JP2837429B2 - Highly sensitive specific nucleic acid assay - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特異的核酸の高感度測定法に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a highly sensitive method for measuring a specific nucleic acid.

〔従来の技術〕 感染症、癌および遺伝子病の臨床検査の分野におい
て、核酸レベルの異常は蛋白質レベルの異常に先行する
ため、核酸の測定は病態の把握に、病因の解析に重要な
意義を持っている。[Prior art] In the field of clinical tests for infectious diseases, cancers and genetic diseases, nucleic acid level abnormalities precede protein level abnormalities, so nucleic acid measurement is important for understanding pathological conditions and analyzing pathogenesis. have.

従前、前述のごとき核酸の測定はDNA（RNA）プローブ
を用いたハイブリダイゼーション法によって行われてい
る。Conventionally, nucleic acid measurement as described above has been performed by a hybridization method using a DNA (RNA) probe.

まず、フィルター上に検体から抽出した核酸を固定
し、標識プローブをハイブリダイズさせる方法（サザン
ブロット法、ドット法）がある（第一の技術）。この例
としては、リンパ芽球細胞中のEBウィルス（Epstein−B
arr Virus）の測定におけるブランズマ（J.Brandsma）
らの報告〔プロシーディングス オブ ナショナル ア
カデミィ オブ サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、第77巻、第6851頁（1980）〕がある。細胞をニト
ロセルローズ膜に固定して、DNAを変性させた後、放射
性同位元素で標識したEBウィルスのDNAプローブをハイ
ブリダイズさせて定量したものである。First, there is a method of immobilizing a nucleic acid extracted from a specimen on a filter and hybridizing a labeled probe (Southern blot method, dot method) (first technique). An example of this is the EB virus (Epstein-B) in lymphoblast cells.
arr Virus) in the measurement of J. Brandsma
[Proceedings of National Academies of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A), Vol. 77, p. 6851 (1980)]. The cells were fixed on a nitrocellulose membrane to denature the DNA, and then quantified by hybridizing a DNA probe of an EB virus labeled with a radioisotope.

また、第一のプローブを固定したフィルターに被検液
中の測定すべき特異的核酸をトラップし、これに標識し
た第二のプローブをハイブリダイズさせる方法（サンド
イッチ法）がある（第二の技術）。この例としては、鼻
咽喉分泌物中のアデノウィルスの測定におけるパルバ
（A.Palva）らの報告〔フェムス マイクロバイオロジ
カルレター（FEMS Microbiol.Lett.）第23巻、第83頁
（1984）〕がある。メンブレンフィルター上に固定した
アデノウィルス２型のDNAプローブと放射性同位元素で
標識したDNAプローブを用いて、アデノウィルスDNAを定
量したものである。There is also a method (sandwich method) in which a specific nucleic acid to be measured in a test solution is trapped on a filter on which a first probe is immobilized, and a second probe labeled with the nucleic acid is hybridized thereto (second technique). ). An example of this is the report of A. Palva et al. In the measurement of adenovirus in nasopharyngeal secretions (FEMS Microbiol. Lett., Vol. 23, p. 83 (1984)). . Adenovirus DNA was quantified using an adenovirus type 2 DNA probe immobilized on a membrane filter and a radioactive isotope-labeled DNA probe.

第一の技術では標識DNAプローブが被検体中に多量に
存在するゲノムDNAと非特異的にハイブリダイズするこ
とにより、フィルターに吸着するため、測定の特異性が
低くなるとともに、バックグラウンドが高くなり、感度
が悪くなるという欠点がある。In the first technique, the labeled DNA probe non-specifically hybridizes to the genomic DNA present in a large amount in the test sample, so that it is adsorbed to the filter, which reduces the specificity of the measurement and increases the background. However, there is a disadvantage that the sensitivity is deteriorated.

第二の技術では、２種のプローブを用いるため、DNA
を認識する特異性は高くなるが、フィルター上のDNAプ
ラーブの検体DNAトラップ能力に限界がある。もし担体
の能力を大きくすれば、その結果、標識プローブのフィ
ルターへの非特異的吸着によるバックグラウンドが大き
くなり、いずれにしても高感度化は困難であった。In the second technique, DNA is used because two types of probes are used.
Although the specificity for recognizing DNA is high, the ability of the DNA probe on the filter to trap the sample DNA is limited. If the capacity of the carrier is increased, as a result, the background due to non-specific adsorption of the labeled probe to the filter is increased, and in any case, it has been difficult to increase the sensitivity.

〔発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by the invention]

本発明の目的は、このような状況下、標識プローブの
非特異的吸着による測定値のバックグラウンドを減少さ
せて高感度のサンドイッチ法による核酸の測定法を提供
することにある。An object of the present invention is to provide a highly sensitive method for measuring a nucleic acid by a sandwich method by reducing the background of measured values due to non-specific adsorption of a labeled probe under such circumstances.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

本発明は以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を包
含することを特徴とする高感度特異的核酸の測定法であ
る。The present invention is a method for measuring a highly sensitive specific nucleic acid, comprising the following steps (A), (B) and (C).

工程（Ａ）：非検液中の測定すべき特異的核酸と、少な
くとも１種は官能基で修飾されている２種以上のプロー
ブとを反応せしめ、官能基と特異的に結合する反応基を
固定した担体に捕捉して、担体上にプローブと測定すべ
き核酸からなる複合体を結合せしめる工程。Step (A): reacting a specific nucleic acid to be measured in a non-test solution with two or more types of probes, at least one of which is modified with a functional group, to form a reactive group that specifically binds to the functional group A step of capturing the immobilized carrier and binding the complex comprising the probe and the nucleic acid to be measured on the carrier.

工程（Ｂ）：該複合体に影響を与えずに、担体から前記
複合体を含む成分を解離させる工程。Step (B): a step of dissociating the component containing the complex from the carrier without affecting the complex.

工程（Ｃ）：該成分量を測定する工程。Step (C): a step of measuring the amount of the component.

以下、本発明について工程順に従い、説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in the order of steps.

工程（Ａ）について 本工程は非検液中の測定すべき特異的核酸とプローブ
とを反応せしめ、担体上に核酸−プローブ複合体を結合
せしめる工程である。Step (A) This step is a step in which a probe is reacted with a specific nucleic acid to be measured in a non-test solution, and a nucleic acid-probe complex is bound on a carrier.

非検液としては、たとえば、血清、血漿、髄液、尿等
の体液、測定すべき核酸を含む緩衝液が挙げられる。測
定すべき特異的核酸としては、実質上、従来の核酸プロ
ーブ法で測定し得たすべての特異的DNA（RNA）が挙げら
れる。Examples of the non-test solution include body fluids such as serum, plasma, cerebrospinal fluid, and urine, and buffers containing nucleic acids to be measured. Specific nucleic acids to be measured include virtually all specific DNA (RNA) that can be measured by a conventional nucleic acid probe method.

例を挙げれば、血友病Ａ型、血友病Ｂ型、フェニル
ケトン尿症、α_1-アンチトリプシン欠損症、鎌型赤血球
症、家族性アミロイドポリニューロパチー、およびハン
チントン病等の遺伝子疾患のDNA EBウィルス、アデ
ノウィルス、Ｂ型肺炎ウィルス、HIV、マイコプラズ
マ、レジオネラ、およびクラミジア等のウィルス・微生
物のDNA 神経芽細胞腫のＮ−myc、バーイキットリン
パ腫のＣ−myc等の癌疾患のDNA 心疾患におけるLDL
レセプター、アポＡ−Ｉ、およびアポＣ−II等のリスク
ファクターのDNA等がある。Examples include the DNA of genetic disorders such as hemophilia A, hemophilia B, phenylketonuria, α ₁ -antitrypsin deficiency, sickle cell disease, familial amyloid polyneuropathy, and Huntington's disease. DNA of viruses and microorganisms such as EB virus, adenovirus, pneumonia virus B, HIV, mycoplasma, legionella, and chlamydia DNA of cancer diseases such as N-myc of neuroblastoma and C-myc of Baikit's lymphoma LDL
There are DNAs for risk factors such as receptor, apo AI, and apo C-II.

