JP2836961B2 - 新規な脱保護剤を用いたリボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 - Google Patents
新規な脱保護剤を用いたリボ核酸（ｒｎａ）の合成方法Info
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- JP2836961B2 JP2836961B2 JP5506669A JP50666993A JP2836961B2 JP 2836961 B2 JP2836961 B2 JP 2836961B2 JP 5506669 A JP5506669 A JP 5506669A JP 50666993 A JP50666993 A JP 50666993A JP 2836961 B2 JP2836961 B2 JP 2836961B2
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、リボ核酸（RNA）の２′位の水酸基の全脱
保護を迅速に行なうことの可能な、脱保護剤を用いたリ
ボ核酸の合成方法に関する。
保護を迅速に行なうことの可能な、脱保護剤を用いたリ
ボ核酸の合成方法に関する。
何年もの間、多くの細胞方法（cellular processe
g）において重要な役割を果たすRNAに対する注目が増す
に連れて、リボ核酸フラグメントの合成方法が、開発さ
れつつある。
g）において重要な役割を果たすRNAに対する注目が増す
に連れて、リボ核酸フラグメントの合成方法が、開発さ
れつつある。
これらの合成方法は、デオキシリボ核酸（DNA）の合
成に使用されるものと類似の方法であり、たとえば、オ
ジルビーらによる文献（Ogilvie et al,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,Vol.85,pp.5764−5768、1988年８月）およびガ
スパルートらによる文献（Gasparutto et al,Nucleos
ides ＆ Nucleotides ９（８）,pp.1087−1098,199
0）に開示されている。
成に使用されるものと類似の方法であり、たとえば、オ
ジルビーらによる文献（Ogilvie et al,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,Vol.85,pp.5764−5768、1988年８月）およびガ
スパルートらによる文献（Gasparutto et al,Nucleos
ides ＆ Nucleotides ９（８）,pp.1087−1098,199
0）に開示されている。
この合成原料は、２′位の水酸基が適当な基で保護さ
れており、また、ヌクレオチド合成に適した基を有する
リボヌクレオシドからなる。リボ核酸を形成するために
は、これらのヌクレオシド誘導体の連続縮合を行なうも
のである。
れており、また、ヌクレオチド合成に適した基を有する
リボヌクレオシドからなる。リボ核酸を形成するために
は、これらのヌクレオシド誘導体の連続縮合を行なうも
のである。
このように、上記オジルビーらによる文献において
は、２′位の水酸基がｔ−ブチル−ジメチルシリル基に
より保護されたリボヌクレオシド誘導体が使用されてい
る。全てのヌクレオシドの結合後、２′位の水酸基が保
護されたリボ核酸が得られる。したがって、これら２′
位の水酸基の保護基を除去するためには、最後に脱保護
処理を行なうのが適当である。
は、２′位の水酸基がｔ−ブチル−ジメチルシリル基に
より保護されたリボヌクレオシド誘導体が使用されてい
る。全てのヌクレオシドの結合後、２′位の水酸基が保
護されたリボ核酸が得られる。したがって、これら２′
位の水酸基の保護基を除去するためには、最後に脱保護
処理を行なうのが適当である。
これまで、前記脱保護は、グレン リサーチ レポー
ト、４巻、１号、1991年３月、RNA シンセシス−プロ
ブレムズ イン デプロテクションに記載されているよ
うに、テトラヒドロフラン中で脱保護剤としてテトラブ
チルアンモニウムフルオリドを用いることにより行なわ
れていた。ｔ−ブチルジメチルシリル（TBDMS）で保護
されたヌクレオシドまたはヌクレオチドの２′位水酸官
能基の脱保護は、テトラブチルアンモニウムフルオリド
により２、３分でおこる。２′位にｔ−ブチルジメチル
シリル基を有するオリゴヌクレオチドの場合には、脱保
護はより困難となり、数時間（図３、曲線５参照）かか
る。非常に長いRNAフラグメントの場合には、たとえ
ば、25塩基より多い場合には、水酸基の脱保護はこの薬
剤では不完全である。というのは、１塩基あたり少なく
とも１−２％の脱保護されていない水酸基が残っている
からである。すなわち、各RNA分子は、少なくとも１つ
の脱保護されていない水酸基を有し、これは、オジルビ
ーにより示されているように、RNAの生物学的な活性に
不利となるものである。
ト、４巻、１号、1991年３月、RNA シンセシス−プロ
ブレムズ イン デプロテクションに記載されているよ
うに、テトラヒドロフラン中で脱保護剤としてテトラブ
チルアンモニウムフルオリドを用いることにより行なわ
れていた。ｔ−ブチルジメチルシリル（TBDMS）で保護
されたヌクレオシドまたはヌクレオチドの２′位水酸官
能基の脱保護は、テトラブチルアンモニウムフルオリド
により２、３分でおこる。２′位にｔ−ブチルジメチル
シリル基を有するオリゴヌクレオチドの場合には、脱保
護はより困難となり、数時間（図３、曲線５参照）かか
る。非常に長いRNAフラグメントの場合には、たとえ
ば、25塩基より多い場合には、水酸基の脱保護はこの薬
剤では不完全である。というのは、１塩基あたり少なく
とも１−２％の脱保護されていない水酸基が残っている
からである。すなわち、各RNA分子は、少なくとも１つ
の脱保護されていない水酸基を有し、これは、オジルビ
ーにより示されているように、RNAの生物学的な活性に
不利となるものである。
