JP2839232B2 - New sugar chain synthase - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は糖鎖合成酵素および該酵
素をコードするＤＮＡに関するものである。さらに詳し
くは、本発明は N−アセチルガラクトサミンα 2,6シア
ル酸転移酵素（GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素）および
該酵素をコードするＤＮＡに関するものである。該酵素
は、癌転移抑制およびウイルス感染抑止効果を有する薬
剤として、あるいは薬剤にシアル酸を付加することによ
り生理作用を増加させるための試薬等として有用であ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a sugar chain synthase and a DNA encoding the enzyme. More specifically, the present invention relates to N-acetylgalactosamine α 2,6 sialyltransferase (GalNAcα2,6-sialyltransferase) and DNA encoding the enzyme. The enzyme is useful as a drug having an inhibitory effect on cancer metastasis and virus infection, or as a reagent for increasing a physiological action by adding sialic acid to the drug.

【０００２】[0002]

【従来の技術】シアル酸は、例えば細胞−細胞間伝達、
細胞基質相互作用、細胞接着等の重要な生理作用をつか
さどる物質である。発生、分化、及び癌遺伝子のトラン
スホーメーション等の過程において調節をうけた、種々
の異なる細胞表面シアル酸が存在することが知られてい
る。シアル酸は糖蛋白および糖脂質の炭化水素基の末端
位置に存在しており、シアル酸は、翻訳の後の過程で、
酵素的にCMP-Sia からこれらの部位に導入される。例え
ば、糖蛋白には３種の結合様式、すなわち Siaα2,6Ga
l, Siaα2,3Gal, および Siaα2,6GalNAc が共通に存
在しており(Hakomori, S., Ann. Rev. Biochem., 50, 7
33-764, 1981) 、ガングリオシドには高頻度に２種の結
合様式、すなわち Siaα2,3Galおよび Siaα2,8Siaが存
在している(Fishman, P., and Brady, R.O., Science,
194, 906-915, 1976) 。2. Description of the Related Art Sialic acid is used, for example, in cell-cell communication,
It is a substance that controls important physiological actions such as cell-substrate interaction and cell adhesion. It is known that there are a variety of different cell surface sialic acids that are regulated during processes such as development, differentiation, and oncogene transformation. Sialic acid is located at the terminal position of the carbohydrate group of glycoproteins and glycolipids.
Enzymatically introduced from CMP-Sia into these sites. For example, glycoproteins have three binding modes: Siaα2,6Ga
l, Siaα2,3Gal and Siaα2,6GalNAc are commonly present (Hakomori, S., Ann. Rev. Biochem., 50, 7
33-764, 1981), gangliosides frequently have two binding modes, Siaα2,3Gal and Siaα2,8Sia (Fishman, P., and Brady, RO, Science,
194, 906-915, 1976).

【０００３】上記の様なシアル酸の酵素的導入（シアル
酸転移）を担う酵素は、シアル酸転移酵素(sialyltrans
ferase) と呼ばるグリコシルトランスフェラーゼ類であ
る。従来既知の全てのシアリルオリゴ糖構造を合成する
ためには、少なくとも12の異なるシアル酸転移酵素が必
要であることが知られている(Broquet, P. et al., In
t. J. Biochem., 23, 385-389, 1991; および Weinstei
n, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 19
87)。これらのうち、５種類のシアル酸転移酵素が精製
されており、いずれの酵素も各受容体基質に対して高い
特異性を示すことが知られている(Sadler, J. et al.,
J. Bio. Chem., 254, 4434-4443, 1979; Weinstein, J.
et al., J. Biol. Chem., 257, 13835-13844, 1982; R
earick, J.et al., J. Biol. Chem., 254, 4444-4451,
1979; および Joqiasse, D.H. eal., J. Biol. Chem.,
260, 4941-4951, 1985)。[0003] The enzyme responsible for the enzymatic introduction of sialic acid (sialyltransferase) is sialyltransferase (sialyltransferase).
ferases). It is known that at least 12 different sialyltransferases are required to synthesize all previously known sialyl oligosaccharide structures (Broquet, P. et al., In
t. J. Biochem., 23, 385-389, 1991; and Weinstei
n, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 19
87). Of these, five types of sialyltransferases have been purified, and all enzymes are known to exhibit high specificity for each receptor substrate (Sadler, J. et al.,
J. Bio.Chem., 254, 4434-4443, 1979; Weinstein, J.
et al., J. Biol. Chem., 257, 13835-13844, 1982; R
earick, J. et al., J. Biol. Chem., 254, 4444-4451,
1979; and Joqiasse, DH eal., J. Biol. Chem.,
260, 4941-4951, 1985).

【０００４】上記のシアル酸転移酵素をコードするcDNA
については、 Galβ1,4GlcNAc α2,6-シアル酸転移酵素
(Galβ4GlcNAc-α6ST)をコードするcDNAが、肝をはじめ
とする種々の組織からクローニングされている(Weinste
in, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 1
987; Grundmann U. et al., Nucleic Acids Res. 18,66
7, 1990; Bast, B. et al., J. Cell. Biol., 116, 423
-435, 1992; およびHamamoto, T. et al., Bioorg. an
d Medic. Chem., 1, 141-145, 1993)。また、Gal β1,3
GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素(Galβ3GalNAc-α3ST)
をコードするcDNA(Gillespie, W. et al., J. Biol. Ch
em., 267, 21004-21010, 1992; およびLee, Y. et a
l., Eur. J. Biochem, 216, 377-385, 1993) 、Gal β
1,3(4)GlcNAcα2,3-シアル酸転移酵素(Galβ3(4)GlcNAc
- α3ST)をコードするcDNA(Wen, D.X et al., J. Biol.
Chem., 267, 21011-21019, 1992)もクローニングされ
ている。[0004] cDNA encoding the above sialyltransferase
About Galβ1,4GlcNAc α2,6-sialyltransferase
CDNA encoding (Galβ4GlcNAc-α6ST) has been cloned from various tissues including liver (Weinste
in, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 1
987; Grundmann U. et al., Nucleic Acids Res. 18,66
7, 1990; Bast, B. et al., J. Cell. Biol., 116, 423
-435, 1992; and Hamamoto, T. et al., Bioorg. An
d Medic. Chem., 1, 141-145, 1993). Gal β1,3
GalNAc α2,3-sialyltransferase (Galβ3GalNAc-α3ST)
(Gillespie, W. et al., J. Biol. Ch.
em., 267, 21004-21010, 1992; and Lee, Y. et a
l., Eur. J. Biochem, 216, 377-385, 1993), Gal β
1,3 (4) GlcNAcα2,3-sialyltransferase (Galβ3 (4) GlcNAc
-cDNA encoding α3ST) (Wen, DX et al., J. Biol.
Chem., 267, 21011-21019, 1992) has also been cloned.

【０００５】しかしながら、GalNAcα2,6-シアル酸転移
酵素(EC 2.4.99.3; GalNAc-α6ST)をコードするcDNAは
クローニングされていない。GalNAcα2,6-シアル酸転移
酵素を分離した報告もあるが(Hakomori, S., Ann. Rev.
Biochem., 50, 733-764, 1981) 、物質として同定でき
る程には精製されておらず、反応特異性、性質の安定
性、供給量に問題があり、実用に供することはできなか
った。[0005] However, cDNA encoding GalNAcα2,6-sialyltransferase (EC 2.4.99.3; GalNAc-α6ST) has not been cloned. There is also a report that GalNAcα2,6-sialyltransferase was isolated (Hakomori, S., Ann. Rev.
Biochem., 50, 733-764, 1981), but it was not purified to the extent that it could be identified as a substance, and had problems in reaction specificity, stability of properties, and supply, and could not be put to practical use.

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、精製
されたGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素を提供することを
目的とするものである。また、本発明は、GalNAcα2,6-
シアル酸転移酵素をコードするcDNAをクローニングし、
該GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素をコードするＤＮＡ配
列および該酵素のアミノ酸配列を提供することを目的と
している。また、本発明は、上記のGalNAcα2,6-シアル
酸転移酵素の構造のうち、活性に係わる部分を大量に蛋
白として発現させることを目的としている。Accordingly, an object of the present invention is to provide a purified GalNAcα2,6-sialyltransferase. The present invention also relates to GalNAcα2,6-
Cloning cDNA encoding sialyltransferase,
An object of the present invention is to provide a DNA sequence encoding the GalNAcα2,6-sialyltransferase and an amino acid sequence of the enzyme. Another object of the present invention is to express a portion of the structure of the above GalNAcα2,6-sialyltransferase involved in activity as a protein in a large amount.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の目的
を達成すべく鋭意努力し、ニワトリ胚からGalNAcα2,6-
シアル酸転移酵素をコードするcDNAをクローニングし、
本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、配列表
の配列番号１に示されるアミノ酸配列により特定される
GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 を提供するもので
ある。また、本発明は、上記のGalNAcα2,6-シアル酸転
移酵素のアミノ酸配列をコードするGalNAcα2,6-シアル
酸転移酵素遺伝子、およびその一態様である配列表の配
列番号１に示される核酸番号１から1698で特定される塩
基配列を有するGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素遺伝子を
提供するものである。さらに、上記のGalNAcα2,6-シア
ル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクター、およびそ
の一態様であるプラスミドλ CEB-3034 、上記組み換え
ベクターにより形質転換された形質転換体、並びに、配
列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の233-566 に
より特定されるGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素活性ドメ
インも提供される。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive efforts to achieve the above-mentioned object, and obtained GalNAcα2,6-
Cloning cDNA encoding sialyltransferase,
The present invention has been completed. That is, the present invention is specified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1. Further, the present invention relates to a GalNAcα2,6-sialyltransferase gene encoding the amino acid sequence of the above GalNAcα2,6-sialyltransferase, and a nucleic acid No. 1 represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing which is one embodiment thereof. The present invention provides a GalNAcα2,6-sialyltransferase gene having the nucleotide sequence specified by Nos. To 1698. Furthermore, a recombinant vector containing the above GalNAcα2,6-sialyltransferase gene, a plasmid λ CEB-3034 which is one embodiment thereof, a transformant transformed with the recombinant vector, and SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Also provided is a GalNAcα2,6-sialyltransferase active domain specified by 233-566 of the amino acid sequence shown in.

【０００７】さらに本発明により、上記のGalNAcα2,6-
シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部
分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であ
って、GalNAcα2,6-シアル酸転移を触媒する蛋白、およ
びその一態様として配列表の配列番号２に示されるアミ
ノ酸配列により特定される蛋白 SB-690 が提供される。
また、上記蛋白をコードする遺伝子、およびその一態様
として配列表の配列番号２に示される核酸番号１から10
65で示される塩基配列を有する遺伝子、ならびに上記遺
伝子を含む組み換えベクター、およびその一態様である
プラスミド pcDSB-690が提供される。さらに、上記の組
み換えベクターにより形質転換された形質転換体、およ
び上記形質転換体を培養し、培養物から上記の蛋白を採
取することを特徴とする、上記GalNAcα2,6-シアル酸転
移を触媒する蛋白の製造方法も提供される。Further, according to the present invention, the above GalNAcα2,6-
An extracellular secretory protein containing a polypeptide portion, which is an active domain of sialyltransferase, and a signal peptide, which catalyzes GalNAcα2,6-sialyltransferase, and as an embodiment thereof, SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Provided is a protein SB-690 specified by the amino acid sequence shown in SEQ.
Further, a gene encoding the above protein, and as one embodiment thereof, nucleic acids 1 to 10 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
A gene having the nucleotide sequence represented by 65, a recombinant vector containing the gene, and a plasmid pcDSB-690 as one embodiment thereof are provided. Further, the transformant transformed by the recombinant vector, and culturing the transformant, characterized in that the protein is collected from the culture, catalyzes the GalNAcα2,6-sialyl transfer. A method for producing a protein is also provided.

【０００８】本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素の
最も好ましい例としてGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P
-B1 が提供される。以下、本明細書において本発明の酵
素の一例としてGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 に
ついて詳細に説明するが、、本発明のGalNAcα2,6-シア
ル酸転移酵素はGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1に
限定されることはなく、本発明により始めて明らかにさ
れたGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素P-B1の活性ドメイ
ン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を改変ないし修飾
したGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素活性ドメインを有す
るGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素は、すべて本発明の範
囲に包含されることを理解すべきである。このような活
性ドメインの好ましい例としては、配列表の配列番号１
に開示したアミノ酸配列の233-566 により特定されるGa
lNAcα2,6-シアル酸転移酵素活性ドメインを挙げること
ができる。The most preferred example of the GalNAcα2,6-sialyltransferase of the present invention is GalNAcα2,6-sialyltransferase P
-B1 is provided. Hereinafter, GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 will be described in detail as an example of the enzyme of the present invention, but the GalNAcα2,6-sialyltransferase of the present invention is GalNAcα2,6-sialic acid. Not limited to the transferase P-B1, GalNAcα2, the active domain of the 6-sialyltransferase P-B1 revealed for the first time according to the present invention, or a modified or modified GalNAcα2, part of the amino acid sequence of the amino acid sequence thereof. It is to be understood that all GalNAcα2,6-sialyltransferases having a 6-sialyltransferase active domain are included within the scope of the present invention. Preferred examples of such an active domain include SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Ga specified by 233-566 of the amino acid sequence disclosed in
Examples include the lNAcα2,6-sialyltransferase active domain.

【０００９】例えば、GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P
-B1 をコードするcDNAの単離する方法は以下の実施例に
詳細に説明されている。もっとも、GalNAcα2,6-シアル
酸転移酵素 P-B1 をコードするcDNAの単離方法はこれら
の方法に限定されることはなく、当業者は下記の実施例
に記載された方法を参照しつつ、この方法を適宜修飾な
いし変更することにより、容易に目的のcDNAを単離する
ことができる。また、下記配列表の配列番号１に記載さ
れたGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 をコードする
DNA は本発明の好ましい一態様であるが、本発明のGalN
Acα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 をコードするDNA はこ
の特定の態様に限定されることはなく、本発明により明
らかにされたGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 のア
ミノ酸配列をコードするDNA はすべて本発明に包含され
る。For example, GalNAcα2,6-sialyltransferase P
Methods for isolating the cDNA encoding -B1 are described in detail in the Examples below. However, the method for isolating the cDNA encoding GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 is not limited to these methods, and those skilled in the art can refer to the methods described in the following Examples, By appropriately modifying or changing this method, the desired cDNA can be easily isolated. It encodes GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 described in SEQ ID NO: 1 in the following sequence listing.
Although DNA is a preferred embodiment of the present invention, the GalN
The DNA encoding Acα2,6-sialyltransferase P-B1 is not limited to this specific embodiment, and the amino acid sequence of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 disclosed by the present invention is All encoding DNAs are encompassed by the present invention.

