lymphotoxin amino acid sequence shown in FIG.
62-position and lack the 118-123 amino acid position, -S to NH 2 -terminal
It was confirmed that er-Thr-Leu-Lys encodes the added lymphotoxin derivative.
実施例 3 pMLT3020をBamH IおよびHind IIIで消化して得た約50
0bpのDNAフラグメントを5′末端をリン酸化した下記合
成オリゴヌクレオチド並びにpUG130をEcoR1およびHind
III消化して得たベクターと酵素的に連結させた(プラ
スミド番号pUG5004)。Example 3 About 50 obtained by digesting pMLT3020 with BamHI and HindIII
The following synthetic oligonucleotide obtained by phosphorylating the DNA fragment of 0 bp at the 5 'end and pUG130 were ligated with EcoR1 and Hind.
It was ligated enzymatically with the vector obtained by digestion III (plasmid number pUG5004).
構築工程図を図5に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
プラスミドpUG5004をSac IIおよびHind IIIで消化し
て得た約540bpのDNAフラグメント、5′末端をリン酸化
した下記合成オリゴヌクレオチド、プラスミドpUG130を
EcoR1およびHind IIIで消化して得た約2.8kbpのDNAフラ
グメントを酵素的に連結させた(プラスミド番号pUG501
1)。 Approximately 540 bp DNA fragment obtained by digesting plasmid pUG5004 with Sac II and Hind III
A DNA fragment of about 2.8 kbp obtained by digestion with EcoR1 and Hind III was ligated enzymatically (plasmid number pUG501).
1).
次に、プラスミドpUG5011をBgl IIおよびHind IIIで
消化して得た約570bpのDNAフラグメントとプラスミドpL
MLT3020をBgl IIおよびHind IIIで消化して得た約4.6kb
pのDNAフラグメントを酵素的に連結させた(プラスミド
番号pMLT5011)。Next, an approximately 570 bp DNA fragment obtained by digesting plasmid pUG5011 with Bgl II and Hind III and plasmid pL
About 4.6 kb obtained by digesting MLT3020 with Bgl II and Hind III
The DNA fragment of p was ligated enzymatically (plasmid number pMLT5011).
構築工程図を図6に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
プラスミドpEH7084を制限酵素Acc I及びHind IIIで切
断した後、1%アガロースゲル電気泳動により約450bp
のDNAフラグメントを分取した。同様にプラスミドpMLT5
011を制限酵素EcoR1及びAcc Iで切断して得た約450bp D
NAフラグメントと前記フラグメントをプラスミドpUG130
のEcoR1及びHind IIIサイトへ酵素的に挿入した(プラ
スミド番号pEH8084)。 After cutting plasmid pEH7084 with restriction enzymes Acc I and Hind III, about 450 bp was obtained by 1% agarose gel electrophoresis.
Was collected. Similarly, plasmid pMLT5
11450 bp D obtained by digesting 011 with restriction enzymes EcoR1 and AccI
The NA fragment and the fragment were converted to plasmid pUG130.
Was enzymatically inserted into the EcoR1 and HindIII sites (plasmid number pEH8084).
構築工程図を図9に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
このpEH8084プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
1に記載のリンホトキシンのアミン酸配列のうち、1−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失したリンホトキシ
ン誘導体をコードすることが確認された。As a result of the nucleotide sequence analysis, this pEH8084 plasmid contained 1-amino acid sequence of the lymphotoxin aminic acid sequence shown in FIG.
The amino acids at positions 62 and 118-123 were confirmed to encode a lymphotoxin derivative deleted.
実施例 4 プラスミドpEH6084をEcoR1及びPst Iで切断して得た
約580bp DNA断片、pTT5001をPst I及びPvu Iで切断して
得た約1700bp DNA断片、pBR322d−ropをEcoR1及びPvu I
で切断して得た約3100bp DNA断片の三者を酵素的に連結
した(プラスミド番号pBRD6084)。Example 4 Approximately 580 bp DNA fragment obtained by cutting plasmid pEH6084 with EcoR1 and PstI, approximately 1700 bp DNA fragment obtained by cutting pTT5001 with PstI and PvuI, pBR322d-rop with EcoR1 and PvuI
Approximately 3,100 bp DNA fragments obtained by digestion were ligated enzymatically (plasmid number pBRD6084).
