JP2815649B2

JP2815649B2 - ヒトレラキシン製剤

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Publication number: JP2815649B2
Application number: JP1502501A
Authority: JP
Inventors: シポーラ，デイビッド・シィー; ニューイェン，チュー・エイチ; シャイア，スティーブン・ジェイ
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-08
Publication date: 1998-10-27
Anticipated expiration: 2013-10-27
Also published as: US5945402A; ATE88352T1; US5451572A; JPH03502794A; EP0407401A1; IL89276A0; AU626840B2; IE890452L; IE63208B1; PT89835B; DE68906153D1; NZ228012A; DE68906153T2; IL89276A; AU3183389A; EP0407401B1; ES2013394A6; PT89835A; CA1336403C; CN1035619A

Description

【発明の詳細な説明】発明の技術分野本発明は安定、均質、かつ生物学的に活性なヒトレラ
キシン製剤および該製剤による哺乳類の治療法に関す
る。

従来技術成熟ヒトレラキシンは約6000ダルトンの卵巣ホルモン
ペプチドであって、分娩に先立って産道を再形成し、出
産過程を容易にする働きがある［ハイソウ（Hisaw,F.
L.），Pros.Soc.Exp.Biol.Med.，23,661−663（192
6）；シュワベら（Schwabe,C.），Biochem.Biophys.Re
s.Comm.，75:503−570（1977）；ジェームズら（James,
R.），Nature，267:544−546（1977）］。このタンパク
質は妊娠および出産期間中に必要な器官構造の変化をも
たらすよう、標的器官の結合組織の再構築を調節するよ
うである。妊娠ホルモンとしてのレラキシンの重要な役
割には、未熟児出産の防止と分娩の際の子宮頚部の熟成
が含まれる。

主として妊娠ホルモンであるが、レラキシンは非懐妊
女性および男性にも検出されている［ブライアント−グ
リーンウッド（Bryant−Greenwood,G.D.），Endocrine
Reviews.，３:62−90（1982）およびウェイス（Weiss,
G.），Ann.Rev.Physiol.，46:43−52（1984）］。

レラキシンはブタ、ネズミ、ウマ、フカ、トラ、ラッ
ト、サメおよびヒトを含む様々な種から精製されてお
り、少なくとも１次または２次構造は、インシュリンお
よびインシュリン様成長ホルモンと相同（ホモロジー）
であることが明らかにされた。ヒトにおいては、レラキ
シンは妊婦の黄体（CL）に最も豊富に存在する。

ブタレラキシン遺伝子から得たブローブを用いるゲノ
ムクローニングによって２種類の形のヒト遺伝子が同定
された［ハドソンら（Hudson,P.）,Nature,301:628−63
1（1984）およびハドソンら（Hudson,P.）,The EMBO Jo
urnal,３:2333−2339（1984）］が、一方の遺伝子形（H
2）のみがCL内で転写されることが分かった。もう一方
の遺伝子が他の組織部位で発現されるか、またはそれが
偽遺伝子であるのかは、明らかでない。両ヒトレラキシ
ン遺伝子は、互いに、ヌクレオチドおよびアミノ酸の相
当な相同性を示し、とりわけ、ＢおよびＣ両鎖がかなり
の相同性を示した。しかしながら、幾つかの注目すべき
配列の分散があり、とりわけＡ鎖およびＢ鎖のアミノ末
端領域にみられる。

試験した全ての種に類似していることは、H2レラキシ
ンの１次翻訳産物は24アミノ酸のシグナル配列、次い
で、約29アミノ酸からなるＢ鎖、104−107アミノ酸から
なる結合組織、および約24アミノ酸のＡ鎖からなるプレ
プロレラキシンであるということである。

卵巣でH2レラキシンが合成され、発現されるという事
実はこれが妊娠の生理学に関与する配列であることを示
唆している。合成ヒトレラキシン（H2）およびある種の
ヒトレラキシン類似体の生物学的活性を試験し、その結
果、生物学的な活性に必要なレラキシンコア（核）、並
びに生物学的活性に影響しない、アミノ酸によるメチオ
ニンの置換が明らかになった［ジョンストンら（Johnst
on），Peptides:Structure and Function,Proc.Ninth A
merican Peptide Symposium,デバーら（Deber,C.M.）
編，（Pierce Chem.Co.1985）］。

静脈内および筋肉内投与を含む、ブタレラキシンを薬
物として適用または導入する様々な方法が発表された。
バーンバーグ（Birnberg）およびアビトール（Abito
l），Obstet.＆ Gynecol.，10:366−370（1957）；エシ
ュナーら（Eeichner），Am.J.Obstet.Gyn.，71:1035−1
048（1956）。さらに、ブタレラキシンは、ヒトにおけ
る臨床試行として、子宮頚部の熟成および出産の誘導の
ために局所的に用いられている。マクレナンら（MacLen
nan），Obstetrics ＆ Gynecology，68:598−601（198
6）；マクレナンら（MacLennan），The Lancet,i:220−
223（1980）；マクレナンら（MacLennan），Obstetrics
＆ Gynecology，58:601−604（1981）；マクレナンら
（MacLennan），Aust.NZ J.Obstet.Gynaec.，25:68−71
（1985）。これらの研究では蒸留水中のブタレラキシン
を水溶性メチルセルロース顆粒と混合して粘性のゲルを
調製する。頚管のスコアを改善するには用量2mgで十分
であった。マクレナン（1981、前掲）。

さらに、ブタレラキシンをポリエチレングリコール製
ペレット内で成形し、ヒト頚管の熟成に用いた。エバン
スら（Evans），Am.J.Obstet.Gynecol.，147:410−414
（1983）。また、滅菌Ｋ−Ｙゲルおよびりん酸緩衝化食
塩水にブタレラキシンを懸濁して製剤化し、滅菌した人
工受精用ピペットで頚骨に注入した。3000単位のレラキ
シンの頚骨への注入から８時間以内に頚部の拡張が増大
した。プレズグラバス（Perezgrovas）およびアンダー
ソン（Anderson），Biology of Reproduction，26:765
−776（1982）。

欧州特許公開第86,649（1983年８月24日公開）にはブ
タプレプロレラキシン、ブタプロレラキシン、およびブ
タレラキシンの製造法が記載されている。オーストラリ
ア特許第561,679（1987年８月26日発行）、欧州特許公
開第68,375（1983年１月５日公開）およびハーレー（Ha
ley），DNA，１:155−162（1982）にはブタレラキシン
の製造法が記載されている。

欧州特許公開第101,309（1984年２月22日公開）およ
び米国特許第4,758,516（1988年７月19日発行）の各々
にはヒトH1レラキシンおよびH2レラキシンおよびその類
似体をコードする遺伝子配列の分子クローニングおよび
特性が開示されている。欧州特許公開第260,149（1988
年３月16日公開）にはヒトプロレラキシンの製剤が開示
されている。米国特許第4,267,101（1981年５月12日発
行）には胎児膜からのヒトレラキシンの調製方法が開示
されている。欧州特許公開第251,615（1988年１月７日
公開）には還元したヒトレラキシンＡ鎖またはその類似
体と、還元したヒトレラキシンＢ鎖またはその類似体と
を、pH7.0以上のpH等の条件下で結合させる方法が開示
されている。

胎児膜からのヒトレラキシンの調製は米国特許第4,26
7,101に開示されている。シェアウッド（Sherwood）
は、「生殖の生理学（The Physiology of Reproductio
n）」（KnobilおよびNeill編,New York,Raven Press,19
88,585−673頁）の587頁で、レラキシンの抽出および単
離はレラキシンが酸性溶媒中で安定であるということを
利用するものであると指摘した。さらに、588頁ではレ
ラキシンを強酸性媒質で抽出すると低pHであることと、
高分子量プロテアーゼが沈澱するという２つの理由から
レラキシンの分解（減成）が最小限になると述べてい
る。エルドリッジ（Eldridge）およびフィールズ（Fiel
ds），Endocrinology，117:2512−2519（1985）は等電
点電気泳動でウサギレラキシンの等電点が約6.5である
ことを報告した。これは、フィールズら（Fields），An
n.NY Acad.Sci.，380:75（1982）が見い出した、より高
いウサギレラキシンの等電点の値と対照的である。

さらに、米国特許2,964,448（1960年12月13日発行）
は好ましくは低酸性の、レラキシンと脂肪酸のアルミニ
ウム塩とを注射用オイル中に含有する注射可能なレラキ
シン組成物を開示した。

EP107782およびEP107045は、天然の起源からのレラキ
シンの精製であって、期間中緩衝化溶液をクロマトグラ
フィーに用いる方法を記載している。しかしながら、最
終生成物は、脱塩された、凍結乾燥形のレラキシンであ
る。

本発明は生物学的に活性で、安定かつ均質な治療用の
ヒトレラキシン製剤、即ち、局所または非経口投与用製
剤を提供することを目的とするものである。本発明はま
た、長期間、液状で保存可能であって、投与前の貯蔵お
よび運送が容易な製剤を提供することを目的とするもの
である。さらにまた本発明は、ヒトレラキシンの凝集お
よび分解を減じ、温度変化による分解に抵抗性を有する
ヒトレラキシン製剤を提供することを目的とするもので
ある。さらにまた本発明は、頚部投与のためにヒトレラ
キシンゲル製剤を提供することを目的とするものであ
る。さらにまた本発明は、治療および生理学／化学的な
利点が付加されたヒトレラキシン製剤を提供することを
目的とするものである。