【００１０】さらに、GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素P-
B1の活性ドメイン、あるいはそのアミノ酸配列の一部を
改変ないし修飾したGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素活性
ドメインをコードするDNA も本発明の範囲に包含され
る。例えば、配列表の配列番号１に開示したアミノ酸配
列の233-566 により特定されるGalNAcα2,6-シアル酸転
移酵素活性ドメインをコードするDNA は本発明の好まし
い態様である。また、配列表の配列番号１に開示した核
酸配列の699-1698により特定されるDNA は本発明の特に
好ましい態様である。Furthermore, GalNAcα2,6-sialyltransferase P-
DNAs encoding GalNAcα2,6-sialyltransferase active domains in which the active domain of B1 or a part of the amino acid sequence thereof has been modified or modified are also included in the scope of the present invention. For example, a DNA encoding the GalNAcα2,6-sialyltransferase active domain identified by 233-566 of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing is a preferred embodiment of the present invention. The DNA specified by 699-1698 of the nucleic acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is a particularly preferred embodiment of the present invention.

【００１１】本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P
-B1 は、発現後に細胞内に留まり、細胞外に分泌されな
いことがある。また、細胞内濃度が一定以上になると、
酵素の発現量が低下するという可能性がある。上記のGa
lNAcα2,6-シアル酸転移酵素P-B1 のGalNAcα2,6-シア
ル酸転移活性を有効に利用するためには、本酵素の活性
を維持し、かつ発現時に細胞から分泌される可溶性形態
の蛋白を製造することができる。このような蛋白として
は、上記のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の活性
に関与するGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素活性ドメイン
であるポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細
胞外分泌型の蛋白であって、GalNAcα2,6-シアル酸転移
を触媒する蛋白を挙げることができる。The GalNAcα2,6-sialyltransferase P of the present invention
-B1 may remain in cells after expression and may not be secreted extracellularly. Also, when the intracellular concentration exceeds a certain level,
It is possible that the expression level of the enzyme is reduced. Ga above
In order to effectively utilize the GalNAcα2,6-sialyltransferase activity of lNAcα2,6-sialyltransferase P-B1, a soluble form of the protein that is secreted from cells during expression must be maintained while maintaining the activity of the enzyme. Can be manufactured. Examples of such a protein include an extracellular secretory type containing a signal peptide and a polypeptide portion which is a GalNAcα2,6-sialyltransferase active domain involved in the activity of the above GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1. Proteins that catalyze the transfer of GalNAcα2,6-sialyl acid can be mentioned.

【００１２】これまでにクローニングされたシアル酸転
移酵素は、他のグリコシル−トランスフェラーゼと同様
のドメイン構造を有している。すなわち、NH₂ 末端の短
い細胞質中尾部、疎水性のシグナルアンカードメイン、
蛋白分解感受性を有するステム(stem)領域、及び COOH-
末端の大きな活性ドメインを有する(Paulson, J.C. and
Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1
989)。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の
経膜ドメインの位置を調べるためには、カイト及びドゥ
ーリトル（Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. Mol. Bi
ol., 157, 105-132, 1982)の方法に従って作成した疎水
性分布図を利用することができる。また、活性ドメイン
部分の推定には、各種のフラグメントを導入した組換え
プラスミドを作成して利用することができる。このよう
な方法の一例は本明細書の実施例に詳細に記載されてい
るが、経膜ドメインの位置の確認や活性ドメイン部分の
推定方法は、この方法に限定されることはない。The sialyltransferase cloned so far has the same domain structure as other glycosyl-transferases. That is, a short cytoplasmic middle tail at the NH ₂ terminus, a hydrophobic signal anchor domain,
Proteolytically sensitive stem region, and COOH-
It has a large active domain at the end (Paulson, JC and
Colley, KJ, J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1
989). In order to determine the location of the transmembrane domain of the GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention, kites and Doolittle (Kyte, J. and Doolittle, RF, J. Mol. Bi)
, 157, 105-132, 1982) can be used. For estimating the active domain portion, a recombinant plasmid into which various fragments have been introduced can be prepared and used. An example of such a method is described in detail in the examples of the present specification, but the method of confirming the location of the transmembrane domain and estimating the active domain portion is not limited to this method.

【００１３】GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の活
性ドメインであるポリペプチド部分とシグナルペプチド
とを含む細胞外分泌型の蛋白の製造のためには、例えば
シグナルペプチドとして免疫グロブリンシグナルペプチ
ド配列を用い、GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の
活性ドメインに対応する配列を該シグナルペプチドにイ
ンフレーム融合させればよい。このような方法として
は、例えば、ジョブリンの方法(Jobling, S.A. and Geh
rke, L., Nature(Lond.), 325, 622-625, 1987)を利用
することができ、本明細書の実施例には、その具体的方
法が詳細に説明されている。もっとも、シグナルペプチ
ドの種類やシグナルペプチドと活性ドメインの結合方法
は上記方法に限定されることはなく、当業者は、GalNAc
α2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の活性ドメインであるポ
リペプチド部分を適宜選択することができるし、それら
を利用可能な任意のシグナルペプチドと適宜の方法によ
り結合することにより細胞外分泌型の蛋白を製造するこ
とができる。In order to produce an extracellular secretory protein containing a polypeptide portion which is the active domain of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 and a signal peptide, for example, an immunoglobulin signal peptide sequence is used as a signal peptide. The sequence corresponding to the active domain of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 may be fused in-frame to the signal peptide. As such a method, for example, the method of Jobrin (Jobling, SA and Geh
rke, L., Nature (Lond.), 325, 622-625, 1987), and the specific method is described in detail in the examples of the present specification. However, the type of signal peptide and the method of binding the signal peptide to the active domain are not limited to the above methods, and those skilled in the art
The polypeptide portion that is the active domain of α2,6-sialyltransferase P-B1 can be appropriately selected, and extracellular secretory type is obtained by binding them to any available signal peptide by an appropriate method. Protein can be produced.

【００１４】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるこ
とはない。Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.

【実施例】GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 のcDNA
クローンを得るために、２個の縮重オリゴヌクレオチド
（ST-107及びST-205) によるPCR を、鋳型としてニワト
リ胚 cDNA を用いて行った。約 150bpの望ましいサイズ
のフラグメントを得た。PCR 組換産物の中で、CEB1と呼
ばれるクローンは、Gal β4GlcNAc-α6STRL(180 -225残
基）、Gal β3(4)GlcNAc- α3STRL(158-203 残基）及び
Gal β3GalNAc-α3STPS(144-189 残基）の既知のシアリ
ルモチーフとは異なる独特のアミノ酸配列を有してい
た。CEB1のシアリルモチーフであるGal β4GlcNAc-α6S
TRL 、Gal β3(4)GlcNAc- α3STRL 及びGal β3GalNAc-
α3STPS とCEB1の相同性は、それぞれ 56%、58% 及び 6
0%であった。[Example] cDNA of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1
To obtain clones, PCR with two degenerate oligonucleotides (ST-107 and ST-205) was performed using chicken embryo cDNA as template. A fragment of the desired size of about 150 bp was obtained. Among the PCR recombination products, clones called CEB1 were Gal β4GlcNAc-α6STRL (180-225 residues), Gal β3 (4) GlcNAc-α3STRL (158-203 residues) and
Gal β3GalNAc-α3STPS (144-189 residues) had a unique amino acid sequence different from the known sialyl motif. Gal β4GlcNAc-α6S, a sialyl motif of CEB1
TRL, Gal β3 (4) GlcNAc- α3STRL and Gal β3GalNAc-
The homology between α3STPS and CEB1 was 56%, 58% and 6%, respectively.
0%.

【００１５】CEB1からの cDNA インサートを用いての６
日齢ニワトリ胚 cDNA ライブラリーのスクリーニングを
行い、いくつかの cDNA クローンを同定した。そのうち
クローンλCEB-3043は 2.7 kb インサートを含んでいた
（図１）。別のオーバーラッピングクローンを得るため
に、ランダムプライムド cDNA ライブラリーをλCEB-30
43の 5´- 末端の 0.8 kb EcoRI-BglII フラグメントと
ハイブリダイゼーションすることにより再スクリーニン
グを行った。この cDNA ライブラリーから15個のクロー
ンが単離された。そのうちのクローンλCEBHADはクロー
ンλCEB-3043の5´- 末端と 160 bp に渡ってオーバー
ラップする 220 bp インサートを含んでいた。6 using cDNA insert from CEB1
A day-old chicken embryo cDNA library was screened and several cDNA clones were identified. Among them, clone λCEB-3043 contained a 2.7 kb insert (Figure 1). In order to obtain another overlapping clone, random primed cDNA library was added to λCEB-30.
Rescreening was performed by hybridization to 43 5'-terminal 0.8 kb EcoRI-BglII fragments. Fifteen clones were isolated from this cDNA library. Clone λCEBHAD contained a 220 bp insert overlapping 160 bp with the 5'-end of clone λCEB-3043.

【００１６】これらの２個の cDNA を結合したものは、
ヌクレオチド 1699 の TGA停止コドンで終わる 1.7 kb
のオープン・リーディング・フレームを含むものであっ
た。ポリ(A) から 23 ヌクレオチド上流にあるポリアデ
ニル化シグナル(AATAAA)は 3´末端に存在している。こ
のオープン・リーディング・フレームの翻訳により、通
常の開始配列を持つヌクレオチド１のメチオニン残基(K
ozak, M., Nature(Lond.), 308, 241-246, 1984)で開始
し、分子量 64,781 の 566アミノ酸から成る蛋白である
本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 （P-B1と
呼ぶ）が発現する。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移
酵素をコードする遺伝子を含む cDNA 、本発明のGalNAc
α2,6-シアル酸転移酵素をコードする遺伝子であるλCE
B-3043の塩基配列、および本発明のGalNAcα2,6-シアル
酸転移酵素 P-B1 のアミノ酸配列を配列表の配列番号１
に示す。The combination of these two cDNAs is
1.7 kb ending with TGA stop codon at nucleotide 1699
It included an open reading frame. A polyadenylation signal (AATAAA), 23 nucleotides upstream from poly (A), is located at the 3 'end. Translation of this open reading frame results in a methionine residue at nucleotide 1 (K
ozak, M., Nature (Lond.), 308, 241-246, 1984) and a GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 (P-B1) of the present invention, which is a protein consisting of 566 amino acids with a molecular weight of 64,781. B1) is expressed. CDNA containing a gene encoding GalNAcα2,6-sialyltransferase of the present invention, GalNAc of the present invention
λCE, a gene encoding α2,6-sialyltransferase
The nucleotide sequence of B-3043 and the amino acid sequence of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention are shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
Shown in

【００１７】ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR) PCR はGal β4GlcNAc-α6STRL(Weinstein, J. et al.,
J. Biol. Chem., 262,17735-17743, 1987) 、Gal β4Gl
cNAc-α6STHP(Grundmann, U. et al., Nucleic Acids R
es., 18, 667, 1990)、及びGal β3GalNAc-α3STPS(Gil
lespie, W. etal., J. Biol. Chem., 267, 21004-2101
0, 1992) 中の保存領域に由来する縮重プライマー[5´
プライマー ST107 :TGGGCCTTGGII(A/C)AGGTGTGCTGTTG及
び 3´プライマー ST205 :AGGCGAATGGTAGTTTTTG(A/T)GC
CCACATC]を用いて行った。cDNAを得るために、３日齢の
ニワトリ胚からの poly(A)リッチRNA (2μg)を、オリゴ
-dT プライマー（ファルマシア社）；dATP、dCTP、dGTP
及びdTTPをそれぞれ 1 mM；並びに2 U/μl のRNase 阻
害剤（プロメガ社）と共に、50μl の 10 mM Tris-HCl
(pH8.3)、50 mM KCl 、1.5 mM MgCl₂及び 0.001% ゼラ
チン中、０℃で 10 分間インキュベートした後、100 μ
U のモロニー・ネズミ白血病ウィルス逆転写酵素(BRL)
を加えてさらに42℃で60分間インキュベートした。Polymerase chain reaction (PCR) PCR is performed using Gal β4GlcNAc-α6STRL (Weinstein, J. et al.,
J. Biol. Chem., 262,17735-17743, 1987), Gal β4Gl
cNAc-α6STHP (Grundmann, U. et al., Nucleic Acids R
es., 18, 667, 1990), and Gal β3GalNAc-α3STPS (Gil
lespie, W. etal., J. Biol. Chem., 267, 21004-2101
0, 1992) degenerate primer [5 ′
Primer ST107: TGGGCCTTGGII (A / C) AGGTGTGCTGTTG and 3 ′ primer ST205: AGGCGAATGGTAGTTTTTG (A / T) GC
CCACATC]. To obtain cDNA, poly (A) -rich RNA (2 μg) from 3-day-old chick embryos was
-dT primer (Pharmacia); dATP, dCTP, dGTP
And dTTP together with 1 mM; and 2 U / μl RNase inhibitor (Promega) together with 50 μl of 10 mM Tris-HCl
(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ and 0.001% gelatin.
U Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (BRL)
And further incubated at 42 ° C. for 60 minutes.

【００１８】上記の反応液を94℃で３分間加熱した後、
0.2μg の poly(A)リッチRNA から製造したcDNAを、50
μl 中に10 mM Tris-HCl(pH8.3) 、50 mM KCl 、1.25 m
M MgCl₂ 、 0.001% ゼラチン、dATP、dCTP、dGTP及びdT
TPをそれぞれ 200μM 、TaqDNA ポリメラーゼ（プロメ
ガ社）を 2U 、並びに 40 pmole の各 PCRプライマーを
含む混合液中における PCR実験に用いた。35サイクルの
PCR増幅を行い、各サイクルは、96℃、45秒間の熱変
性；50℃、60秒間のアニーリング；及び72℃、60秒間の
伸長とした。 PCR生成物を 3% アガロースゲルで展開
し、150bp に相当する DNAフラグメントをゲルから溶出
し（キアエックス・キット、キアゲン社）、平滑末端化
し、キナーゼ処理した後、pUC119のSmaI部位の中にサブ
クローニングし、最終的に配列決定した。After heating the above reaction solution at 94 ° C. for 3 minutes,
CDNA prepared from 0.2 μg poly (A) -rich RNA was
10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.25 m in μl
M MgCl ₂ , 0.001% gelatin, dATP, dCTP, dGTP and dT
TP was used for PCR experiments in a mixture containing 200 μM each, Taq DNA polymerase (Promega) 2 U, and 40 pmole of each PCR primer. 35 cycles
PCR amplification was performed, each cycle consisting of heat denaturation at 96 ° C. for 45 seconds; annealing at 50 ° C. for 60 seconds; and extension at 72 ° C. for 60 seconds. The PCR product was run on a 3% agarose gel and the DNA fragment corresponding to 150 bp was eluted from the gel (QIAX Kit, Qiagen), blunt-ended, kinased, and subcloned into the SmaI site of pUC119. And finally sequenced.