プローブとは、測定すべき特異的核酸と相補的な核酸
の断片である。一般に１〜20kb（キロ塩基）のものが用
いられているが、合成オリゴヌクレオチドプローブ（約
20〜50ヌクレオチド）を用いることもできる。〔高橋、
DNAプローブ−技術と応用−、（株）シーエムシー、198
8年発行〕。これらのプローブは通常（Ａ）以下の工程
において、担体または標識との結合に関与する官能基を
１種または２種異常結合させて用いる。ここでいう官能
基とは、プローブに導入した特異的な結合性を有する物
質であり、抗原（ハプテンを含む）−抗体、酵素−補酵
素等のアフィニティー結合物質対の一方を用いる。A probe is a fragment of a nucleic acid that is complementary to a specific nucleic acid to be measured. In general, those having a length of 1 to 20 kb (kilobases) are used.
20 to 50 nucleotides) can also be used. [Takahashi,
DNA probe-technology and application-, CMC, 198
8 years). These probes are usually used in the following step (A) after abnormally binding one or two kinds of functional groups involved in binding to a carrier or a label. The term “functional group” as used herein refers to a substance having specific binding properties introduced into a probe, and uses one of an affinity-binding substance pair such as an antigen (including a hapten) -antibody or an enzyme-coenzyme.

官能基としては、例えば、ジニトロフェニル基または
トリニトロフェニル基等のハプテン、ビオチン、抗原、
および抗体等が挙げられる。特に分子量の小さい、ハプ
テンやビオチン等が好ましい。これらは公知の方法によ
り、プローブに導入できる。ビオチン基に関しては、ラ
ンガー（P.R.Langer）〔プロシーディングス オブ ナ
ショナル アカデミィオブ サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）第78巻、第6633頁（1981）〕、フォスター
（A.C.Foster）他〔ヌクレイックアシズ リサーチ（Nu
cleic Acids Res.）第13巻、第745頁（1985）〕等、ジ
ニトロフェニル基に関しては、シュロイヤー（K.R.Shro
yer）〔ジャーナルオブ セル バイオロジー（J.Cell.
Biol.）第97巻、第377a頁（1983）〕等、参照のこと。As the functional group, for example, a hapten such as a dinitrophenyl group or a trinitrophenyl group, biotin, an antigen,
And antibodies. In particular, hapten, biotin, and the like having a small molecular weight are preferable. These can be introduced into the probe by a known method. Regarding the biotin group, PRLanger [Proceedings of National Academies of Science (Proc.
ad.Sci.USA) Vol. 78, p. 6633 (1981)], Foster (ACFoster) et al. [Nucleic Acids Research (Nu
cleic Acids Res.), Vol. 13, pp. 745 (1985)].
yer) [Journal of Cell Biology (J. Cell.
Biol.) 97, 377a (1983)].

また、官能基を結合させる際、官能基とプローブの間
に核酸−プローブ複合体に影響を与えずに切断すること
ができる結合を導入してもよい。このような例として、
−Ｓ−Ｓ−結合、ビオチン−アビジン結合、および抗原
（ハプテンを含む）−抗体結合等が挙げられる。When binding a functional group, a bond that can be cleaved without affecting the nucleic acid-probe complex may be introduced between the functional group and the probe. In such an example,
-SS-bond, biotin-avidin bond, antigen (including hapten) -antibody bond, and the like.

また、これらのプローブの一つは、工程（Ｃ）の測定
の際に利用される標識を結合させて用いてもよい。標識
としては免疫学的測定法において用いられるいずれの物
質でもよく、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物質、
および金属化合物等が挙げられる。例えば、酵素では、
ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ、放射性物質としては、りん（³²P）、ヨ
ウ素（¹²⁵I）、水素（³H）、蛍光物質としてはフルオレ
セインイソチオシアネート、発光物質としては、アクリ
ジウム塩、金属化合物としては、ユーロピウム（Eu³⁺）
等が好適である。標識を結合させる方法としては、従来
の核酸プローブ法における技術を何れでも用いることが
できる。酵素標識プローブに関しては、レンツ（M.Ren
z）他〔ヌクレイックアシズ リサーチ（Nucleic Acids
Res.）第12巻、第3435頁（1984）〕、ヤブロンスキー
（E.Jablonski）他〔ヌクレイックアシズ リサーチ（N
ucleic Acids Res.）第14巻、第6115頁（1986）〕：蛍
光物質標識プローブに関しては、ルース（J.Ruth）他
〔ディーエヌエー（DNA）第３巻、第122頁（1984）〕、
プロバー（J.Prober）他〔サイエンス（Science）第238
巻、第336頁（1987）〕等、公知の方法にて作成でき
る。Further, one of these probes may be used by binding a label used in the measurement in the step (C). The label may be any substance used in immunoassays, such as enzymes, radioactive substances, luminescent substances, fluorescent substances,
And metal compounds. For example, in the enzyme
Peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, radioactive substances such as phosphorus ( ³² P), iodine ( ¹²⁵ I), hydrogen ( ³ H), fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate, luminescent substances such as acridium salts and metal compounds As europium (Eu ³⁺ )
Etc. are preferred. As a method of binding the label, any of the techniques in the conventional nucleic acid probe method can be used. For enzyme-labeled probes, see Lenz (M. Ren)
z) Others [Nucleic Acids Research
Res.), Vol. 12, pp. 3435 (1984)], E. Jablonski, et al. [Nucleic Acids Research (N
ucleic Acids Res.) Vol. 14, p. 6115 (1986)]: Regarding fluorescent substance-labeled probes, J. Ruth et al. [D.N.A. (DNA) Vol. 3, p. 122 (1984)],
J. Prober, et al. [Science 238
Vol., P. 336 (1987)].

これらの官能基、標識は、（Ａ）から（Ｃ）の工程に
影響を及ぼさないキャリアーを介在させてプローブに結
合させても良い。キャリアーとしては、蛋白質や鎖状の
有機化合物、ポリヌクレオチド等が挙げられる。例とし
て、アル・ハキムら〔ヌクレイックアシズ リサーチ
（Nucleic Acids Res.）第14巻、第9965頁（1986）〕に
よる、DNAプローブにヒストンH1、チトクロムＣおよび
ポリエチレンイミン（分子量60,000）を介して、ビオチ
ン分子を結合させている報告がある。また、検体DNAと
ハイブリダイズしていない、DNAプローブの一端と相補
的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを介して、DNA
プローブとビオチンを結合させているアーディア他〔特
開昭62−188970〕の技術がある。These functional groups and labels may be bound to the probe via a carrier that does not affect the steps (A) to (C). Examples of the carrier include a protein, a chain organic compound, and a polynucleotide. By way of example, Al Hakim et al. (Nucleic Acids Res. Vol. 14, pp. 9965 (1986)) via DNA probes via histone H1, cytochrome C and polyethyleneimine (molecular weight 60,000). There are reports that biotin molecules are bound. In addition, the DNA is not hybridized with the sample DNA, through a polynucleotide having a base sequence complementary to one end of the DNA probe.
There is a technique of Ardia et al. [JP-A-62-188970] in which a probe and biotin are bound.

