JP2830072B2 - 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法 - Google Patents
合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、合成ホスファチジルコリンを酵素分解する
方法、詳しくは合成ホスファチジルコリンの脱アシル化
により、１−アシル−リゾホスファチジルコリンを得る
方法に関する。
方法、詳しくは合成ホスファチジルコリンの脱アシル化
により、１−アシル−リゾホスファチジルコリンを得る
方法に関する。
（従来の技術） ホスホリパーゼA2は、系統名でホスファタイド２−ア
シルハイドラーゼとも呼ばれ、リン脂質のSn−２位にエ
ステル結合している脂肪酸を位置特異的に加水分解する
酸素である。
シルハイドラーゼとも呼ばれ、リン脂質のSn−２位にエ
ステル結合している脂肪酸を位置特異的に加水分解する
酸素である。
この酵素はホスファチジルコリンに比べホスファチジ
ルエタノールアミンを加水分解し易く、その際pH8〜10
に緩衝液で調整し、その緩衝液濃度を50mMから200mMの
範囲にすると、この濃度によって最適pHが変化する（M.
Waite ＆ P.Sisson,10,2377,1971）。生体を起源とする
種々のホスホリパーゼA2が知られているが、この酵素に
よる分解は、いずれも、最適pH範囲とカルシウムイオン
を要求する条件で、水溶液とリン脂質溶液との乳化によ
る界面反応で起きる。事実、従来、次の様な酵素分解方
法が知られている。
ルエタノールアミンを加水分解し易く、その際pH8〜10
に緩衝液で調整し、その緩衝液濃度を50mMから200mMの
範囲にすると、この濃度によって最適pHが変化する（M.
Waite ＆ P.Sisson,10,2377,1971）。生体を起源とする
種々のホスホリパーゼA2が知られているが、この酵素に
よる分解は、いずれも、最適pH範囲とカルシウムイオン
を要求する条件で、水溶液とリン脂質溶液との乳化によ
る界面反応で起きる。事実、従来、次の様な酵素分解方
法が知られている。
エイチ・オクヤマら、Biochemistry,11,4392（197
2） ド・ハッス・ジー・エイチら、Biochemi.Biophys.A
cta.195,105（1968） エム・カテ、脂質研究法・生化学実験法５、p255、
東京化学同人社、1975、東京 特開昭63−44893号、「リン脂質の酵素分解法」 特開昭63−302929号、「乳化剤組成物の製造法」 しかるに、これら従来の酵素分解方法では次の様な問
題が生じる。の方法は、処理量が1mgと少量であり工
業的に利用できない。さらに、pH調整用のトリス／塩酸
緩衝液とカルシウム供給用の塩化カルシウム溶液を使用
する乳化系反応であり、反応生成物の精製が難しい。ま
た、この方法は反応収率が精々85％程度で限界がある。
の方法は、処理量が1mgと少量である。さらに緩衝液
でpH8に調整し、塩化カルシウム濃度を6mMに調整する必
要がある。そのため、この方法も乳化系反応であり、反
応生成物の精製が難しい。の方法は、処理量が5mgと
少量であり、工業的に利用できない。さらに、pH調整用
のホウ酸緩衝液とカルシウム供給用の酢酸カルシウム溶
液を使用する乳化系反応であり、反応生成物の精製が難
しい。また、この方法は反応収率が低く、未反応リン脂
質から遊離脂肪酸とリゾリン脂質を分離しなければなら
ない。の方法は、リン脂質またはリン脂質と油脂の混
合物に0.1〜1.0重量部の水を加えた乳化系反応であり、
脱水が難しい。しかも、この水にはpH調整用の緩衝液と
カルシウム供給用の塩化カルシウムを添加する必要があ
る。の方法は、リン脂質と油脂の混合物に分解酵素と
してホスホリパーゼA2とリパーゼを使用し、反応時にpH
調整用の水酸化ナトリウム溶液とカルシウム供給用の塩
化カルシウム溶液を使用する乳化系反応であり、反応収
率が低く反応生成物の精製が難しい。
2） ド・ハッス・ジー・エイチら、Biochemi.Biophys.A
cta.195,105（1968） エム・カテ、脂質研究法・生化学実験法５、p255、
東京化学同人社、1975、東京 特開昭63−44893号、「リン脂質の酵素分解法」 特開昭63−302929号、「乳化剤組成物の製造法」 しかるに、これら従来の酵素分解方法では次の様な問
題が生じる。の方法は、処理量が1mgと少量であり工
業的に利用できない。さらに、pH調整用のトリス／塩酸
緩衝液とカルシウム供給用の塩化カルシウム溶液を使用
する乳化系反応であり、反応生成物の精製が難しい。ま
た、この方法は反応収率が精々85％程度で限界がある。
の方法は、処理量が1mgと少量である。さらに緩衝液
でpH8に調整し、塩化カルシウム濃度を6mMに調整する必
要がある。そのため、この方法も乳化系反応であり、反