【００１９】cDNAライブラリーの作成 全RNA をグアニジニウムチオシアネート法: 及びそれに
続く 5.7 M CsCl 溶液中における遠心により、ニワトリ
胚（６日齢）から調製した(Sambrook, J., Molecular C
loning: a Laboratory Mannual, 2nd edition, Cold Sp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1
989)。 poly(A)リッチRNA はオリゴテックス-dT30 （宝
酒造）で精製し、オリゴ-dT プライマー及びランダムプ
ライマーにλZAPII （ストラタジーン社）及び cDNA 合
成キット（ファルマシア社）を用いたcDNAライブラリー
の作成に使用した。Construction of cDNA Library Total RNA was prepared from chick embryos (6 days old) by the guanidinium thiocyanate method: followed by centrifugation in 5.7 M CsCl solution (Sambrook, J., Molecular C
loning: a Laboratory Mannual, 2nd edition, Cold Sp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1
989). Poly (A) -rich RNA is purified by Oligotex-dT30 (Takara Shuzo) and used to create a cDNA library using λZAPII (Stratagene) and cDNA synthesis kit (Pharmacia) as oligo-dT primers and random primers. did.

【００２０】cDNAライブラリーのスクリーニング 増幅されたcDNAライブラリー（1x10⁶ プラーク）をニワ
トリ胚 PCRフラグメントでスクリーニングした。プラー
クを移したフィルターを、5 ×SSC 、0.2% SDS、5 ×デ
ンハルド溶液及び 10 μg/ml変性サケ***DNA 中で ³²P
- 放射性ラベル化DNA プローブと65℃で12時間にわたり
ハイブリダイズさせた。その後、2 ×SSC 、0.1% SDS中
で65℃、20分で二回洗浄した。単離されたファージクロ
ーンからプラスミドを得るために、ファージミドレスキ
ューをλZAPII クローニングキットの製造元（ストラタ
ジーン社）の使用説明書に従って行った。cDNAインサー
トはBluescriptプラスミドとして直接切り取った。プラ
スミドの作成はサムブルックら（Sambrook, J. et al.,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd editi
on, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Har
bor, N.Y., 1989)によって述べられている分子クローニ
ング標準法を用いた。Screening of cDNA Library The amplified cDNA library (1 × 10 ⁶ plaques) was screened with the chicken embryo PCR fragment. The filters were transferred plaques, 5 × SSC, 0.2% SDS , 5 × Denharudo solution and 10 [mu] g / ml denatured salmon sperm DNA ³² P
-Hybridized with radiolabeled DNA probe at 65 ° C for 12 hours. Thereafter, the plate was washed twice in 2 × SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 20 minutes. To obtain plasmids from the isolated phage clones, phage midless rescue was performed according to the manufacturer's instructions for the λZAPII cloning kit (Stratagene). The cDNA insert was cut directly as a Bluescript plasmid. The construction of the plasmid was performed according to Sambrook, J. et al.,
Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd editi
on, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Har
bor, NY, 1989).

【００２１】DNA 配列分析 上記のインサートのDNA 配列を、T7-DNAポリメラーゼの
鋳型として一本鎖DNAを用いるジデオキシ鎖停止法(Sang
er, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 546
3-5467, 1977)により決定した。シーケンシング反応及
び電気泳動はオートリードDNA シーケンシングキット及
びDNA シーケンサー（ファルマシア社）を用いて行っ
た。一本鎖DNA は、ヘルパーファージR408（ストラタジ
ーン社）で重複感染させた後に大腸菌XL-Blue （ストラ
タジーン社）から調製した。配列データは PC/Gene（テ
イジンシステムテクノロジー社）を用いたコンピュータ
ーで分析した。DNA Sequence Analysis The DNA sequence of the above insert was converted to a dideoxy chain termination method (Sang
er, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 546.
3-5467, 1977). Sequencing reaction and electrophoresis were performed using an auto-read DNA sequencing kit and a DNA sequencer (Pharmacia). Single-stranded DNA was prepared from E. coli XL-Blue (Stratagene) after superinfection with helper phage R408 (Stratagene). Sequence data was analyzed with a computer using PC / Gene (Teijin System Technology).

【００２２】ノーザン及びサザンブロッティング 遺伝子の存在を確認するために、ニワトリゲノム DNAの
サザン・ブロット分析を行った。λCEB-201 の EcoRI c
DNA インサートとのハイブリダイゼーションを行い、 E
coRI及び BamHIで切断した DNAでは単一のバンド、Hind
III 及び SacIで切断した DNAでは２バンドが得られ
た。この単純なハイブリダイゼーションパターンによれ
ば、クローニングされた cDNA が単一コピー遺伝子であ
ることが明らかである。実験の詳細は以下のとおりであ
る。To confirm the presence of Northern and Southern blotting genes, Southern blot analysis of chicken genomic DNA was performed. EcoRI c of λCEB-201
Perform hybridization with the DNA insert,
A single band, Hind, for DNA cut with coRI and BamHI.
Two bands were obtained with DNA digested with III and SacI. From this simple hybridization pattern, it is clear that the cloned cDNA is a single copy gene. The details of the experiment are as follows.

【００２３】また、胚発生過程における転写パターンを
調べるために、ノーザンブロットハイブリダイゼーショ
ンを行った。6, 8, および10日齢のニワトリ胚由来ＲＮ
Ａを分析したところ、3.0 および 2.2 Kb の２種のＲＮ
Ａが検出された。3.0 Kb転写が優勢であり、胚発生の全
期間において常に発現していた。低レベルの2.2 Kb転写
が６日齢の胚に検出されたが、８および10日齢の胚から
は消失していた。ニワトリの脳、心臓、肝臓、胚、腎
臓、及び精巣から得た10μg のポリＡリッチＲＮＡを用
いて遺伝子発現を分析したところ、極めて低レベルの
3.0および4.0 Kbの転写が精巣に検出されたが、他の組
織からはほとんど検出されなかった。各実験の詳細は以
下のとおりである。Further, Northern blot hybridization was performed to examine the transcription pattern during the embryonic development process. 6, 8, and 10-day-old chick embryo-derived RN
Analysis of A revealed that two RNs of 3.0 and 2.2 Kb
A was detected. The 3.0 Kb transcript was predominant and was always expressed during the entire embryonic development. Low levels of 2.2 Kb transcript were detected in 6-day-old embryos, but were absent from 8 and 10-day-old embryos. Analysis of gene expression using 10 μg of poly A-rich RNA from chicken brain, heart, liver, embryo, kidney, and testis showed very low levels.
Transcripts of 3.0 and 4.0 Kb were detected in testis, but hardly detected in other tissues. The details of each experiment are as follows.

【００２４】ノーザンブロット用に、ニワトリ胚からの
変性 poly(A)リッチRNA 5 μg をホルムアルデヒド−ア
ガロースゲル上でサイズ分画化した後、ハイボンド N+
ナイロンメンブレン（アマシャム社）上にブロッティン
グさせた。サザンブロット用には、ニワトリ胚から調製
した 7.5μg のゲノムDNA を制限酵素EcoRI 、BamHI、H
indIII 及びSacIで切断し、0.6% アガロースゲル上で
サイズ分画化した。電気泳動の後、ゲルを 0.5 N NaOH
及び 1.5 M NaCl 中で変性（30分間）させた後、0.5 M
Tris-HCl(pH7.5) 及び 1.5 M NaCl 中で中性化し（30分
間）、DNA をハイボンド N+ ナイロンメンブレン上に移
した。ノーザン及びサザンフィルターは両方とも 50%ホ
ルムアミド、5 ×SSC 、5 ×デンハルド溶液、0.5% SDS
及び 10μg/ml変性サケ***DNA 中で37℃、１時間にわ
たりプレハイブリダイズさせた後に、プレハイブリダイ
ゼーションと同じ条件で12時間、³²P-放射性ラベル化DN
Aプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして
は、マルチプライムラベリングシステム（アマシャム
社）でラベルしたλCEB201である 0.6kb EcoRI cDNA イ
ンサートを用いた。フィルターを2 ×SSC 及び0.1% SDS
中で65℃、10分で二回洗浄し、次いで0.2 ×SSC 及び0.
1% SDS中で65℃、30分で二回洗浄した後、-70 ℃で約一
日間、コダックXAR フィルムに感光させた。For Northern blotting, 5 μg of denatured poly (A) -rich RNA from chick embryos was subjected to size fractionation on formaldehyde-agarose gel, followed by Hybond N +
It was blotted on a nylon membrane (Amersham). For Southern blots, 7.5 μg of genomic DNA prepared from chicken embryos was digested with restriction enzymes EcoRI, BamHI, H
Cleavage with indIII and SacI and size fractionation on a 0.6% agarose gel. After electrophoresis, run the gel with 0.5 N NaOH
And denaturation in 1.5 M NaCl (30 min)
Neutralized in Tris-HCl (pH 7.5) and 1.5 M NaCl (30 min), the DNA was transferred onto a Hybond N + nylon membrane. Both Northern and Southern filters are 50% formamide, 5x SSC, 5x Denhard solution, 0.5% SDS
And 10 μg / ml denatured salmon sperm DNA, prehybridized at 37 ° C. for 1 hour, and then ³² P-radiolabeled DN under the same conditions as prehybridization for 12 hours.
Hybridized with the A probe. As a probe, a 0.6 kb EcoRI cDNA insert, λCEB201, labeled with a multi-prime labeling system (Amersham) was used. Filter with 2 x SSC and 0.1% SDS
Wash twice at 65 ° C. for 10 minutes in 0.2 × SSC and 0.
After washing twice in 1% SDS at 65 ° C. for 30 minutes, Kodak XAR film was exposed at −70 ° C. for about one day.

【００２５】上記のとおり解明された本発明のシアル酸
転移酵素 P-B1 のアミノ酸配列は、従来公知のシアル酸
転移酵素のアミノ酸配列には観察されない以下の特徴を
示するものである。 (i) 従来クローニングされたシアル酸転移酵素は全てII
型膜蛋白であり、それらは他のグリコシル−トランスフ
ェラーゼと同様のドメイン構造を有する。すなわち、NH
₂ 末端の短い細胞質中尾部、疎水性のシグナルアンカー
ドメイン、蛋白分解感受性を有するステム領域、及び C
OOH-末端の大きな活性ドメインを有している。一方、本
発明のシアル酸転移酵素 P-B1 は、大きなステム領域
（または中間領域）を有するものである。The amino acid sequence of the sialyltransferase P-B1 of the present invention elucidated as described above has the following characteristics which are not observed in the amino acid sequence of a conventionally known sialyltransferase. (i) All sialyltransferases that have been previously cloned are II
Type membrane proteins, which have a domain structure similar to other glycosyl-transferases. That is, NH
_Two- terminal short middle cytoplasmic tail, hydrophobic signal anchor domain, proteolytically sensitive stem region, and C
It has a large active domain at the OOH-terminus. On the other hand, the sialyltransferase P-B1 of the present invention has a large stem region (or an intermediate region).

【００２６】(ii)本発明のシアル酸転移酵素 P-B1 は、
PEST領域(233-258残基）を有している。細胞内半減期が
２時間未満の蛋白のアミノ酸配列は、プロリン、グルタ
ミン酸、セリン、及びスレオニン残基が多い領域（PEST
と呼ばれる: Rogers, S. et al., Science, 234, 364-3
68, 1986) を１個以上含むことが知られている。これら
のPEST領域は、一般にプラスの電荷を持つ数個のアミノ
酸を含む集団を側面に擁している。従来公知のシアル酸
転移酵素はこの領域を有していない。 (iii) ８アミノ酸(SSSXVSTC)から成る領域が２カ所、24
7-254 残基及び 330-337残基に見出された。他の蛋白の
ジーンバンクデータベースの検索からこの配列に類似す
る配列は明らかにされなかった。(Ii) The sialyltransferase P-B1 of the present invention comprises:
It has a PEST region (residues 233-258). The amino acid sequence of a protein having an intracellular half-life of less than 2 hours has a region containing many proline, glutamic acid, serine, and threonine residues (PEST
Called: Rogers, S. et al., Science, 234, 364-3
68, 1986). These PEST regions generally flank a population containing several positively charged amino acids. Conventionally known sialyltransferases do not have this region. (iii) Two regions consisting of 8 amino acids (SSSXVSTC), 24
Found at residues 7-254 and 330-337. Searches of the Genebank database for other proteins did not reveal sequences similar to this sequence.

【００２７】従来公知のシアル酸転移酵素は、驚くほど
組織特異的発現を示すものであったが、これは細胞型特
異的糖鎖構造の存在に相関しているものと考えられてい
る(Paulson, J.C. and Colley, K.J., J. Biol. Chem.,
264, 17615-17618, 1989)。上記のノーザン・ブロッテ
ィングの結果によれば、シアル酸転移酵素 P-B1 の mRN
A の発現パターンが変化することが明らかである。シア
ル酸転移酵素 P-B1 の遺伝子から３種の異なるサイズの
mRNA (4.0 、3.0 及び 2.2 kb)が転写されることは、そ
れらがGal β1,4GlcNAc-α2,6-シアル酸転移酵素（Gal
β4GlcNAc-α6STRL)及びGal β1,3(4)GlcNAcα2,3-シア
ル酸転移酵素（Gal β3(4)GlcNAc- α3STRL)(Weinstei
n, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 19
87; および Wen, D.X. et al., J. Biol. Chem., 267,
21011-21019, 1992)に観察されたような、選択的スプ
ライシングメカニズム及び選択的プロモーター利用メカ
ニズムを通じて発現されることを示唆している。このこ
とは、シアル酸転移酵素 P-B1 に対しては単一コピーの
遺伝子しか存在しないことがサザン・ハイブリダイゼー
ションにより示されていることからも明らかである。Previously known sialyltransferases showed surprisingly tissue-specific expression, which is thought to correlate with the presence of cell type-specific sugar chain structures (Paulson , JC and Colley, KJ, J. Biol. Chem.,
264, 17615-17618, 1989). According to the results of Northern blotting described above, the mRN of sialyltransferase P-B1
It is clear that the expression pattern of A changes. Three different sizes of sialyltransferase P-B1 genes
Transcription of mRNA (4.0, 3.0 and 2.2 kb) indicates that they are Gal β1,4GlcNAc-α2,6-sialyltransferase ( Gal
β4GlcNAc-α6STRL) and Gal β1,3 (4) GlcNAcα2,3-sialyltransferase ( Gal β3 (4) GlcNAc-α3STRL) (Weinstei
n, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 19
87; and Wen, DX et al., J. Biol. Chem., 267,
21011-21019, 1992), suggesting expression through an alternative splicing mechanism and an alternative promoter utilization mechanism. This is evident from the Southern hybridization showing that only a single copy of the gene exists for sialyltransferase P-B1.