これらの、および他の目的は本明細書全体から明らか
であろう。

発明の要約即ち、本発明は、哺乳類の生殖生理の調整に有用な、
生物学的に活性な医薬組成物であって、該組成物のpHを
約４から約７以下、好ましくは4.5〜5.5に維持するバッ
ファー中に治療有効量のヒトレラキシンを含有する組成
物を提供するものである。さらに、好ましくは、製剤は
等張性である。

この組成物は液体、凍結乾燥品、凍結溶液、またはゲ
ルの形状であってよい。組成物がゲル形である場合、好
ましくは水溶性多糖類（ポリサッカリド）またはポリエ
チレングリコールを含有し、最も好ましくはメチルセル
ロースを含有する。

本発明はまた、哺乳類の生殖生理の調整法であって、
哺乳類に治療有効量本発明組成物を投与することからな
る方法を提供するものである。

本発明において初めて、HPLCによる評価で、ヒトレラ
キシンの分解速度が酸性条件下で最適レベルまで低下す
ることが見いだされた。従って、製剤の免疫原性が減少
し、その安全性が改善され得る。この発見の結果、生物
学的活性を保持し、有効期間（シェルフライフ）が長
く、凍結乾燥し、またはせずに治療用に投与することが
できるヒトレラキシン製剤が調製された。好ましくは、
５℃における有効期限が少なくとも２年（HPLCの主ピー
ク面積の10％減少を許容減少量としたとき）であるよ
う、約pH5でレラキシンを製剤化することが好ましい。

図面の簡単な説明図1a−1eは５種類の異なる製剤（pH3からpH7.5まで）
に関する、３種の異なる温度でのRP−HPLCにおけるヒト
レラキシンの主要ピークフラクションを時間の関数とし
て表したグラフである。

図２は３種の異なる温度においてRP−HPLCで測定し
た、ヒトレラキシン製剤の分解速度を製剤のpHの関数と
して表したグラフである。

図3a−3eは５種類の異なる製剤（pH3からpH7.5まで）
に関する、３種の異なる温度でのRP−HPLCにおけるヒト
レラキシンの活性を時間の関数として表したグラフであ
る。

図４は種々の安定化剤を添加したクエン酸製剤中の逆
相HPLCにおける主ピークの25℃での分解速度を表す棒グ
ラフである。

図５は妊娠ウサギへの静脈内、皮下、および膣内投与
後の短いレラキシンの血清濃度対時間のグラフである。

図６は妊娠ウサギへのベンゾプルプリンの存在下、ま
たは非存在下での皮下投与後における短いレラキシンの
血清濃度対時間のグラフである。

好ましい実施態様本明細書中、ヒトレラキシンとは、特異的なホルモン
作用を示すタンパク質であって、それは人類および、お
そらく他の哺乳類の生殖生理学の調整、例えば、妊娠の
維持、分娩の有効化および***運動を高めて受精を助け
る等のホルモン作用（ただしこれらに限定されない）を
示すタンパク質を指す。そのような使用の具体例には、
以下の妊娠に関連した多くの生殖作用、並びに生物学的
作用が含まれる。例えば恥骨結合または恥骨靭帯への作
用、およびコラーゲン性フィラメントの再配列によって
分娩を有効にする；子宮筋層の抑制；着床に先立つ子宮
内膜の調製；黄体崩壊における役割；乳腺の成長および
分化；***運動性の増進；および可能な***のヒト頚管
通過能力の増強。ヒトレラキシンまたはその変異体の機
能性を、インビトロのバイオアッセイでネズミの恥骨結
合に正作用を示すか、子宮細胞系を用いるインビトロア
ッセイでcAMP濃度を増大するかについて調べた。本明細
書中、医薬製剤の定義において用いる“生物学的に活
性”という語句は、上記のヒトレラキシンに関する文脈
で定義される。

ヒトレラキシンおよびその製造方法（組換え培養によ
る合成をも含めて）は既知である（例、欧州特許101,30
9および112,149、前掲）。

“レラキシン”という語句には、組換えまたは天然起
源のレラキシン、並びにアミノ酸配列変異体等のレラキ
シン変異体が包含される。高速原子衝撃イオン化による
イオン化マススペクトルで黄体および血清中のレラキシ
ンとして優勢なものはＢ鎖の先端が切断された形のH2レ
ラキシン、即ちレラキシンH2（B29A24）であり、Ｂ鎖の
Ｃ末端４アミノ酸が存在しないのでＢ鎖が29位のセリン
で終わっているものであるということが分かった。この
優勢な形のもの（本明細書中、33アミノ酸残基からＢ鎖
を含有する“長レラキシン”に対して“短縮レラキシ
ン”と称する）が、本発明において用いるのに好まし
い。

また、本発明において“ヒトレラキシン”という語句
は１またはそれ以上のアミノ酸残基の挿入、置換、また
は欠失、グリコシル化の変異体、非グリコシル化ヒトレ
ラキシン、有機または無機塩、共有結合を介し修飾され
たヒトレラキシン、ヒトプレプロレラキシン、およびヒ
トプロレラキシンを包含する。組換えDNA法を用いて、
既存のDNAを変化させることで変異体を得ることができ
る。そのようなレラキシン分子の構造の変異または変化
による変異体も、ヒトレラキシンの機能（生物学的）が
維持されている限り、本発明の範囲に含まれる。そのよ
うな既述の生物学的作用を有するヒトレラキシン変異体
は上記したインビトロアッセイによって容易に同定され
る。

変異体は、１またはそれ以上の方法によって、選択し
た遺伝子の特定の部位（１以上）にアスパラギン酸をコ
ードするコドンを導入するよう改変することにより、レ
ラキシンコード化配列から調製される。得られた変異体
タンパク質を希酸で処理して所望のタンパク質またはペ
プチドを遊離し、タンパク質が単離および精製され易い
ようにする。

レラキシンはまた、レラキシン鎖とユビキチンとの融
合タンパク質を生成させ、ユビキチン加水分解酵素を用
いてタンパク質を開裂することにより調製することがで
きる。加えて、トランス活性化タンパク質をコードする
ベクター用い、プロレラキシンのための酵母発現系を利
用して得ることもできる。

本発明のレラキシンは欧州特許251,615（1988年１月
７日公開）記載のごとくＡ鎖およびＢ鎖を合成し、精製
し、結合させることにより生成される。合成レラキシン
については、一般にＡ鎖とＢ鎖を4:1のモル比で用い
る。得られた生成物を、次いで、逆相HPLC、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過、透析等の既知の方法、
またはそれらの任意の組み合わせからなる方法で精製す
る。

組成物として製剤化する上で有効なレラキシンの量は
治療の具体的な状況、患者の病歴、治療経路、および投
与計画等、幾つかの変数に基づいて決定される。治療対
象となる状況には、妊娠期間末期の出産困難、および未
熟児出産の防止が含まれ、さらに強皮症のようなある種
の結合組織異常の治療が含まれる。治療経路には例え
ば、皮下、腹腔内、静脈内、および筋肉内投与等の非経
口投与が含まれる。

現在、問題のある妊娠の治療に用いられる平均用量は
通常の臨床医ならばよく知っている様々な指標、例えば
投与経路、投与計画、妊娠期間、レラキシンの型、治療
される患者の状態、組成物の形状、その他、医師にとっ
て既知の勘案すべき条件に基づいて変化される。例え
ば、臨床での局所投与の有効量はヒトレラキシン約１〜
3mgを含有するゲルを約５〜10ml用いることが適当であ
る。産道の調製等、生殖機能のへの作用の場合、静脈投
与の平均用量は約0.1μg/kgから約1500mg/kgの範囲であ
る。

製剤のpHは約４から約７以下、好ましくは約4.5〜5.
5、最も好ましくは約５とする。至適pHはまた製剤のイ
オン強度および保存温度に依存する。製剤は等張性であ
ることが好ましく、製剤のイオン強度μは少なくとも約
0.1、より好ましくは約0.1〜0.2、最も好ましくは、約
0.15モル（molar）であり、製剤の浸透圧重量モル濃度
は好ましくは約200〜300mmol/kg、より好ましくは240〜
260mmol/kgである。保存温度が約25℃であれば、pHは約
４〜５であることが好ましい。

所望の範囲にpHを維持し得るバッファーを用いて本発
明の製剤のpHを維持することが好ましい。特定のバッフ
ァーを用いることができるか否かはバッファーの能力、
より詳細にはそのpK値に依存する。例として、ある種の
有機酸バッファーおよびヒスチジンが含まれる。適当な
有機酸バッファー（有機酸とその塩のバッファー）に
は、例えば、クエン酸（塩）バッファー類（例、クエン
酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン
酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸
一ナトリウム混合物）、コハク酸（塩）バッファー類
（例、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク
酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナ
トリウム混合物）、酒石酸（塩）バッファー（例、酒石
酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−酒石酸ナトリウム
混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物）、マレイン
酸（塩）バッファー、グルコン酸（塩）バッファー（グ
ルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−
水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリ
ウム混合物）、ホウ酸（塩）バッファー、イミダゾール
バッファー、乳酸（塩）バッファー（乳酸−乳酸ナトリ
ウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳
酸カリウム混合物）および酢酸（塩）バッファー（酢酸
−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合
物）が含まれる。本発明にとって最も好ましいバッファ
ーはクエン酸バッファーおよび酢酸バッファーであり、
なかでもクエン酸バッファーが最も好ましい。注目すべ
きことは、従来用いられているりん酸バッファーやTris
バッファーでは製剤のpHを所望のレベルに維持すること
ができないということである。