本発明は、合成されたリボ核酸の２′位における水酸
化の全脱保護を迅速に行なうことの可能な、リボ核酸
（RNA）の合成方法に関する。
化の全脱保護を迅速に行なうことの可能な、リボ核酸
（RNA）の合成方法に関する。
本方法は、 ａ）式： ［ここで、R1は、以下の式で表される基から選択された
ピリミジン塩基またはプリン塩基から誘導された基であ
り、］ ［ここで、R5は、ＨまたはCH3であり、R6、R7、およびR
8は、水素原子または環外NH2基を保護するアシル基であ
り、 R2は、ヌクレオチド合成に適当な酸媒体において不安
定な基であり、 R3は、固体支持体であり、 R4は、トリアルキルシリル基である、］ で表される第１ヌクレオシドを、２′位の全水酸基は
R4により保護されている合成リボ核酸を形成するため
に、式（Ｉ）で表される、１以上の同一または異なった
ヌクレオシド、［ここで、R1、R2、およびR4は、上記と
同様の意味を有し、R3はヌクレオチド合成に適当なリン
基である、］ と連続縮合し、 ｂ）上記合成されたリボ核酸を、式： ［ここで、R9は、直鎖状または分岐したC1からC10アル
キル基、R10およびR11は、同じでも異なっていてもよい
直鎖状または分岐したC1からC10アルキル基であり、R9
と同じでも異なっていてもよく、ｎは１から３の数であ
り、整数であっても整数でなくてもよい、］ で表される脱保護剤で処理することにより、２′位の
全ての水酸基を脱保護することからなる。
ピリミジン塩基またはプリン塩基から誘導された基であ
り、］ ［ここで、R5は、ＨまたはCH3であり、R6、R7、およびR
8は、水素原子または環外NH2基を保護するアシル基であ
り、 R2は、ヌクレオチド合成に適当な酸媒体において不安
定な基であり、 R3は、固体支持体であり、 R4は、トリアルキルシリル基である、］ で表される第１ヌクレオシドを、２′位の全水酸基は
R4により保護されている合成リボ核酸を形成するため
に、式（Ｉ）で表される、１以上の同一または異なった
ヌクレオシド、［ここで、R1、R2、およびR4は、上記と
同様の意味を有し、R3はヌクレオチド合成に適当なリン
基である、］ と連続縮合し、 ｂ）上記合成されたリボ核酸を、式： ［ここで、R9は、直鎖状または分岐したC1からC10アル
キル基、R10およびR11は、同じでも異なっていてもよい
直鎖状または分岐したC1からC10アルキル基であり、R9
と同じでも異なっていてもよく、ｎは１から３の数であ
り、整数であっても整数でなくてもよい、］ で表される脱保護剤で処理することにより、２′位の
全ての水酸基を脱保護することからなる。
この方法においては、連続縮合サイクルは、異なった
ヌクレオシドを他のヌクレオシドに、常法、すなわちRN
A合成に関する公知のプロトコールおよび化学剤を用い
て、結合させることにより行なわれる。
ヌクレオシドを他のヌクレオシドに、常法、すなわちRN
A合成に関する公知のプロトコールおよび化学剤を用い
て、結合させることにより行なわれる。
最後に、各結合に使用される式（Ｉ）のヌクレオシド
は、ヌクレオチド合成に適当なR2およびR3基と、使用さ
れた塩基に依存するR1とからなる。この塩基が環外NH2
基を有する場合、後者は、ヌクレオチド合成に一般的に
使用される適当な保護基により保護されている。
は、ヌクレオチド合成に適当なR2およびR3基と、使用さ
れた塩基に依存するR1とからなる。この塩基が環外NH2
基を有する場合、後者は、ヌクレオチド合成に一般的に
使用される適当な保護基により保護されている。
適当な保護基は、たとえば、米国特許第4980460号、
コスターらによるテトラヘドロン、37巻、363−369ペー
ジ、1981年、ウーらによる、ヌクレイック アシズ リ
サーチ、17巻、９、1989、3501−3517ページに記載され
たアシル基である。
コスターらによるテトラヘドロン、37巻、363−369ペー
ジ、1981年、ウーらによる、ヌクレイック アシズ リ
サーチ、17巻、９、1989、3501−3517ページに記載され
たアシル基である。
本発明において、塩基がアデニンまたはグアニンの場
合には、保護基は、フェノキシアセチル基、すなわち、
前記式においてR7とR8がフェノキシアセチル基からなる
ことが好ましい。
合には、保護基は、フェノキシアセチル基、すなわち、
前記式においてR7とR8がフェノキシアセチル基からなる
ことが好ましい。
塩基がシトシンの場合には、保護基は、好ましくはア
セチル基からなり、すなわち、R6が上記式において、ア
セチル基であるものである。この場合、イソブチリル基
またはプロピオニル基を使用することも可能である。
セチル基からなり、すなわち、R6が上記式において、ア
セチル基であるものである。この場合、イソブチリル基
またはプロピオニル基を使用することも可能である。
R2としては、適当に使用可能な酸媒体において不安定
な基、たとえば： 式： ［ここで、R12、R13、およびR14は、各々同じでも異な
っていてもよい、水素原子、アルキル基、またはアルコ
キシ基であり、たとえば、モノメトキシトリチルまたは
ジメトキシトリチル基である、］ で表されるトリチル基、 ピクシル基、および ９−フェニル−キサンテニル基が挙げられる。
な基、たとえば： 式： ［ここで、R12、R13、およびR14は、各々同じでも異な
っていてもよい、水素原子、アルキル基、またはアルコ
キシ基であり、たとえば、モノメトキシトリチルまたは
ジメトキシトリチル基である、］ で表されるトリチル基、 ピクシル基、および ９−フェニル−キサンテニル基が挙げられる。
R3としては、使用可能なリン基は、たとえば、式： ［ここで、R15、R16、R17、R18、およびR19は、直鎖状
または分岐したアルキル基である、］ が使用可能である。
または分岐したアルキル基である、］ が使用可能である。
好ましくは、本発明の方法においては、R3として、
式： ［ここで、R15およびR16は、同じでも異なっていてもよ