【００２８】本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P
-B1 は、発現後に細胞内に留まり、細胞外に分泌され
ず、また、細胞内濃度が一定以上になると、酵素の発現
が低下する場合がある。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸
転移酵素 P-B1 のGalNAcα2,6-シアル酸転移活性を利用
するため、本酵素の活性を維持し、かつ、発現時に細胞
から分泌される可溶性形態の蛋白 SB-690 を製造した。
本発明の蛋白 SB-690 をコードする遺伝子および本発明
の蛋白 SB-690 のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に
示す。GalNAcα2,6-sialyltransferase P of the present invention
-B1 remains in the cell after expression and is not secreted out of the cell, and when the intracellular concentration exceeds a certain level, the expression of the enzyme may decrease. Since the GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention utilizes the GalNAcα2,6-sialyltransferase activity of P-B1, the soluble form of the protein SB which is maintained in the activity of the enzyme and secreted from cells during expression -690 was manufactured.
The gene encoding the protein SB-690 of the present invention and the amino acid sequence of the protein SB-690 of the present invention are shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.

【００２９】これまでにクローニングされたシアル酸転
移酵素は、他のグリコシル−トランスフェラーゼと同様
のドメイン構造を有している。すなわち、NH₂ 末端の短
い細胞質中尾部、疎水性のシグナルアンカードメイン、
蛋白分解感受性を有するステム(stem)領域、及び COOH-
末端の大きな活性ドメインを有する(Paulson, J.C. and
Colley, K.J., J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1
989)。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素の経膜ド
メインの位置を調べるために、疎水性分布図をカイト及
びドゥーリトル（Kyte, J. and Doolittle, R.F., J. M
ol. Biol., 157, 105-132, 1982)の方法に従って翻訳さ
れた配列から生成した（図２）。この結果、本発明のGa
lNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の疎水性経膜ドメイ
ンはアミノ酸番号17から37の21アミノ酸残基であること
が示唆された。The sialyltransferase cloned so far has the same domain structure as other glycosyl-transferases. That is, a short cytoplasmic middle tail at the NH ₂ terminus, a hydrophobic signal anchor domain,
Proteolytically sensitive stem region, and COOH-
It has a large active domain at the end (Paulson, JC and
Colley, KJ, J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1
989). In order to investigate the location of the transmembrane domain of the GalNAcα2,6-sialyltransferase of the present invention, the hydrophobicity distribution map was determined using the kite and J. and Doolittle, RF, J. M.
ol. Biol., 157, 105-132, 1982) (FIG. 2). As a result, the Ga
It was suggested that the hydrophobic transmembrane domain of lNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 is 21 amino acid residues from amino acids 17 to 37.

【００３０】上記のとおり、GalNAcα2,6-シアル酸転移
酵素の疎水性シグナルアンカードメインはアミノ酸残基
17から37に位置している。鋳型として pSB-BGLを含むイ
ンビトロの翻訳／転写系では蛋白(33 kDa)が合成される
にもかかわらず、pcDSB-BGLでトランスフェクションし
た細胞からの培地は有意の活性を持たないことから、23
3 から269 残基が酵素活性に対して何らかの必須残基を
含むことが明らかであり、活性ドメインは 233-566の周
辺と推定された（図３）。これはクローニングされた他
のシアル酸転移酵素のものに匹敵するサイズである。上
記の活性ドメインを含む可溶性蛋白を作るために、P-B1
の推定活性ドメインに対応する配列を免疫グロブリンシ
グナルペプチド配列にインフレーム融合させた(Joblin
g, S.A. and Gehrke, L., Nature(Lond.), 325, 622-62
5, 1987) 。以下に実験の詳細を示す。As described above, the hydrophobic signal anchor domain of GalNAcα2,6-sialyltransferase is composed of amino acid residues
Located at 17-37. Although the in vitro translation / transcription system containing pSB-BGL as a template synthesizes a protein (33 kDa), the medium from cells transfected with pcDSB-BGL has no significant activity.
It was evident that 3 to 269 residues contained some essential residues for enzyme activity, and the active domain was estimated around 233-566 (FIG. 3). It is of a size comparable to that of other cloned sialyltransferases. To make a soluble protein containing the above active domain, P-B1
The sequence corresponding to the putative active domain was fused in-frame to the immunoglobulin signal peptide sequence (Joblin
g, SA and Gehrke, L., Nature (Lond.), 325, 622-62
5, 1987). The details of the experiment are shown below.

【００３１】ベクタープラスミド pUGS を、pBluescrip
t SK(+) プラスミドの PstI-XhoIフラグメントを 117 b
p の合成DNA フラグメントで置換することにより作成し
た。このフラグメントは、 5´末端に合成PstI部位を持
つ43 bp のアルファルファモザイクウィルス(Jobling,
S.A. and Gehrke, L., Nature(Lond.) 325, 622-625,19
87)の 5´- 非翻訳(untranslated)リーダー配列を含ん
でおり、この配列には3´末端に17 bp の合成EcoRI 、B
glII 及びXhoI クローニング部位を持つマウス免疫グ
ロブリン M重鎖シグナルペプチド配列(57 bp)(Boersch-
Supan, M.E. etal., J. Exp. Med. 161, 1272-1292, 19
85)が続いている。このフラグメントのヌクレオチド配
列は 5´-CTGCAGGGTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCA
CCATGAAATTCAGCTGGGTCATGTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGG
GTCAATTCAGAATTCCAGATCTCGAG-3´である。The vector plasmid pUGS was replaced with pBluescrip
t PSK-XhoI fragment of SK (+) plasmid
It was prepared by substituting the synthetic DNA fragment of p. This fragment is a 43 bp alfalfa mosaic virus with a synthetic PstI site at the 5 'end (Jobling,
SA and Gehrke, L., Nature (Lond.) 325, 622-625,19
87) contains a 5'-untranslated leader sequence, which contains a 17 bp synthetic EcoRI, B
Mouse immunoglobulin M heavy chain signal peptide sequence (57 bp) with glII and XhoI cloning sites (Boersch-
Supan, ME etal., J. Exp. Med. 161, 1272-1292, 19
85) is continued. The nucleotide sequence of this fragment is 5'-CTGCAGGGTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCA
CCATGAAATTCAGCTGGGTCATGTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGG
GTCAATTCAGAATTCCAGATCTCGAG-3 '.

【００３２】本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素を
コードする遺伝子であるλCEB-3043を EcoRVで部分切断
し、1.8 kbのフラグメントを pBluescript SK(+)のEcoR
V 部位にサブクローニングして、pCEB-1800 を生産し
た。このクローンはλCEB-3043の0.8 kbの 3´- 非翻訳
領域を欠くものである。GalNAcα2,6-シアル酸転移酵素
P-B1 の活性ドメインを、 5´- プライマーとしてその
中央部分に合成EcoRI 部位を持つ 5´-AGGGCTGCTGAATTC
ACTGAGCCACAG-3´（ヌクレオチド 679-708）、及び3 ´
ユニバーサル M13シーケンシングプライマー、さらに鋳
型としてpCEB-1800 を用いたPCR によって生産した。こ
のPCR 産物をEcoRI 及びXhoIで切断した後、上記ベクタ
ープラスミドpUGSの EcoRI/XhoI部位に結合させてプラ
スミドpSB-690 を得た。このプラスミドには、λCEB-30
34遺伝子のうちGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1 の
活性ドメインをコードする領域が免疫グロブリンシグナ
ル配列の3 ´末端にインフレーム融合された配列が含ま
れるものである。この融合フラグメントをPstI及びXhoI
で pSB-690から切り取った後、 pcDSRα発現ベクターの
PstI/XhoI部位中に挿入して pcDSB-690を得た。The gene encoding GalNAcα2,6-sialyltransferase of the present invention, λCEB-3043, was partially digested with EcoRV, and the 1.8 kb fragment was digested with EcoRV of pBluescript SK (+).
Subcloning into the V site produced pCEB-1800. This clone lacks the 0.8 kb 3'-untranslated region of λCEB-3043. GalNAcα2,6-sialyltransferase
5'-AGGGCTGCTGAATTC with a synthetic EcoRI site in the center using the active domain of P-B1 as the 5'-primer
ACTGAGCCACAG-3 '(nucleotides 679-708) and 3'
Produced by PCR using universal M13 sequencing primers and pCEB-1800 as template. This PCR product was digested with EcoRI and XhoI, and ligated to the EcoRI / XhoI site of the vector plasmid pUGS to obtain plasmid pSB-690. This plasmid contains λCEB-30
Among the 34 genes, a sequence containing the region encoding the active domain of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 fused in-frame to the 3 ′ end of the immunoglobulin signal sequence is included. This fusion fragment was digested with PstI and XhoI.
After cutting from pSB-690 with pcDSRα expression vector,
Insertion into the PstI / XhoI site yielded pcDSB-690.

【００３３】対照として、GalNAcα2,6-シアル酸転移酵
素 P-B1 の活性ドメインの一部を欠く蛋白であるSB-BGL
を以下のとおり製造した。pCEB-1800 及びpUGSをBglII
で切断し、粘着末端を DNAポリメラーゼのクレノウ(Kle
now)フラグメントを用いて充填した。 DNAポリメラーゼ
のクレノウ(Klenow)フラグメントを熱変性させた（94
℃、20分間）後、これらのプラスミドをXhoIで切断し
た。pCEB-1800 からの 1.0kb フラグメントをゲル精製
し、pUGSの平滑末端を持つBglII/XhoI部位中にサブクロ
ーニングしてプラスミドpSB-BGL を得た。pSB-BGL から
の PstI/XhoIフラグメントを pcDSRαの発現ベクターの
PstI/XhoI部位中でサブクローニングして pcDSB-BGLを
得た。As a control, SB-BGL, a protein lacking a part of the active domain of GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1,
Was produced as follows. pCEB-1800 and pUGS to BglII
And sticky ends to DNA polymerase Klenow (Kle
Now) filled with fragments. The Klenow fragment of DNA polymerase was heat denatured (94
(C, 20 minutes), these plasmids were cut with XhoI. The 1.0 kb fragment from pCEB-1800 was gel purified and subcloned into the blunt-ended BglII / XhoI site of pUGS to yield plasmid pSB-BGL. The PstI / XhoI fragment from pSB-BGL was
Subcloning in the PstI / XhoI site yielded pcDSB-BGL.

【００３４】上記の蛋白の発現は以下のように行った。
COS-7 細胞に DEAE-デキストラン法(McCutchan, J.H. a
nd Pagano, J.S. J. Natl. Cancer Inst. 41, 351-357,
1968)を用いて 5μg のプラスミドDNA によりトランス
フェクションした。48時間のトランスフェクションの
後、培地を回収し、セントリコン30フィルター（アミコ
ン社）を用いて酵素アッセイ用に10倍に濃縮した。代謝
ラベル用に、COS 細胞（60-mm 培養皿）を Met- フリー
の培地（ダルベッコの改良イーグル培地及び 2%ウシ胎
児血清)(GIBCO)で洗浄した後、同じ培地で１時間インキ
ュベートした。細胞を 1.5 ml の Met- フリーの培地中
10 MBq/皿のエクスプレス³⁵S プロテインラベリングミ
ックス（デュポン−ニューイングランドヌクレア社）で
２時間、パルスラベルした。これらの細胞をその後 Met
- フリーの培地で洗浄し、エクスプレスラベルなしの培
地中で５時間チェイスした。分泌された蛋白を含む培地
を回収し、10倍に濃縮した後、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、次いでフルオログラフィーに掛けた。The expression of the above proteins was carried out as follows.
COS-7 cells were treated with the DEAE-dextran method (McCutchan, JH a
nd Pagano, JSJ Natl. Cancer Inst. 41, 351-357,
1968) using 5 μg of plasmid DNA. After 48 hours of transfection, the medium was harvested and concentrated 10-fold using a Centricon 30 filter (Amicon) for enzyme assays. For metabolic labeling, COS cells (60-mm culture dishes) were washed with Met-free medium (Dulbecco's modified Eagle's medium and 2% fetal bovine serum) (GIBCO) and then incubated in the same medium for 1 hour. Cells in 1.5 ml Met-free medium
Pulse labeled with 10 MBq / dish of Express ³⁵ S Protein Labeling Mix (Dupont-New England Nuclear) for 2 hours. These cells are then
-Washed with free medium and chased for 5 hours in medium without express label. The medium containing the secreted protein was collected, concentrated 10-fold, and then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and then to fluorography.

【００３５】発現した蛋白の酵素活性を以下のようにし
て測定した。アクセプターとしてオリゴサッカライド及
びグリコプロテインを用いたアッセイを、総量が10μl
となる 50 mMカコジル酸ナトリウムバッファー、pH 6.
0、50μM CMP-[¹⁴C-]NeuAc (0.9 Bq/pmol) 、1 mg/ml
ウシ血清アルブミン、2 mg/ml アクセプター基質及び 1
μl 濃縮 COS細胞培地の存在下で行い、30℃で２時間イ
ンキュベートした。インキュベート時間終了時に、アッ
セイ混合液 1μl をシリカゲル 60 HPTLC プレート（メ
ルク社、ドイツ）にのせた。このプレートをエタノー
ル：ピリジン：n-ブタノール：水：酢酸（100:10:10:3
0:3) で展開し、放射能活性を BAS2000 ラジオイメー
ジアナライザー（富士写真フィルム製、日本）で可視化
して定量した。原点に残った放射能はシアル化糖蛋白と
見なした。The enzyme activity of the expressed protein was measured as follows. Assays using oligosaccharides and glycoproteins as acceptors in a total volume of 10 μl
50 mM sodium cacodylate buffer, pH 6.
0, 50 μM CMP- [ ¹⁴ C-] NeuAc (0.9 Bq / pmol), 1 mg / ml
Bovine serum albumin, 2 mg / ml acceptor substrate and 1
Performed in the presence of μl concentrated COS cell medium and incubated at 30 ° C. for 2 hours. At the end of the incubation period, 1 μl of the assay mixture was placed on a silica gel 60 HPTLC plate (Merck, Germany). This plate is ethanol: pyridine: n-butanol: water: acetic acid (100: 10: 10: 3
0: 3), and the radioactivity was visualized and quantified using a BAS2000 radio image analyzer (Fuji Photo Film, Japan). Radioactivity remaining at the origin was considered sialylated glycoprotein.