本発明の製剤は非経口投与、とりわけ静脈投与に有用
なように適当な等張性および浸透圧重量モル濃度を有す
ることが好ましい。もしもイオン強度および浸透圧が上
記の好ましい範囲になければ、浸透圧重量モル濃度を調
節する試薬を製剤に添加し、上記範囲内に調節すること
が望ましい。そのような試薬には、例えば、塩化ナトリ
ウムおよび塩化カリウム、臭化マグネシウム等のハロゲ
ンのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、並びに
マンニトールのような中性多価糖アルコールがある。最
も好ましい試薬は塩化ナトリウムである。

製剤の安定化および凍結乾燥のために、薬学的に許容
される物質を製剤に加えても良い。例えば、３価または
それ以上の多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、
エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリ
トール、アラビトール、およびマンニトール、並びにエ
タノールおよびプロピレングリコール等の直鎖アルコー
ルが含まれる。これらの物質は単独で、もしくは混合物
として用いることができる。好ましくは、他の成分を考
慮して、これらの物質を約１〜25w/w％、より好ましく
は２〜10w/w％用いる。

さらに、本発明の組成物は、それが局所適用されるも
のである場合、子宮頚部または膣からの吸収を促進する
物質を含有することが好ましい。そのような吸収促進剤
の例として以下のものを挙げることができる。コレステ
ロールと類似構造を有する分子、例えば、グリココール
酸ナトリウム等のグリココール酸の塩、コール酸ナトリ
ウム等のコール酸の塩、24,25−タウロジヒドロフシデ
ート等のフシジン酸の塩、およびエステル等の誘導体；
非イオン性表面活性剤；オレイン酸等の約７〜25炭素原
子からなる脂肪酸誘導体；ナイアシンアミド；ニコチン
酸またはサリチル酸、またはその塩またはエステル；お
よびアゾン類。

本明細書中、好ましい液状組成物は、全イオン強度が
約0.15モルとなるように塩化ナトリウムを含有し、適当
な浸透圧重量モル濃度を示す、10mMクエン酸バッファー
（pH5）中ヒトレラキシン含有組成物である。

本発明の製剤は液体、凍結品、またはゲル状、あるい
は凍結乾燥され再構築されるものであってよい。当業者
ならば、他の添加物、例えば最適な凍結乾燥に必要な糖
アルコールなどのタイプおよび量を決定することができ
る。そのような好ましい添加物の１つはマンニトールで
ある。本発明の製剤は長期間安定で種々の温度で液体状
態のまま保存できる。本発明製剤をプラスチックでなく
ガラス容器内に保存することが好ましい。また、本発明
製剤は凍結、解凍、再凍結、再解凍してもなんら悪影響
はない。好ましい貯蔵温度は−20〜30℃であり、最も好
ましい貯蔵温度は約２〜８℃である。液状の本発明製剤
の生物学的活性は少なくとも30日間維持され、生理学的
安定性は１年間の結果から外挿して少なくとも２年間で
ある。

ゲル製剤を得るためには、通常、液状組成物を有効量
の水溶性多糖類またはポリエチレングリコールと混合し
て局所適用に適した粘度のゲルを調製する。多糖類に
は、例えば以下のものが含まれる。メチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびヒ
ドロキシプロピルセルロース等の、アルキルセルロー
ス、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒド
ロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース
等のセルロース誘導体；デンプンおよび粉砕デンプン；
寒天；アルギン酸およびアルギネート；アラビアゴム；
プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デ
キストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラ
ン；アラビナン；チトサン；グリコーゲン；グルカン；
および合成バイオポリマー；並びにゴム類、例えばキサ
ンタンゴム；グアゴム；ローカストビーンゴム；アラビ
アゴム；トラガカントゴム；カラヤゴム；およびそれら
の誘導体および混合物。本発明にとって好ましいゲル化
剤は生物学的な系で不活性であって、無毒、調製が容易
であり極端な流動性や粘性を示さず、その中に含有する
レラキシンの安定性を損なわない物質である。

好ましくは多糖類がエーテル化セルロース誘導体、よ
り好ましくは、十分に規定され、精製された米国特許に
記載の、メチルセルロースおよびヒドロキシアルキルセ
ルロース誘導体、例えばヒドロキシプロピルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒドロキシプ
ロピルメチルセルロースである。本発明にとって最も好
ましいものはメチルセルロースである。

ゲル化に有用なポリエチレングリコールは通常、適当
な粘度を得るための低分子量および高分子量ポリエチレ
ングリコールである。例えば、分子量400−600のポリエ
チレングリコールと分子量1500のポリエチレングリコー
ル一個の、ペーストを得るのに適当な比率の混合物が本
目的に適する。

多糖類およびポリエチレングリコールに関して“水溶
性”という語句は、コロイド溶液および分散液を含む。
一般に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換
率により決定され、本発明にとって有用な安定化誘導体
は誘導体が水溶性になるよう、セルロース鎖のアンヒド
ログルコース単位あたり十分な数のエーテル基を含有し
ている必要がある。エーテル置換率はアンヒドログルコ
ース単位あたり少なくとも0.35個のエーテル基で十分で
ある。さらに、セルロース誘導体はアルカリ金属の塩、
例えばLi、Na、ＫまたはCsの塩であってもよい。

ゲルにメチルセルロースを用いる場合、そのゲル中濃
度は約２−５％であり、レラキシンのゲル中濃度は約10
0−1000μg/mlであることが好ましい。さらに好ましく
は、メチルセルロースのゲル中含有量が約３％であっ
て、レラキシン濃度が約300−1000μg/mlである。

また、光感受性のゲル製剤の場合、抗酸化剤、即ち、
好ましくはアスコルビン酸（好ましくは少なくとも0.5
％）、および／または補助溶媒、好ましくはグリセロー
ルおよび／またはエタノール（好ましくは約20％）、最
も好ましくはグリセロール等、ゲルが光に暴露されたと
き、該ゲルの光酸化を防止する１またはそれ以上の物質
を含有させる。例えば、メチルセルロースゲルをホイル
で覆って、または着色ビンに入れて保存し、光の侵入を
阻止する。

以下に実施例を挙げ、本発明を詳しく説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１ヒトレラキシン安定性の研究はpH3から10までの数個
の10mMバッファーを用いて行った（研究１）。製剤の安
定性に及ぼすイオン強度の増大による影響も調べた（研
究２）。

試料の調製研究１および２のために、ヒト長レラキシン（33アミ
ノ酸のＢ鎖を有するH2型）を、固相合成法［バラニー
（Barany,G.）およびメリーフィールド（Merrifield）
ら，The Peptides，２:1−284,グロス（Gross,E.）およ
びメイエンホーファー（Meienhofer,J.）ら編,Acadmic
Press,New York（1980）］によってＡおよびＢ鎖を合成
することにより得た（欧州特許112,149（前掲）に開
示）。鎖をHPLC精製し（トリフルオロ酢酸（TFA）／酢
酸グラジエント）、A:B鎖を重量比4:1で混合し、0.2−1
M CAPSバッファー（３−［シクロヘキシルアミノ］プロ
パンスルホン酸、Calbiochem）、0.75M グアニジン塩
酸塩、10％（v/v）メタノール（BurdickおよびJackso
n）中、pH約10.2において、全タンパク質量0.25〜2.0mg
/mlで結合させた。溶液を完全に窒素洗浄し、20℃で一
夜（12−18時間）撹拌した。次いで試料を適当なバッフ
ァー（りん酸緩衝化食塩水、0.01％ Tween 20、または
0.1％酢酸）に対して透析し、Vydac C−4 HPLCカラムに
適用し、TFA/アセトニトリルグラジエントで溶離した。
HPLCのレラキシンフラクションを同定し、TFAバッファ
ーに採取し、試料から減圧下に除去した。このようにし
て得たレラキシンを凍結乾燥した。

長レラキシンを、研究１には124mg（ペプチドの約80
重量％）、研究２には20mg（ペプチドの約67重量％）用
いた。いずれの試料もトリフルオロ酢酸（TFA）を15重
量％含有する白色の凍結乾燥粉末である。十分量のMill
i−Ｑ水（活性炭およびMillipore Inc.供給のイオン交
換からなる水精製系を通しておいた脱イオン水）を加え
てペプチド濃度を約1mg/mlとした。

Milli−Ｑ水中の長レラキシンを５℃でSpectrapor 7
（分子量限界3500）透析チュービングを用いて透析する
ことにより適当な製剤系バッファーに入れた。このチュ
ービングをβ−メルカプトエタノール1ml、EDTA 3.36
g、およびNaHCO₃ 4.2gを含有するMilli−Ｑ水２中で
洗浄し、次いで60〜70℃で４回、Milli−Ｑ水により洗
浄した。チュービングを50％（w/v）エタノール中、５
℃で保存し透析前に十分に洗浄した。

透析直後の全試料の濃度を、メチオニン残基がリジン
残基で置換されているレラキシン類似体の定量アミノ酸
分析で得た値の吸光係数2.18（mg/ml）^-1cm^-1を用いて
紫外吸収スペクトル測定により求め、濃度を光散乱効果
に関して補正した。各試料を層流フード中、0.2μm Mil
lex GV−４（表面積6.45mm²）フィルターを通して滅菌
ろ過し、テフロンを張ったネジ式のフタのついた滅菌ホ
ウケイ酸ガラスビン（Wheaton、100μ、300μおよ
び1.5ml）を入れ、５、52および40℃において保存し
た。別の1mg/mlで行った実験におけるろ過ではタンパク
質濃度の有意な低下を認めなかったことから、濃度は何
がビンにろ過されたかということを正確に示唆してい
る。

研究１では、誤差評価を得るとともに、同一ビンから
の繰り返し試料採取によって、不純物が混入されるか否
かを決定するために各バッファーについて３重反復試験
用のビンをそれぞれの温度で貯蔵した。