い、C1からC4アルキル基である、］ であらわされるホスホラミジト（phosphoramidite）
基が使用される。
式： ［ここで、R15およびR16は、同じでも異なっていてもよ
い、C1からC4アルキル基である、］ であらわされるホスホラミジト（phosphoramidite）
基が使用される。
たとえば、R15がメチル基であり、R16がエチル基であ
るか、または、R15およびR16の双方がイソプロピル基で
あってもよい。
るか、または、R15およびR16の双方がイソプロピル基で
あってもよい。
R15およびR16にエチル基およびメチル基を使用するこ
とは、非常に興味深いことである。なぜならば、これら
の基を用いると、ヌクレオチド（インターヌクレオチド
結合は３分で形成される）の迅速な結合が、優れた収率
（98％）で副反応もなく少なく、可能となるものであ
る。しかも、２′位にｔ−ブチル−ジメチルシリル保護
基を有するこれらの基を使用すると、RNA合成に対して
優れた反応性を有する安定なヌクレオシド誘導体が得ら
れる。ここで、これらのエチル基およびメチル基は、DN
A合成用の非常に不安定な誘導体を与えるものである。
とは、非常に興味深いことである。なぜならば、これら
の基を用いると、ヌクレオチド（インターヌクレオチド
結合は３分で形成される）の迅速な結合が、優れた収率
（98％）で副反応もなく少なく、可能となるものであ
る。しかも、２′位にｔ−ブチル−ジメチルシリル保護
基を有するこれらの基を使用すると、RNA合成に対して
優れた反応性を有する安定なヌクレオシド誘導体が得ら
れる。ここで、これらのエチル基およびメチル基は、DN
A合成用の非常に不安定な誘導体を与えるものである。
本発明の方法によれば、ヌクレオシドの連続縮合サイ
クルを行なった後、２′位の全ての水酸基が保護され
た、合成リボ核酸が、式： ［ここで、R9は直鎖状または分岐したC1からC10アルキ
ル基であり、R10およびR11は同じでも異なっていてもよ
い、Ｈまたは直鎖状または分岐したC1からC10アルキル
基であり、R9と同じであっても異なっていても良く、ｎ
は１から３の数字であり、整数であってもなくてもよ
い、］ で表される薬剤を脱保護剤として用いる脱保護処理に
ふされる。
クルを行なった後、２′位の全ての水酸基が保護され
た、合成リボ核酸が、式： ［ここで、R9は直鎖状または分岐したC1からC10アルキ
ル基であり、R10およびR11は同じでも異なっていてもよ
い、Ｈまたは直鎖状または分岐したC1からC10アルキル
基であり、R9と同じであっても異なっていても良く、ｎ
は１から３の数字であり、整数であってもなくてもよ
い、］ で表される薬剤を脱保護剤として用いる脱保護処理に
ふされる。
このような薬剤の例としては、Ｎ（C2H5）3,3HF;N（C
H3）3,2HF;N（CH3）2,HF;イソプロピルアミン,HF;イソ
プロピルアミン,1.8HF;ジイソプロピルアミン,2HF;およ
びジイソプロピルアミン,3HFが挙げられる。
H3）3,2HF;N（CH3）2,HF;イソプロピルアミン,HF;イソ
プロピルアミン,1.8HF;ジイソプロピルアミン,2HF;およ
びジイソプロピルアミン,3HFが挙げられる。
好ましくは、本発明においては、式： Ｎ（C2H5）3,3HF で表される脱保護剤が使用される。
この公知の薬剤は、これまで炭水化物のフッソ化剤と
して用いられてきたものである。
して用いられてきたものである。
本発明によれば、リボ核酸の２′位における水酸基の
脱保護用にこの薬剤を使用することは非常に興味深いこ
とであり、なぜならば、これにより、約10時間で非常に
長いリボ核酸の全脱保護が完了可能となるからである。
さらに、精製された状態で使用することが可能であり、
蒸発により簡単に除去可能である。
脱保護用にこの薬剤を使用することは非常に興味深いこ
とであり、なぜならば、これにより、約10時間で非常に
長いリボ核酸の全脱保護が完了可能となるからである。
さらに、精製された状態で使用することが可能であり、
蒸発により簡単に除去可能である。
一般には、脱保護処理は、約２時間から20時間、常温
で行なわれる。
で行なわれる。
この薬剤を、たとえばアセトニトリルなどの有機溶媒
で希釈して使用することも可能である。
で希釈して使用することも可能である。
本発明の他の特徴部および優位点は、以下に示す実施
例から明かとなるであろう。ただし、本発明はこれらの
実施例および図面に限定されるものではない。
例から明かとなるであろう。ただし、本発明はこれらの
実施例および図面に限定されるものではない。
図１は、実施例１で合成された転移RNAを示す。
図２は、実施例１で合成された転移RNAの合成に使用
されるリボヌクレオシドのホスホラミジトを示す。
されるリボヌクレオシドのホスホラミジトを示す。
図３は、異なる脱保護剤による、時間（ｈ）に対する
42塩基のオリゴヌクレオチドの脱保護％を示す。
42塩基のオリゴヌクレオチドの脱保護％を示す。
図４から９は、高速液体クロマトグラフィーの場合に
得られるオリゴヌクレオチドのクロマトグラムである。
得られるオリゴヌクレオチドのクロマトグラムである。
実施例1:大腸菌K12のアラニンの転移リボ核酸ｔ−RNAの
合成 この転移RNAは図１に示すものである。
合成 この転移RNAは図１に示すものである。
この合成をおこなうために、図２に示された保護され
たリボヌクレオシドホスホラミジトを使用した。図２に
おいて、DMtはジメトキシトリチル基を示し、BPは任意
に保護されてもよいプリン塩基またはピリミジン塩基を
示す。塩基がアデニンまたはグアニンである場合には、
その環外NH2基はフェノキシアセチル基により保護され
ており、塩基がシトシンである場合には、その環外NH2
基はアセチル基により保護されている。
たリボヌクレオシドホスホラミジトを使用した。図２に
おいて、DMtはジメトキシトリチル基を示し、BPは任意
に保護されてもよいプリン塩基またはピリミジン塩基を
示す。塩基がアデニンまたはグアニンである場合には、
その環外NH2基はフェノキシアセチル基により保護され