応生成物の精製が難しい。の方法は、処理量が5mgと
少量であり、工業的に利用できない。さらに、pH調整用
のホウ酸緩衝液とカルシウム供給用の酢酸カルシウム溶
液を使用する乳化系反応であり、反応生成物の精製が難
しい。また、この方法は反応収率が低く、未反応リン脂
質から遊離脂肪酸とリゾリン脂質を分離しなければなら
ない。の方法は、リン脂質またはリン脂質と油脂の混
合物に0.1〜1.0重量部の水を加えた乳化系反応であり、
脱水が難しい。しかも、この水にはpH調整用の緩衝液と
カルシウム供給用の塩化カルシウムを添加する必要があ
る。の方法は、リン脂質と油脂の混合物に分解酵素と
してホスホリパーゼA2とリパーゼを使用し、反応時にpH
調整用の水酸化ナトリウム溶液とカルシウム供給用の塩
化カルシウム溶液を使用する乳化系反応であり、反応収
率が低く反応生成物の精製が難しい。
（発明が解決しようとする課題） 本発明では、工業的に大量生産が可能な合成ホスファ
チジルコリンの酵素分解による１−アシル−リゾホスフ
ァチジルコリンの合成法を検討した。
チジルコリンの酵素分解による１−アシル−リゾホスフ
ァチジルコリンの合成法を検討した。
工業的な生産方法に拡大するには、従来法では次のよ
うな三つの問題点がある。第一点は、リン脂質を溶解し
た有機溶媒と水溶液との界面反応であり、単位容積当た
りの反応面積を保持するため、反応中は激しい撹拌を続
ける必要があり、それでも反応収率は80〜90％程度で、
収率に限界があることである。第二点は、反応生成物の
リゾリン脂質が強い親水性界面活性を示すため、反応液
からの脱水に際し、リゾリン脂質が水中にミセルとして
可溶化し、リゾリン脂質の収量が低下することである。
第三点はリン脂質が含水系で発泡性を示すため、反応液
からの減圧脱水に際し、著しい発泡現象が生じて脱水が
面倒である。
うな三つの問題点がある。第一点は、リン脂質を溶解し
た有機溶媒と水溶液との界面反応であり、単位容積当た
りの反応面積を保持するため、反応中は激しい撹拌を続
ける必要があり、それでも反応収率は80〜90％程度で、
収率に限界があることである。第二点は、反応生成物の
リゾリン脂質が強い親水性界面活性を示すため、反応液
からの脱水に際し、リゾリン脂質が水中にミセルとして
可溶化し、リゾリン脂質の収量が低下することである。
第三点はリン脂質が含水系で発泡性を示すため、反応液
からの減圧脱水に際し、著しい発泡現象が生じて脱水が
面倒である。
また、従来法は水溶液としてpH調整用の緩衝液やカル
シウム供給用の塩類溶液を使用するため、次のような二
つの問題点がある。第一点は上記の水溶液に用いる無機
物質が反応生成物に混入することである。反応規模を拡
大すると、この混入物の処理工程が必要となるが、現
在、リン脂質中に混入する無機物質の効率良い除去方法
は確立されていない。第二点は、カルシウム塩溶液を用
いた大量の分解反応では、水に可溶でクロロホルム／メ
タノール系溶媒に不溶な物質が、反応生成物中にしばし
ば出現することである。この物質はリゾリン脂質と水に
対する挙動が類似しているため、反応生成物中から除去
することが難しい。
シウム供給用の塩類溶液を使用するため、次のような二
つの問題点がある。第一点は上記の水溶液に用いる無機
物質が反応生成物に混入することである。反応規模を拡
大すると、この混入物の処理工程が必要となるが、現
在、リン脂質中に混入する無機物質の効率良い除去方法
は確立されていない。第二点は、カルシウム塩溶液を用
いた大量の分解反応では、水に可溶でクロロホルム／メ
タノール系溶媒に不溶な物質が、反応生成物中にしばし
ば出現することである。この物質はリゾリン脂質と水に
対する挙動が類似しているため、反応生成物中から除去
することが難しい。
即ち、本発明の目的は、上記課題を解決し、合成ホス
ファチジルコリンから、１−アシル−リゾホスファチジ
ルコリンを、酵素分解方法を用いて収率よく製造し、し
かも反応生成物の精製が容易な工業的製法を提供するこ
とである。
ファチジルコリンから、１−アシル−リゾホスファチジ
ルコリンを、酵素分解方法を用いて収率よく製造し、し
かも反応生成物の精製が容易な工業的製法を提供するこ
とである。
（課題を解決するための手段） 本発明の酸素分解方法は、合成ホスファチジルコリン
をホスホリパーゼA2酵素を用いて加水分解する際に、ア
ルミナ処理したエーテル、炭化水素、エステルの群から
選ばれる有機溶媒に0.01〜１容量％の水を加えた反応液
中で反応させ１−アシル−リゾホスファチジルコリンを
得ることを特徴とする。
をホスホリパーゼA2酵素を用いて加水分解する際に、ア
ルミナ処理したエーテル、炭化水素、エステルの群から
選ばれる有機溶媒に0.01〜１容量％の水を加えた反応液
中で反応させ１−アシル−リゾホスファチジルコリンを
得ることを特徴とする。
本発明において用いる合成ホスファチジルコリンは、
例えばグリセロホスホコリン１モルに対して脂肪酸の無