研究３ではレラキシンH2（B33 A24）_APyro−Glu¹を用
いた。ここにH2はヒト卵巣で発現されたヒト遺伝子を指
し、ＡおよびＢはヒトレラキシンのそれぞれの鎖を指
し、ＡまたはＢの後方の数字は鎖の長さ、即ち、Ａ鎖ま
たはＢ鎖を構成するアミノ酸の数を指し、アミノ酸の前
方の下付き文字はアミノ酸が位置するＡまたはＢ鎖、ア
ミノ酸後方の上付き文字は鎖中の位置を表している。こ
の類似体の調製および鎖の組換えは欧州特許公開第251,
615（前掲）に記載されている。タンパク質を上記研究
１および２に記載した方法で精製した。

約4.65mg/mlのヒトピログル（pyroglu）レラキシン約
36mlを上記のごとく10mMクエン酸（pH5）で製剤化し、N
aClを加えて等張性にした。このタンパク質を1mg/ml
（吸光度係数2.18を使用し、分光光度計で測定）に希釈
した。各製剤、合計1.4mlを層流フード内でテフロンス
トッパー付きのオートクレーヴ処理した1.5mlのガラス
ビンに滅菌ろ過して入れた。凍結および解凍による影響
を調べる実験では、タンパク質を2mg/mlに希釈し、凍結
し、次いで、実験を行った。

安定性実験法研究1:約1mg/mlの水中長レラキシン各20mlを透析によ
って、クエン酸バッファー成分がpH5.0を与えるという
計算に基いて、表Ｉ記載の正確な成分を有する以下の各
バッファー:10mMグリシン（pH3）、10mMクエン酸塩（pH
5）、10mM酢酸塩（pH5）、10mMヒスチジン（pH6）およ
び10mM Tris（pH7.5）の各バッファーに交換した。全バ
ッファーにNaClを加えて等張性（0.154モル）に調節し
た。前記のごとくにして濃度を決定し、試料を滅菌ろ過
し、表II記載の手順に従ってビンに詰めた。得られた13
5個の100μ微量（マイクロ）バイアルと90個の1.5ml
バイアルを安定性試験のために５、25および40℃に放置
した。試料を、０、７、21および30日目に逆相HPLC、EL
ISA、およびサイクリックAMPアッセイで分析した。これ
らのアッセイに加えて、０および30日目に試料を近紫外
円２色性（近UV CD）および分析的超遠心（UC）でも分
析した。さらに、クエン酸塩製剤を５℃においてRP−HP
LCで５箇月間、−20℃においてRP−HPLCで60日間分析し
た。

研究2:約1mg/mlの水中長レラキシン各1mlを透析によ
って、それぞれpH5の10mM酢酸塩、クエン酸塩、コハク
酸塩バッファーであって、塩無添加、0.1M NaCl、およ
び0.5N NaCl含有バッファー（バッファー組成は表Ｉに
記載）に移した。得られた９個の試料をそれぞれ滅菌ろ
過し、等容量に３分割し、滅菌した300μのガラス製
マイクロバイアルに充填した。得られた、約9mgを含有
する27個のバイアルを安定性試験のために５、25および
40℃で40日間放置した。０、７、14、28および40日目に
試料をELISA分析およびC4逆相HPLCで分析した。残った3
mgのレラキシンをMilli−Ｑ水に５℃で保存し、比較物
質として用いた。研究１および以後の安定性試験の結
果、この水中レラキシンが、５℃で少なくとも５箇月間
安定であることが逆相HPLCで示された。これらの観察
は、以後の安定性研究に用いた比較試料に関しても繰り
返された。

７、14および21日目のELISA、HPLCおよびサイクリッ
クAMPアッセイのための製剤化タンパク質100μを100
μの滅菌マイクロバイアルに入れた（３バイアル／ア
ッセイ×５製剤×３温度＝45バイアル）。１、２および
３箇月用試料も同様にしてグループ分けし（45バイア
ル）、さらに４、５および６箇月試料も同様に45バイア
ルにグループ分けした。合計135個の100μバイアルが
これら３種のアッセイ用に得られた。残る製剤化タンパ
ク質を各1.5mlバイアルに、CD、UVおよびUCアッセイに
とって十分な量である0.9mlづつ入れた。この結果、90
個の1.5mlバイアルが得られた（５製剤×３温度×６回
の測定時間（タイムポイント））。

研究3:評価すべきレラキシン類似体製剤は以下の通り
である。

1. NaClで等張性にした10mMクエン酸バッファー。

2. NaClで等張性にした10mMクエン酸バッファーであっ
て調製したばかりの等張性クエン酸バッファーに対して
透析したもの（これは対照となる）。

3. 10mMクエン酸バッファー、5.07％マンニトール（NaC
l不含）に対して透析した、マンニトール（5.07％）で
等張性にした10mMクエン酸バッファー。

4. 5％無水エタノールを添加した、NaClで等張性にした
10mMクエン酸バッファー。

5. 10％無水エタノールを添加した、NaClで等張性にし
た10mMクエン酸バッファー。

6. 5％グリセロールを添加した、NaClで等張性にした10
mMクエン酸バッファー。

7. 10％グリセロールを添加した、NaClで等張性にした1
0mMクエン酸バッファー。

8. 5％プロピレングリコールを添加した、NaClで等張性
にした10mMクエン酸バッファー。

9. 10％プロピレングリコールを添加した、NaClで等張
性にした10mMクエン酸バッファー。

10. 0.02％ EDTA（二ナトリウム塩）を添加した、NaCl
で等張性にした10mMクエン酸バッファー。

11. 5％マンニトールを添加した、NaClで等張性にした1
0mMクエン酸バッファー。

これらの製剤を３重反復実験（トリプリケート）のた
めに５、25および40℃に置いた。

さらに、元の等張性（NaCl）クエン酸バッファー中2m
g/mlのレラキシン1mlを27個の1.5mlバイアルに滅菌充填
し、−20℃で凍結した。０および３日目にバイアルを解
凍し、分析した。以後の日には３個のバイアルを解凍
し、分析した。

分析法 HPLC分析:Vydac^TMC4逆相カラムを用い、以下のカラム
条件下でクロマトグラムを得た。流速1ml/分。溶液A:0.
1％TFA、溶液B:0.1％TFA、90％アセトニトリル、20％Ａ
から50％Ｂまでのグラジエント（１％／分）。

研究１では、クロマトグラムの全面積は測定誤差の範
囲内で一定であった。即ち、主ピークの面積の減少は副
ピークの面積増大によるものであった。続くHPLCカラム
の再生によって大多数のレラキシンがグラジエント条件
下で溶離することが分かった。この挙動はHPLC分析で決
定された全面積が時間に対して一定でない、研究２の観
察結果と対照的であった。物質がより高度に精製される
と、HPLC測定による安定性も改善された。

ELISA分析：標準曲線の直線部分の中央に予測濃度が
達するよう、試料をELISAアッセイ用に希釈した。ELISA
アッセイのための１次抗体はアフィニティー精製した、
ヒトレラキシンＡ鎖が鎖の１位にpyro−Gluを有してい
る合成ヒトレラキシンペプチドに対して惹起されたウサ
ギポリクローナル抗体である。

ELISA法で測定した濃度を、安定性試料と一緒に用い
た比較試料によって標準化した。ELISAによって測定し
た値は通常UVスペクトル測定に基く予測値よりも大きか
ったが、標準化の後には予測値よりも20％低かった。研
究１では、３個のバイアルの各々から得た試料を希釈す
ることにより、各タイムポイントに３重反復試験試料を
充当した。

サイクリックAMPアッセイ：試料を細胞アッセイバッ
ファー中で希釈しアカゲザルの子宮細胞と一緒にインキ
ュベートした。得られた細胞懸濁液をデュポン・ドゥ・
ネムア（Dupont de Nemours,Inc.,Wilmington,Del.）供
給のアッセイ法を用い、サイクリックAMPに関して分析
した。サイクリックAMP濃度をレラキシン濃度と関連付
けるために標準曲線を作成した。この濃度は“免疫反応
性濃度”測定にかかるELISAのそれに対して、理論的に
は“生物活性”濃度である。既知濃度の比較試料を安定
性試料と一緒に用い、レラキシン濃度測定値を標準化し
た。

マウス恥骨結合アッセイ：ネズミ恥骨結合靭帯のイン
ビボバイオアッセイによってレラキシンの結合組織形成
作用を測定した。スタイネッツら（Steinetz,B.G.）,En
docrinology,67:102（1960）。

近UV円２色性:Aviv^TM改良Cary60分光偏光計を用い、
約1mg/mlのレラキシン試料を透析液で1:1希釈し0.5cm光
路長で、恒温に維持した円筒キュベット中、20℃で320
〜240nmにおいてスペクトラムを得た。CDデータを得た
後、試料をCDセルから出しりん酸緩衝化食塩水中で５倍
希釈した。次いで、以前と同様にUV分光光度計を用いて
濃度測定を行った。楕円偏光のCDシグナル（ミリ度）を
アドラーら［Adler,Meth.Enzym.,27:675（1973）］の方
法で、ヒトレラキシンの平均残基を112.9gとして、平均
残基重量楕円偏光（mean residue weight ellipticit
y）に変換した。

分析的超遠心分離：レラキシン安定性試料を適当な透
析液で４倍希釈し、ダブルセクター超遠心セルに入れ、
それをAn−F4ホール分析用ローターに入れた。遠心分離
はeckman ModelE分析的超遠心機を用い、32,000rpmで20
℃において18時間行った。別の実験で、沈降平衡に達す
るのに18時間で十分であることが分かった。セル内の濃
度グラジエントは光電光学スキャナーを用い、280nmに
おけるUV吸収によって決定した。曲線トレースを、Maci
ntizer^TMトレーシングパッドを用い、マッキントッシュ
のコンピューターに入力した。以下の等式（Teller,Met
h.Enzym.,27:346（1972））を用い、重量平均分子量を
セル内の濃度勾配と関連させた。