プローブは少なくとも２種以上作成し、測定の対象や
目的により、最適の組み合わせを任意に選択するが、代
表例として下記のような組み合わせが挙げられる。At least two or more types of probes are prepared, and an optimal combination is arbitrarily selected depending on the measurement object and purpose. Typical examples include the following combinations.

プローブＡ−官能基 プローブＢ−標識 プローブＡ−官能基１ プローブＢ−官能基２ プローブＡ−官能基１ プローブＢ−官能基２ プローブＣ−標識 プローブＡ−官能基１、官能基２ プローブＢ−標識 のように標識プローブをハイブリダイズさせる時に用
いない場合には、後に官能基の標識化を行う。その方法
については、工程（Ｃ）の項で述べる。Probe A-functional group Probe B-label Probe A-functional group 1 Probe B-functional group 2 Probe A-functional group 1 Probe B-functional group 2 Probe C-label Probe A-functional group 1, functional group 2 Probe B- When the labeled probe is not used for hybridization as in the case of labeling, labeling of a functional group is performed later. The method will be described in the step (C).

担体としては、従来サンドイッチ法測定法において使
用されている物全てを使用しうる。例えば、ポリスチレ
ン、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース
等の他、ニトロセルロース、ナイロンが挙げられる。ま
た、その形状はどのようなものであっても良い。担体
は、工程（Ａ）で形成される複合体を結合させるため、
または、担体上で複合体を形成させるために反応基を結
合させておく。反応基は、プローブに結合された官能基
と特異的に結合するものならば、どのようなものでも良
く、例えば、官能基がジニトロフェニル基、トリニトロ
フェニル基等のハプテンのときは、抗ハプテン抗体、官
能基がビオチンのときは、アビジンまたはストレプトア
ビジン、官能基が抗原または抗体のときは、対応する抗
体または抗原が挙げられる。As the carrier, all of those conventionally used in the sandwich measurement method can be used. For example, in addition to polystyrene, polyacryl, Teflon, paper, glass, agarose, etc., nitrocellulose and nylon can be mentioned. Further, the shape may be any shape. The carrier binds the complex formed in step (A),
Alternatively, a reactive group is bound to form a complex on the carrier. The reactive group may be any as long as it specifically binds to the functional group bonded to the probe.For example, when the functional group is a hapten such as a dinitrophenyl group or a trinitrophenyl group, an anti-hapten When the antibody or the functional group is biotin, avidin or streptavidin is used. When the functional group is an antigen or an antibody, the corresponding antibody or antigen is used.

反応基の担体への結合は、免疫学的測定における担体
作成の公知の方法で行われる。 また、反応基と担体の
間に、核酸−プローブ複合体に影響を与えずに切断する
ことができる結合を導入してもよい。このような例とし
て、−Ｓ−Ｓ−結合、ビオチン−アビジン結合、および
抗原（ハプテンを含む）−抗体結合等が挙げられる。The binding of the reactive group to the carrier is performed by a known method for preparing a carrier in an immunological assay. Further, a bond that can be cleaved without affecting the nucleic acid-probe complex may be introduced between the reactive group and the carrier. Such examples include -SS- bonds, biotin-avidin bonds, and antigen (including hapten) -antibody bonds.

工程（Ａ）は次の手順で行う。 Step (A) is performed according to the following procedure.

まず、被検波に２種以上のプローブを加えて、通常の
DNAプローブ法で用いられる条件下、測定すべき核酸と
プローブから構成される複合体を形成させる。反応は一
般には20〜75℃、数時間〜数十時間、好ましくは65〜72
℃、10〜20時間行う。このようにして形成された核酸−
プローブ複合体は免疫学的測定に通常用いられる条件
で、担体に結合させる。プローブと測定すべき核酸を反
応させ、核酸−プローブ複合体形成後、担体と結合させ
る方法、または、プローブと測定すべき核酸と担体とを
同時に加えて、核酸−プローブ複合体形成を担体上で行
わせる方法等がある。後者は工程を簡略にできるので望
ましい。First, two or more probes are added to the test
Under the conditions used in the DNA probe method, a complex composed of the nucleic acid to be measured and the probe is formed. The reaction is generally performed at 20 to 75 ° C. for several hours to several tens of hours, preferably 65 to 72 hours.
C. for 10-20 hours. Nucleic acid thus formed-
The probe complex is bound to a carrier under conditions commonly used for immunological measurements. The probe is reacted with the nucleic acid to be measured, and after forming the nucleic acid-probe complex, a method of binding to the carrier, or the probe and the nucleic acid to be measured and the carrier are simultaneously added to form the nucleic acid-probe complex on the carrier. There is a method to make it. The latter is desirable because the process can be simplified.

担体上に複合体を結合させた後、一般には担体の洗浄
を行う。洗浄は免疫学的測定で用いる公知の方法で行わ
れる。After binding the complex onto the carrier, the carrier is generally washed. Washing is performed by a known method used for immunological measurement.

工程（Ｂ）について 本工程はバックグラウンドの原因となる、担体に非特
異的に結合した標識プローブ及び非特異的核酸から、核
酸−プローブ複合体を含む成分を選択的に分離する工程
である。Step (B) This step is a step of selectively separating a component containing a nucleic acid-probe complex from a labeled probe and a non-specific nucleic acid non-specifically bound to a carrier, which causes a background.

複合体の解離は下記のいずれかの結合を切断して行
う。The dissociation of the complex is performed by cleaving any of the following bonds.

１）官能基と反応基の結合 ２）官能基とプローブの結合 ３）反応基と担体の結合 核酸−プローブ複合体に影響を与えずに解離させる好
ましい方法は、上記の結合に関与する結合物質対にお
いて、一方の物質と置換しうる反応部位を有する物質を
加えること、還元剤または酸化剤を加えること、等で
ある。具体的には、結合がジニトロフェニル基またはト
リニトロフェニル基等のハプテン−抗ハプテン抗体のと
きには、ジニトロフェニルアミノ酸（例：ジニトロフェ
ニルリジン）、ビオチン−アビジンまたはストレプトア
ビジンのときには、ビオチンを添加する。結合が−Ｓ−
Ｓ−である場合、−Ｓ−Ｓ−を切断する試薬、例えば２
−メルカプトエタノール等を用いる。1) Bonding between a functional group and a reactive group 2) Bonding between a functional group and a probe 3) Bonding between a reactive group and a carrier The preferred method of dissociating without affecting the nucleic acid-probe complex is a binding substance involved in the above-mentioned binding. In the pair, adding a substance having a reaction site capable of replacing one of the substances, adding a reducing agent or an oxidizing agent, and the like. Specifically, when the bond is a hapten-anti-hapten antibody such as a dinitrophenyl group or a trinitrophenyl group, biotin is added when the bond is a dinitrophenyl amino acid (eg, dinitrophenyl lysine), biotin-avidin or streptavidin. The bond is -S-
If S-, a reagent that cleaves -SS-, for example, 2
-Use mercaptoethanol or the like.

工程（Ｃ）について 工程（Ｂ）で解離された核酸−プローブ複合体を含む
成分を定量する工程である。Step (C) This is a step of quantifying a component containing the nucleic acid-probe complex dissociated in step (B).