水物または脂肪酸の酸ハロゲン化物3.5〜６モルを、エ
ステル化触媒の存在下に非プロトン性高極性溶媒中で反
応させることによって得られる。この反応において、エ
ステル化触媒はピリジン誘導体または第三アミンから選
ばれ、具体的にはジメチルアミノピリジンやトリイソプ
ロピルアミン等が挙げられる。非プロトン性高極性溶媒
としては、例えばジメチルスルホキシド、ヘキサメトキ
シホスホロアミドが挙げられる。また脂肪酸誘導体のア
ルキル基に関し、単一種の脂肪酸を原料に使用すると、
単酸基ホスファチジルコリンが得られ、複数種以上の脂
肪酸を原料に使用すると混酸基ホスファチジルコリンが
得られる。この合成ホスファチジルコリンの脂肪酸種
が、後述する１−アシル−リゾホスファチジルコリンの
脂肪酸種を決定する。
例えばグリセロホスホコリン１モルに対して脂肪酸の無
水物または脂肪酸の酸ハロゲン化物3.5〜６モルを、エ
ステル化触媒の存在下に非プロトン性高極性溶媒中で反
応させることによって得られる。この反応において、エ
ステル化触媒はピリジン誘導体または第三アミンから選
ばれ、具体的にはジメチルアミノピリジンやトリイソプ
ロピルアミン等が挙げられる。非プロトン性高極性溶媒
としては、例えばジメチルスルホキシド、ヘキサメトキ
シホスホロアミドが挙げられる。また脂肪酸誘導体のア
ルキル基に関し、単一種の脂肪酸を原料に使用すると、
単酸基ホスファチジルコリンが得られ、複数種以上の脂
肪酸を原料に使用すると混酸基ホスファチジルコリンが
得られる。この合成ホスファチジルコリンの脂肪酸種
が、後述する１−アシル−リゾホスファチジルコリンの
脂肪酸種を決定する。
本発明に用いられるホスホリパーゼA2は、ヘビ毒由
来、ハチ毒由来、細菌由来及び牛や豚の膵臓由来の公知
のものが何れも使用出来る。この中でもホスホリパーゼ
A2活性の力価、酵素の価格および除去の簡便さから、豚
膵臓由来のものが好ましい。
来、ハチ毒由来、細菌由来及び牛や豚の膵臓由来の公知
のものが何れも使用出来る。この中でもホスホリパーゼ
A2活性の力価、酵素の価格および除去の簡便さから、豚
膵臓由来のものが好ましい。
本発明における加水分解は、例えば合成ホスファチジ
ルコリン１部を後述する有機溶媒10〜500部に溶解し、
これにホスホリパーゼA2を加えて行われる。酵素量はホ
スホリパーゼA2の種類、酵素純度および力価によって変
化するが、通常は合成ホスファチジルコリン1gに対し２
〜100mg程度でよい。反応温度は、10℃から使用する有
機溶媒の沸点の範囲で任意に選択できるが、反応効率を
考えると、室温から50℃までの温度が望ましい。また、
この方法は酵素の熱安定性が良く、例えば豚膵臓起源の
ホスホリパーゼA2は70℃でも活性を示す。反応時間は酵
素量や反応温度によって異なるが、通常１〜10時間程度
である。また、従来の大量の水を使用する界面反応にお
いては、撹拌速度が反応進行率に大きな影響を与えた
が、本発明では通常60〜150rpmの低速撹拌で充分に反応
が進行する。また従来のホスホリパーゼA2の反応では、
反応進行にカルシウム塩溶液やpH調整用の緩衝液の添加
が必要であったが、本発明では、これらの溶液を必要と
しないため反応終了後の精製も容易である。
ルコリン１部を後述する有機溶媒10〜500部に溶解し、
これにホスホリパーゼA2を加えて行われる。酵素量はホ
スホリパーゼA2の種類、酵素純度および力価によって変
化するが、通常は合成ホスファチジルコリン1gに対し２
〜100mg程度でよい。反応温度は、10℃から使用する有
機溶媒の沸点の範囲で任意に選択できるが、反応効率を
考えると、室温から50℃までの温度が望ましい。また、
この方法は酵素の熱安定性が良く、例えば豚膵臓起源の
ホスホリパーゼA2は70℃でも活性を示す。反応時間は酵
素量や反応温度によって異なるが、通常１〜10時間程度
である。また、従来の大量の水を使用する界面反応にお
いては、撹拌速度が反応進行率に大きな影響を与えた
が、本発明では通常60〜150rpmの低速撹拌で充分に反応
が進行する。また従来のホスホリパーゼA2の反応では、
反応進行にカルシウム塩溶液やpH調整用の緩衝液の添加
が必要であったが、本発明では、これらの溶液を必要と
しないため反応終了後の精製も容易である。
本発明における酵素反応は加水分解反応であるため、
加水分解に必要な最少量の水の添加が望ましい。水は有
機溶媒中に0.01〜１容量％になるように添加する。この
範囲の水量では、反応終了後の溶媒による再沈、乾燥濃
縮、濾過剤処理等の精製手段により容易に脱水され、特
別な脱水工程を必要としない。水の添加が0.01容量％未
満では充分に加水分解が行われず、１容量％を超える
と、水除去に伴う反応液の発泡現象、反応生成物の損失
等を生じ、また、余分な脱水工程が必要になり、コスト
と時間がかかってしまう。
加水分解に必要な最少量の水の添加が望ましい。水は有