次に、pBRD6084をEcoR1,Acc I及びPvu Iで切断して得
た約1100bp DNA断片とpEH8037をEcoR1及びAcc Iで切断
して得た約450bp DNA断片、pBR322 d−ropをEcoR1及びP
vu Iで切断して得た約3100bp DNA断片の三者を酵素的に
連結した(プラスミド番号pBRD8050)。Next, about 1100 bp DNA fragment obtained by cutting pBRD6084 with EcoR1, AccI and PvuI and about 450 bp DNA fragment obtained by cutting pEH8037 with EcoR1 and AccI, pBR322 d-rop was used for EcoR1 and P
Three of the approximately 3100 bp DNA fragments obtained by digestion with vu I were ligated enzymatically (plasmid number pBRD8050).
構築工程図を図10に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
このpBRD8005プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
1に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、1−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失し、71位のプロリ
ンがバリンに変換されたリンホトキシン誘導体をコード
することが確認された。As a result of the nucleotide sequence analysis, this pBRD8005 plasmid was found to have the amino acid sequence 1- of the lymphotoxin amino acid sequence shown in FIG.
It was confirmed that the amino acids at positions 62 and 118-123 were deleted, and that proline at position 71 encoded a lymphotoxin derivative converted to valine.
実施例 5 プラスミドpEH7084を制限酵素Acc I及びHind IIIで切
断し、約300bpのDNA断片を得た。またプラスミドpEH503
7をEcoR1及びAcc Iで切断して約450bp DNA断片を得、先
のDNA断片と共に酵素的にプラスミドpUG130のEcoR1,Hin
d III部位へ挿入した(プラスミド番号pEH5050)。Example 5 Plasmid pEH7084 was digested with restriction enzymes AccI and HindIII to obtain a DNA fragment of about 300 bp. Plasmid pEH503
7 was cleaved with EcoR1 and AccI to obtain a DNA fragment of about 450 bp.
dIII site (plasmid number pEH5050).
構築工程図を図11に示す。 The construction process diagram is shown in FIG.
このpEH5050プラスミドは、塩基配列解析の結果、図
1に記載のリンホトキシンのアミノ酸配列のうち、1−
62位及び118−123位のアミノ酸が欠失し、71位のプロリ
ンがバリンに変換され、更にNH2末端にMet−Lysが付加
したリンホトキシン誘導体をコードすることが確認され
た。As a result of the nucleotide sequence analysis, this pEH5050 plasmid was found to have 1-amino acid sequence of the lymphotoxin amino acid sequence shown in FIG.
It was confirmed that the amino acids at positions 62 and 118-123 were deleted, the proline at position 71 was converted to valine, and the gene encoded a lymphotoxin derivative with Met-Lys added to the NH 2 terminus.
実施例 6 プラスミドpEH6084で形質転換した大腸菌W3110をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地20に接種し、37℃下20
時間の撹拌培養を行った。次に遠心分離により菌体を集
めPBSで洗浄後、100mlのPBSに懸濁した。この菌体液を
超音波発生装置で破砕した後、遠心分離(トミー精工:R
B20BH,15,000回転、30分間)により菌体抽出液125mlを
得た。この粗抽出液のリンホトキシン活性は4.4×108U/
mlであった。次に、予め0.2Mリン酸緩衝液で十分に平衡
化したゲル濾過担体であるSephacryl S−200(ファルマ
シア)φ113×900mmに付した。Example 6 Escherichia coli W3110 transformed with plasmid pEH6084 was inoculated into LB medium 20 containing 100 mg / ampicillin, and incubated at 37 ° C. for 20 minutes.
Time stirring culture was performed. Next, the cells were collected by centrifugation, washed with PBS, and suspended in 100 ml of PBS. After disrupting the cell fluid with an ultrasonic generator, centrifugation (Tomy Seiko: R
B20BH, 15,000 rotations, 30 minutes) to obtain 125 ml of the bacterial cell extract. The lymphotoxin activity of this crude extract is 4.4 × 10 8 U /
ml. Next, it was applied to a gel filtration carrier Sephacryl S-200 (Pharmacia) φ113 × 900 mm, which was sufficiently equilibrated with a 0.2 M phosphate buffer in advance.