解離された核成分はそのまま溶液状態で定量しても良
く、また他の担体に結合させ、洗浄後定量しても良い。
この他の担体への結合は公知の材料、方法にて行うこと
ができる。そして、免疫学的測定に通常用いられる方法
で定量する。測定法の例として、放射性同位元素、酵
素、蛍光物質等を用いた方法が、臨床病理〔（The Japa
nese Journal of Clinical Pathology）、臨時増刊特集
第53号、昭和58年２月28日発行〕に総括されている。The dissociated nuclear component may be quantified in a solution state as it is, or may be bound to another carrier and then quantified after washing.
Bonding to other carriers can be performed by known materials and methods. Then, quantification is performed by a method usually used for immunological measurement. As an example of the measurement method, a method using a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, or the like is used in clinical pathology [(The Japa
nese Journal of Clinical Pathology), Special Issue No. 53, published February 28, 1983].

解離された核酸−プローブ複合体を含む成分を測定す
るには、核成分中の標識を用いる。従って、工程（Ａ）
の項で記載したように、標識プローブを工程（Ａ）のハ
イブリダイゼーションに用いない場合は、後の工程で反
応基を結合させた標識を加え、核酸−プローブ複合体上
の官能基に結合させて標識化を行う。To measure the component containing the dissociated nucleic acid-probe complex, a label in the nuclear component is used. Therefore, step (A)
As described in the section, when the labeled probe is not used for the hybridization in the step (A), a label to which a reactive group is bound in a later step is added, and the labeled probe is bound to a functional group on the nucleic acid-probe complex. Labeling.

ここで用いる反応基と官能基は、工程（Ａ）で担体と
核酸−プローブ複合体との結合に用いる様なアフィニテ
ィ結合物質対であり、強い結合性を有するものが好まし
い。例としてアビジン−ビオチンが挙げられる。反応基
と結合させた標識は当分野で公知の方法により作成され
る。標識と官能基及び反応基の選択は任意であるが、標
識化に用いる反応基−官能基は、担体と核酸−プローブ
複合体の結合に関与している反応基−官能基とは異なる
ものを選ぶ。また、担体との結合に関与しているプロー
ブには標識を導入しない。The reactive group and the functional group used here are an affinity binding substance pair used for binding the carrier and the nucleic acid-probe complex in the step (A), and those having strong binding properties are preferable. An example is avidin-biotin. Labels attached to reactive groups are made by methods known in the art. Selection of the label, the functional group and the reactive group is optional, but the reactive group-functional group used for labeling is different from the reactive group-functional group involved in the binding between the carrier and the nucleic acid-probe complex. Choose. Also, no label is introduced into the probe involved in binding to the carrier.

標識化する時点は任意であるが、溶液状態で定量する
場合は、担体から核酸−プローブ複合体を最終的に解離
する前に行う。また、他の担体上で定量する場合は最終
的な担体洗浄の前の適切な時点を選んで行う。The time of labeling is arbitrary, but when quantifying in a solution state, it is performed before the nucleic acid-probe complex is finally dissociated from the carrier. In the case of quantification on another carrier, an appropriate time point before final carrier washing is selected.

例を挙げれば、工程（Ａ）の核酸−プローブ複合体
形成後工程（Ｂ）の複合体解離前工程（Ｃ）の他の
担体への複合体結合後、等である。For example, after the binding of the complex to another carrier after the nucleic acid-probe complex formation in the step (A) and before the complex dissociation in the step (B) in the step (B).

このハイブリダイゼーション終了後に標識を導入する
方法は、特に酵素で標識する場合に好ましい。一般に酵
素の分子量は大きいため、酵素標識プローブを用いた場
合、各プローブと、測定すべき核酸とのハイブリダゼー
ションが阻害されるかも知れないからである。This method of introducing a label after completion of hybridization is particularly preferable when labeling with an enzyme. In general, since the molecular weight of an enzyme is large, when an enzyme-labeled probe is used, hybridization between each probe and a nucleic acid to be measured may be inhibited.

以上説明したように、本発明は従来の核酸サンドイッ
チ法におけるバックグラウンドの原因であった、担体に
非特異的に結合する標識プローブおよび非特異的核酸を
除くことにより、より高感度に特異的核酸を定量しうる
測定法を提供するものである。As described above, the present invention removes a labeled probe and a non-specific nucleic acid that non-specifically bind to a carrier, which are the cause of the background in the conventional nucleic acid sandwich method, thereby allowing a specific nucleic acid to be detected with higher sensitivity. The present invention provides a measurement method capable of quantifying

以下、本発明を実施例に即して説明するがもとより、
これに限られるものではない。Hereinafter, the present invention will be described based on Examples,
However, it is not limited to this.

実施例 １ 検体用DNA及びプローブ用DNAの調製 測定の検体モデル用DNA及びそれの一部分と相補的な
配列をもつ二種のプローブ用DNAは、全自動DNA合成機MO
DEL 381A（アプライド・バイオシステム、カルフォルニ
ア州）を用い、同社の操作手引書に従い、公知の方法
〔M.D.マツーシ（M.D.Matteucci）ら、ジャーナル オ
ブ アメリカン ケミカル ソサイエティ（J.Am.Chem.
Soc.）第103巻，第3185頁（1981）〕で合成した。合成
後、150シリーズセパレーションシステム（アプライド
・バイオシステム）を用い、逆相の高速液体クロマトグ
ラフィーにより精製を行った。Example 1 Preparation of DNA for sample and DNA for probe DNA for sample model for measurement and two types of probe DNAs having a sequence complementary to a part of the DNA were used for a fully automatic DNA synthesizer MO.
Using DEL 381A (Applied Biosystems, Calif.), According to the manufacturer's instructions, a known method [MD Matteucci et al., Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem.
Soc.) 103, 3185 (1981)]. After the synthesis, purification was performed by reversed-phase high-performance liquid chromatography using a 150 series separation system (Applied Biosystem).

上記の方法で調製した各DNAの塩基配列を以下に示
す。The base sequence of each DNA prepared by the above method is shown below.

³²P標識DNAプローブの調製 プローブDNA−2 10μｇ（1.5nmole）に対して〔γー
³²P〕アデノシン３リン酸（アマシャム・ジャパン、東
京）20nmole（５μCi/nmole）及びT4ポリヌクレオチド
・キナーゼ（東洋紡，大阪）80単位を用い、公知方法
〔C.C.リチャードソン（C.C.Richardson）、プロシーデ
ィングス オブ ナショナル アカデミィ オブ サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）第54巻，第158頁
（1965）〕で、５′末端を³²P標識した。次いでPD−10
カラム（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を用
いて0.15M塩化ナトリウムおよび1mM EDTAを含む0.1Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液でゲルろ過を行った後、70％エタ
ノールで沈澱させて、プローブを精製した。 Preparation of ³² P-Labeled DNA Probe Probe DNA-2 [10 μg (1.5 nmole) [γ-
³² P] Adenosine triphosphate (Amersham Japan, Tokyo), 20 nmole (5 μCi / nmole) and T4 polynucleotide kinase (Toyobo, Osaka) 80 units, using known methods [CC Richardson, Proceedings of National In the Academia of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 54, p. 158 (1965), the 5 'end was labeled with ³² P. Then PD-10
After gel filtration using a column (Pharmacia, Uppsala, Sweden) with a 0.1 M sodium phosphate buffer containing 0.15 M sodium chloride and 1 mM EDTA, the probe was purified by precipitation with 70% ethanol.