【００３６】シアル化産物の同定は以下のように行っ
た。アシアロ-BSMを pcDSB-690 COS細胞培地中でCMP-[
¹⁴C]NeuAcで再シアル化して還元し、β−除去オリゴサ
ッカライドを製造した。β−除去はカールソンの方法(C
arlson, D.M., J. Biol. Chem.,243, 616-626, 1968)
に従って行った。アシアロ-BSM (各 100μg)を、インキ
ュベーション時間が12時間であることを除き、上記と同
じ条件下で pcDSB-690 COS細胞培地中でCMP-[¹⁴C-]NeuA
c でシアル化した。反応を 0.5 M HCl中 1% リンタング
ステン酸 500μl を加えて停止し、次いで 10,000xg で
５分間遠心した。ペレットを同じリンタングステン酸溶
液で一回洗浄し、さらにメタノールで一回洗浄した後、
0.5 mlの0.05M NaOH及び 1M NaBH₄ 溶液中に溶解し、45
℃で30時間インキュベートした。The sialylated product was identified as follows. Asialo-BSM was added to CMP- [
Re-sialylation and reduction with ¹⁴ C] NeuAc produced β-removed oligosaccharides. β-removal was performed by Carlson's method (C
arlson, DM, J. Biol. Chem., 243, 616-626, 1968)
Was performed according to Asialo-BSM (100 μg each) was treated with CMP- [ ¹⁴ C-] NeuA in pcDSB-690 COS cell medium under the same conditions as above, except that the incubation time was 12 hours.
Sialized with c. The reaction was stopped by adding 500 μl of 1% phosphotungstic acid in 0.5 M HCl and then centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes. After washing the pellet once with the same phosphotungstic acid solution and once with methanol,
It was dissolved in 0.05 M NaOH and 1M NaBH ₄ solution in 0.5 ml, 45
Incubated for 30 hours at ° C.

【００３７】インキュベーション時間の終了時に、この
溶液を酢酸で pH 6 に中和し、凍結乾燥した。この乾燥
産物を 50 μl の水に溶解し、水で平衡化及び溶出する
セファデックス G-15 カラム（0.5 x 5 cm) 上のゲル濾
過によって脱塩した。放射能活性のある分画はそれ以上
精製せずに産物同定用の薄層クロマトグラフィーに付し
た。異なる２種類の展開溶媒を用い、天然 BSMからの N
euAcα2,6GalNAc-オール及びGlcNAcβ1,3 [NeuAcα2,6]
GalNAc- オールと共泳動させた。転移したシアリル残基
の比率は 1:0.9:0.6であった。シアル化GalNAc-SerNAc
を異なる２種類の展開溶媒系において NeuAcα2,6GalNA
c-SerNAcと共泳動させることにより、本発明の蛋白 SB-
690 が、グリコプロテイン中の Ser又は Thr残基に直接
結合している GalNAc に NeuAcα2,6 結合を形成するこ
とが示された。At the end of the incubation period, the solution was neutralized to pH 6 with acetic acid and lyophilized. The dried product was dissolved in 50 μl of water and desalted by gel filtration on a Sephadex G-15 column (0.5 × 5 cm) equilibrating and eluting with water. The radioactive fraction was subjected to thin layer chromatography for product identification without further purification. Using two different developing solvents, N from natural BSM
euAcα2,6GalNAc-ol and GlcNAcβ1,3 [NeuAcα2,6]
Co-electrophoresed with GalNAc-ol. The ratio of transferred sialyl residues was 1: 0.9: 0.6. Sialylated GalNAc-SerNAc
NeuAcα2,6GalNA in two different developing solvent systems
By co-electrophoresis with c-SerNAc, the protein SB-
690 has been shown to form NeuAcα2,6 bonds to GalNAc which is directly linked to Ser or Thr residues in glycoproteins.

【００３８】pcDSB-690 でトランスフェクトされた細胞
を培養した培地にはシアル酸転移酵素活性が検出され、
pcDSB-690により発現される本発明の蛋白 SB-690 がシ
アル酸転移酵素活性を保持しつつ、細胞外に分泌されて
いることが明らになった。一方、cDSB-BGLでトランスフ
ェクトされた細胞を培養した培地からはシアル酸転移酵
素活性が検出されなかった。Sialyltransferase activity was detected in the medium in which cells transfected with pcDSB-690 were cultured.
It was revealed that the protein SB-690 of the present invention expressed by pcDSB-690 was secreted extracellularly while retaining sialyltransferase activity. On the other hand, sialyltransferase activity was not detected in the medium in which cells transfected with cDSB-BGL were cultured.

【００３９】本発明の蛋白 SB-690 の受容体特異性を p
cDSB-690でトランスフェクションされた COS-7細胞培養
濃縮培地で調べた。表１に示すように、アシアロムチ
ン、フェツイン及びアシアロフェツインは良好な受容体
として作用した。注目すべきことに、フェツインはアシ
アロフェツインよりも優れた受容体であることが示され
た(Baubichon-Cortay, H. et al., Carbohydr. Res., 1
49, 209-223, 1986; および Brockhausen, I. et al.,
Biochemistry, 29, 10206-10212, 1990) 。他のグリコ
プロテイン、オリゴサッカライド及びグリコリピッドは
GalNAc-SerNAcを除いて、アクセプターとして作用しな
かった。これらのデータは当アクセプター部位がα−グ
リコシド結合を通じてグリコプロテイン中の Ser又は T
hr残基に直接結合している GalNAc であることを示唆し
ている。The receptor specificity of the protein SB-690 of the present invention
COS-7 cell cultures transfected with cDSB-690 were examined in concentrated culture medium. As shown in Table 1, asialomutin, fetuin and asialofetuin acted as good receptors. Remarkably, fetuin was shown to be a better receptor than asialofetuin (Baubichon-Cortay, H. et al., Carbohydr. Res., 1
49, 209-223, 1986; and Brockhausen, I. et al.,
Biochemistry, 29, 10206-10212, 1990). Other glycoproteins, oligosaccharides and glycolipids
Except for GalNAc-SerNAc, it did not act as an acceptor. These data indicate that the acceptor site may be associated with Ser or T in glycoprotein through α-glycosidic bonds.
This suggests that GalNAc is directly bound to the hr residue.

【００４０】[0040]

【表１】 本発明の蛋白 SB-690 の受容体特異性 ─────────────────────────────────── 受 容 体 pmoles/hr/10μl 培地 ─────────────────────────────────── フェツイン (fetuin) 142 アシアロフェツイン (asialo-fetuin) 96 α1 酸糖蛋白 6 アシアロ- α1 酸糖蛋白 4 ウシ下顎ムチン 15 ウシ下顎アシアロムチン 186 卵ムコイド 7 アシアロ- 卵ムコイド 0 Gal β1,3GlcNAc β1,3Galβ1,4Glc 0 Gal β1,4GlcNAc 0 Gal β1,3GalNAc 0 GalNAcβ1,4Gal 0 Gal β1,4Glc 0 ガラクトース 0 ガングリオシド混合物 0 ガングリオシド GD1a 0 GalNAc-SerNAc 4 ベンジル-GalNAc 2 ─────────────────────────────────── 表中、"0" は 1 pmole/hr/10μl 培地未満であることを
示す。[Table 1] Receptor specificity of protein SB-690 of the present invention ─ Receptor pmoles / hr / 10μl medium ─────────────────────────────────── Fetuin 142 Asialo-fetuin 96 α1 acid glycoprotein 6 asialo-α1 acid glycoprotein 4 bovine mandibular mucin 15 bovine mandibular asialomucin 186 egg mucoid 7 asialo-egg mucoid 0 Gal β1,3GlcNAc β1,3Galβ1,4Glc 0 Gal β1, 4GlcNAc 0 Gal β1,3GalNAc 0 GalNAcβ1,4Gal 0 Gal β1,4Glc 0 Galactose 0 Ganglioside mixture 0 Ganglioside GD1a 0 GalNAc-SerNAc 4 Benzyl-GalNAc 2 ──────────────────中 In the table, "0" indicates less than 1 pmole / hr / 10μl medium.

【００４１】従来クローニングされたシアル酸転移酵素
は Gal- 部分に対してのみアクセプター特異性を示すも
のであった。一方、本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移
酵素P-B1 および本発明の蛋白 SB-690 は、GalNAc- 部
分に対してアクセプター特異性を示すが Gal- 部分に対
してはアクセプター特異性を示さないものである。以下
の知見は、本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B
1 および本発明の蛋白SB-690 が、α2,6-結合を有する
CMP-NeuAcを、グリコプロテインの Thr/SerにO- 結合し
ている GalNAc-残基上に転移させる GalNAc α2,6-シア
ル酸転移酵素活性を有することを示すものである。A conventionally cloned sialyltransferase shows acceptor specificity only for the Gal- moiety. On the other hand, the GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention and the protein SB-690 of the present invention show acceptor specificity for the GalNAc-part, but show acceptor specificity for the Gal-part. Not something. The following findings indicate that GalNAcα2,6-sialyltransferase PB
1 and the protein SB-690 of the present invention have an α2,6-linkage
FIG. 4 shows that Gal-NeuAc has a GalNAc α2,6-sialyltransferase activity of transferring CMP-NeuAc onto a GalNAc-residue O-linked to Thr / Ser of glycoprotein.

【００４２】(i) COS細胞中の pcDSB-690の発現によ
り、Thr/Ser 残基に結合している GalNAc 部分のみに対
するアクセプター特異性が明らかにされた。一方、試験
した他の基質に対しては検出可能な酵素活性は全く見ら
れなかった（表１）。 (ii) ウシ下顎腺アシアロ−ムチン及びGalNAc-SerNAc
から得られたシアル化産物はα2,6 結合を通じてGalNAc
部分に結合しているシアル酸を有することが示された。 ２種類の型、すなわちウシ下顎腺型及び肝臓（脳）型の
GalNAc-α6ST が報告されており、それらは異なるアク
セプター特異性を持つ(Bergh, M.E. et al., J. Biol.
Chem., 258, 7430-7436, 1983)。前者の酵素はGalNAc、
Galβ1,3GalNAc 及び NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc に対
して広範囲の特異性を持つが、後者はグリコプロテイン
の NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc 部分に対してのみ特異性
を持つ。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1
および本発明の蛋白 SB-690 のアクセプター特異性は、
前者の酵素と同様であることを示している。(I) Expression of pcDSB-690 in COS cells revealed acceptor specificity only for the GalNAc portion bound to Thr / Ser residues. On the other hand, no detectable enzyme activity was observed for the other substrates tested (Table 1). (ii) Bovine mandibular asialo-mucin and GalNAc-SerNAc
Sialylated product obtained from GalNAc through α2,6 linkage
It was shown to have sialic acid attached to the moiety. There are two types: bovine mandibular gland type and liver (brain) type
GalNAc-α6ST has been reported and has different acceptor specificities (Bergh, ME et al., J. Biol.
Chem., 258, 7430-7436, 1983). The former enzyme is GalNAc,
It has broad specificity for Galβ1,3GalNAc and NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc, while the latter has specificity only for the NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc portion of glycoprotein. GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention
And the acceptor specificity of the protein SB-690 of the present invention is:
It shows that it is similar to the former enzyme.

【００４３】アシアロムチンのアクセプター部位の検討
から NeuAcα2,6GalNAc-Ser/Thr が最も多い産物である
ことが示された。しかしながら、ウシ下顎腺アシアロム
チン中の糖共役体の比率、すなわち、GalNAc-Ser/Thr、
GlcNAcβ1,3GalNAc-Ser/Thr及び Galβ1,3GalNAc-Ser/T
hr がそれぞれ 65%、25% 及び 5% に当たること(Tsuji,
T. and Osawa, T., Carbohydr. Res., 151, 391-402,
1986)を考慮すると、本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転
移酵素 P-B1 および本発明の蛋白 SB-690 は、以下のア
クセプター優先順位を有するものである： Galβ1,3Gal
NAc-Ser/Thr ＞) GlcNAcβ1,3GalNAc-Ser/Thr ＞ GalNA
c-Ser/Thr 。一方、ほとんど全ての放射能活性が弱アル
カリ処理によって解離し、かつ、フェツインの方がアシ
アロフェツインよりも好ましい（表１）という事実は、
ウシ肝臓 (Bergh, M.E. et al.,J. Biol. Chem., 258,
7430-7436, 1983) 及びラット脳(Baubichon-Cortay, H.
et al., Carbohydr. Res., 149, 209-223, 1986)のGalN
Acα2,6-シアル酸転移酵素について報告されているよう
に、 NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc-Ser/Thr が Galβ1,3G
alNAc-Ser/Thr よりも好ましい基質であることを示して
いる。Examination of the acceptor site of asialomucin showed that NeuAcα2,6GalNAc-Ser / Thr was the most abundant product. However, the ratio of glycoconjugates in bovine mandibular gland asialomucin, i.e., GalNAc-Ser / Thr,
GlcNAcβ1,3GalNAc-Ser / Thr and Galβ1,3GalNAc-Ser / T
hr is 65%, 25% and 5% respectively (Tsuji,
T. and Osawa, T., Carbohydr. Res., 151, 391-402,
1986), the GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the invention and the protein SB-690 of the invention have the following acceptor priority: Galβ1,3Gal
NAc-Ser / Thr>) GlcNAcβ1,3GalNAc-Ser / Thr> GalNA
c-Ser / Thr. On the other hand, the fact that almost all radioactivity is dissociated by weak alkaline treatment, and fetuin is more preferable than asialofetuin (Table 1)
Bovine liver (Bergh, ME et al., J. Biol. Chem., 258,
7430-7436, 1983) and rat brain (Baubichon-Cortay, H.
et al., Carbohydr. Res., 149, 209-223, 1986).
As reported for Acα2,6-sialyltransferase, NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc-Ser / Thr was replaced by Galβ1,3G
This indicates that the substrate is more preferable than alNAc-Ser / Thr.

【００４４】GalNAc-SerNAc のシアル化はアシアロムチ
ン上の対応する残基のシアル化よりもはるかに遅い（表
１）。ブロックハウゼンら(Brockhausen et al., Bioch
emistry, 29, 10206-10212, 1990) によれば、最低５ア
ミノ酸の長さが有効なシンセターゼ活性にとって必要で
ある。本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B1お
よび本発明の蛋白 SB-690 も、ペプチド部分に同様の直
接作用を有するものと思われる（表１）。The sialylation of GalNAc-SerNAc is much slower than the sialylation of the corresponding residue on asialomtin (Table 1). Brockhausen et al., Bioch
emistry, 29, 10206-10212, 1990), a minimum length of 5 amino acids is required for effective synthetase activity. It is likely that the GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 of the present invention and the protein SB-690 of the present invention also have a similar direct action on the peptide portion (Table 1).