ており、塩基がシトシンである場合には、その環外NH2
基はアセチル基により保護されている。
塩基BPはまた、ウラシル、チミン、5,6−ジヒドロウ
ラシルおよびプソイドウラシルであってもよい。
ラシルおよびプソイドウラシルであってもよい。
ヌクレオシドの連続縮合段階は、キャップ剤としてフ
ェノキシ無水酢酸を用いて行なわれる。合成は、制御さ
れた大きさの孔のシリカゲルサポートを用いて0.2マイ
クロモルのスケールで、固体相において行なわれる。
ェノキシ無水酢酸を用いて行なわれる。合成は、制御さ
れた大きさの孔のシリカゲルサポートを用いて0.2マイ
クロモルのスケールで、固体相において行なわれる。
各縮合サイクルは、以下の段階を含有する： 脱トリチル化:2％のトリクロロ酢酸、ジクロロメタン
中、90分間、 洗浄：アセトニトリル、２分間、 縮合：ヌクレオシド誘導体＋活性化剤、無水アセトニ
トリル中、３分間、 不完全な鎖の延長を止めるための、反応していないヒ
ドロキシル官能基のマスキング：フェノキシ無水酢酸お
よび１−メチルイミダゾール、無水アセトニトリル中、
１分間、 酸化:0.45％ヨウ素、テトラヒドロフラン／水／ルチ
ジン（89.5/10/0.5）中、45秒間、および 洗浄：アセトニトリル中、90秒間。
中、90分間、 洗浄：アセトニトリル、２分間、 縮合：ヌクレオシド誘導体＋活性化剤、無水アセトニ
トリル中、３分間、 不完全な鎖の延長を止めるための、反応していないヒ
ドロキシル官能基のマスキング：フェノキシ無水酢酸お
よび１−メチルイミダゾール、無水アセトニトリル中、
１分間、 酸化:0.45％ヨウ素、テトラヒドロフラン／水／ルチ
ジン（89.5/10/0.5）中、45秒間、および 洗浄：アセトニトリル中、90秒間。
各サイクルにおいては、45ヌクレオシド当量が使用さ
れる。
れる。
上記処理の最後に、オリゴヌクレオチドは、サポート
から外され、シアノエチル基が、エタノールおよび濃縮
アンモニア水溶液（28％アンモニア：エタノール、3/1
容積）の混合物を用いて２時間常温で処理することによ
り加水分解される。
から外され、シアノエチル基が、エタノールおよび濃縮
アンモニア水溶液（28％アンモニア：エタノール、3/1
容積）の混合物を用いて２時間常温で処理することによ
り加水分解される。
このオリゴヌクレオチドを次いで、55℃で１時間加熱
し、塩基の環外NH2基の保護基を除去して、次いで、こ
の溶液を減圧濃縮し、残渣を常温で、300マイクロリッ
トルの精製状態（TEA、3HF）の脱保護剤Ｎ（C2H5）3,3H
Fで16時間処理した。
し、塩基の環外NH2基の保護基を除去して、次いで、こ
の溶液を減圧濃縮し、残渣を常温で、300マイクロリッ
トルの精製状態（TEA、3HF）の脱保護剤Ｎ（C2H5）3,3H
Fで16時間処理した。
液相を次いで蒸発させて乾燥し、塩をプロダクトの混
合物から除去し、次いで、15％ポリアクリルアミドゲル
（1.5mm厚さ）において電気泳動することにより得られ
た、合成リボ核酸を精製する。
合物から除去し、次いで、15％ポリアクリルアミドゲル
（1.5mm厚さ）において電気泳動することにより得られ
た、合成リボ核酸を精製する。
３′位または５′位のOH端部をリン32により標識化し
た後、得られたリボ核酸が実際、図１に示すRNAと一致
するかを、酵素分解方法を用いて配列決定を調べること
により、チェックする。
た後、得られたリボ核酸が実際、図１に示すRNAと一致
するかを、酵素分解方法を用いて配列決定を調べること
により、チェックする。
すべての場合において、転移リボ核酸の構造は、図１
の配列にしたがうものである。
の配列にしたがうものである。
このようにして得られた合成リボ核酸の構造は、次い
で、少量の前記RNAにおける、その３′位末端のハイブ
リッド形成を、16塩基の長さの相補オリゴデオキシヌク
レオチドを用いて行ない、これをインバーストランスク
リプターゼでコピーする。PCR増幅の後、２つのDNA鎖は
配列され、完全に所望の配列であることが確かめられ
た。
で、少量の前記RNAにおける、その３′位末端のハイブ
リッド形成を、16塩基の長さの相補オリゴデオキシヌク
レオチドを用いて行ない、これをインバーストランスク
リプターゼでコピーする。PCR増幅の後、２つのDNA鎖は
配列され、完全に所望の配列であることが確かめられ
た。
実施例２ この実施例においては、評価は、ｔ−ブチルジメチル
シリル基により保護された１つのリボヌクレオチドrUを
含有する、DNA鎖を有するオリゴヌクレオチドである、
モデルとしてのdT21rUdT20において、本発明による脱保
護レベルでおこなう。
シリル基により保護された１つのリボヌクレオチドrUを
含有する、DNA鎖を有するオリゴヌクレオチドである、
モデルとしてのdT21rUdT20において、本発明による脱保
護レベルでおこなう。
このオリゴヌクレオチドdT21rUdT20を合成するため
に、原料となるヌクレオシドが、図２に示す化合物、
［ここで、BPはチミンを表し、 がＨで置換される］および、図２に示す化合物［ここ
で、BPがウラシルである］ からなること以外は、実施例１と同様の方法が用いら
れた。
に、原料となるヌクレオシドが、図２に示す化合物、
［ここで、BPはチミンを表し、 がＨで置換される］および、図２に示す化合物［ここ
で、BPがウラシルである］ からなること以外は、実施例１と同様の方法が用いら
れた。
合成後、脱保護が、種々の時間で行なわれ、各脱保護
の処理後、脱保護レベルは、ｔ−ブチルジメチルシリル
基をまだ有している同族体から完全に脱保護されたフラ
グメントを分離することの可能な、逆相C18カラムにお
いてプロダクトを分離することにより決定される。
の処理後、脱保護レベルは、ｔ−ブチルジメチルシリル
基をまだ有している同族体から完全に脱保護されたフラ
グメントを分離することの可能な、逆相C18カラムにお
いてプロダクトを分離することにより決定される。
得られた結果は、図３の曲線（１）に表される。これ