ビオチニル−DNAプローブの調製 プローブDNA−1 10μｇ（1.5nmole）に対して、アデ
ノシン３リン酸（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデ
ン）80nmole及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ80単位を
用い、公知の方法〔C.C.リチャードソン（C.C.Richards
on）、プロシーディングス オブ ナショナル アカデ
ミィ オブ サイエンス（前出）〕で５′末端にリン酸
基を導入した。次いでリン酸基の先にアミノ基を導入
し、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルビオチンを結合させ
る公知の方法〔C.F.バーバラ（C.F.Barbara）ら、ディ
ーエヌエー（DNA）、第４巻、第327頁（1985）〕に従っ
てプローブDNAの５′末端にビオチン分子を導入した。
反応後、前述同様PD−10カラムによるゲルろ過及びエタ
ノール沈澱によりプローブの精製を行った。³² Pの放射活性の測定 各ポリスチレンボールに結合した³²P放射活性の測定
は、ポリスチレンボールをキシレン系液体シンチレータ
ACS II（アマシャム・ジャパン、東京）5mlを含むミニ
バイアル中で激しく撹拌した後、液体シンチレーション
カウンター（パッカード、MINAXI TRI−CARB 4000）を
用いて５分間計測で行った。Preparation of biotinyl-DNA probe To 10 μg (1.5 nmole) of probe DNA-1, 80 nmole of adenosine triphosphate (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and 80 units of T4 polynucleotide kinase were used, and a known method [CC Richardson (CC Richardson) was used.
on), Proceedings of National Academy of Science (supra)] to introduce a phosphate group at the 5 'end. Next, a known method of introducing an amino group prior to a phosphate group and binding N-hydroxysuccinimidyl biotin [CF Barbara et al., D.N.A. (DNA), vol. 4, p. 327 (1985)] ], A biotin molecule was introduced into the 5 'end of the probe DNA.
After the reaction, the probe was purified by gel filtration using a PD-10 column and ethanol precipitation as described above. ³² measurements of ³² P radioactivity measured bound to each polystyrene balls radioactivity P is xylene-based liquid scintillator polystyrene balls
After vigorously stirring in a mini vial containing 5 ml of ACS II (Amersham Japan, Tokyo), measurement was performed for 5 minutes using a liquid scintillation counter (Packard, MINAXI TRI-CARB 4000).

ジニトロフェニル−アビジン結合 ウサギ（抗ジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化固相の調製 （１） ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン）IgG不溶化固相の調製 ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）
IgG（生化学工業、東京）4.23gを溶解した0.0175M リ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH6.3）に0.747gの硫酸ナトリ
ウムを少しずつ加え、０℃ 30分間撹拌した後10,000×
ｇで15分間遠心した。沈澱を4.0mlの0.0175Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.3）に溶解し、同緩衝液で透析した
後、DE−52セルロース（ワットマン、ケント州、イギリ
ス）カラム（1.6×8.0cm）を用いて、塩化ナトリウムの
直線濃度勾配による陰イオン交換クロマトグラフィーを
行った。IgGを含む分画を集め、0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.0）で透析した後IgG濃度を280nmにおける
吸光係数1.5g^-1・ｌ・cm^-1から求め、0.1g/になるよ
うに同緩衝液で希釈した。Preparation of rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized solid phase (1) Preparation of rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized solid phase rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin)
To a 0.0175 M sodium phosphate buffer (pH 6.3) in which 4.23 g of IgG (Seikagaku, Tokyo) was dissolved, 0.747 g of sodium sulfate was added little by little, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes and then 10,000 ×
Centrifuged at g for 15 minutes. The precipitate was dissolved in 4.0 ml of 0.0175 M sodium phosphate buffer (pH 6.3), dialyzed with the same buffer, and then using a DE-52 cellulose (Whatman, Kent, UK) column (1.6 × 8.0 cm). Anion exchange chromatography was performed using a linear concentration gradient of sodium chloride. The fractions containing IgG were collected, dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the IgG concentration was determined from the extinction coefficient at 280 nm of 1.5 g ^-1 · l · cm ^-1 , and was adjusted to 0.1 g /. Was diluted with the same buffer.

次いで、この溶液を用いてポリスチレンボール〔直径
3.2mm（プレシジョン・プラスチックボール、シカ
ゴ）〕表面上に公知の方法〔石川ら、スカンジナビアン
ジャーナル オブ イムノロジー（Scand.J.Immuno
l.）第８巻（補７）第43頁（1978）〕で、物理的吸着に
よる不溶化した。Then, using this solution, a polystyrene ball [diameter
3.2 mm (Precision Plastic Ball, Chicago)] on a surface by known methods [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology (Scand.J.Immuno)
l.) Volume 8 (Supplement 7) p. 43 (1978)].

（２） ジニトロフェニル−アビジンの調製 （ｉ）メルカプトサクシニル−アビジンの調製0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解したアビジンＤ
（ベクター社）1mgにＳ−アセチルメルカプト−サクシ
ニック−アンハイドライド（ナカライテスク、京都）を
用いて、公知の方法〔石川ら、ジャーナル オブ イム
ノアッセイ（J.Immunoassay）第４巻、第209頁（198
3）〕に従ってチオール基を導入した。導入されたチオ
ール基の数はアビジン１分子当たり13個であった。(2) Preparation of dinitrophenyl-avidin (i) Preparation of mercaptosuccinyl-avidin Avidin D dissolved in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.5)
(Vector) 1-mg of S-acetylmercapto-succinic-anhydride (Nacalai Tesque, Kyoto) using a known method [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay (J. Immunoassay), Vol. 4, 209 (198)
3)] to introduce a thiol group. The number of thiol groups introduced was 13 per avidin molecule.

（ii）マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンの調
製 5.5mM 2,4−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン塩酸塩
（東京化成，東京）を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.0）1.7mlと、5.5mM Ｎ−サクシニミジル−６−
マレイミドヘキサノエート（同仁化学，熊本）を溶解し
たN,N−ジメチルホルムアミド0.17mlとを30℃で30分反
応させた。(Ii) Preparation of maleimide-dinitrophenyl-L-lysine 1.7 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 5.5 mM 2,4-dinitrophenyl-L-lysine hydrochloride (Tokyo Kasei, Tokyo) , 5.5 mM N-succinimidyl-6
0.17 ml of N, N-dimethylformamide in which maleimide hexanoate (Dojindo Chemical, Kumamoto) was dissolved was reacted at 30 ° C. for 30 minutes.

（iii）ジニトロフェニル−アビジンの調製 （ｉ）で調製したメルカプトサクシニル−アビジン0.
54mgを溶解した、5mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）
を含む、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）1.0mlと
（ii）で調製したマレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−
リジン溶液0.43mlとを30℃で30分反応させた後、同緩衝
液に溶解した0.1M N−エチルマレイミド（ナカライテス
ク，京都）５μを加え30℃で15分保温した。反応液を
セファデックスＧ−25（ファルマシア、スウェーデン）
カラム（1.0×30cm）を用い、0.1Mリン酸ナトリウム緩
衝液でゲルろ過を行った。アビジン１分子当り導入され
たジニトロェニル基の数は７個であった。(Iii) Preparation of dinitrophenyl-avidin Mercaptosuccinyl-avidin prepared in (i).
5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) with 54 mg dissolved
Containing 1.0 ml of a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) and maleimide-dinitrophenyl-L- prepared in (ii).
After reaction with 0.43 ml of the lysine solution at 30 ° C. for 30 minutes, 5 μM of 0.1 M N-ethylmaleimide (Nacalai Tesque, Kyoto) dissolved in the same buffer was added, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 15 minutes. The reaction solution was separated by Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden).
Using a column (1.0 × 30 cm), gel filtration was performed with a 0.1 M sodium phosphate buffer. The number of dinitroenyl groups introduced per avidin molecule was 7.