【００４５】上記の実験に用いた試薬および試料、なら
びに詳細な実験方法は以下のとおりである。フェツイ
ン、アシアロフェツイン、ウシ下顎腺ムチン、α1-酸グ
リコプロテイン、ガラクトースβ1,4-N-アセチルガラク
トサミン、CMP-NeuAc 、ラクト-N- テトラオース、ベン
ジル-GalNAc 、N-アセチルラクトサミン、及びトライト
ンCF-54 はシグマ社（セント・ルイス、USA)から入手し
た。CMP-[¹⁴C]NeuAc(11GBq/mmole) はアマシャム社(U.
K.)から入手したものである。N-アセチルガラクトサミ
ンβ1,4-ガラクトースは梶本博士（理化学研究所、埼玉
県和光市）より寄贈されたものを用いた。2-アセトアミ
ド、2-デオキシガラクトシルαN-アセチルセリン(GalNA
c-SerNAc) はグランドラー及びシュミット（Grundler
G., and Schmidt R.R., Liebigs Ann. Chem., 1984, 18
26-1847, 1984) の方法によって合成した。The reagents and samples used in the above experiments and the detailed experimental methods are as follows. Fetuin, asialofetuin, bovine mandibular gland mucin, α1-acid glycoprotein, galactose β1,4-N-acetylgalactosamine, CMP-NeuAc, lacto-N-tetraose, benzyl-GalNAc, N-acetyllactosamine, and Triton CF -54 was obtained from Sigma (St. Louis, USA). CMP- [ ¹⁴ C] NeuAc (11 GBq / mmole) was purchased from Amersham (U.S.A.).
K.). N-acetylgalactosamine β1,4-galactose used was donated by Dr. Kajimoto (RIKEN, Wako, Saitama). 2-acetamide, 2-deoxygalactosyl αN-acetylserine (GalNA
c-SerNAc) is Grandler and Schmidt (Grundler
G., and Schmidt RR, Liebigs Ann. Chem., 1984, 18
26-1847, 1984).

【００４６】NeuAc α2,6-GalNAc-SerNAc は NeuAcα2,
6GalNAc-Ser(メクト社) からピリジン−水中で無水酢酸
でアセチル化によって製造した。 NeuAcα2,6GalNAc-オ
ール及びGlcNAcβ1,3 [NeuAcα2,6]GalNAc- オールは辻
および大沢(Tsuji, T. and Osawa T., Carbohydr. Re
s., 151, 391-402, 1986) の方法によってウシ下顎腺ム
チンから製造し、270MHz ¹H 及び ¹³C NMRにより同定し
た(Savage, A.V. et al., Eur. J. Biochem., 192, 427
-432, 1990; および Savage, A.V. et al., Eur.J. Bio
chem., 193, 837-843, 1990) 。合成プライマーはアプ
ライド・バイオシステム 394 DNAシンセサイザーで合成
した。制限酵素 SmaI 、EcoRI 、BamHI 、HindIII 、Sa
cI、XhoI、BglII 及びPstIは宝酒造から入手した。NeuAc α2,6-GalNAc-SerNAc is NeuAcα2,
Prepared from 6GalNAc-Ser (Mect) by acetylation with acetic anhydride in pyridine-water. NeuAcα2,6GalNAc-ol and GlcNAcβ1,3 [NeuAcα2,6] GalNAc-ol were obtained from Tsuji, T. and Osawa T., Carbohydr. Re.
, 151, 391-402, 1986) and identified by 270 MHz ¹ H and ¹³ C NMR (Savage, AV et al., Eur. J. Biochem., 192, 427).
-432, 1990; and Savage, AV et al., Eur. J. Bio
chem., 193, 837-843, 1990). Synthetic primers were synthesized on an Applied Biosystems 394 DNA synthesizer. Restriction enzymes SmaI, EcoRI, BamHI, HindIII, Sa
cI, XhoI, BglII and PstI were obtained from Takara Shuzo.

【００４７】[0047]

【発明の効果】本発明により新規酵素 P-B1 、および該
酵素の活性部分を有し細胞外に分泌される新規蛋白 SB-
690 が提供される。本発明の酵素および蛋白はGalNAcα
2,6-シアル酸転移酵素活性を有するので、例えば、蛋白
にヒト型の糖鎖を導入する試薬として有用である。ま
た、ヒトに特異的な糖鎖を欠く遺伝性疾患の治療のため
の医薬として有用である。さらに、癌転移抑制、ウイル
ス感染防止、炎症反応抑制を目的とする医薬としても用
いることが可能である。According to the present invention, a novel enzyme P-B1 and a novel protein SB- having an active part of the enzyme and secreted extracellularly
690 is provided. The enzyme and protein of the present invention are GalNAcα.
Since it has 2,6-sialyltransferase activity, it is useful, for example, as a reagent for introducing a human-type sugar chain into a protein. In addition, it is useful as a medicament for treating a hereditary disease lacking a human-specific sugar chain. Furthermore, it can be used as a medicine for suppressing cancer metastasis, preventing viral infection, and suppressing inflammatory response.