リンホトキシン活性を示す画分を集めた後、一部を抗
リンホトキシンマウスモノクローナル抗体カラム30mlに
付した。同抗体カラムは組換リンホトキシンをマウスに
免疫して作成したモノクローナル抗体をSepharose 4B
(ファルマシア)に結合して作成した。同カラムを0.2M
リン酸緩衝液で十分に平衡換し、先の部分精製したリン
ホトキシン誘導体を吸着させた後に同緩衝液で洗浄し、
3M KSCMを含む0.2Mリン酸緩衝液で溶出させた。次にSep
hadex G−25(ファルマシア)で脱塩を行い、SDS−ポリ
アクリルアミド電気泳動で純度検定を行ったところ、分
子量約16,000の単一バンドであった。また、NH2末端配
列を調べたところ、その構造はMet Lys Pro Ala Ala Hi
s Leu IIe Gly Aspであった。After collecting fractions showing lymphotoxin activity, a portion was applied to a 30 ml anti-lymphotoxin mouse monoclonal antibody column. The antibody column is a monoclonal antibody prepared by immunizing mice with recombinant lymphotoxin, Sepharose 4B
(Pharmacia). 0.2M
After sufficient equilibration with a phosphate buffer, the previously partially purified lymphotoxin derivative is adsorbed, and then washed with the same buffer.
Elution was performed with 0.2 M phosphate buffer containing 3 M KSCM. Then Sep
Desalting was performed with hadex G-25 (Pharmacia), and purity was determined by SDS-polyacrylamide electrophoresis. As a result, a single band having a molecular weight of about 16,000 was obtained. When the NH 2 terminal sequence was examined, the structure was found to be Met Lys Pro Ala Ala Hi
s Leu IIe Gly Asp.
実施例 7 プラスミドpEH7084で形質転換した大腸菌JM83をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地200mlに接種し、37℃下1
8時間の振とう培養を行った。次に遠心分離により菌体
を集めPBS(Dalbecco)で洗浄後、2mlのPBSに懸濁し
た。この菌体液を超音波発生装置で破砕した後、遠心分
離により菌体抽出液を得た。この粗抽出液を無菌濾過
(0.22μm)した後、濾液を抗リンホトキシンマウスモ
ノクローナル抗体カラム2mlに付した。同カラムは50mM
Tris HCl pH8.0緩衝液で十分に平衡化し、先のリンホト
キシン誘導体を吸着させた後に同緩衝液で洗浄を行っ
た。次に3M KSCNを含む50mM Tris HCl pH8.0緩衝液で溶
出させた。溶出液は直ちにPBS(Dulbecco)緩衝液に透
析した。Example 7 Escherichia coli JM83 transformed with the plasmid pEH7084 was inoculated into 200 ml of LB medium containing 100 mg / ampicillin.
Shaking culture was performed for 8 hours. Next, the cells were collected by centrifugation, washed with PBS (Dalbecco), and suspended in 2 ml of PBS. After crushing the cell fluid with an ultrasonic generator, a cell extract was obtained by centrifugation. After the crude extract was subjected to aseptic filtration (0.22 μm), the filtrate was applied to a 2 ml anti-lymphotoxin mouse monoclonal antibody column. The column is 50 mM
After sufficient equilibration with Tris HCl pH 8.0 buffer, the above lymphotoxin derivative was adsorbed, and then washed with the same buffer. Next, elution was carried out with 50 mM Tris HCl pH 8.0 buffer containing 3 M KSCN. The eluate was dialyzed immediately against PBS (Dulbecco) buffer.
実施例 8 プラスミドpEH8084で形質転換した大腸菌JM83をアン
ピシリン100mg/を含むLB培地200mlに接種し、37℃下1
8時間の振とう培養を行った。次に遠心分離により菌体
を集めPBS(Dulbecco)で洗浄後、2mlのPBSに懸濁し
た。この菌体液を超音波発生装置で破砕した後、遠心分
離により菌体抽出液を得た。この粗抽出液のリンホトキ
シン活性は6.6×107/mlであった。次に、同抽出液を無
菌濾過(0.22μm)した後、抗リンホトキシンマウスモ
ノクローナル抗体カラム2mlに付した。前記と同様の方
法で溶出させ、PBSに透析して2.9×107U/mlの活性を含
む2ml溶液を得た。SDS−ポリアクリルアミド電気泳動で
は分子量約16,000の単一バンドを与え、NH2末端配列はP
ro Ala Ala His Leu IIe Gly Aspであった。Example 8 Escherichia coli JM83 transformed with plasmid pEH8084 was inoculated into 200 ml of LB medium containing 100 mg / ampicillin.