（３）ジニトロフェニル−アビジン結合ウサギ（抗ジニ
トロフェニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化固相の
調製 （１）で調製したウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ
血清アルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボールを、
（２）で調製したジニトロフェニル−アビジンを溶解し
た（0.1g/）、0.1M塩化ナトリウムおよび0.1％ウシ血
清アルブミンを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.0）中で、30℃10時間保温して反応させた。(3) Preparation of dinitrophenyl-avidin-conjugated rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized solid phase The rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized polystyrene ball prepared in (1) was
The dinitrophenyl-avidin prepared in (2) was dissolved (0.1 g /) in 0.01 M sodium phosphate buffer (pH: 0.1 M) containing 0.1 M sodium chloride and 0.1% bovine serum albumin.
In 7.0), the reaction was carried out at 30 ° C. for 10 hours.

ポリスチレンボールは、0.1M塩化ナトリウム、0.1％
ウシ血清アルブミンおよび0.1％アジ化ナトリウムを含
む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中で保存し
た。Polystyrene ball is 0.1M sodium chloride, 0.1%
Stored in 0.01 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing bovine serum albumin and 0.1% sodium azide.

ビオチニル−ウシ血清アルブミン不溶化固相の調製 （１） Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミン
の調製 Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル−ビオチン（ピアスケ
ミカル，イリノイ州）に２−メルカプトエチルアミンを
用いて公知の方法〔石川ら、バイオケミカル アンド
バイオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.）、第147巻、第644頁（198
7）〕でチオール基を導入した。Preparation of Biotinyl-Bovine Serum Albumin Insolubilized Solid Phase (1) Preparation of N-Biotinyl-2-mercaptoethylamine A known method using 2-mercaptoethylamine for N-hydroxysuccinimidyl-biotin (Pierce Chemical, Ill.) [ Ishikawa et al., Biochemical and
Biophysical Research Communication (Bi
ochem. Biophys. Res. Commun.), 147, 644 (198
7)] to introduce a thiol group.

（２） マレイミド−ウシ血清アルブミンの調製ウシ血
清アルブミン（ナカライテスク、京都）にＮ−サクシニ
ミジル−６−マレイミドヘキサノエートを用い、公知の
方法〔橋田ら、ジャーナルオブ アプライド バイオケ
ミストリー（J.Appl.Biochem.）第６巻、第56頁（198
4）〕に従ってマレイミド基を導入した。導入されたマ
レイミド基の数は、ウシ血清アルブミン１分子当り11個
であった。(2) Preparation of maleimide-bovine serum albumin Using N-succinimidyl-6-maleimidohexanoate for bovine serum albumin (Nacalai Tesque, Kyoto), a known method [Hashida et al., Journal of Applied Biochemistry (J. Appl. Biochem.) Volume 6, page 56 (198
4)], a maleimide group was introduced. The number of maleimide groups introduced was 11 per bovine serum albumin molecule.

（３） ビチチニル−ウシ血清アルブミンの調製（２）
で調製したマレイミド−ウシ血清アルブミン10mgを溶解
した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
0）2.0mlに（１）で調製したＮ−ビオチニル−２−メル
カプトエチルアミン溶液0.22mlを加え30℃、30分反応さ
せた。反応後、0.1M 2−メルカプトエチルアミンを溶解
した5mM EDTAを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
0）0.05mlを加え、セファデックスＧ−25（ファルマシ
ア、スウェーデン）カラム（1.0×30cm）を用い、0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）でゲルろ過を行っ
た。ウシ血清アルブミン１分子当りに導入されたビオチ
ン分子は７個であった。(3) Preparation of bititinyl-bovine serum albumin (2)
0.1M sodium phosphate buffer containing 5 mM EDTA in which 10 mg of maleimide-bovine serum albumin prepared in
0) 0.22 ml of the N-biotinyl-2-mercaptoethylamine solution prepared in (1) was added to 2.0 ml, and the mixture was reacted at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.20) containing 5 mM EDTA in which 0.1 M 2-mercaptoethylamine is dissolved.
0) Add 0.05 ml, and use a Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden) column (1.0 × 30 cm) to obtain 0.1 M
Gel filtration was performed with a sodium phosphate buffer (pH 7.5). Seven biotin molecules were introduced per bovine serum albumin molecule.

（４） ビオチニル−ウシ血清アルブミン不溶化固相の
調製 （３）で調製したビオチニル−ウシ血清アルブミン溶
液（0.1g/）を用いて、ポリスチレンボール〔直径3.2
mm（プレシジョン社、シカゴ）〕表面上に公知の方法
〔石川ら、スカンジナビアンジャーナル オブ イムノ
ロジー（前出）〕で、物理的吸着により不溶化した。(4) Preparation of Biotinyl-Bovine Serum Albumin Insolubilized Solid Phase Using the biotinyl-bovine serum albumin solution (0.1 g /) prepared in (3), a polystyrene ball [diameter 3.2
mm (Precision, Chicago)] on the surface by physical adsorption using a known method [Ishikawa et al., Scandinavian Journal of Immunology (supra)].

検体DNAの測定 種々の濃度に希釈した検体DNA（ｎ＝６）、5ngの³²P
標識DNAプローブ、5ngのビオチニル−DNAプローブ、100
ngのサケ***の単鎖DNA、0.15M塩化ナトリウム、1mM ED
TAおよび0.1％ウシ血清アルブミンを含む、0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.15mlを65℃、16時間保温
した。室温に戻した後、ジニトロフェニル−アビジン結
合ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）
IgG不溶化ポリスチレンボールを１個添加し、30℃５時
間反応させた。ボールを0.15M塩化ナトリウム、1mM EDT
A及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH7.0）2mlで２回洗浄した後、150nmoleの
ジニトロフェノール−Ｌ−リジン（東京化成工業、東
京）を溶解した、0.15M塩化ナトリウム、1mM EDTA及び
0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.0）0.15ml中でビオチニル−ウシ血清アル
ブミン不溶化ポリスチレンボール１個とともに30℃、２
時間反応させた。ジニトロフェニル−アビジン結合ウサ
ギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）IgG不
溶化ポリスチレンボールを除去した後、さらに30℃、３
時間反応させた。ポリスチレンボールを上述と同様に洗
浄した後、ポリスチレンボールに結合した³²Pの放射活
性を測定した。結果を第１図に示す。Measurement of sample DNA Sample DNA diluted to various concentrations (n = 6), 5 ng of ³² P
Labeled DNA probe, 5 ng biotinyl-DNA probe, 100
ng salmon sperm single-stranded DNA, 0.15 M sodium chloride, 1 mM ED
0.15 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing TA and 0.1% bovine serum albumin was kept at 65 ° C. for 16 hours. After returning to room temperature, dinitrophenyl-avidin-conjugated rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin)
One IgG insolubilized polystyrene ball was added and reacted at 30 ° C. for 5 hours. Balls 0.15M sodium chloride, 1mM EDT
After washing twice with 2 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing A and 0.1% bovine serum albumin, 150 nmole of dinitrophenol-L-lysine (Tokyo Kasei Kogyo, Tokyo) was dissolved. Sodium chloride, 1 mM EDTA and
In 0.15 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% bovine serum albumin, at a temperature of 30 ° C. with one biotinyl-bovine serum albumin-insoluble polystyrene ball.
Allowed to react for hours. After removing the dinitrophenyl-avidin-conjugated rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG insolubilized polystyrene ball, the mixture was further treated at 30 ° C.
Allowed to react for hours. After washing the polystyrene ball as described above, the radioactivity of ³² P bound to the polystyrene ball was measured. The results are shown in FIG.

比較例 １ 検体用およびプローブ用DNAの調製、固相の調製、お
よび放射活性の測定は実施例１の方法に従った。Comparative Example 1 Preparation of DNA for a sample and a probe, preparation of a solid phase, and measurement of radioactivity followed the method of Example 1.