Mw＝2RT/［w²（１−vp）］dlnc/dr² ここに、Mwは重量平均分子量、Ｔは温度、Ｒは気体常
数、ｗはラジアンで表した角速度、ｖはタンパク質の部
分比容、ｐは溶液の密度、ｃはタンパク質濃度、ｒは回
転中心からの放射距離を表す。この等式は理想的な溶液
を想定したものであり、選択したバッファー条件はレラ
キシン沈降に適当と思われる。inc対r²の最小２乗回帰
分析で、セル内の濃度域の平均値として、重量平均分子
量を得た。このデータも３次多項式でならし、遠心セル
内で測定した各濃度についてdlnc/dr²値を求めた。レラ
キシンに関する部分比容0.731ml/gをコーンおよびエド
サル［Cohon ＆ Edsall,“Proteins,Amino Acids and P
eptides as Ions and Dipolar Ions",（Hafner:New Yor
k,1965）157−175頁］の方法に従い、個々のアミノ酸残
基の値を用い、アミノ酸組成について計算した。

結果研究1:レラキシンの分解を時間の関数として逆相HPLC
でモニターした。全HPLCピーク面積は時間を通して一定
であり、全面積の割合（％）を用いてレラキシン分解速
度を調べた。残存する主ピークのフラクションを３重反
復試験試料から計算し（可能な場合）、表Ｉ記載の５製
剤（3.0から7.5まで）についてHPLC主ピークの分解速度
の１次プロットを求めた。反応速度を逆相HPLCにおける
レラキシン主ピークの消滅速度測定によって追跡した。
図1a−1eはこれら３種の温度における５種の製剤に関す
るHPLC主ピーク対時間グラフを示し、分解速度を表して
いる。図1aは10mMグリシン（pH3.0）中レラキシン、図1
bは10mMクエン酸塩（pH5.0）中レラキシン、図1cは10mM
ヒスチジン（pH6.0）中レラキシン、図1dは10mM酢酸塩
（pH5.0）中レラキシン、図1eは10mM Tris（pH7.5）中
レラキシンを表す。各グラフにおいて、三角は５℃、円
は25℃、四角は40℃を表す。これらの図はレラキシン分
解速度が１次反応速度分析によって解析し得ることを意
味している。図２は５種類の製剤の、５℃（白色方
形）、25℃（ひし形）および40℃（黒色方形）におけ
る、pHに対する主ピークの分解を求めた１次反応速度定
数をプロットした図である。図２のデータはヒトレラキ
シンがpH約４から６で安定であり、特にpH5で最も安定
であることを示している。

研究2:コハク酸、酢酸およびクエン酸製剤中のレラキ
シンの安定性は、RP−HPLCおよびELISAで測定した場
合、0.0M、0.1Mおよび0.5MのNaClを用いて得られるイオ
ン強度の変化では有意に変化しなかった。静注および筋
注製剤として用い得るよう、タンパク質をイオン強度約
0.15モル、浸透圧重量モル濃度約250mmol/kgで製剤化し
た。

研究3:表IIIおよび表IVは、それぞれ、pH5.0のクエン
酸製剤を温度５℃で１年間（レラキシン濃度1mg/ml）、
−20℃で60日間（レラキシン濃度2mg/ml）保存して得
た、逆相HPLCデータである。表IIIのデータを外挿し、
１次反応式を前提として、５℃で少なくとも2.0年間安
定（即ち、分解は約10％を越えない）と見積もることが
できる。２つの表は製剤がそれぞれの温度で安定である
ことを示している。

５℃で１年間後のヒトレラキシンのRP−HPLC主ピーク
の分解に関する１次反応速度定数。各タイムポイントに
おけるデータは３重反復試験（可能な場合）の平均値で
あって以下に適合するように用いた。

レラキシンのいわゆる生物活性の安定性を、レラキシ
ンとアカゲザルの子宮細胞の相互反応によって生成する
サイクリックAMPの生産を測定する方法を用いて追跡し
た。サイクリックAMP分析による濃度対時間曲線を図3a
−3eに示す。図3aはグリシン−HCl（pH3.0）中のレラキ
シン、図3bはクエン酸塩（pH5.0）中のレラキシン、図3
cは酢酸塩（pH5.0）中のレラキシン、図3dはヒスチジン
（pH6.0）中のレラキシン、図3eはTrisバッファー（pH
7.5）中のレラキシンを表す。すべての図で白丸は５
℃、黒丸は25℃、三角は40℃、直線は予測値を表す。全
試料（pH3から7.5）は40日間の保存後にも実験誤差の範
囲内で等しい生物活性を有すると思われる。

レラキシンの生物活性に関する安定性を、マウス恥骨
結合アッセイで評価した。クエン酸バッファー（pH5.
0）中の未分解レラキシンの生物活性とTrisバッファー
（pH7.5）中の高度に分解されたレラキシンの生物活性
とを比較し、分析誤差の範囲内で生物活性には差異がな
いことが分かった。

ELISAおよび円二色性分析は製剤のタンパク質コンホ
メーションの評価に用いた。データはレラキシンの三次
構造が１および２カ月の保存後にも変化していないこと
を示した。

タンパク質が自己会合して変化する可能性は沈降平衡
分析的超遠心法によって調べた。10mM酢酸塩、0.1M NaC
l、pH5中のレラキシンを、負荷濃度0.1、0.2および0.4m
g/mlで分析的超遠心法によって分析した。重量平均分子
量はこれら３種の負荷濃度で約10,000であり、これらの
条件下でレラキシンが二量体を形成していることを示し
た。

種々の薬学的に許容し得る賦形剤を10mMクエン酸塩、
pH5製剤に加え、その製剤の安定性への効果を調べた。
図４は様々な温度における、種々の製剤の逆相HPLCで見
られるレラキシン主ピークの分解率を示す。左から右
へ、超遠心（黒）および透析（濃いハッチング（線
影））試料と、以下の賦形剤を添加した試料とを比較し
た：等張性量（交差ハッチング）または５重量％（中程
度のハッチング）のマンニトール、５重量％（白）また
は10重量％（黒）のグリセロール５重量％（水平平行
線）または10重量％（点描）のエタノール、５重量％
（薄いハッチング）または10重量％（白）のプロピレン
グリコール、および0.02重量％（黒）のEDTAである。そ
れぞれを５、25または40℃で保存した。理解され得るよ
うに、賦形剤の安定化効果は、超遠心および透析対照と
比較して、誤差範囲の、無視し得る程度にすぎない。透
析および超遠心試料間の差異も誤差範囲内である。

また、レラキシンを酸性溶液として再構成し得る凍結
乾燥製剤を調製することもできる。より詳しくは、当
初、クエン酸製剤バッファー中に含有された長レラキシ
ンを10mMクエン酸塩、0.507％マンニトール、pH5.0に対
して透析した。次いで、この調製物をそれぞれ容量1ml
づつ、９個の3mlバイアルに滅菌ろ過して入れた。これ
らのバイアルをLyovac CT20凍結乾燥機内のトレーに置
いた。レラキシン試料を−90℃に冷却し、０℃で25時
間、一次乾燥サイクルに付した。次いで、25℃で17.5時
間の二次乾燥サイクルに付した。凍結乾燥終了後、１個
のバイアルをMilli−Ｑ水1mlで再構成したところ、極め
て清澄で濁りがなく、再構成が成功したことを示してい
た。残るバイアルを５℃および25℃での安定性のために
供した。

プレ凍結乾燥対照として凍結乾燥前に凍結乾燥バッフ
ァー内に移し変えた長レラキシンを用いた。０時間にお
ける再構成試料の外、５℃および25℃での保存後、２週
間、１カ月、および３カ月後に試料を再構成した。全試
料に関して、既述のRP−HPLCによって分解産物を分析し
た。可能な場合はすべて、３重反復注入試験の平均をと
った。全試料に関し、凍結乾燥保存時間の長さと無関係
に、主ピークの％は変化せず、25℃で３カ月後も安定性
が失われていなかった（表IV a）。また、全試料の分光
光度計分析は、凍結乾燥して25℃で３カ月間の保存後
も、光散乱物質（％）が増加していないことを示してい
た。

第１に、凍結−解凍研究により、タンパク質を液体中
濃度2mg/ml、pH5において、−20および−60℃で凍結す
ることができ、HPLC分析で観察される変化がないことが
示された。さらに、表Ｖはクエン酸塩pH5.0製剤を凍結
し、次いで解凍し、試料をとり、即座に凍結し、30日間
凍結しつづけ、室温で５時間解凍したもののRP−HPLC安
定性データを示している。解凍に際して、HPLCデータに
は変化が見られない。

結論として、RP−HPLCで測定したヒトレラキシンの構
造の完全さはそれが形成されるpHに影響され、分解はpH
7およびそれ以上で起きる。検査した５種の製剤のHPLC
分析の結果、レラキシンは他のバッファーよりも酢酸バ
ッファーおよびクエン酸バッファー（pH5）中で安定で
あり、５℃および−20℃で５カ月間、クエン酸バッファ
ー（pH5）中で最も安定であった。生物活性は影響され
なかった。

実施例２ブタおよびヒトレラキシンの比較実験で、重量平均分
子量データから、pH5の溶液中で、ヒトレラキシンはブ
タレラキシンより、はるかに会合し易いことが分かっ
た。種々の負荷濃度で得たヒトレラキシンに関するデー
タは同様であり、凝集が可逆性の自己会合であることを
示唆していた。データはまた、ヒトレラキシンの自己会
合はpH5よりもpH3で少ないことを示した。