から、４時間で100％脱保護されていることがわかる。
から、４時間で100％脱保護されていることがわかる。
実施例３ オリゴヌクレオチドdT21rUdT20を合成するために、実
施例２と同様の方法がもちいられるが、脱保護は、本発
明による薬剤（TEA,3HF）とアセトニトリルの1/1容量比
の混合物を用いて行なわれる。
施例２と同様の方法がもちいられるが、脱保護は、本発
明による薬剤（TEA,3HF）とアセトニトリルの1/1容量比
の混合物を用いて行なわれる。
得られた結果は、図３の曲線（２）に表される。図３
から、本発明による脱保護剤のアセトニトリルによる希
釈により、完全な脱保護は８時間後に得られることがわ
かる。
から、本発明による脱保護剤のアセトニトリルによる希
釈により、完全な脱保護は８時間後に得られることがわ
かる。
比較例１ この例においては、オリゴヌクレオチドdT21rUdT20を
合成するために、実施例２と同様の方法がもちいられる
が、脱保護は、従来の脱保護剤、すなわちテトラブチル
アンモニウムトリハイドレートフロリド（TBAF,3H2O）
をジメチルスルホキシドにおいて１モル/Lの量で用いる
ことにより行なう。
合成するために、実施例２と同様の方法がもちいられる
が、脱保護は、従来の脱保護剤、すなわちテトラブチル
アンモニウムトリハイドレートフロリド（TBAF,3H2O）
をジメチルスルホキシドにおいて１モル/Lの量で用いる
ことにより行なう。
得られた結果は、図３の曲線（３）に表される。図３
から、従来の脱保護剤を用いると、完全な脱保護には11
時間かかることがわかる。
から、従来の脱保護剤を用いると、完全な脱保護には11
時間かかることがわかる。
比較例２ この例においては、オリゴヌクレオチドdT21−rU−dT
20を合成するために、実施例２と同様の方法がもちいら
れるが、脱保護は、従来の脱保護剤、TBAF,3H2Oのジメ
チルホルムアミドの１モル/L溶液を用いることにより行
なう。
20を合成するために、実施例２と同様の方法がもちいら
れるが、脱保護は、従来の脱保護剤、TBAF,3H2Oのジメ
チルホルムアミドの１モル/L溶液を用いることにより行
なう。
得られた結果は、図３の曲線（４）に表される。この
場合、完全な脱保護には24時間かかることがわかる。
場合、完全な脱保護には24時間かかることがわかる。
比較例３ この例においては、オリゴヌクレオチドdT21−rU−dT
20を合成するために、実施例２と同様の方法がもちいら
れるが、脱保護は、テトラヒドロフラン（THF）中、TBA
F,3H2Oの１モル/L溶液を用いることにより行なう。
20を合成するために、実施例２と同様の方法がもちいら
れるが、脱保護は、テトラヒドロフラン（THF）中、TBA
F,3H2Oの１モル/L溶液を用いることにより行なう。
得られた結果は、図３の曲線（５）に表される。図３
から、THF中において、現在使用されているテトラブチ
ルアンモニウムフルオリドを用いると、完全な脱保護が
不可能であることがわかる。
から、THF中において、現在使用されているテトラブチ
ルアンモニウムフルオリドを用いると、完全な脱保護が
不可能であることがわかる。
実施例４ この実施例は、18塩基の長さを有し、以下の配列： ５′UTUACUAUCUAUCUCCCAA3′ を有するオリゴヌクレオチドを合成するために、実施
例１と同様の方法を用いる。
例１と同様の方法を用いる。
アンモニア性媒体において塩基の環外NH2基の保護基
を除去した後、約40マイクログラムのシリル化されたオ
リゴヌクレオチド（すなわち260nm（20D）において２吸
収単位）をエッペンドルフマイクロチューブにおいて、
60マイクロリットルの脱保護剤Ｎ（C2H5）3,3HF（TEA,3
HF）で20時間常温で処理する。ただし、反応混合物を、
反応進行を評価するために、TEA,3HFと反応させる前の
ものと、４時間反応させるものと、20時間反応させるも
のとの、いくつかのサンプルに分ける。サンプル分けし
た後、各サンプルはトリエチルアンモニウムアセテー
ト、TEAA（pH7.0、25mM）の４容積で中性化し、次いで
モノＱカラム（LKB）を用いてKH2PO4緩衝液（pH6.0）に
おいて40分で０から１％KClの勾配で溶出する高速液体
のカラムクロマトグラフィーにより分析を行なう。20時
間の反応後のサンプルの場合は、中性化の後、前記サン
プルと同様にして分析し、他の部分は、セファデックス
G25カラム（ファルマシアNAP10）においてTEAAにより中
性化後、塩を除去し、次いで高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）で同様に分析する。塩の除去により、TEA,3H
F混合物による副生ピークを除去することが可能とな
る。
を除去した後、約40マイクログラムのシリル化されたオ
リゴヌクレオチド（すなわち260nm（20D）において２吸
収単位）をエッペンドルフマイクロチューブにおいて、
60マイクロリットルの脱保護剤Ｎ（C2H5）3,3HF（TEA,3
HF）で20時間常温で処理する。ただし、反応混合物を、
反応進行を評価するために、TEA,3HFと反応させる前の
ものと、４時間反応させるものと、20時間反応させるも
のとの、いくつかのサンプルに分ける。サンプル分けし
た後、各サンプルはトリエチルアンモニウムアセテー
ト、TEAA（pH7.0、25mM）の４容積で中性化し、次いで
モノＱカラム（LKB）を用いてKH2PO4緩衝液（pH6.0）に
おいて40分で０から１％KClの勾配で溶出する高速液体
のカラムクロマトグラフィーにより分析を行なう。20時
間の反応後のサンプルの場合は、中性化の後、前記サン
プルと同様にして分析し、他の部分は、セファデックス
G25カラム（ファルマシアNAP10）においてTEAAにより中
性化後、塩を除去し、次いで高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）で同様に分析する。塩の除去により、TEA,3H