機溶媒中に0.01〜１容量％になるように添加する。この
範囲の水量では、反応終了後の溶媒による再沈、乾燥濃
縮、濾過剤処理等の精製手段により容易に脱水され、特
別な脱水工程を必要としない。水の添加が0.01容量％未
満では充分に加水分解が行われず、１容量％を超える
と、水除去に伴う反応液の発泡現象、反応生成物の損失
等を生じ、また、余分な脱水工程が必要になり、コスト
と時間がかかってしまう。
本発明に用いられる有機溶媒は、反応の進行速度を上
げるためにアルミナ処理してから使用する。このアルミ
ナには活性度Ｉに調整したカラムクロマトグラフィー用
の中性アルミナが好ましい。アルミナ処理は、有機溶媒
を反応直前に、常温でアルミナを充填したガラスカラム
に通すだけで良い。溶媒の種類や酵素添加量によって異
なるが、アルミナ処理溶媒での反応は、溶媒中に不溶性
のリゾホスファチジルコリンの出現時間が早くなること
が観察される。例えば、ジオキサンを反応溶媒とした反
応例では、処理溶媒中に反応開始10分後にリゾホスファ
チジルコリンによる濁りが生じたが、未処理溶媒中では
30分〜２時間経過後に濁りが生じていた。有機溶媒のア
ルミナ処理で、水分や硫黄、またホスホリパーゼA2の活
性を抑制する因子が除去される。
げるためにアルミナ処理してから使用する。このアルミ
ナには活性度Ｉに調整したカラムクロマトグラフィー用
の中性アルミナが好ましい。アルミナ処理は、有機溶媒
を反応直前に、常温でアルミナを充填したガラスカラム
に通すだけで良い。溶媒の種類や酵素添加量によって異
なるが、アルミナ処理溶媒での反応は、溶媒中に不溶性
のリゾホスファチジルコリンの出現時間が早くなること
が観察される。例えば、ジオキサンを反応溶媒とした反
応例では、処理溶媒中に反応開始10分後にリゾホスファ
チジルコリンによる濁りが生じたが、未処理溶媒中では
30分〜２時間経過後に濁りが生じていた。有機溶媒のア
ルミナ処理で、水分や硫黄、またホスホリパーゼA2の活
性を抑制する因子が除去される。
本発明に用いられる有機溶媒は、エーテル、炭化水
素、エステルの群から選ばれる。具体例としては、エー
テルとしてジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、
ジオキサン、テトラヒドロフラン等、炭化水素としてｎ
−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、石油エーテル、シクロヘキ
サン等、エステルとして酢酸メチル、酢酸エチル等が挙
げられる。これら有機溶媒は非イオン性無極性溶媒であ
り、酵素はこれら溶媒との接触により活性が低下しな
い。また基質であるホスファチジルコリンを溶解するこ
とが出来、酵素が溶解している水層と撹拌により微小界
面を形成し反応を進行させることが出来る。この溶媒中
で反応物のリゾホスファチジルコリンは微少の水層に移
行し、恰もこの水は相間移動触媒の役割を果たすことが
出来る。これら以外の有機溶媒では、例えば、ハロゲン
化炭化水素やアプロテックな非イオン性極性溶媒では酵
素の活性が発揮出来ない。ジクロルエタン、クロロホル
ム等のハロゲン化炭化水素中では酵素が失活する。メタ
ノール、エタノール等は酵素の阻害剤であり、アセト
ン、アセトニトリル、ジメチルスルホオキサイド、ジメ
チルホルムアミド等の非イオン性極性溶媒は蛋白質であ
る酵素を一部溶解し、酵素の構造を変化させ活性を失わ
せる恐れがある。
素、エステルの群から選ばれる。具体例としては、エー
テルとしてジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、
ジオキサン、テトラヒドロフラン等、炭化水素としてｎ
−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、石油エーテル、シクロヘキ
サン等、エステルとして酢酸メチル、酢酸エチル等が挙
げられる。これら有機溶媒は非イオン性無極性溶媒であ
り、酵素はこれら溶媒との接触により活性が低下しな
い。また基質であるホスファチジルコリンを溶解するこ
とが出来、酵素が溶解している水層と撹拌により微小界
面を形成し反応を進行させることが出来る。この溶媒中
で反応物のリゾホスファチジルコリンは微少の水層に移
行し、恰もこの水は相間移動触媒の役割を果たすことが
出来る。これら以外の有機溶媒では、例えば、ハロゲン
化炭化水素やアプロテックな非イオン性極性溶媒では酵
素の活性が発揮出来ない。ジクロルエタン、クロロホル
ム等のハロゲン化炭化水素中では酵素が失活する。メタ
ノール、エタノール等は酵素の阻害剤であり、アセト
ン、アセトニトリル、ジメチルスルホオキサイド、ジメ
チルホルムアミド等の非イオン性極性溶媒は蛋白質であ
る酵素を一部溶解し、酵素の構造を変化させ活性を失わ
せる恐れがある。
反応終了後は、エーテル洗浄とアセトンによる再沈、