Shaking culture was performed for 8 hours. Next, the cells were collected by centrifugation, washed with PBS (Dulbecco), and suspended in 2 ml of PBS. After crushing the cell fluid with an ultrasonic generator, a cell extract was obtained by centrifugation. The lymphotoxin activity of the crude extract was 6.6 × 10 7 / ml. Next, the extract was subjected to aseptic filtration (0.22 μm), and then applied to a 2 ml anti-lymphotoxin mouse monoclonal antibody column. The mixture was eluted in the same manner as described above, and dialyzed against PBS to obtain a 2 ml solution containing 2.9 × 10 7 U / ml activity. SDS- gave a single band with a molecular weight of about 16,000 in polyacrylamide electrophoresis, NH 2 terminal sequence P
ro Ala Ala His Leu IIe Gly Asp.
実験例をもって本発明の効果を説明する。 The effects of the present invention will be described using experimental examples.
実験例 1 <試 料> プラスミドpEH6084を発現し、精製し、最終目的物質
Aを得て、これを検体試料とした。別に対照試料として
天然リンホトキシンを用意した。Experimental Example 1 <Sample> The plasmid pEH6084 was expressed and purified to obtain the final target substance A, which was used as a sample. Separately, natural lymphotoxin was prepared as a control sample.
<方 法> インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞(PC−10)、ヒ
ト結腸腺癌細胞(WiDr)及びヒト繊維肉腫細胞(HT108
0)を使用した。各細胞株を2〜5×104/Wellの密度で9
6Wellミクロタイタープレートに添加し、各試料を含む
培地及びアクチノマイシンD(PC−10の場合には0.1μg
/ml、WiDr及びHT1080の場合には0.5μg/ml)を添加し
た。湿潤CO2存在下で12〜15時間培養し、生存細胞をCry
stal violetで固定染色し、染色された細胞より色素を
抽出し、その吸光値を測定した。試料添加前の生存値を
100%として、試料添加による生存率を求めた。<Method> As indicator cells, human lung cancer cells (PC-10), human colon adenocarcinoma cells (WiDr) and human fibrosarcoma cells (HT108)
0) was used. Each cell line is grown at a density of 2-5 × 10 4 / Well 9
The medium containing each sample and actinomycin D (0.1 μg in the case of PC-10) were added to a 6-well microtiter plate.
/ ml, 0.5 μg / ml for WiDr and HT1080). And 12 to 15 hours at a wet CO 2 presence, viable cells Cry
The cells were fixed and stained with stal violet, a dye was extracted from the stained cells, and the absorbance was measured. Survival values before sample addition
The survival rate by adding the sample was determined as 100%.
<結 果> 結果を図12−図14に示す。図12〜図14はそれぞれイン
ジケーター細胞としてPC−10,WiDr,HT1080を使用した場
合の結果であり、図中、△印線は天然リンホトキシン、
○印線は目的物質Aをそれぞれ試料としたときのリンホ
トキシン活性と生存率の関係を示すグラフである。<Results> The results are shown in FIGS. FIGS. 12 to 14 show the results when PC-10, WiDr, and HT1080 were used as indicator cells, respectively.
The circles indicate the relationship between the lymphotoxin activity and the survival rate when the target substance A was used as a sample.
図12〜図14より、本発明で示される137個のアミノ酸
配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性があることが知られ
る。12 to 14, it is known that the 137 amino acid sequence shown in the present invention has antitumor activity of lymphotoxin.
実験例 2 <試 料> プラスミドpHE6084,pH7084,pEH8084をそれぞれ発現
し、精製し、最終目的物質B,C,Dを得て、これを検体試
料とした。別に対照試料として天然リンホトキシンを用
意した。Experimental Example 2 <Samples> Plasmids pHE6084, pH7084, and pEH8084 were respectively expressed and purified to obtain final target substances B, C, and D, which were used as specimen samples. Separately, natural lymphotoxin was prepared as a control sample.