F混合物による副生ピークを除去することが可能とな
る。
得られた結果を、図４から７に示す。図４は、時間０
におけるクロマトグラムであり、すなわち、TEA,3HFで
反応する前のものである。図５は、４時間反応した後の
クロマトグラムである。図６は、20時間反応した後のク
ロマトグラムである。図７は、20時間反応後のサンプル
されたプロダクトから塩除去した場合のクロマトグラム
である。全ての場合において、プロダクトは１マイクロ
リットル、注入するものであるが、図７の場合は、プロ
ダクトが2.5マイクロリットル、注入されたものであ
る。
におけるクロマトグラムであり、すなわち、TEA,3HFで
反応する前のものである。図５は、４時間反応した後の
クロマトグラムである。図６は、20時間反応した後のク
ロマトグラムである。図７は、20時間反応後のサンプル
されたプロダクトから塩除去した場合のクロマトグラム
である。全ての場合において、プロダクトは１マイクロ
リットル、注入するものであるが、図７の場合は、プロ
ダクトが2.5マイクロリットル、注入されたものであ
る。
これらのクロマトグラムから、脱保護されたオリゴヌ
クレオチドは、４時間の反応後（図５、６、および７の
クロマトグラム）、27分の保持時間tRで現われることが
わかる。20時間までの明白な脱保護は少しずつ行なわ
れ、ほとんど補助劣化（図６参照）はおこらない。
クレオチドは、４時間の反応後（図５、６、および７の
クロマトグラム）、27分の保持時間tRで現われることが
わかる。20時間までの明白な脱保護は少しずつ行なわ
れ、ほとんど補助劣化（図６参照）はおこらない。
塩除去（図７）の後、塩−除去されたプロダクトは、
粗オリゴリボヌクレオチドの純度を有する。不完全な配
列は明らかにクロマトグラムで見つけることができる。
粗オリゴリボヌクレオチドの純度を有する。不完全な配
列は明らかにクロマトグラムで見つけることができる。
このようにして、脱保護して塩除去されたオリゴヌク
レオチドは、非常に純度が高く、高い収率で得られるも
のである。
レオチドは、非常に純度が高く、高い収率で得られるも
のである。
実施例５ この実施例においては、TEA−3HFの存在下における天
然転移RNAの安定性を研究することにより、脱保護用に
使用されたTEA−3HFが、得られたオリゴヌクレオチドを
分解しないことをチェックする。
然転移RNAの安定性を研究することにより、脱保護用に
使用されたTEA−3HFが、得られたオリゴヌクレオチドを
分解しないことをチェックする。
最後に、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、ジ
ヒドロウリジン、プソイドウリジン、７−メチルグアノ
シンおよび２′０−メチルシチジンなどの多くの変性塩
基を含有する、ホルミル−メチオニン（ボーリンガー）
の大腸菌特異性転移RNAを使用する。
ヒドロウリジン、プソイドウリジン、７−メチルグアノ
シンおよび２′０−メチルシチジンなどの多くの変性塩
基を含有する、ホルミル−メチオニン（ボーリンガー）
の大腸菌特異性転移RNAを使用する。
このRNAtの安定性をテストするために、40マイクログ
ラムのRNAt（20D）が、60マイクロリットルのTEA−3HF
に導入され、２時間激しく撹拌される。プロダクトは次
いで、常温で20時間、この媒体中におかれ、次いで中性
化が、TEAA、25mM、pH7.0の４容積により行なわれ、つ
いでプロダクトはファルマシアNAP−10カラムにおいて
塩除去にふされる。このプロダクトの1.8OD（すなわち9
0％）が回収され、次いでイオン交換高速液体クロマト
グラフィーにより、実施例４にあるように、分析され
る。図８は、カラムに0.025OD注入することにより得ら
れるクロマトグラムである。
ラムのRNAt（20D）が、60マイクロリットルのTEA−3HF
に導入され、２時間激しく撹拌される。プロダクトは次
いで、常温で20時間、この媒体中におかれ、次いで中性
化が、TEAA、25mM、pH7.0の４容積により行なわれ、つ
いでプロダクトはファルマシアNAP−10カラムにおいて
塩除去にふされる。このプロダクトの1.8OD（すなわち9
0％）が回収され、次いでイオン交換高速液体クロマト
グラフィーにより、実施例４にあるように、分析され
る。図８は、カラムに0.025OD注入することにより得ら
れるクロマトグラムである。
図９は、比較の目的で、同一のカラムに0.01OD注入す
る場合の、同様の天然で処理していないRNAtを用いて得
られたクロマトグラムである。
る場合の、同様の天然で処理していないRNAtを用いて得
られたクロマトグラムである。
これら２つのクロマトグラムを比較すると、保持時間
は、厳密にいって同一であり、不完全な配列のプロダク
トは、図８のクロマトグラムには見受けられないことが
判明した。
は、厳密にいって同一であり、不完全な配列のプロダク
トは、図８のクロマトグラムには見受けられないことが
判明した。
したがって、脱保護剤、TEA−3HFを常温で20時間使用
しても、変性塩基を含み、こわれやすいとされている天
然RNAtは分解しないものである。
しても、変性塩基を含み、こわれやすいとされている天
然RNAtは分解しないものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガスパルット，ディディエ フランス国 38400 サン−マルタン デレ リュ ドゥ ベルドン 12 (72)発明者 リヴァシェ，チェリー フランス国 38000 グレノーブル リ ュ フェリックス エスクランゴン 22 (72)発明者 モルコ，ディディエ フランス国 38210 チュリン−フュー レ アヴェニュ ドゥ ラ ガール 11 レ ノワイエ ア１−１ (72)発明者 テウル，ロベール フランス国 38000 グレノーブル リ ュ チェ 52 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 21/02 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】リボ核酸の合成方法であり、 ａ）式： ［ここで、R1は、以下の式で表される基から選択された