乾燥濃縮、濾過助剤による脱酵素等の公知の精製手段に
より容易に目的物が単離出来る。一般的には理論収率は
85％以上、特に反応溶媒と酵素量の選択により理論収率
は90％と極めて良好である。
乾燥濃縮、濾過助剤による脱酵素等の公知の精製手段に
より容易に目的物が単離出来る。一般的には理論収率は
85％以上、特に反応溶媒と酵素量の選択により理論収率
は90％と極めて良好である。
（作用） 従来のホスホリパーゼA2を使用する界面反応では、ホ
スホリパーゼA2の窒素末端の疎水性部分が基質の界面と
結合して加水分解が進行する。一方、本発明において
は、基質とホスホリパーゼA2と疎水性部分が有機溶媒に
溶解し均一系に近い反応で進行し、その際、ホスホリパ
ーゼA2の活性は有機溶媒中でも保持される。また、微量
に加えられた水は有機溶媒中に分散される。
スホリパーゼA2の窒素末端の疎水性部分が基質の界面と
結合して加水分解が進行する。一方、本発明において
は、基質とホスホリパーゼA2と疎水性部分が有機溶媒に
溶解し均一系に近い反応で進行し、その際、ホスホリパ
ーゼA2の活性は有機溶媒中でも保持される。また、微量
に加えられた水は有機溶媒中に分散される。
（発明の効果） 本発明によれば下記のような効果が得られる。
（１） 温和な反応条件で高収率並びに高純度で目的化
合物が製造できる。
合物が製造できる。
（２） 反応液中に無機物を添加しないため、反応生成
物の精製が容易である。
物の精製が容易である。
（３） 水添加量が微量なため、水除去に伴う反応液の
発泡現象、反応生成物の損失、エネルギーの大量消費が
防止出来る。
発泡現象、反応生成物の損失、エネルギーの大量消費が
防止出来る。
（４） 有機溶媒中の均一系に近い反応のため、溶媒の
種類によって反応の進行に伴い生成物が容器の底部に堆
積し、反応状況が肉眼で観察出来る。
種類によって反応の進行に伴い生成物が容器の底部に堆
積し、反応状況が肉眼で観察出来る。
以上の効果により、本発明方法は１−アシル−リゾホ
スファチジルコリンの工業的製造法として極めて好適で
ある。
スファチジルコリンの工業的製造法として極めて好適で
ある。
（実施例） 以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。
尚、各例中、％は重量基準である。
尚、各例中、％は重量基準である。
参考例 反応溶媒のアルミナ処理 シグマ社製のカラムクロマトグラフィー用アルミナ
（活性度Ｉ、タイプWN−3:Neutral）500gを110℃の恒温
槽で２時間乾燥し、水分２％以下とした。このアルミナ
140gを内径4cmのガラスカラムに充填した。充填容積は1
25cm3であった。反応に用いる有機溶媒は、反応直前に
常温で上記アルミナカラムを50ml/minの流速で通した。
（活性度Ｉ、タイプWN−3:Neutral）500gを110℃の恒温
槽で２時間乾燥し、水分２％以下とした。このアルミナ
140gを内径4cmのガラスカラムに充填した。充填容積は1
25cm3であった。反応に用いる有機溶媒は、反応直前に
常温で上記アルミナカラムを50ml/minの流速で通した。
実施例１ ナス型フラスコ中に、化学合成したジパルミトイルホ
スファチジルコリン1g、エチルエーテル150ml及び豚膵
臓起源のホスホリパーゼA2（Novo Industri A/S製,Leci
tase 10L）の1.5ml（ホスホリパーゼA275mg）を添加
し、撹拌子で緩やかに撹拌しながら蒸留水を数滴加え
た。室温で10時間おいた。経時後、エチルエーテルをデ
カンテーションで除去し、新しいエチルエーテル140ml
を加えて撹拌し、再度、デカンテーションでエチルエー
テルを除去し、さらに冷アセトン100mlで２回撹拌とデ
カンテーションを繰り返し、粗生成物を乾燥濃縮した。
この濃縮物をクロロホルム・メタノール同量混液100ml
に溶解し、この溶液中に濾過助剤（ダイカライト・オリ
エント社製、商品名ダイカライト・パーライト）1gを添
加し、撹拌後、濾過して、その母液を蒸留乾燥して0.66
g（収率95％）の白色粉末を得た。
スファチジルコリン1g、エチルエーテル150ml及び豚膵
臓起源のホスホリパーゼA2（Novo Industri A/S製,Leci
tase 10L）の1.5ml（ホスホリパーゼA275mg）を添加
し、撹拌子で緩やかに撹拌しながら蒸留水を数滴加え
た。室温で10時間おいた。経時後、エチルエーテルをデ
カンテーションで除去し、新しいエチルエーテル140ml
を加えて撹拌し、再度、デカンテーションでエチルエー
テルを除去し、さらに冷アセトン100mlで２回撹拌とデ
カンテーションを繰り返し、粗生成物を乾燥濃縮した。
この濃縮物をクロロホルム・メタノール同量混液100ml
に溶解し、この溶液中に濾過助剤（ダイカライト・オリ
エント社製、商品名ダイカライト・パーライト）1gを添