検体DNAの測定 種々の濃度に希釈した検体DNA（ｎ＝６）、5ngの³²P
標識DNAプローブ、5ngのビオチニル−DNAプローブ、100
ngのサケ***の単鎖DNA、0.15M塩化ナトリウム1mM EDTA
および0.1％ウシ血清アルブミンを含む、0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）0.15mlを65℃、16時間保温し
た。室温に戻した後、ジニトロフェニル−アビジン結合
ウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン）Ig
G不溶化ポリスチレンボールを１個添加し、30℃で５時
間反応させた。ポリスチレンボールを0.15M塩化ナトリ
ウム、1mM EDTA及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1
Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）2mlで２回洗浄した
後、ポリスチレンボールに結合した³²Pの放射活性を測
定した。結果を第１図に示す。Measurement of sample DNA Sample DNA diluted to various concentrations (n = 6), 5 ng of ³² P
Labeled DNA probe, 5 ng biotinyl-DNA probe, 100
ng salmon sperm single-stranded DNA, 0.15 M sodium chloride 1 mM EDTA
And 0.15 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% bovine serum albumin was kept at 65 ° C. for 16 hours. After returning to room temperature, dinitrophenyl-avidin-conjugated rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) Ig
One G insolubilized polystyrene ball was added and reacted at 30 ° C. for 5 hours. Polystyrene balls are loaded with 0.15 M sodium chloride, 0.1 mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin.
After washing twice with 2 ml of M sodium phosphate buffer (pH 7.0), the radioactivity of ³² P bound to the polystyrene balls was measured. The results are shown in FIG.

本発明による実施例の測定限界は10pg（0.6fmole）で
あった。従来法である比較例に比して、バックグラウン
ドが約1/8に減少し、３倍の感度向上が認められた。The measurement limit of the example according to the present invention was 10 pg (0.6 fmole). The background was reduced to about 1/8 compared to the comparative example, which was a conventional method, and a three-fold improvement in sensitivity was observed.

実施例 ２ 検体用DNA及びプローブ用DNAの調製、³²P識別DNAプロ
ーブの調製、及びウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血
清アルブミン）IgG不溶化固相の調製は実施例１の方法
に従った。Example 2 Preparation of a sample DNA and a probe DNA, preparation of a ³² P discriminating DNA probe, and preparation of a rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized solid phase were performed in accordance with the method of Example 1.

ジニトロフェニル−DNAプローブの調製 （１） ５′−アミノヘキシルホスホールアミデート−
DNAの調製 プローブDNA−１ 10μｇ（1.5nmole）に対して、ア
デノシン３リン酸（ファルマシア、ウプサラ、スウェー
デン）80nmole及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ80単位
を用い、公知の方法〔C.C.リチャードソン（C.C.Richar
dson）、プロシーディングス オブ ナショナル アカ
デミィ オブ サイエンス（前出）〕で５′末端にリン
酸基を導入した。次いで、0.1Mイミダゾール−塩酸緩衝
液（pH6.0）で、１−エチル−3,3−ジメチルアミノプロ
ピルカルボジイミド（ナカライテスク、京都）により導
入したリン酸基に イミド基を結合させた後、1.6−ジ
アミノヘキサン（ナカライテスク）を反応させる公知の
方法〔A.コレット（A.Chollet）ら、ヌクレイックアシ
ズ リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第13巻、第1529
頁（1985）〕に従って、５′−末端にアミノ基を導入し
た。Preparation of dinitrophenyl-DNA probe (1) 5'-aminohexylphosphoramidate-
Preparation of DNA To 10 μg (1.5 nmole) of probe DNA-1, 80 nmole of adenosine triphosphate (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and 80 units of T4 polynucleotide kinase were used and a known method [CC Richardson (CC Richardchar) was used.
dson), Proceedings of National Academy of Science (supra)] to introduce a phosphate group at the 5 'end. Next, an imido group was bonded to a phosphate group introduced with 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (Nacalai Tesque, Kyoto) using a 0.1 M imidazole-hydrochloric acid buffer solution (pH 6.0), followed by 1.6 A known method of reacting diaminohexane (Nacalai Tesque) [A. Chollet et al., Nucleic Acids Res., Vol. 13, No. 1529
(1985)], an amino group was introduced at the 5'-terminal.

（２） サクシニミジル−2,4−ジニトロフェニル−ξ
−カプロン酸の合成 2,4−ジニトロフェニル−ξ−カプロン酸（シグマ
社、ミズーリ州）と、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（和
光純薬工業、大阪）をジクロロカルボジイミド（和光純
薬工業）により縮合される公知の方法〔F.レビ・シェー
ファー（F.levi−schaffer）ら、アメリアン ジャーナ
ル オブ トロピカル メディスン アンド ハイジー
ン（Am.J.Trop.Med.Hyg.、第32巻、第343頁（1983）〕
によりサクシニミジル−2,4−ジニトロフェニル−ξ−
カプロン酸を合成した。次いで、シリカゲル（40g）カ
ラムを用い、クロロホルム／メタノール〔40/1（V/
V）〕の系で精製を行った後、NMR（核磁気共鳴法）およ
び質量スペクトル法による製造を確認した。(2) Succinimidyl-2,4-dinitrophenyl-ξ
-Synthesis of caproic acid 2,4-Dinitrophenyl- フ ェ ニ ル -caproic acid (Sigma, MO) and N-hydroxysuccinimide (Wako Pure Chemical Industries, Osaka) condensed with dichlorocarbodiimide (Wako Pure Chemical Industries) [F. Levi-schaffer et al., Amerian Journal of Tropical Medicine and Hygene, Am. J. Trop. Med. Hyg., Vol. 32, 343 (1983)]
With succinimidyl-2,4-dinitrophenyl-ξ-
Caproic acid was synthesized. Then, using a silica gel (40 g) column, chloroform / methanol [40/1 (V /
V)], the production was confirmed by NMR (nuclear magnetic resonance) and mass spectrometry.

（３） ジニトロフェニル−DNAプローブの調製 （１）で調製した５′−アミノヘキシルホスホールア
ミデート−DNA 150pmoleを溶解した0.01Mリン酸カリウ
ム緩衝液（pH7.5）50μｌに、（２）で調製したサクシ
ニミジル−2,4−ジニトロフェニル−ξ−カプロン酸50n
moleを含むN,N−ジメチルホルムアミド50μｌを加え、2
0℃、20時間反応させた。反応後RPC−５カラム（アプラ
イド・バイオシステム）を用いる公知の方法〔R.L.ピア
ソン（R.L.Peason）ら、バイオケミカル エト バイオ
フィジカ アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、第228
巻、第770頁（1971）〕で高速液体クロマトグラフィー
を行って未反応DNAを除き、さらにエタノール沈澱によ
りプローブを精製した。³² Pの放射活性の測定 反応溶液中に含まれる³²P放射活性の測定は、反応溶
液全量（150μｌ）をキシレン系液体シンチレータACS I
I（アマシャム・ジャパン、東京）5mlを含むミニバイア
ル中で激しく撹拌した後、液体シンチレーションカウン
ター（パッカード、MINAXI TRI−CARB 4000）を用いて
５分間計測で行った。(3) Preparation of dinitrophenyl-DNA probe In 50 μl of 0.01 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) in which 150 pmole of 5′-aminohexylphosphoramidate-DNA prepared in (1) was dissolved, and in (2) The prepared succinimidyl-2,4-dinitrophenyl-ξ-caproic acid 50n
Add 50 μl of N, N-dimethylformamide containing moles and add
The reaction was performed at 0 ° C. for 20 hours. After the reaction, a known method using an RPC-5 column (Applied Biosystem) [RL Pearson et al., Biochemical E. Biophysis. Acta, No. 228]
Volume, p. 770 (1971)] to remove unreacted DNA by high performance liquid chromatography, and further, the probe was purified by ethanol precipitation. ³² measurements of ³² P radioactivity contained in the measurement reaction solution radioactivity of P, the reaction solution the total amount (150 [mu] l) The xylene-based liquid scintillator ACS I
After vigorously stirring in a mini vial containing 5 ml of I (Amersham Japan, Tokyo), measurement was performed for 5 minutes using a liquid scintillation counter (Packard, MINAXI TRI-CARB 4000).