ピリミジン塩基またはプリン塩基から誘導された基であ
る、］ ［ここで、R5は、ＨまたはCH3であり、R6、R7、およびR
8は、水素原子または環外NH2基を保護するアシル基であ
り、 R2は、ヌクレオチド合成に適当な酸媒体において不安定
な基であり、 R3は、固体支持体であり、 R4は、トリアルキルシリル基である、］ で表される第１ヌクレオシドを、２′位の全水酸基はR4
により保護されている合成リボ核酸を形成するために、
式（Ｉ）で表される、１以上の同一または異なったヌク
レオシド、［ここで、R1、R2、およびR4は、上記と同様
の意味を有し、R3はヌクレオチド合成に適当なリン基で
ある、］ と連続縮合し、 ｂ）上記合成されたリボ核酸を、式： ［ここで、R9は、直鎖状または分岐したC1からC10アル
キル基、R10およびR11は、同じでも異なっていてもよい
直鎖状または分岐したC1からC10アルキル基であり、R9
と同じでも異なっていてもよく、ｎは１から３の数であ
り、整数であっても整数でなくてもよい、］ で表される脱保護剤で処理することにより、２′位の全
ての水酸基を脱保護することからなることを特徴とす
る、リボ核酸の合成方法。 - 【請求項２】脱保護剤が、式： Ｎ（C2H5）3,3HF で表されるものからなることを特徴とする、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】脱保護剤による処理が、常温で140分間行
なわれることを特徴とする、請求項１または２に記載の
方法。 - 【請求項４】R4が、ｔ−ブチルジメチルシリル基であ
る、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】R3が、式： ［ここで、R15およびR16が、同じでも異なっていてもよ
いC1からC4アルキル基である、］ である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項６】R15が、メチル基であり、R16が、エチル基
である、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】R15およびR16が、イソプロピル基である、
請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】R2が、ジメトキシトリチル基である、請求
項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9112357A FR2682112B1 (fr) | 1991-10-08 | 1991-10-08 | Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection. |
| FR91/12357 | 1991-10-08 | ||
| PCT/FR1992/000929 WO1993007164A1 (fr) | 1991-10-08 | 1992-10-07 | Procede de synthese d'acide ribonucleique (arn) utilisant un nouveau reactif de deprotection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07501794A JPH07501794A (ja) | 1995-02-23 |
| JP2836961B2 true JP2836961B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=9417692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5506669A Expired - Lifetime JP2836961B2 (ja) | 1991-10-08 | 1992-10-07 | 新規な脱保護剤を用いたリボ核酸（ｒｎａ）の合成方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5552539A (ja) |
| EP (1) | EP0607337B1 (ja) |
| JP (1) | JP2836961B2 (ja) |
| AT (1) | ATE151434T1 (ja) |
| DE (1) | DE69218958T2 (ja) |
| FR (1) | FR2682112B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| CA2234159A1 (en) * | 1995-10-19 | 1997-04-24 | Alecia Settle | Method for solution phase synthesis of oligonucleotides |
| US6989442B2 (en) * | 2002-07-12 | 2006-01-24 | Sirna Therapeutics, Inc. | Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives |
| US7655790B2 (en) | 2002-07-12 | 2010-02-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives |
| WO2005097817A2 (en) * | 2004-04-05 | 2005-10-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Process and reagents for oligonucleotide synthesis and purification |