加し、撹拌後、濾過して、その母液を蒸留乾燥して0.66
g（収率95％）の白色粉末を得た。
白色粉末を分析値は下記の通りであった。
TLC メルク社製TLC（Plates Silica Gel 60）20×20cm、
厚さ0.25mm、展開液：クロロホルム／メタノール／水
65/25/4（v/v/v）Rf値0.11、 発色剤:2′,7′−ジクロロフルオレッセン試薬 橙
色、ディトマーレスター試薬 青色 TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 １−パルミトイル−リゾホスファチジルコリン（以
下、LPCと略記） 96％ 不明 ４％ FAB−MS （Pos.）,TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:496 〔パルミトイルLPC＋Ｈ〕+:496 （Neg.）,TEA〔Ｍ−Ｈ〕:255 〔C15H31COO-〕即ちパルミチン酸-:255 実施例２ ナス型フラスコ中に、化学合成したジオレイルホスフ
ァチジルコリン1g、エチルエーテル400mlおよびヘビ毒
起源のホスホリパーゼA2（シグマ社製、Crotalus adama
nteus）20mgを添加し、撹拌子で緩やかに撹拌しながら
蒸留水を数滴加え、キャップで密栓し37℃で２時間反応
させた。後の処理は実施例１に従い、0.62g（収率94
％）の黄色油状物を得た。
厚さ0.25mm、展開液：クロロホルム／メタノール／水
65/25/4（v/v/v）Rf値0.11、 発色剤:2′,7′−ジクロロフルオレッセン試薬 橙
色、ディトマーレスター試薬 青色 TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 １−パルミトイル−リゾホスファチジルコリン（以
下、LPCと略記） 96％ 不明 ４％ FAB−MS （Pos.）,TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:496 〔パルミトイルLPC＋Ｈ〕+:496 （Neg.）,TEA〔Ｍ−Ｈ〕:255 〔C15H31COO-〕即ちパルミチン酸-:255 実施例２ ナス型フラスコ中に、化学合成したジオレイルホスフ
ァチジルコリン1g、エチルエーテル400mlおよびヘビ毒
起源のホスホリパーゼA2（シグマ社製、Crotalus adama
nteus）20mgを添加し、撹拌子で緩やかに撹拌しながら
蒸留水を数滴加え、キャップで密栓し37℃で２時間反応
させた。後の処理は実施例１に従い、0.62g（収率94
％）の黄色油状物を得た。
黄色油状物の分析値は下記の通りであった。
TLC 実施例１と同様の結果であった。
TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 LPC 97％ 不明 ３％ FAB−MS （Pos.）,TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:522 〔オレオイルLPC＋Ｈ〕+:522 （Neg.）,TEA〔Ｍ−Ｈ〕:281 〔C17H33COO-〕即ちオレイン酸-:281 実施例３ 実施例１の反応溶媒をｎ−ヘキサン200ml、豚膵臓起
源のホスホリパーゼA2を2.0mlに変更し、以下同様に操
作し0.68g（収率98％）の白色粉末を得た。
源のホスホリパーゼA2を2.0mlに変更し、以下同様に操
作し0.68g（収率98％）の白色粉末を得た。
白色粉末の分析値は下記の通りであった。
TLC 実施例１と同じ条件 Rf値:0.13に強く、0.53に弱い発色が認められた。
TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 LPC 93％ ホスファチジルコリン ５％ 不明 ２％ FAB−MS （Pos.）,TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:496（強）と733（弱） 〔パルミトイルホスファチジルコリン＋Ｈ〕+:733 以上の結果から、収率の高い理由は未分解の微量のホ
スファチジルコリンが反応生成物に存在するためと思わ
れる。
スファチジルコリンが反応生成物に存在するためと思わ
れる。
実施例４ 実施例１のジパルミトイルホスファリジルコリンをジ
リノレイルホスファチジルコリン、反応溶媒をジオキサ
ン200mlに変更して、キャップで密栓し50℃で５時間反
応させた。後の処理は実施例１に従い0.71g（理論収率
以上）の濃黄色油状物を得た。
リノレイルホスファチジルコリン、反応溶媒をジオキサ
ン200mlに変更して、キャップで密栓し50℃で５時間反
応させた。後の処理は実施例１に従い0.71g（理論収率
以上）の濃黄色油状物を得た。
濃黄色油状物の分析値は下記の通りであった。
TLC 実施例１と同じ条件 Rf値:0.13に強く、0.55に弱い発色が認められた。
TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 LPC 90％ ホスファチジルコリン ７％ 不明 ３％ FAB−MS （Pos.）TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:519（強）と783（弱） 〔リノレイルホスファチジルコリン＋Ｈ〕+:783 以上の結果から、収率が理論量を越えた理由は未分解
の少量のホスファチジルコリンが反応生成物に存在する
ためと思われる。
の少量のホスファチジルコリンが反応生成物に存在する
ためと思われる。
実施例５ 実施例１の反応溶媒を酢酸エチル200mlに変更し、以
下同様に操作し、0.74g（理論収量以上）の白色粉末を
得た。
下同様に操作し、0.74g（理論収量以上）の白色粉末を
得た。
白色粉末の分析値は下記の通りである。
TLC 実施例１と同じ条件 Rf値:0.10に強く、0.52に弱い発色が認められた。
TLC−FID（イヤトロスキャン法） 展開液:TLCと同様 LPC 86％ ホスファチジルコリン 11％ 不明 ３％ FAB−MS （Pos.）,TEA〔Ｍ＋Ｈ〕+:496（強）と733（弱） 〔パルミトイルホスファチジルコリン＋Ｈ〕＋は733 以上の結果から、収率が理論量を越えた理由は未分解
の少量のホスファチジルコリンが反応生成物に存在する
ためと思われる。
の少量のホスファチジルコリンが反応生成物に存在する
ためと思われる。
比較例１ ナスフラスコ中に、化学合成したジパルミトイルホス
ファチジルコリン1g、エチルエーテル／エタノール溶液
（95/5 v/v）150ml、ハブ毒（日本蛇族学術研究所製）2
0mgを溶解した0.05M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）10m
l、10mMの塩化カルシウム水溶液30mlを添加し、撹拌子
で激しく撹拌しながら、37℃で２時間反応させた。減圧
下に溶媒を留去し、さらに連続的に脱水を試みたが、反
応液に発泡現象が認められた。そのためベンゼン10mlを
加えての減圧蒸留を３回繰り返して脱水した。この蒸留
残査を冷アセトン100mlで２回撹拌とデカンテーション
を行い、粗生成物760mgを得た。この粗生成物をクロロ
ホルム／メタノール同量混液100mlに溶解したが、この
溶媒に不溶な物質が出現した。この物質は脱水前の反応
溶媒には認められなかった。この粗生成物の溶液をカラ
ムクロマト用シリカゲル（フナコシ薬品製、商品名フナ
ゲル）が充填されたガラスカラム（３×30cm、充填量90
g）に注入した。溶離溶媒はクロロホルムとメタノール
を４対１に混合し、3ml/minで通液し、TLCで脂肪酸とホ
スファチジルコリンの流出を確認後、メタノール比率を
高めて、最終的には１対１でLPCを溶出した。LPCの収量
は541mgで理論収量は80％であった。
ファチジルコリン1g、エチルエーテル／エタノール溶液
（95/5 v/v）150ml、ハブ毒（日本蛇族学術研究所製）2
0mgを溶解した0.05M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.4）10m
l、10mMの塩化カルシウム水溶液30mlを添加し、撹拌子
で激しく撹拌しながら、37℃で２時間反応させた。減圧
下に溶媒を留去し、さらに連続的に脱水を試みたが、反
応液に発泡現象が認められた。そのためベンゼン10mlを
加えての減圧蒸留を３回繰り返して脱水した。この蒸留
残査を冷アセトン100mlで２回撹拌とデカンテーション
を行い、粗生成物760mgを得た。この粗生成物をクロロ
ホルム／メタノール同量混液100mlに溶解したが、この
溶媒に不溶な物質が出現した。この物質は脱水前の反応
溶媒には認められなかった。この粗生成物の溶液をカラ
ムクロマト用シリカゲル（フナコシ薬品製、商品名フナ
ゲル）が充填されたガラスカラム（３×30cm、充填量90
g）に注入した。溶離溶媒はクロロホルムとメタノール
を４対１に混合し、3ml/minで通液し、TLCで脂肪酸とホ
スファチジルコリンの流出を確認後、メタノール比率を
高めて、最終的には１対１でLPCを溶出した。LPCの収量
は541mgで理論収量は80％であった。
以上のように従来法では厳しい反応条件が要求され、
さらに反応生成物の脱水や精製に特別な工程が必要であ
る。
さらに反応生成物の脱水や精製に特別な工程が必要であ
る。
比較例２ 実施例４の反応条件のうち、ジオキサンのみをアルミ
ナ未処理ジオキサンに変えた。反応開始40分後、反応溶
媒中に反応生成物による濁りが生じ始めた。処理溶媒で
は反応開始10分後に濁りが生じていた。
ナ未処理ジオキサンに変えた。反応開始40分後、反応溶
媒中に反応生成物による濁りが生じ始めた。処理溶媒で
は反応開始10分後に濁りが生じていた。