実施例３天然型のレラキシンは33アミノ酸のＢ鎖を有するもの
（長レラキシン）ではなく、29アミノ酸のＢ鎖を有する
もの（短縮レラキシン）であることが分かった。本研究
の目的は短縮レラキシンが、長レラキシンと同様の安定
性と吸着特性を有するかを調べることにある。さらに、
２つの型のレラキシンの、280nmにおけるUV吸光係数
と、UV CDによる二次構造とを比較した。

これらの実験に用いた短縮レラキシンは長レラキシン
（実施例１で調製）を制限的にタンパク分解してＢ鎖が
29アミノ酸からなるようにすることによって調製した。
長レラキシンを合成した後、TFAグラジエントを用いるH
PLCカラムに適用し、次いで、monoSイオン交換カラムに
適用した。レラキシン含有フラグメントを製剤バッファ
ーにディアフィルター（diafilter）した。レラキシン2
00mgを含有するバッファーにレラキシンに対して１重量
部から2000重量部のトリプシンを加え、約40分間タンパ
ク分解を行った。次いでカルボキシペプチダーゼＢ（70
μ/mg）の16.9mg/ml溶液50μを消化物に加えた。得ら
れた溶液を室温で１時間放置し、クエン酸を加えて酸性
にし、HPLCおよびmonoSカラムで精製した。このように
して精製したレラキシンを塩化ナトリウムで等張性にし
た10mMクエン酸塩、pH5に1.0mg/mlでディアフィルター
し、−60℃で凍結保存した（3ml I型ガラスビン中1m
l）。このロットの一部を液体として得、これを非凍結
試料と称する。

温度安定性:10mM等張性クエン酸塩中レラキシンのpH5
での安定性を逆相HPLC主ピークの減少に関する１次反応
速度式により評価した。以下の条件下、SynChropak^TMC4
カラムを用いてクロマトグラムを得た。流速:1ml/分、3
0分間の20％溶液Ａから50％溶液Ｂまでのグラジエント
（溶液Ａは0.1％トリフルオロ酢酸、溶液Ｂは0.1％トリ
フルオロ酢酸および90％アセトニトリル）。

表VIは長レラキシンと短縮レラキシンとの動力学の比
較である。長レラキシンの１次速度定数は１年間の安定
性データから、短縮レラキシンのそれは６カ月間の凍結
−解凍試料のデータ、および非凍結試料の２カ月間のデ
ータから決定した。１次反応速度定数にはt.9とt1/2の
値が含まれる。短縮型の安定性は、少なくとも長レラキ
シンのそれと同様に良好であるが、凍結−解凍試料につ
いて25℃で２年間以上の安定性が示されているので、そ
れ以上に良好であり得る。先の長レラキシンに関する観
察と同様、凍結および解凍は短縮レラキシンの安定性に
影響しなかった。

光安定性：短縮レラキシンの２個のバイアルを1600フ
ィートキャンドル（foot candles）の等級の光ボックス
に７日間入れた。１個のバイアルをアルミホイルで遮光
し対照とした。長レラキシンの主ピークの保持時間（R
t）を短縮レラキシンのそれに対して標準化し、表VIIに
示した。次いで、分解ピークの全保持時間をこの標準化
した値に関連させた。理解され得るように、短縮および
長レラキシンに関する標準化保持時間は極めて良く一致
しており、両方のタンパク質の分解が同一の過程で起き
ることを示唆していた。しかしながら、長レラキシンの
分解速度は短縮レラキシンのそれよりも幾分大きいよう
である。

撹拌に対する安定性：短縮レラキシンのバイアルを室
温下、Glas−Col model S−500アジテーターを用い2.5
単位のセッティングで７日間撹拌した。対照試料は室温
で撹拌せずに置いた。安定性は温度に対する安定性に関
して述べた上記方法に従い、逆相HPLCで測定した。

表VIIIは７日間の撹拌後残ったレラキシン主ピークの
比率（％）を表す。これらのデータは撹拌試料と非撹拌
対照とを比較した場合、長および短縮レラキシンのいず
れにも、逆相HPLCでは有意な変化が検出されないことを
示している。

吸着研究:UVスペクトル測定に基づいて、ノーマルセ
ーラインによりレラキシンを約10μg/mlに希釈した。内
径0.02in.、外径0.037in.の２フィートのSilastic^Rチュ
ーブを5mlのガラスシリンジと22Gの針を備えたHarvard
インフュージョンポンプに連結した。チューブを通して
レラキシンを100μ／分で注入し、最初の10分間は１
分ごとに100μづつ、以後30分間は100μ試料を５分
ごとに、900μのELISAアッセイバッファー（EAB）中
に採取した。この1:10希釈をさらに２回、EABで希釈す
ることにより1:4000に希釈した。1:4000希釈をELISAに
よるタンパク質濃度測定に用いた。

レラキシンはチューブに吸着した。しかしながら、チ
ューブからの５分間の注入の後、ELISA測定でのレラキ
シン濃度は予測された10ng/mlに近付いた。曲線下方の
面積の積分によって、全タンパク質の約５％がチューブ
表面への吸着により失われたことが分かった。Silastic
^Rチューブへの吸着に関して、前記の２種のレラキシン
相互に有意な差異はないようであった。

吸光係数の決定：長および短縮レラキシンの吸光係数
を、定量的アミノ酸分析により、２つの別個の測定で求
め、長レラキシンについては2.04または2.14cm²/mg、短
縮レラキシンについては2.25または2.30cm²/mgを得た。
長および短縮レラキシンについて計算したモル吸光係数
は13,000±200M^-1cm^-1であった。この結果はＣ末端から
の４アミノ酸の除去が２個のトリプトファンと１個のチ
ロシンの直接の環境に殆ど影響しないことを示唆してい
る。また、この結果は２つの型のレラキシンのコンホメ
ーションが同様であることをも示唆している。

円２色性:240〜190nmの円２色性測定を長レラキシン
（0.8mg/ml）および短縮レラキシン（1mg/ml）につい
て、等張性クエン酸塩（pH5）中、Aviv Cary60スペクト
ロポーラリメーター（分光偏光計）を用いて行った。試
料を光路長0.01cmの円筒形水晶キューベット内で恒温に
保った。CD出力（ミリ度）を、平均残基重量113と、27
8.4nmでのUV吸収で得たレラキシン濃度とを用い、平均
残基重量楕円偏光に変換した。吸光係数から求めたレラ
キシン濃度は、長レラキシンが2.04cm²/mg、短縮レラキ
シンが2.25cm²/mgであった。チャンら（Chang）,Anal.B
iochem.,91:13−31（1978）の方法に従って２次構造を
推定した。

チャンら（前掲）の方法による、遠UVCDスペクトルの
解析の結果、長レラキシンに関しては、50％アルファヘ
リックス、47％ベータシートおよび３％ランダムコイ
ル、短縮レラキシンに関しては、50％アルファヘリック
スおよび50％ベータシートという結果を得た。短縮およ
び長レラキシンのスペクトル間の相違は十分、実験誤差
の範囲内であり、短縮および長レラキシンの２次構造が
非常に似通ったものであることを示唆している。

結論：液状製剤中での短縮レラキシンの温度安定性は長
レラキシンのそれと匹敵するか、おそらくそれ以上であ
る。さらに、光照射および撹拌に対する安定性はこれら
２タンパク質間で同様であった。モル吸光係数、２次構
造、および表面への吸着等の物理学的特性も同一と思わ
れる。

実施例４本実施例ではレラキシンゲル製剤の製造と性質を例示
する。

液状レラキシン製剤短縮レラキシン（29アミノ酸Ｂ鎖を有するレラキシ
ン）を実施例３記載のごとく製剤化し、本実験に用い
た。NaClで等張性にした10mMクエン酸塩（pH5.0）にレ
ラキシンを濃度1.0mg/mlで含有させた。この製造を使用
直前まで、バイアル中、−60℃で保存した。これらバイ
アルのレラキシンを2ml Amicon Centricon 10 microcon
centratorを用い、4000rpmで１〜２時間遠心して、2.4m
g/ml以上に濃縮した（UVスペクトル測定により推定;e＝
2.04ml/mg・cmと仮定）。正確な時間は濃縮すべきレラ
キシンの初期容量に依存する。

４％Methocel製剤４％メチルセルロースゲルをMethocelA 4Mメチルセル
ロース粉末（Dow Chemicals）から、以下の方法で再構
築した。

（ａ）クエン酸製剤バッファー（実施例１記載）10mlを
40mlの撹拌棒を入れたビーカー中で沸点近く（約90℃）
に加熱した後、熱から外した。

（ｂ）ビーカーにMethocel粉末0.8gを入れ、数秒間旋回
させて粒子を分散させた。

（ｃ）次いで、ビーカーを５℃の涼しい部屋でマグネチ
ックスターラーの上においた。直ぐに、液体が粘度を増
す前に冷却したクエン酸製剤バッファー10mlを追加し、
ビーカーの壁面からすべての乾燥粒子を流し落とした。

（ｄ）連続撹拌の20分後液体の粘度が増大し、均質な４
％メチルセルロースゲルが形成された。

（ｅ）最後の２つの安定性研究のために、４％メチルセ
ルロースゲルをオートクレーブに入れ、滅菌と同時にゲ
ル内の溶存酸素を除去した。オートクレーブから出した
後、ゲルを窒素雰囲気下（nitrogen head space）で撹
拌し、新たな酸素の混入がない状態で均質なゲルを得
た。