【００４８】[0048]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ ：2072 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー ：直鎖 配列の種類 ：cDNA to mRNA 起源 ：G. gallus (ニワトリ) 配列の特徴 ：CDS 1-1698 配列 (-31) CCGAGCTTCCATCTCTCCCGGGCCTCTCACT -1 ATG GGG TTT TTA ATC AGA AGG CTT CCT AAA GAT TCC AGA ATA TTC 45 MET Gly Phe Leu Ile Arg Arg Leu Pro Lys Asp Ser Arg Ile Phe 15 CGT TGG CTC CTT ATT TTA ACA GTC TTT TCC TTC ATC ATT ACT AGT 90 Arg Trp Leu Leu Ile Leu Thr Val Phe Ser Phe Ile Ile Thr Ser 30 TTT AGC GCC TTG TTT GGC ATG GAG AAA AGC ATT TTC AGG CAG CTC 135 Phe Ser Ala Leu Phe Gly MET Glu Lys Ser Ile Phe Arg Gln Leu 45 AAG ATT TAC CAA AGC ATT GCA CAT ATG CTA CAA GTG GAC ACC CAA 180 Lys Ile Tyr Gln Ser Ile Ala His MET Leu Gln Val Asp Thr Gln 60 GAT CAG CAA GGT TCA AAC TAT TCT GCT AAT GGG AGA ATT TCA AAG 225 Asp Gln Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Ala Asn Gly Arg Ile Ser Lys 75 GTT GGT TTG GAG AGA GAC ATT GCA TGG CTC GAA CTG AAT ACT GCT 270 Val Gly Leu Glu Arg Asp Ile Ala Trp Leu Glu Leu Asn Thr Ala 90 GTG AGT ACA CCA AGT GGG GAA GGG AAG GAA GAG CAG AAG AAA ACA 315 Val Ser Thr Pro Ser Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gln Lys Lys Thr 105 GTG AAA CCA GTT GCC AAG GTG GAA GAA GCC AAG GAG AAA GTG ACT 360 Val Lys Pro Val Ala Lys Val Glu Glu Ala Lys Glu Lys Val Thr 120 GTG AAA CCA TTC CCT GAG GTG ATG GGG ATC ACA AAT ACA ACA GCA 405 Val Lys Pro Phe Pro Glu Val MET Gly Ile Thr Asn Thr Thr Ala 135 TCA ACA GCC TCT GTG GTG GAG AGA ACA AAG GAG AAA ACA ACA GCG 450 Ser Thr Ala Ser Val Val Glu Arg Thr Lys Glu Lys Thr Thr Ala 150 AGA CCA GTT CCA GGG GTG GGG GAA GCT GAT GGG AAG AGA ACA ACG 495 Arg Pro Val Pro Gly Val Gly Glu Ala Asp Gly Lys Arg Thr Thr 165 ATA GCA CTT CCC AGC ATG AAG GAA GAC AAA GAG AAG GCG ACT GTG 540 Ile Ala Leu Pro Ser MET Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Thr Val 180 AAA CCA TCC TTT GGG ATG AAG GTA GCT CAT GCA AAC AGC ACA TCC 585 Lys Pro Ser Phe Gly MET Lys Val Ala His Ala Asn Ser Thr Ser 195 AAA GAT AAA CCA AAG GCA GAA GAG CCT CCT GCA TCA GTG AAA GCC 630 Lys Asp Lys Pro Lys Ala Glu Glu Pro Pro Ala Ser Val Lys Ala 210 ATA AGA CCT GTG ACT CAG GCT GCC ACA GTG ACA GAG AAG AAG AAA 675 Ile Arg Pro Val Thr Gln Ala Ala Thr Val Thr Glu Lys Lys Lys 225 CTG AGG GCT GCT GAC TTC AAG ACT GAG CCA CAG TGG GAT TTT GAT 720 Leu Arg Ala Ala Asp Phe Lys Thr Glu Pro Gln Trp Asp Phe Asp 240 GAT GAG TAC ATA CTG GAT AGC TCA TCT CCA GTA TCG ACC TGC TCT 765 Asp Glu Tyr Ile Leu Asp Ser Ser Ser Pro Val Ser Thr Cys Ser 255 GAA TCA GTG AGA GCC AAG GCT GCC AAG TCT GAC TGG CTG CGA GAT 810 Glu Ser Val Arg Ala Lys Ala Ala Lys Ser Asp Trp Leu Arg Asp 270 CTT TTC CTG CCG AAC ATC ACA CTC TTC ATA GAC AAG AGT TAC TTC 855 Leu Phe Leu Pro Asn Ile Thr Leu Phe Ile Asp Lys Ser Tyr Phe 285 AAT GTC AGT GAG TGG GAC CGC CTG GAG CAT TTT GCA CCT CCC TAT 900 Asn Val Ser Glu Trp Asp Arg Leu Glu His Phe Ala Pro Pro Tyr 300 GGC TTC ATG GAG CTG AAT TAC TCA CTG GTA GAA GAA GTC ATG TCA 945 Gly Phe MET Glu Leu Asn Tyr Ser Leu Val Glu Glu Val MET Ser 315 CGG CTG CCT CCA AAT CCC CAC CAG CAG CTG CTC CTG GCC AAC AGT 990 Arg Leu Pro Pro Asn Pro His Gln Gln Leu Leu Leu Ala Asn Ser 330 AGC AGC AAC GTG TCA ACG TGC ATC AGC TGT GCT GTT GTG GGG AAT 1035 Ser Ser Asn Val Ser Thr Cys Ile Ser Cys Ala Val Val Gly Asn 345 GGA GGG ATA TTG AAT AAC TCT GGA ATG GGC CAG GAG ATT GAC TCC 1080 Gly Gly Ile Leu Asn Asn Ser Gly MET Gly Gln Glu Ile Asp Ser 360 CAT GAC TAT GTG TTC CGG GTG AGC GGG GCT GTA ATC AAA GGT TAC 1125 His Asp Tyr Val Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Ile Lys Gly Tyr 375 GAA AAG GAT GTG GGA ACA AAA ACC TCC TTC TAC GGA TTC ACA GCG 1170 Glu Lys Asp Val Gly Thr Lys Thr Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Ala 390 TAC TCC CTG GTG TCC TCT CTC CAG AAC TTG GGA CAC AAA GGG TTC 1215 Tyr Ser Leu Val Ser Ser Leu Gln Asn Leu Gly His Lys Gly Phe 405 AAG AAG ATC CCA CAG GGG AAG CAT ATC AGA TAC ATT CAC TTC CTG 1260 Lys Lys Ile Pro Gln Gly Lys His Ile Arg Tyr Ile His Phe Leu 420 GAG GCA GTT AGA GAC TAT GAG TGG CTG AAG GCT CTT CTG TTG GAC 1305 Glu Ala Val Arg Asp Tyr Glu Trp Leu Lys Ala Leu Leu Leu Asp 435 AAG GAT ATC AGG AAA GGA TTC CTG AAC TAC TAT GGG CGA AGG CCC 1350 Lys Asp Ile Arg Lys Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Gly Arg Arg Pro 450 CGG GAG AGA TTC GAT GAA GAT TTC ACA ATG AAT AAG TAC CTG GTA 1395 Arg Glu Arg Phe Asp Glu Asp Phe Thr MET Asn Lys Tyr Leu Val 465 GCT CAC CCT GAT TTC CTC AGA TAC TTG AAA AAC AGG TTC TTA AAA 1440 Ala His Pro Asp Phe Leu Arg Tyr Leu Lys Asn Arg Phe Leu Lys 480 TCT AAA AAT CTG CAA AAG CCC TAC TGG CGG CTG TAC AGA CCC ACA 1485 Ser Lys Asn Leu Gln Lys Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Arg Pro Thr 495 ACA GGA GCC CTC CTG CTG CTG ACT GCC CTG CAT CTC TGT GAC CGG 1530 Thr Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ala Leu His Leu Cys Asp Arg 510 GTG AGT GCC TAT GGC TAC ATC ACA GAA GGT CAC CAG AAG TAC TCG 1575 Val Ser Ala Tyr Gly Tyr Ile Thr Glu Gly His Gln Lys Tyr Ser 525 GAT CAC TAC TAT GAC AAG GAG TGG AAA CGC CTG GTC TTC TAC GTT 1620 Asp His Tyr Tyr Asp Lys Glu Trp Lys Arg Leu Val Phe Tyr Val 540 AAC CAT GAC TTC AAC TTG GAG AAG CAG GTG TGG AAA AGG CTT CAT 1665 Asn His Asp Phe Asn Leu Glu Lys Gln Val Trp Lys Arg Leu His 555 GAT GAG AAC ATC ATG AAG CTC TAC CAG AGA TCC TGA CAG TGT GCC 1710 Asp Glu Asn Ile MET Lys Leu Tyr Gln Arg Ser --- 566 GAGGGCCATT GCCTGGGAAA TCTCAACAGC ACCTCATGGG GAACAGAAGA 1760 GGACCTCGGA AGCCAGGGTT AGCTCTGGAC TTCCAGGCCC AGCTTCAGCT 1810 CCACAGAGAT ATTTCCCTCC TTTGATATCT TTATTTTCTC ACAACACTTC 1860 CTAAAATGTG CATATTCTAC AGACCAAGCG AACAGTAGGG AAAAGTGCCT 1910 CCAAACAAGG TCCCATCTGA CTTGTGGACG GTTGTAGGCT CTGGTACTGG 1960 GAAAGAGGAA TCCGGGATGA ATCCGAATAG CAGATGTTCC AGTGCCCATT 2010 ATCTTAATCA GGTTCTCCCT CTGCAAGGAG ATGCTCTTGG GGCTGGGGCT 2060 AGTTTTGCTC TAGGTGGGTT CTCTCTGTGA GTAGTGCTTG TTATGGAGCT 2110 GGGTGTTTTG GGTAAGCAGT GGATAGAATG GAGACACACA CAATCCTGTC 2160 TCAAGAGGAT GATTTGTGTC CTGGAGGTGC TGCTGTCACT CTGCTCACTG 2210 CAGGCATAAG GACCCTTCCA ATGAACTCAA TCCCAATGTG ACTTTGCTGT 2260 GACACCTCCT GGGGAGCACT GTGATGTCGG TGCCCAGCCT GCTGCCCTTG 2310 GCCTAGTTCA CCATCAGCAC AAGGGAAGGG GAGAGCCCTC CGTAGTGCAG 2360 CAGAATGCTG GACATTGTAC CTCTTGCTGT GGGTTCCCCT GGCTGCAGAC 2410 TACGTGTAGT GAGTCTGATG AAGAAGCTGG TGCTTGGCTG TGCCAGGAGC 2460 ATGGTGCTTC CTCTTCTACC AGGAGAAATG AGAATTCTCA ATGTCCATGG 2510 ATGGATGCTG TCTGTCCTTG CTGCTGGCTG GAGTGCCTGC CTACATTGTC 2560 CTGAGAAAAG CACTGTTACA GCCAGTAAGC CTTTGGAGTA TTGGCCTTCT 2610 GAGTGGGCTT TTGCAAACAA AATAAACGGC ACTGCTTTCC CCCAAGCTGA 2660 AAAAAAAAAA A 2671 配列番号：２ 配列の長さ ：1294 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー ：直鎖 配列の種類 ：cDNA to mRNA 起源 ：G. gallus (ニワトリ) 配列の特徴 ：CDS 1-1065 配列の特徴 ：signal peptide 1-1065 配列 (-43) CTG CAGGGTTTTT ATTTTTAATT TTCTTTCAAA TACTTCCACC -1 PstI ATG AAA TTC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 MET Lys Phe Ser Trp Val MET Phe Phe Leu MET Ala Val Val Thr 15 GGG GTC AAT TCA GAA TTC ACT GAG CCA CAG TGG GAT TTT GAT GAT 90 Gly Val Asn Ser Glu Phe Thr Glu Pro Gln Trp Asp Phe Asp Asp 30 GAG TAC ATA CTG GAT AGC TCA TCT CCA GTA TCG ACC TGC TCT GAA 135 Glu Tyr Ile Leu Asp Ser Ser Ser Pro Val Ser Thr Cys Ser Glu 45 TCA GTG AGA GCC AAG GCT GCC AAG TCT GAC TGG CTG CGA GAT CTT 180 Ser Val Arg Ala Lys Ala Ala Lys Ser Asp Trp Leu Arg Asp Leu 60 TTC CTG CCG AAC ATC ACA CTC TTC ATA GAC AAG AGT TAC TTC AAT 225 Phe Leu Pro Asn Ile Thr Leu Phe Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Asn 75 GTC AGT GAG TGG GAC CGC CTG GAG CAT TTT GCA CCT CCC TAT GGC 270 Val Ser Glu Trp Asp Arg Leu Glu His Phe Ala Pro Pro Tyr Gly 90 TTC ATG GAG CTG AAT TAC TCA CTG GTA GAA GAA GTC ATG TCA CGG 315 Phe MET Glu Leu Asn Tyr Ser Leu Val Glu Glu Val MET Ser Arg 105 CTG CCT CCA AAT CCC CAC CAG CAG CTG CTC CTG GCC AAC AGT AGC 360 Leu Pro Pro Asn Pro His Gln Gln Leu Leu Leu Ala Asn Ser Ser 120 AGC AAC GTG TCA ACG TGC ATC AGC TGT GCT GTT GTG GGG AAT GGA 405 Ser Asn Val Ser Thr Cys Ile Ser Cys Ala Val Val Gly Asn Gly 135 GGG ATA TTG AAT AAC TCT GGA ATG GGC CAG GAG ATT GAC TCC CAT 450 Gly Ile Leu Asn Asn Ser Gly MET Gly Gln Glu Ile Asp Ser His 150 GAC TAT GTG TTC CGG GTG AGC GGG GCT GTA ATC AAA GGT TAC GAA 495 Asp Tyr Val Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Ile Lys Gly Tyr Glu 165 AAG GAT GTG GGA ACA AAA ACC TCC TTC TAC GGA TTC ACA GCG TAC 540 Lys Asp Val Gly Thr Lys Thr Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Ala Tyr 180 TCC CTG GTG TCC TCT CTC CAG AAC TTG GGA CAC AAA GGG TTC AAG 585 Ser Leu Val Ser Ser Leu Gln Asn Leu Gly His Lys Gly Phe Lys 195 AAG ATC CCA CAG GGG AAG CAT ATC AGA TAC ATT CAC TTC CTG GAG 630 Lys Ile Pro Gln Gly Lys His Ile Arg Tyr Ile His Phe Leu Glu 210 GCA GTT AGA GAC TAT GAG TGG CTG AAG GCT CTT CTG TTG GAC AAG 675 Ala Val Arg Asp Tyr Glu Trp Leu Lys Ala Leu Leu Leu Asp Lys 225 GAT ATC AGG AAA GGA TTC CTG AAC TAC TAT GGG CGA AGG CCC CGG 720 Asp Ile Arg Lys Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Gly Arg Arg Pro Arg 240 GAG AGA TTC GAT GAA GAT TTC ACA ATG AAT AAG TAC CTG GTA GCT 765 Glu Arg Phe Asp Glu Asp Phe Thr MET Asn Lys Tyr Leu Val Ala 255 CAC CCT GAT TTC CTC AGA TAC TTG AAA AAC AGG TTC TTA AAA TCT 810 His Pro Asp Phe Leu Arg Tyr Leu Lys Asn Arg Phe Leu Lys Ser 270 AAA AAT CTG CAA AAG CCC TAC TGG CGG CTG TAC AGA CCC ACA ACA 855 Lys Asn Leu Gln Lys Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Arg Pro Thr Thr 285 GGA GCC CTC CTG CTG CTG ACT GCC CTG CAT CTC TGT GAC CGG GTG 900 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ala Leu His Leu Cys Asp Arg Val 300 AGT GCC TAT GGC TAC ATC ACA GAA GGT CAC CAG AAG TAC TCG GAT 945 Ser Ala Tyr Gly Tyr Ile Thr Glu Gly His Gln Lys Tyr Ser Asp 315 CAC TAC TAT GAC AAG GAG TGG AAA CGC CTG GTC TTC TAC GTT AAC 990 His Tyr Tyr Asp Lys Glu Trp Lys Arg Leu Val Phe Tyr Val Asn 330 CAT GAC TTC AAC TTG GAG AAG CAG GTG TGG AAA AGG CTT CAT GAT 1035 His Asp Phe Asn Leu Glu Lys Gln Val Trp Lys Arg Leu His Asp 345 GAG AAC ATC ATG AAG CTC TAC CAG AGA TCC TGA CAGTGTGCCGAG 1080 Glu Asn Ile MET Lys Leu Tyr Gln Arg Ser --- 360 GGCCATTGCC TGGGAAATCT CAACAGCACC TCATGGGGAA CAGAAGAGGA 1175 CCTCGGAAGC CAGGGTTAGC TCTGGACTTC CAGGCCCAGC TTCAGCTCCA 1225 CAGAGATATT TCCCTCCTTT GATATC 1251 EcoRV SEQ ID NO: 1 Sequence length: 2072 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin: G. gallus (chicken) Sequence characteristics: CDS 1-1698 sequence (-31) CCGAGCTTCCATCTCTCCCGGGCCTCTCACT -1 ATG GGG TTT TTA ATC AGA AGG CTT CCT AAA GAT TCC AGA ATA TTC 45 MET Gly Phe Leu Ile Arg Arg Leu Pro Lys Asp Ser Arg Ile Phe 15 CGT TGG CTC CTT ATT TTA TCA TTC TTC ATC ATT ACT AGT 90 Arg Trp Leu Leu Ile Leu Thr Val Phe Ser Phe Ile Ile Thr Ser 30 TTT AGC GCC TTG TTT GGC ATG GAG AAA AGC ATT TTC AGG CAG CTC 135 Phe Ser Ala Leu Phe Gly MET Glu Lys Ser Ile Phe Arg Gln Leu 45 AAG ATT TAC CAA AGC ATT GCA CAT ATG CTA CAA GTG GAC ACC CAA 180 Lys Ile Tyr Gln Ser Ile Ala His MET Leu Gln Val Asp Thr Gln 60 GAT CAG CAA GGT TCA AAC TAT TCT GCT AAT GGG AGA ATT TCA AAG 225 Asp Gln Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Ala Asn Gly Arg Ile Ser Lys 75 GTT GGT TTG GAG AGA GAC ATT GCA TGG CTC GAA CTG AAT ACT GCT 270 Val Gly Leu Glu Arg Asp Ile Ala Trp Leu Glu Leu Asn Thr Ala 90 GTG AGT ACA CCA AGT GGG GAA GGG AAG GAA GAG CAG AAG AAA ACA 315 Val Ser Thr Pro Ser Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gln Lys Lys Thr 105 GTG AAA CCA GTT GCC AAG GTG GAA GAA GCC AAG GAG AAA GTG ACT 360 Val Lys Pro Val Ala Lys Val Glu Glu Ala Lys Glu Lys Val Thr 120 GTG AAA CCA TTC CCT GAG GTG ATG GGG ATC ACA AAT ACA ACA GCA 405 Val Lys Pro Phe Pro Glu Val MET Gly Ile Thr Asn Thr Thr Ala 135 TCA ACA GCC TCT GTG GTG GAG AGA ACA AAG GAG AAA ACA ACA GCG 450 Ser Thr Ala Ser Val Val Glu Arg Thr Lys Glu Lys Thr Thr Ala 150 AGA CCA GTT CCA GGG GTG GGG GAA GCT GAT GGG AAG AGA ACA ACG 495 Arg Pro Val Pro Gly Val Gly Glu Ala Asp Gly Lys Arg Thr Thr 165 ATA GCA CTT CCC AGC ATG AAG GAA GAC AAA GAG AAG GCG ACT GTG 540 Ile Ala Leu Pro Ser MET Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Thr Val 180 AAA CCA TCC TTT GGG ATG AAG GTA GCT CAT GCA AAC AGC ACA TCC 585 Lys Pro Ser Phe Gly MET Lys Val Ala His Ala Asn Ser Thr Ser 195 AAA GAT AAA CCA AAG GCA GAA GAG CCT CCT GCA TCA GTG AAA GCC 630 Lys Asp Lys Pro Lys Ala Glu Glu Pro Pro Ala Ser Val Lys Ala 210 ATA AGA CCT GTG ACT CAG GCT GCC ACA GTG ACA GAG AAG AAG AAA 675 Ile Arg Pro Val Thr Gln Ala Ala Thr Val Thr Glu Lys Lys Lys 225 CTG AGG GCT GCT GAC TTC AAG ACT GAG CCA CAG TGG GAT TTT GAT 720 Leu Arg Ala Ala Asp Phe Lys Thr Glu Pro Gln Trp Asp Phe Asp 240 GAT GAG TAC ATA CTG GAT AGC TCA TCT CCA GTA TCG ACC TGC TCT 765 Asp Glu Tyr Ile Leu Asp Ser Ser Ser Pro Val Ser Thr Cys Ser 255 GAA TCA GTG AGA GCC AAG GCT GCC AAG TCT GAC TGG CTG CGA GAT 810 Glu Ser Val Arg Ala Lys Ala Ala Lys Ser Asp Trp Leu Arg Asp 270 CTT TTC CTG CCG AAC ATC ACA CTC TTC ATA GAC AAG AGT TAC TTC 855 Leu Phe Leu Pro Asn Ile Thr Leu Phe Ile Asp Lys Ser Tyr Phe 285 AAT GTC AGT GAG TGG GAC CGC CTG GAG CAT TTT GCA CCT CCC TAT 900 Asn Val Ser Glu Trp Asp Arg Leu Glu His Phe Ala Pro Pro Tyr 300 GGC TTC ATG GAG CTG AAT TAC TCA CTG GTA GAA GAA GTC ATG TCA 945 Gly Phe MET Glu Leu Asn Tyr Ser Leu Val Glu Glu Val MET Ser 315 CGG CTG CCT CCA AAT CCC CAC CAG CAG CTG CTC CTG GCC AAC AGT 990 Arg Leu Pro Pro Asn Pro His Gln Gln Leu Leu Leu Ala Asn Ser 330 AGC AGC AAC GTG TCA ACG TGC ATC AGC TGT GCT GTT GTG GGG AAT 1035 Ser Ser Asn Val Ser Thr Cys Ile Ser Cys Ala Val Val Gly Asn 345 GGA GGG ATA TTG AAT AAC TCT GGA ATG GGC CAG GAG ATT GAC TCC 1080 Gly Gly Ile Leu Asn Asn Ser Gly MET Gly Gln Glu Ile Asp Ser 360 CAT GAC TAT GTG TTC CGG GTG AGC GGG GCT GTA ATC AAA GGT TAC 1125 His Asp Tyr Val Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Ile Lys Gly Tyr 375 GAA AAG GAT GTG GGA ACA AAA ACC TCC TTC TAC GGA TTC ACA GCG 1170 Glu Lys Asp Val Gly Thr Lys Thr Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Ala 390 TAC TCC TCC CTG GTG TCC TCT CTC CAG AAC TTG GGA CAC AAA GGG TTC 1215 Tyr Ser Leu Val Ser Ser Leu Gln Asn Leu Gly His Lys Gly Phe 405 AAG AAG ATC CCA CAG GGG AAG CAT ATC AGA TAC ATT CAC TTC CTG 1260 Lys Lys Ile Pro Gln Gly Lys His Ile Arg Tyr Ile His Phe Leu 420 GAG GCA GTT AGA GAC TAT GAG TGG CTG AAG GCT CTT CTG TTG GAC 1305 Glu Ala Val Arg Asp Tyr Glu Trp Leu Lys Ala Leu Leu Leu Asp 435 AAG GAT ATC AGG AAA GGA TTC CTG AAC TAC TAT GGG CGA AGG CCC 1350 Lys Asp Ile Arg Lys Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Gly Arg Arg Pro 450 CGG GAG AGA TTC GAT GAA GAT TTC ACA ATG AAT AAG TAC CTG GTA 1395 Arg Glu Arg Phe Asp Glu Asp Phe Thr MET Asn Lys Tyr Leu Val 465 GCT CAC CCT GAT TTC CTC AGA TAC TTG AAA AAC AGG TTC TTA AAA 1440 Ala His Pro Asp Phe Leu Arg Tyr Leu Lys Asn Arg Phe Leu Lys 480 TCT AAA AAT CTG CAA AAG CCC TAC TGG CGG CTG TAC AGA CCC ACA 1485 Ser Lys Asn Leu Gln Lys Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Arg Pro Thr 495 ACA GGA GCC CTC CTG CTG CTG ACT GCC CTG CAT CTC TGT GAC CGG 1530 Thr Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ala Leu His Leu Cys Asp Arg 510 GTG AGT GCC TAT GGC TAC ATC ACA GAA GGT CAC CAG AAG TAC TCG 1575 Val Ser Ala Tyr Gly Tyr Ile Thr Glu Gly His Gln Lys Tyr Ser 525 GAT CAC TAC TAT GAC AAG GAG TGG AAA CGC CTG GTC TTC TAC GTT 1620 Asp His Tyr Tyr Asp Lys Glu Trp Lys Arg Leu Val Phe Tyr Val 540 AAC CAT GAC TTC AAC TTG GAG AAG CAG GTG TGG AAA AGG CTT CAT 1665 Asn His Asp Phe Asn Leu Glu Lys Gln Val Trp Lys Arg Leu His 555 GAT GAG AAC ATC ATG AAG CTC TAC CAG AGA TCC TGA CAG TGT GCC 1710 Asp Glu Asn Ile MET Lys Leu Tyr Gln Arg Ser --- 566 GAGGGCCATT GCCTGGGAAA TCTCAACAGC ACCTCATGGG GAACAGAAGA 1760 GGACCTCGGA AGCCAGGGTT AGCTCTGGAC TTCCAGGCCC AGCTTCAGCT 1810 CCACAGAGAT ATTTCCCTCC TTTGATATCT TTATTTTCTC ACAACACTTC 1860 CTAAAATGTG CATATTCTAC AGACCAAGCG AACAGTAGGG AAAAGTGCCT 1910 CCAAACAAGG TCCCATCTGA CTTGTGGACG GTTGTAGGCT CTGGTACTGG 1960 GAAAGAGGAA TCCGGGATGA ATCCGAATAG CAGATGTTCC AGTGCCCATT 2010 ATCTTAATCA GGTTCTCCCT CTGCAAGGAG ATGCTCTTGG GGCTGGGGCT 2060 AGTTTTGCTC TAGGTGGGTT CTCTCTGTGA GTAGTGCTTG TTATGGAGCT 2110 GGGTGTTTTG GGTAAGCAGT GGATAGAATG GAGACACACA CAATCCTGTC 2160 TCAAGAGGAT GATTTGTGTC CTGGAGGTGC TGCTGTCACT CTGCTCACTG 2210 CAGGCATAAG GACCCTTCCA ATGAACTCAA TCCCAATGTG ACTTTGCTGT 2260 GACACCTCCT GGGGAGCACT GTGATGTCGG TGCCCAGCCT GCTGCCCTTG 2310 GCCTAGTTCA CCATCAGCAC AAGGGAAGGG GAGAGCCCTC CGTAGTGCAG 2360 CAGAATGCTG GACATTGTAC CTCTTGCTGT GGGTTCCCCT GGCTGCAGAC 2410 TACGTGTAGT GAGTCTGATG AAGAAGCTGG TGCTTG GCTG TGCCAGGAGC 2460 ATGGTGCTTC CTCTTCTACC AGGAGAAATG AGAATTCTCA ATGTCCATGG 2510 ATGGATGCTG TCTGTCCTTG CTGCTGGCTG GAGTGCCTGC CTACATTGTC 2560 CTGAGAAAAG CACTGTTACA GCCAGTAAGC CTTTGGAGTA TTGGCCTTCT 2610 GAGTGGGCTT TTGCAAACAA AATAAACGGC ACTGCTTTCC CCCAAGCTGA 2660 AAAAAAAAAA A 2671 SEQ ID NO: 2 sequence Length: type 1294 sequence: the number of a nucleic acid strand: 2 Main chain topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin: G. gallus (chicken) Sequence characteristics: CDS 1-1065 Sequence characteristics: signal peptide 1-1065 sequence (-43) CTG CAGGGTTTTT ATTTTTAATT TTCTTTCAAA TACTTCCACC -1 PstI ATG AAA TTC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 MET Lys Phe Ser Trp Val MET Phe Phe Leu MET Ala Val Val Thr 15 GGG GTC AAT TCA GAA TTC ACT GAG CCA CAG TGG GAT TTT GAT GAT 90 Gly Val Asn Ser Glu Phe Thr Glu Pro Gln Trp Asp Phe Asp Asp 30 GAG TAC ATA CTG GAT AGC TCA TCT CCA GTA TCG ACC TGC TCT GAA 135 Glu Tyr Ile Leu Asp Ser Ser Ser Pro Val Ser Thr Cys Ser Glu 45 TCA GTG AGA GCC AAG GCT GCC AAG TCT GAC TGG CTG CGA GAT CTT 180 Ser Val Arg Ala Lys Ala Ala Lys Ser Asp Trp Leu Arg Asp Leu 60 TTC CTG CCG AAC ATC ACA CTC TTC ATA GAC AAG AGT TAC TTC AAT 225 Phe Leu Pro Asn Ile Thr Leu Phe Ile Asp Lys Ser Tyr Phe Asn 75 GTC AGT GAG TGG GAC CGC CTG GAG CAT TTT GCA CCT CCC TAT GGC 270 Val Ser Glu Trp Asp Arg Leu Glu His Phe Ala Pro Pro Tyr Gly 90 TTC ATG GAG CTG AAT TAC TCA CTG GTA GAA GAA GTC ATG TCA CGG 315 Phe MET Glu Leu Asn Tyr Ser Leu Val Glu Glu Val MET Ser Arg 105 CTG CCT CCA AAT CCC CAC CAG CAG CTG CTC CTG GCC AAC AGT AGC 360 Leu Pro Pro Asn Pro His Gln Gln Leu Leu Leu Leu Ala Asn Ser Ser 120 AGC AAC GTG TCA ACG TGC ATC AGC TGT GCT GTT GTG GGG AAT GGA 405 Ser Asn Val Ser Thr Cys Ile Ser Cys Ala Val Val Gly Asn Gly 135 GGG ATA TTG AAT AAC TCT GGA ATG GGC CAG GAG ATT GAC TCC CAT 450 Gly Ile Leu Asn Asn Ser Gly MET Gly Gln Glu Ile Asp Ser His 150 GAC TAT GTG TTC CGG GTG AGC GGG GCT GTA ATC AAA GGT TAC GAA 495 Asp Tyr Val Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Ile Lys Gly Tyr Glu 165 AAG GAT GTG GGA ACA AAA ACC TCC TTC TAC GGA TTC ACA GCG TAC 540 Lys Asp Val Gly Thr Lys Thr Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Ala Tyr 180 TCC CTG GTG TCC TCT CTC CAG AAC TTG GGA CAC AAA GGG TTC AAG 585 Ser Leu Val Ser Ser Leu Gln Asn Leu Gly His Lys Gly Phe Lys 195 AAG ATC CCA CAG GGG AAG CAT ATC AGA TAC ATT CAC TTC CTG GAG 630 Lys Ile Pro Gln Gly Lys His Ile Arg Tyr Ile His Phe Leu Glu 210 GCA GTT AGA GAC TAT GAG TGG CTG AAG GCT CTT CTG TTG GAC AAG 675 Ala Val Arg Asp Tyr Glu Trp Leu Lys Ala Leu Leu Leu Asp Lys 225 GAT ATC AGG AAA GGA TTC CTG AAC TAC TAT GGG CGA AGG CCC CGG 720 Asp Ile Arg Lys Gly Phe Leu Asn Tyr Tyr Gly Arg Arg Pro Arg 240 GAG AGA TTC GAT GAA GAT TTC ACA ATG AAT AAG TAC CTG GTA GCT 765 Glu Arg Phe Asp Glu Asp Phe Thr MET Asn Lys Tyr Leu Val Ala 255 CAC CCT GAT TTC CTC AGA TAC TTG AAA AAC AGG TTC TTA AAA TCT 810 His Pro Asp Phe Leu Arg Tyr Leu Lys Asn Arg Phe Leu Lys Ser 270 AAA AAT CTG CAA AAG CCC TAC TGG CGG CTG TAC AGA CCC ACA ACA 855 Lys Asn Leu Gln Lys Pro Tyr Trp Arg Leu Tyr Arg Pro Thr Thr 285 GGA GCC CTC CTG CTG CTG ACT GCC CTG CAT CTC TGT GAC CGG GTG 900 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Thr Ala Leu His Leu Cys Asp Arg Val 300 AGT GCC TAT GGC TAC ATC ACA GAA GGT CAC CAG AAG TAC TCG GAT 945 Ser Ala Tyr Gly Tyr Ile Thr Glu Gly His Gln Lys Tyr Ser Asp 315 CAC TAC TAT GAC AAG GAG TGG AAA CGC CTG GTC TTC TAC GTT AAC 990 His Tyr Tyr Asp Lys Glu Trp Lys Arg Leu Val Phe Tyr Val Asn 330 CAT GAC TTC AAC TTG GAG AAG CAG GTG TGG AAA AGG CTT CAT GAT 1035 His Asp Phe Asn Leu Glu Lys Gln Val Trp Lys Arg Leu His Asp 345 GAG AAC ATC ATG AAG CTC TAC CAG AGA TCC TGA CAGTGTGCCGAG 1080 Glu Asn I MET Lys Leu Tyr Gln Arg Ser --- 360 GGCCATTGCC TGGGAAATCT CAACAGCACC TCATGGGGAA CAGAAGAGGA 1175 CCTCGGAAGC CAGGGTTAGC TCTGGACTTC CAGGCCCAGC TTCAGCTCCA 1225 CAGAGATATT TCCCTCCTTT GATATC 1251 EcoRV