以上の様にアルミナ未処理の反応溶媒では実施例４に
比較して反応の進行速度が遅い。
比較して反応の進行速度が遅い。
以上の結果より、合成ホスファチジルコリンは微量水
分を含むアルミナ処理の有機溶媒中でホスホリパーゼA2
により効率良く加水分解され、１−アシル−リゾホスフ
ァチジルコリンに変換され、その反応生成物の精製も容
易であることが判明した。特に反応溶媒や酵素の選択条
件によって90％以上の理論収量で、純度90％以上の１−
アシルリゾホスファチジルコリンが製造出来る。
分を含むアルミナ処理の有機溶媒中でホスホリパーゼA2
により効率良く加水分解され、１−アシル−リゾホスフ
ァチジルコリンに変換され、その反応生成物の精製も容
易であることが判明した。特に反応溶媒や酵素の選択条
件によって90％以上の理論収量で、純度90％以上の１−
アシルリゾホスファチジルコリンが製造出来る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−54384（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−54385（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−2589（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ（1981），663（２），ｐ．506− 515 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 C07F 9/10 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- 【請求項１】合成ホスファチジルコリンをホスホリパー
ゼA2酵素を用いて加水分解する際に、アルミナ処理した
エーテル、炭化水素、エステルの群から選ばれる有機溶
媒に0.01〜１容量％の水を加えた反応液中で反応させ１
−アシル−リゾホスファチジルコリンを得ることを特徴
とする合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14209089A JP2830072B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14209089A JP2830072B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037589A JPH037589A (ja) | 1991-01-14 |
| JP2830072B2 true JP2830072B2 (ja) | 1998-12-02 |
Family
ID=15307198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14209089A Expired - Fee Related JP2830072B2 (ja) | 1989-06-06 | 1989-06-06 | 合成ホスファチジルコリンの酵素分解方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2830072B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5891466A (en) * | 1990-08-13 | 1999-04-06 | Yesair; David W. | Mixed Liped-Bicarbonate colloidal particles for delivering drugs or calories |
| US5716814A (en) * | 1996-02-02 | 1998-02-10 | Biomolecular Products, Inc. | Methods for making lysophosphatidylcholine |
| CA2788500C (en) * | 2001-10-11 | 2017-08-01 | Biomolecular Products, Inc. | Modifications of solid 3-sn-phosphoglycerides |
-
1989
- 1989-06-06 JP JP14209089A patent/JP2830072B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８１），６６３（２），ｐ．５０６−５１５ |
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|---|---|
| JPH037589A (ja) | 1991-01-14 |
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