局所レラキシンの調製 600μg/mlレラキシンの均質な３％Methocelゲルを以
下の方法で調製した。

（ａ）２本の滅菌10mlシリンジを秤量した。１個のシリ
ンジに４％Methocel 3gを入れた。もう１個のシリンジ
にゲル（1ml）容量の1/3の液状レラキシン製剤2.4mg/ml
を入れた。

（ｂ）プランジャーを２本のシリンジに戻し、２本のシ
リンジを、両端を２本のシリンジの端にネジ式に嵌め込
んで連結する、滅菌Rainin 47−FLUコネクターにより、
連結した。

（ｃ）20−25回、１個のシリンジプランジャーを押し込
んだ後、もう１個のシリンジを押し込むことでレラキシ
ン溶液をメチルセルロースに拡散させると、均質なゲル
が形成された。（しかしながら、後の２つの実験では、
保存と試料除去を容易にするために、ゲルを1.5mlのエ
ッペンドルフチューブに移した。）ゲル中のレラキシン
の最終濃度は600μg/mlであった。このゲルは３％メチ
ルセルロース、10mMクエン酸塩、pH5.0および等張化の
ためにNaClを含有している。

ELISAアッセイ実施例１記載と同様のELISA希釈剤でゲル中レラキシ
ン試料を連続的に10倍段階希釈し、レラキシン濃度6ng/
mlとした。ELISA測定によると0.25％のMethocelゲル
は、レラキシン濃度に影響を及ぼさないようであった。
上記のELISAアッセイはゲル中のレラキシン濃度が、UV
スペクトル測定に基づいて（吸光係数を2.04と算定し）
予測される値よりも低いことを示した。この結果は完全
な長さのＢ鎖を有するレラキシンがアッセイの標準であ
るのに対して、用いた試料が短縮Ｂ鎖レラキシンであっ
たことに起因する。

局所レラキシンのRP−HPLC分析液状レラキシン製剤の分析に用いたRP−HPLC（実施例
１記載）を局所レラキシン試料に用いるように改良し
た。ゲルが高粘性であるために、試料を水で10倍希釈
し、約５分間ボルテックス撹拌してゲルを均質化した
後、静かに放置して気泡を上昇させた。これらの試料の
分析は、250μをC4−300SynChropak（4.6×250mm）カ
ラムに室温で注入して行った。最初の平衡化バッファー
は18％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸であ
る。溶離は、１％／分の漸増濃度のアセトニトリルを30
分間で最終濃度が45％アセトニトリルとなるように流す
ことからなる線状アセトニトリルグラジエントで行っ
た。流速は1.0ml/分の一定速度であり、214nmで吸光度
をモニターした。“スローダウン”ステップ（粘性ゲル
が計量器に挿入される時間）を36から270分に増加し
た。実際には、“スローダウン”ステップが増加する前
に注入されたゲルは、その粘性の故に250μ以下であ
ることが明らかになった。

これらの実験過程で、SynChropakカラムはピークの分
離機能を失い始めた。従って、最後の数回の注入をC4−
300 Vydacカラムで行った。

３回の重要な安定性実験を局所レラキシン製剤につい
て行った。第１は、室温で５日間これら製剤を放置した
後、安定性を測定することである。試料を元のシリンジ
に入れたまま保ち、温度と光の変動にさらした。

RP−HPLC分析によって、主ピーク面積％の減少と初期
に溶出する分解ピークの数および面積％の増大によって
示される、分解されていないレラキシン主ピークの分解
が時間と共に増大することが分かった。主ピーク面積％
の減少を定量し、時間０（レラキシンをゲルに入れる
前）のときの主ピーク面積％に関して標準化した。標準
化フラクション主ピークを、時間に対してプロットした
対数曲線は局所レラキシンが１次分解速度反応式に従う
ことを示した。

レラキシン主ピークと、最大の分解ピークの両者をHP
LC溶出液から採取し、Savant Speed−vac内で約１時間
真空凍結乾燥した。次いで、これらの試料をチオグリセ
ロールおよび酢酸中で再構成し、プローブ上で還元して
ＡおよびＢ鎖を分離しマススペクトル分析にかけた。こ
れら２試料のマススペクトル分析の結果、両試料のＡ鎖
の分子イオンは同一であって、予測値約2657と一致し
た。しかしながら、Ｂ鎖の分子イオンは異なっていた。
主ピーク試料の分子イオンは理論値約3314と一致した。
分解ピークからのＢ鎖の分子イオンは約3330であった。
この16という増加は、Ｂ鎖の残基が酸化されたと予測し
た場合の値と正確に対応している。

ブタの卵巣から得たブタレラキシン6.6mgをクエン酸
塩製剤化バッファーに再構成し約３分間遠心分離してあ
らゆる粒子をペレット化し、上記のごとく４％ Methoce
lゲルと共にクエン酸塩製剤化バッファー0.248mlに濃度
3.19mg/mlで混合し、600μg/mlブタレラキシン含有３％
ゲルを得た。短縮Ｂ鎖のヒトレラキシンと対照的に、ブ
タレラキシン製剤は上記のHPLC分析にかけたとき、殆ど
分解していなかった。

第２の研究は局所適用用レラキシンの、５℃および25
℃の十分にコントロールされた条件下での安定性を測定
することである。さらに、この研究のためのMethocel G
elをオートクレーブによって滅菌し、あらゆる可溶性の
酸化をもたらし得る酸素をゲルから除去した。局所レラ
キシン試料を４個のエッペンドルフチューブに移し、２
個を５℃で、２個を25℃で保存した。144時間後、HPLC
分析の結果、５℃保存の局所レラキシンは分解し始めた
が、25℃の物質は比較的分解されていなかった。以後の
分析で、５℃の涼しい部屋では光が当たっており、25℃
の箱は完全に光源から遮断されていることが分かった。

光が５℃での分解ピークの形成に寄与しているかどう
かを決定するために、２個の試料の内、１個をアルミニ
ウムホイルで包装して光を遮蔽した。さらに５℃で360
時間放置した後、HPLC分析にかけると、暴露されていた
レラキシンは完全に分解されていたが、遮蔽したレラキ
シンはより遅い速度で分解し続けていた。このように、
光の存在は安定性に影響し、次の遮蔽によって完全に局
所レラキシンが保護されるが、光暴露の後、遮蔽した場
合には、はるかに遅い速度であるが分解が続くようであ
る。局所レラキシンの広いピークを収集し672時間保存
し（いずれも光を遮蔽、光に暴露）、マススペクトル分
析したところ、Ａ鎖は影響されずＢ鎖は、第１の、次い
で、第２の酸化を受けることが分かった。

第３の実験では、いずれも光に暴露し、光から遮蔽し
た局所レラキシンと液状に製剤化したレラキシンの安定
性を比較した。816時間５℃で保存した後のRP−HPLCク
ロマトグラムは、光から遮蔽した場合、局所レラキシン
は液状製剤化レラキシンとまさに同等の安定性を有し、
いずれも96％の主ピークを有した。しかしながら、光に
暴露すると、局所レラキシンは液状製剤化レラキシンに
比較して極めて分解され易いことが分かった。

有効性研究本研究の目的は短縮レラキシンのウサギ子宮頚管の熟
成における有効性を決定することにある。種々の研究
で、ウサギ頚管は生理学的応答に関してヒト頚管に匹敵
することから、頚管の挙動の機構を調査する上でウサギ
頚管がかなり良好なモデルであることが示唆されていた
ために、ウサギを用いた。

成熟妊娠雌性ニュージランドラビット（4.5〜6.0kg）
を研究に用いた。妊娠26−27日にウサギ（１群あたり４
匹）を、上記のごとく調製した３％メチルセルロースゲ
ル中、短縮ヒトレラキシンゲルまたはブタレラキシンゲ
ルで処置した。短縮ヒトレラキシンおよびブタレラキシ
ンを100、200、300、600および1000μg/mlレラキシン／
動物の用量で処方した。両ホルモンをシリンジおよびカ
テーテルを用い、0.5ml用量で経膣的に適用した。対照
動物にはビヒクルのみを与えた。16−18時間後、動物に
致死量のペントバルビタールを与えて殺した。子宮、よ
り低いセグメント、および子宮頚管を摘出し、組織学的
検査のために10％NBホルマリンに固定化した。パラフィ
ン切片を切り取り、ヘマトキシリン／エオシンおよびア
ルシン・ブルーPAS染色した。切片を総合的には形態学
を、および具体的には粘膜下の筋肉組織およびコラーゲ
ン原線維の分離の程度、並びにマクロファージ由来の多
核細胞であって、通常は頚管をろ過されないPAS陽性巨
細胞の存在を示す特徴に関して評価した。巨細胞の測定
はマックレナンら［MacLennan,Am.J.Obstet.Gynecol.,1
52:691−696（1985）］の方法を用いて行った。

局所製剤中に濃度300μg/mlのヒトレラキシンまたは
ブタレラキシンを用いる最初の実験では、この用量で、
いずれのホルモンも妊娠頚管に、熟成に一致する変化を
もたらすことが示唆された。頚管への適用後18時間で有
意な拡張と頚管熟成が観察された。染色した頚管切片の
組織学的検査で、介在空間的にタンパク質に富む物質の
僅かな存在を伴う筋性粘膜の著しい分離、コラーゲン線
維束の分離（コラーゲン密度の低下）、細胞間質の増
加、およびリンパ管の拡張に伴う粘膜下浮腫が示され
た。また、対照動物には希である、特徴的なPAS陽性巨
細胞が、レラキシン処置動物には多量に認められた。そ
のような細胞は血管周囲と上皮下層に最も一般的に認め
られたが、頚管深部全般を通しても認められた。レラキ
シンの最少有効量および最大有効量を定義するための以
後の研究は初期の研究と対照的に、300または600μg/ml
では効果なく、1mg/mlでのみ、効果が明らかに認められ
た。