<方 法> インジケータ細胞としてヒト肺癌細胞(PC−10)、ヒ
ト結腸腺癌細胞(WiDr)及びヒト繊維肉腫細胞(HT108
0)を使用した。各細胞株を2〜5×104/Wellの密度で9
6Wellミクロタイタープレートに添加し、各試料を含む
培地及びアクチノマイシンD(PC−10の場合には0.1μg
/ml、WiDr及びHT1080の場合には0.5μg/ml)を添加し
た。湿潤CO2存在下で20時間培養し、生存細胞をCrystal
violetで固定染色し、染色された細胞より色素を抽出
し、その吸光値を測定した。試料添加前の生存値を100
%として、試料添加による生存率を求めた。<Method> As indicator cells, human lung cancer cells (PC-10), human colon adenocarcinoma cells (WiDr) and human fibrosarcoma cells (HT108)
0) was used. Each cell line is grown at a density of 2-5 × 10 4 / Well 9
The medium containing each sample and actinomycin D (0.1 μg in the case of PC-10) were added to a 6-well microtiter plate.
/ ml, 0.5 μg / ml for WiDr and HT1080). Incubated for 20 hours in a wet CO 2 presence, the viable cells Crystal
The cells were fixed and stained with violet, a dye was extracted from the stained cells, and the absorbance was measured. Survival value before sample addition is 100
%, The survival rate due to the addition of the sample was determined.
<結 果> 結果を図15に示す。図15の(a),(b),(c)は
それぞれインジケーター細胞としてPC−10,WiDr,HT1080
を使用した場合の結果であり、図中、●印線、△印線、
□印線、▽印線はそれぞれ天然リンホトキシン、目的物
質B,C,Dを試料としたときのリンホトキシン活性と生存
率の関係を示すグラフである。<Results> The results are shown in FIG. (A), (b) and (c) of FIG. 15 show PC-10, WiDr and HT1080 as indicator cells, respectively.
Are the results when is used.
The □ and ▽ marks are graphs showing the relationship between the lymphotoxin activity and the survival rate when natural lymphotoxin and target substances B, C, and D were used as samples, respectively.
図15(a),(b),(c)より、本発明で示される
137個のアミノ酸配列にリンホトキシンの抗腫瘍活性が
あることが知られる。FIGS. 15A, 15B and 15C show the present invention.
It is known that the 137 amino acid sequence has antitumor activity of lymphotoxin.
実験例 3 実験例2の試料B,C,Dについてエンザイムイムノアッ
セイ法により、マウスL−P3細胞に対する活性を求め、
天然リンホトキシンの活性(0.5〜1×108U/mg蛋白)を
標準にして、各試料の生物活性を算出した。Experimental Example 3 For the samples B, C, and D of Experimental Example 2, the activity on mouse LP3 cells was determined by enzyme immunoassay,
The biological activity of each sample was calculated using the activity of natural lymphotoxin (0.5-1 × 10 8 U / mg protein) as a standard.
index 天然リンホトキシン 1.0 B 7.3 C 5.6 D 6.2 上記結果より、本発明リンホトキシン誘導体の活性は
天然リンホトキシンよりも5〜8倍大きいことが知られ
る。index Natural lymphotoxin 1.0 B 7.3 C 5.6 D 6.2 From the above results, it is known that the activity of the lymphotoxin derivative of the present invention is 5 to 8 times greater than that of the natural lymphotoxin.
図1はリンホトキシンcDNAのアミノ酸コーディング領域
の塩基配列の図である。 図2はpMLT3020の構築工程図である。 図3はpUG5001およびpMLT5001Aの各構築工程図である。 図4はpEH5123の構築工程図である。 図5はpPU5004の構築工程図である。 図6はpMLT5011の構築工程図である。 図7はpEH6084の構築工程図である。 図8はpEH7084の構築工程図である。 図9はpEH8084の構築工程図である。 図10はpBRD8050の構築工程図である。 図11はpEH5050の構築工程図である。 図12、13、14はそれぞれ実験例1の結果を示すグラフ、
図15は実験例2の結果を示すグラフである。FIG. 1 is a diagram of the nucleotide sequence of the amino acid coding region of lymphotoxin cDNA. FIG. 2 is a construction process diagram of pMLT3020. FIG. 3 is a diagram showing the construction steps of pUG5001 and pMLT5001A. FIG. 4 is a construction step diagram of pEH5123. FIG. 5 is a construction process diagram of pPU5004. FIG. 6 is a construction step diagram of pMLT5011. FIG. 7 is a construction step diagram of pEH6084. FIG. 8 is a construction step diagram of pEH7084. FIG. 9 is a construction step diagram of pEH8084. FIG. 10 is a construction step diagram of pBRD8050. FIG. 11 is a construction step diagram of pEH5050. 12, 13, and 14 are graphs showing the results of Experimental Example 1, respectively.