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B
1 をコードするcDNAクローンの制限酵素地図である。図
中、E: EcoRI; RV: EcoRV; P: PstI; B: BglIIを示す。FIG. 1. GalNAcα2,6-sialyltransferase PB of the present invention
1 is a restriction map of a cDNA clone encoding 1. In the figure, E: EcoRI; RV: EcoRV; P: PstI; B: BglII.

【図２】 本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B
1 の疎水性分析の結果を示す図である。図中、左側が蛋
白N-末端であり、正の値は疎水性部分を示している。FIG. 2 GalNAcα2,6-sialyltransferase PB of the present invention
FIG. 2 is a view showing the results of a hydrophobicity analysis of No. 1. In the figure, the left side is the protein N-terminal, and a positive value indicates a hydrophobic portion.

【図３】 本発明のGalNAcα2,6-シアル酸転移酵素 P-B
1 の活性ドメインの位置と本発明の蛋白 SB-690 との対
比を示す図である。図中、蛋白 SB-BGL はGalNAcα2,6-
シアル酸転移酵素活性を示さない蛋白である。FIG. 3 GalNAcα2,6-sialyltransferase PB of the present invention
FIG. 2 is a view showing a comparison between the position of the active domain No. 1 and the protein SB-690 of the present invention. In the figure, protein SB-BGL is GalNAcα2,6-
This protein does not show sialyltransferase activity.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 李 泳春 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究 所内 (72)発明者 中岡 隆志 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究 所内 (72)発明者 小島 直也 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究 所内 (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．268（16) ｐ．11504−11507（1993) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/10 C12N 15/54 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Li, Kiharu, 2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama Pref. (72) Inventor Takashi Nakaoka 2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama Pref. (72) Invention Naoya Kojima 2-1 Hirosawa, Wako-shi, Saitama Pref. RIKEN (56) References Biol. Chem. 268 (16) p. 11504-11507 (1993) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12N 9/10 C12N 15/54 BIOSIS (DIALOG) GenBank / EMBL / DDBJ (GENETYX) WPI (DIALOG)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
配列により特定されるＧａｌＮＡｃα２，６−シアル酸
転移酵素Ｐ−Ｂ１。1. A GalNAcα2,6-sialyltransferase P-B1 specified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. 【請求項２】 請求項１記載のＧａｌＮＡｃα２，６−
シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードするＧａｌＮ
Ａｃα２，６−シアル酸転移酵素遺伝子。2. The GalNAc α2,6- according to claim 1.
GalN encoding the amino acid sequence of sialyltransferase
Acα2,6-sialyltransferase gene. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示される核酸番号
１から１６９８で特定される塩基配列を有する請求項２
記載のＧａｌＮＡｃα２，６−シアル酸転移酵素遺伝
子。3. The nucleotide sequence according to claim 2, which has a nucleotide sequence specified by nucleic acid numbers 1 to 1698 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
The described GalNAcα2,6-sialyltransferase gene. 【請求項４】 請求項２記載のＧａｌＮＡｃα２，６−
シアル酸転移酵素遺伝子を含む組み換えベクター。4. The GalNAc α2,6- according to claim 2,
A recombinant vector containing a sialyltransferase gene. 【請求項５】 プラスミドλ ＣＥＢ−３０３４である
請求項４記載の組み換えベクター。5. The recombinant vector according to claim 4, which is a plasmid λ CEB-3034. 【請求項６】 請求項４または５に記載のベクターによ
り形質転換された形質転換体。6. A transformant transformed by the vector according to claim 4 or 5. 【請求項７】 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
配列の２３３−５６６により特定されるＧａｌＮＡｃα
２，６−シアル酸転移酵素活性ドメイン。7. GalNAcα specified by the amino acid sequence 233 to 566 shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
2,6-sialyltransferase active domain. 【請求項８】 請求項１記載のＧａｌＮＡｃα２，６−
シアル酸転移酵素の活性ドメインであるポリペプチド部
分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の蛋白であ
って、ＧａｌＮＡｃα２，６−シアル酸転移を触媒する
蛋白。8. The GalNAcα2,6- according to claim 1.
An extracellular secretory protein containing a polypeptide portion, which is an active domain of sialyltransferase, and a signal peptide, which catalyzes GalNAcα2,6-sialyltransferase. 【請求項９】 配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列により特定される請求項８記載の蛋白ＳＢ−６９
０。9. The protein SB-69 according to claim 8, which is specified by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
0. 【請求項１０】 請求項８または９に記載の蛋白をコー
ドする遺伝子。10. A gene encoding the protein according to claim 8 or 9. 【請求項１１】 配列表の配列番号２に示される核酸番
号１から１０６５で示される塩基配列を有する請求項１
０記載の遺伝子。11. The method according to claim 1, which has a nucleotide sequence represented by nucleic acid numbers 1 to 1065 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
0 described gene. 【請求項１２】 請求項１０または１１に記載の遺伝子
を含む組み換えベクター。A recombinant vector comprising the gene according to claim 10 or 11. 【請求項１３】 プラスミドｐｃＤＳＢ−６９０である
請求項１２に記載の組み換えベクター。13. The recombinant vector according to claim 12, which is a plasmid pcDSB-690. 【請求項１４】 請求項１２または１３に記載の組み換
えベクターにより形質転換された形質転換体。A transformant transformed by the recombinant vector according to claim 12 or 13. 【請求項１５】 請求項１４に記載の形質転換体を培養
し培養物から請求項８または９に記載の蛋白を採取する
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の蛋白の製
造方法。15. The method for producing a protein according to claim 8 or 9, wherein the transformant according to claim 14 is cultured, and the protein according to claim 8 or 9 is collected from the culture. .