検体DNAの測定 種々の濃度に希釈した検体DNA（ｎ＝６）、2ngの³²P
標識DNAプローブ、2ngのジニトロフェニル−DNAプロー
ブ、100ngのサケ***の単鎖DNA、0.15M塩化ナトリウ
ム、1mM EDTAおよび0.1％ウシ血清アルブミンを含む、
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.15mlを65℃、1
6時間保温した。室温に戻した後、ウサギ（抗ジニトロ
フェニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリスチレ
ンボールを１個添加し、30℃、５時間反応させた。ボー
ルを0.15M塩化ナトリウム、1mM EDTA及び0.1％ウシ血清
アルブミンを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）2mlで２回洗浄した後、150nmoleのジニトロフェノー
ル−Ｌ−リジン（東京化成工業、東京）を溶解した、0.
15M塩化ナトリウム、1mM EDTA及び0.1％ウシ血清アルブ
ミンを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.15m
l中で30℃、２時間反応させた。Measurement of sample DNA Sample DNA diluted to various concentrations (n = 6), 2 ng of ³² P
Containing a labeled DNA probe, 2 ng of dinitrophenyl-DNA probe, 100 ng of single-stranded DNA of salmon sperm, 0.15 M sodium chloride, 1 mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin,
0.15 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) at 65 ° C, 1
It was kept warm for 6 hours. After returning to room temperature, one rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized polystyrene ball was added and reacted at 30 ° C. for 5 hours. The ball was placed in a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.10) containing 0.15 M sodium chloride, 1 mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin.
0) After washing twice with 2 ml, 150 nmole of dinitrophenol-L-lysine (Tokyo Kasei Kogyo, Tokyo) was dissolved.
0.15m of 0.1M sodium phosphate buffer (pH7.0) containing 15M sodium chloride, 1mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin
The reaction was carried out at 30 ° C. for 2 hours in l.

反応後溶液150μｌ全量をとり、標識DNAプローブの³²
P放射活性を測定した。結果を第２図に示す。Take the reaction solution after 150μl total amount, of labeled DNA probes ³²
P radioactivity was measured. The results are shown in FIG.

比較例 ２ 検体DNA、ジニトロフェニルDNAプローブ、³²P標識DNA
プローブおよびウサギ（抗ジニトロフェニル−ウシ血清
アルブミン）IgG不溶化固相の調製は実施例１の方法に
従った。³² P放射活性の測定 各ポリエスチレンボールに結合した³²P標識DNAプロー
ブの放射活性の測定は、ポリスチレンボールを液体シン
チレータを含むミニバイアルに入れ、実施例と同様の条
件で計測を行った。Comparative Example 2 Sample DNA, dinitrophenyl DNA probe, ³² P-labeled DNA
Preparation of the probe and rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized solid phase followed the method of Example 1. Measurement of ³² P radioactivity The radioactivity of the ³² P-labeled DNA probe bound to each polystyrene ball was measured by placing the polystyrene ball in a mini vial containing a liquid scintillator under the same conditions as in the examples.

検体DNAの測定 種々の濃度に希釈した検体DNA（ｎ＝６）、2ngの³²P
標識DNAプローブ、2ngのジニトロフェニル−DNAプロー
ブ、100ngのサケ***の単鎖DNA、0.15M塩化ナトリウム
−1mM EDTAおよび0.1％ウシ血清アルブミンを含む、0.1
Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.15mlを65℃、16時
間保温した。室温に戻した後、ウサギ（抗ジニトロフェ
ニル−ウシ血清アルブミン）IgG不溶化ポリスチレンボ
ールを１個添加し、30℃で５時間反応させた。ボリスチ
レンボールを0.15M塩化ナトリウム、1mM EDTA及び0.1
％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.0）2mlで２回洗浄した後、ポリスチレンボール
に結合した³²Pの放射活性を測定した。結果を第２図に
示す。Measurement of sample DNA Sample DNA diluted to various concentrations (n = 6), 2 ng of ³² P
Labeled DNA probe, 2 ng dinitrophenyl-DNA probe, 100 ng salmon sperm single stranded DNA, 0.15 M sodium chloride-1 mM EDTA and 0.1% bovine serum albumin containing
0.15 ml of M sodium phosphate buffer (pH 7.0) was kept at 65 ° C. for 16 hours. After the temperature was returned to room temperature, one rabbit (anti-dinitrophenyl-bovine serum albumin) IgG-insolubilized polystyrene ball was added and reacted at 30 ° C. for 5 hours. Polystyrene balls were mixed with 0.15 M sodium chloride, 1 mM EDTA and 0.1
After washing twice with 2 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing% bovine serum albumin, the radioactivity of ³² P bound to the polystyrene balls was measured. The results are shown in FIG.

本発明による実施例の測定限界は0.9pg（50amole＝5x
10^-7mole）であった。従来法である比較例に比して、バ
ックグラウンドが約1/3に減少し、３倍の感度向上が認
められた。The measurement limit of the embodiment according to the present invention is 0.9 pg (50 amole = 5 ×
^10-7 moles). The background was reduced to about 1/3 and the sensitivity was improved three times compared to the comparative example which was the conventional method.

〔効果〕〔effect〕

以上、説明したように、本発明は従来サンドイッチ法
で測定しえた核酸を、より高感度に測定しうる方法を提
供するものである。As described above, the present invention provides a method for measuring a nucleic acid which has been conventionally measured by the sandwich method with higher sensitivity.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図及び第２図は、本発明の実施例、及び比較例のDN
A測定における検量線である。横軸は、測定対象のDNA
量、縦軸に測定値（³²P放射活性）を示した。FIGS. 1 and 2 show the DN of the embodiment of the present invention and the comparative example.
It is a calibration curve in A measurement. The horizontal axis is the DNA to be measured
The amount and the measured value ( ³² P radioactivity) are shown on the vertical axis.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/53 Ｍｅｄｌｉｎｅ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on front page (58) Field surveyed (Int.Cl. ⁶ , DB name) C12Q 1/68 G01N 33/53 Medline

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】下記の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）工程を
包含することを特徴とする特異的核酸の測定法。 工程（Ａ）：被検液中の測定すべき特異的核酸と、少な
くとも１種は官能基で修飾されている２種以上のプロー
ブとを反応せしめ、官能基と特異的に結合する反応基を
固定した担体に捕捉して、担体上にプローブと測定すべ
き核酸からなる複合体を結合せしめる工程。 工程（Ｂ）：該複合体に影響を与えずに、担体から前記
複合体を含む成分を解離させる工程。 工程（Ｃ）：該成分量を測定する工程。1. A method for measuring a specific nucleic acid, comprising the following steps (A), (B) and (C): Step (A): reacting a specific nucleic acid to be measured in a test solution with two or more types of probes, at least one of which is modified with a functional group, to form a reactive group that specifically binds to the functional group. A step of capturing the immobilized carrier and binding the complex comprising the probe and the nucleic acid to be measured on the carrier. Step (B): a step of dissociating the component containing the complex from the carrier without affecting the complex. Step (C): a step of measuring the amount of the component.