FIG. 15 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI //(C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 四方 靖 茨城県つくば市春日4―19―13 エーザ イ紫山寮311号 (72)発明者 桑田 学 茨城県牛久市牛久町3010―118 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 15/12 - 15/28 C12N 1/21 C07K 14/51 - 14/57 A61K 37/02 C12P 21/00 - 21/02 GenBank/EMBL/DDBJ,B IOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Yasushi Shikata Tsukuba, Ibaraki 4-19-13, Kasuga-shi, Eisai Mt. Shiyama Ryo 311 (72) Inventor Manabu Kuwata 3010-118, Ushiku-cho, Ushiku-shi, Ibaraki (58) Field surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) C12N 15/12- 15/28 C12N 1/21 C07K 14/51-14/57 A61K 37/02 C12P 21/00-21/02 GenBank / EMBL / DDBJ, BIOSIOS (DIALOG) WPI (DIALOG)
Claims (10)
酸配列を含有する新規な組換リンホトキシン誘導体。 (式中、A1はPro又はValを表す)1. A novel recombinant lymphotoxin derivative having an amino acid sequence represented by the following primary structural formula in the molecule. (Where A 1 represents Pro or Val)
ノ酸が連結しているか、又はアミノ酸が連結していない
請求項1記載の組換リンホトキシン誘導体。2. The recombinant lymphotoxin derivative according to claim 1, wherein 1 to 4 amino acids are linked to the NH 2 terminus of the amino acid sequence, or no amino acids are linked.
酸がMet−Lysである請求項2記載の組換リンホトキシン
誘導体。3. The recombinant lymphotoxin derivative according to claim 2, wherein the amino acid linked to the NH 2 terminus of the amino acid sequence is Met-Lys.
酸がSer−Thr−Leu−Lysである請求項2記載の組換リン
ホトキシン誘導体。4. The recombinant lymphotoxin derivative according to claim 2, wherein the amino acid linked to the NH 2 terminus of the amino acid sequence is Ser-Thr-Leu-Lys.
リンホトキシン誘導体をコードするcDNA。A cDNA encoding the recombinant lymphotoxin derivative according to any one of claims 1 to 4.
み、かつ、選択した宿主内で制御および発現が可能とな
るように連結して得られた発現プラスミド。6. An expression plasmid comprising the cDNA according to claim 5 as a foreign gene and ligated so as to enable control and expression in a selected host.
れる請求項6記載の発現プラスミド。 pEH6084,pEH7084,pEH8084,pBRD8050,pEH50507. The expression plasmid according to claim 6, wherein the expression plasmid is identified by the following. pEH6084, pEH7084, pEH8084, pBRD8050, pEH5050
り形質転換される宿主。(8) A host transformed with the expression plasmid according to (6) or (7).
リンホトキシン誘導体を有効成分として含有する抗腫瘍
剤。9. An antitumor agent comprising the recombinant lymphotoxin derivative according to claim 1 as an active ingredient.
ら回収することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に
記載の組換リンホトキシン誘導体の製造方法。10. A method for producing a recombinant lymphotoxin derivative according to claim 1, comprising culturing the host according to claim 8, and recovering the host from the culture solution.
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MA23841A1 (en) * | 1995-04-07 | 1996-12-31 | Alberto Vazquez Figueroa Rial | INSTALLATION FOR DESALINATING SEAWATER BY REVERSE OSMOSIS BY CLEAN PRESSURE AND METHOD FOR DESALINATING SEAWATER BY REVERSE OSMOSIS BY CLEAN PRESSURE |
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1989
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