| DE602005008029D1 (de) * | 2004-04-19 | 2008-08-21 | Avecia Biotechnology Inc | Verfahren zum abspalten exocyclischer basenschutzgruppen |
| US20080119563A1 (en) | 2006-11-20 | 2008-05-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for rna desilylation |
| JO2778B1 (en) | 2007-10-16 | 2014-03-15 | ايساي انك | Certain vehicles, installations and methods |
| WO2009117227A2 (en) * | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Merck & Co., Inc. | Deprotection of oligonucleotides that contain one or more ribonucleotides |
| US8252194B2 (en) * | 2008-05-02 | 2012-08-28 | Micron Technology, Inc. | Methods of removing silicon oxide |
| TWI477508B (zh) * | 2009-04-06 | 2015-03-21 | Otsuka Pharma Co Ltd | 用以治療癌症之組成物及方法 |
| UY32546A (es) * | 2009-04-06 | 2010-10-29 | Eisai Inc | Composiciones y metodos para tratar cancer |
| WO2010118013A1 (en) * | 2009-04-06 | 2010-10-14 | Eisai Inc. | Combination of cytidine-based antineoplastic drugs with cytidine deaminase inhibitor and use thereof in the treatment of cancer |
| US8609631B2 (en) | 2009-04-06 | 2013-12-17 | Eisai Inc. | Compositions and methods for treating cancer |
| CA2926734C (en) | 2013-10-29 | 2022-03-15 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Synthetic route to 2'-deoxy-2',2'-difluorotetrahydrouridines |
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|---|---|---|---|---|
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| AU5931290A (en) * | 1989-06-20 | 1991-01-08 | Meiogenics, Inc. | Nuclease resistant, single-stranded, non-naturally occurring nucleic acid molecules |
| JP2794461B2 (ja) * | 1989-08-17 | 1998-09-03 | 有機合成薬品工業株式会社 | ホスホアミダイト化合物及びそれを用いたオリゴリボヌクレオチドの固相合成法 |
-
1991
- 1991-10-08 FR FR9112357A patent/FR2682112B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-10-07 EP EP92922336A patent/EP0607337B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-07 DE DE69218958T patent/DE69218958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-07 WO PCT/FR1992/000929 patent/WO1993007164A1/fr active IP Right Grant
- 1992-10-07 AT AT92922336T patent/ATE151434T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-10-07 JP JP5506669A patent/JP2836961B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-07 US US08/211,424 patent/US5552539A/en not_active Expired - Lifetime
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| FR2682112A1 (fr) | 1993-04-09 |
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| EP0607337B1 (fr) | 1997-04-09 |
| WO1993007164A1 (fr) | 1993-04-15 |
| DE69218958D1 (de) | 1997-05-15 |
| EP0607337A1 (fr) | 1994-07-27 |
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