薬動力学的研究本研究の目的は妊娠ウサギへの短縮レラキシンの、１
回の静脈注射、皮下注射および経膣投与後の生体内利用
効率（バイオアベイラビリティー）を決定することにあ
る。

使用したウサギは16回の経産雌性ニュージランドホワ
イトラビット（Elkhorn）（４−5kg）である。妊娠26日
目に４匹の動物（Ｉ群）に、耳静脈へのAbbocath−Ｔカ
テーテルを通して、静脈内ポーラス（iv）で短縮レラキ
シンを100μg/kgで与えた。３匹（II群）に、大腿へ滅
菌食塩水中の短縮レラキシン100μ/kgを皮下（sc）投与
した。３匹（５群）に、１％ベンゾプルプリン中短縮レ
ラキシン100μ/kgをsc投与した。４匹（３群）に、３−
メチルセルロース中短縮レラキシン100μg/kgを経膣投
与した。ivおよびsc投与溶液の濃度は、500μg/ml清澄
短縮レラキシン溶液1mg/mlであった。希釈は滅菌等張性
食塩水または食塩水中１％ベンゾプルプリン（BPP）で
行った。投与容量は通常、1mlであり、以下の等式に従
って、個別に計算した。

用量＝（100μg/kg）（kg）／（500μg/ml）経膣投与のために、上記の手順に従い、全量3mgのMet
hocelゲル（４％）を短縮レラキシン0.487ml（上記）お
よびクエン酸製剤バッファー0.513gと混合し、短縮レラ
キシン600μg/ml、３％メチルセルロースゲルを得た。
経膣投与容量は0.5mlであった。

血液試料（1ml）を耳動脈のViggo Secalonカテーテル
で採取した。血液試料の採取時間は以下の通りである。
（iv）０、１、２、３、４、５、７、10、20、40、60、
80、120、180、240、300、360、420、480、540、600、6
60、および720分目；（scおよび経膣）０、１、２、
３、５、７、10、15、20、30、40、50、60、75、90、12
0、180、240、300、360、420、480、540、600、660およ
び720分目。血液試料を凝固させ、遠心分離して血清を
採取した。試料をドライアイス上で凍結しELISAアッセ
イまで、−70℃で保存した。このアッセイは20〜1280pg
/mlの範囲であった。

非線状曲線適合プログラム（NONLIN84,Statiscal Con
sultants,Inc.;Lexington,KY）を用い、個々の免疫反応
性血清の濃度−時間データを３−指数関数モデルと比較
することで個々のiv薬動力学的パラメーターを評価し
た。血管外の投与経路から得たデータをRS−１プログラ
ム［ボルト、バーナックおよびニューマン（Bolt,Berna
k ＆ Newman）,Cambridge,MA］に従って適合させた。血
清濃度−時間曲線（AUC）下の、ｔ＋０から最後の測定
可能な血清濃度（Ct）に至る面積を台形法で計算した。
Ctから無限の時間までのAUCを外挿した。Ctをターミナ
ルエリミネーション（最終消滅）速度定数で割った。血
清クリアランス（CL）を等式： CL＝用量/AUC（iv）から求めた。

分散の初期用量（Vc）は式： Vc＝用量Ｃ（０）（式中、Ｃ（０）は血清濃度−時間データを表す３−指
数関数の係数である。定常期における分散容量（Vdss）
は、式： CL＊AUMC/AUC （式中、AUMCはモーメント曲線（すなわち、血清濃度＊
時間／時間曲線）下方の面積である。

によって計算された。血清半減期は0.693をそれぞれの
配置（disposition）速度定数で割って求めた。生体利
用率は面積比法：（AUC（血管外）/AUC（iv））×100 で求めた。

妊娠ウサギに、短縮レラキシン100μg/kgをiv、sc、
および経膣投与した後の血清濃度−時間像は図５に示さ
れている。図中、黒丸はiv、白四角はsc、白丸は経膣投
与を表す。図６は妊娠ウサギに短縮レラキシン100μg/k
gをBPPの存在下（黒丸）または非存在下（白四角）で皮
下投与した後の血清濃度−時間像を表す。表Ｘに全投与
経路における薬動力学的パラメーターを列挙した。iv投
与後の血清クリアランス（CL）は2.95±0.88mg/ml/kgで
あった。初期の分散容量（Vc）および定常期の分散容量
（Vdss）は、それぞれ、89±22および209±30mg/kgであ
った。iv血清濃度−時間データを表すために３つの指数
期間（term）が必要であり、半減期（t1/2）はそれぞ
れ、8.4±2.7、59.1±8.7、および279±128分であっ
た。ヒトレラキシンの皮下投与における平均の血清ピー
ク濃度は180分において76.20±17.80ng/mlであり、生体
利用率は76.0±20.6％（ivレラキシンの生体利用率を10
0％として）であった。BPPと一緒にsc投与したヒトレラ
キシンは、ヒトレラキシンsc単独投与によって得られた
値と比較して、平均ピーク血清濃度が低く（41.67±16.
32ng/ml）、遅かった（420分）。BPPと一緒のsc生体利
用率は59.4±6.7％であった。

ヒトレラキシンは経膣投与によっては全身的には殆ん
ど吸収されないようである。全身の血清濃度は非常に低
く（98分で0.34±0.16ng/ml）、得られた生体利用率は
1.0±0.8％にすぎなかった。

薬動力学的実験の完了（12時間）後、動物を殺し、生
殖管を摘出し組織学的検査のために調製した。組織を10
％NBFに固定化し、パラフィン包囲し、Ｈ＆ＥおよびPAS
/Alcian Blue染料で染色した。ウサギ頚管の組織学的切
片を処置群未知の状態で試験した。この研究における基
本的な判定基準は以下の通りである。（１）固有層およ
び筋層の相対的コンパクトネス（つまり具合）、（２）
巨細胞の存在、および（３）頚管領域への局在化。頚管
を３つのカテゴリーに分けた。陽性、固有層および下方
の筋層の配列がばらばらで巨細胞が明らかに増加してい
る；疑わしい、何等かの変化が存在するが明らかな程で
はなく、また頚管外に存在する；陰性、頚管には何の変
化もない。

組織学的研究から、処置と組織学的変化にはなんら明
確な関連性がないと結論された。

抗酸化剤および補助溶剤（Co−solvent）の影響本研究では、種々の製剤アジュバントの、レラキシン
のメチルセルロースゲル中での安定化能力を評価する。
分解は光酸化によって起きるので、アスコルビン酸およ
びソディウムメタビサルファイト等の抗酸化剤を研究
した。さらに、遊離ラジカルの起源がメチルセルロース
の過酸化物である可能性があるので、グリセロールやエ
タノール等の補助溶剤がメチルセルロースとレラキシン
の相互作用を減少して製剤を安定化し得るか否かを知る
ために研究した。最後に、製剤に用いる前にゲルを光に
さらし、レラキシン酸化におけるゲル活性化の影響を研
究した。

ゲル製剤:Methocelパウダー（Dow Chemical）4gを10m
Mクエン酸バッファー、pH5（NaClで等張性にしておいた
もの）、100mlに加えて４％（w/v）メチルセルロースゲ
ルを調製した。粉末をバッファーに85℃で分散させた
後、溶液を121.5℃で30分間オートクレーブ処理した。
完了後、ゲルの上に窒素ヘッドを配置し、５℃のインキ
ュベーターに一夜放置して水和した。グリセロールおよ
びエタノールを含有する製剤の調製のために、補助溶剤
を直接製剤バッファーに加えた。レラキシンと混合する
前に、オートクレーブ処理した４％ゲルを34℃で24時
間、蛍光ボックス中に置くことにより“活性化”ゲルを
調製した。

研究手順：表XIは研究に用いた各製剤における条件、
含有成分、および組成を表す。

レラキシン溶液は1mg/mlで得、Amicon限外濾過ユニッ
トによって2mg/mlに濃縮した。試料の調製は、レラキシ
ン濃度2mg/mlの10mMクエン酸バッファー（pH5）と４％
Methocelゲルとを容量比1:4で混合して行った。上記の
ごとく、溶液と４％ゲルを別々に２個のシリンジに入
れ、シリンジを横切るように、インターロッキングコネ
クターを通して20回、内容物を前後に移動させることに
より混合した。ゲルと混合する前にレラキシン溶液にア
スコルビン酸とメタビサルファイトを導入した。最後
に、ゲル調製物をオートクレーブ処理した1.5mlのHPLC
ガラスバイアルに0.25mlづつ入れた。バイアルの蓋を
し、密閉し、蛍光照射下、５℃の冷涼な室に上向きに置
いた。製剤＃１および＃８の試料はホイルに包んだが、
製剤＃３の試料は短時間真空にした後、窒素を充填して
おいた。

ゲル中でのレラキシンの分解をRP−HPLCで定量した。
ゲルの粘性が試料をHPLCに直接適用することを妨げるの
で、注入前にゲルを製剤バッファーで５倍希釈した。ク
ロマトグラフィーの条件は以下の通りである。

機器:HP1090L カラム:Vydac C4−300,4.6×150mm 流速:1mg/分波長:214nm インジェクション容量:200μ 温度：室温移動相：（Ａ）0.1％TFA （Ｂ）90％アセトニトリル、0.1％TFA グラジエント速度:30分間に20％Ｂ→50％Ｂの増大。

結果：表XIIに研究当初の結果を列挙する。表はそれ
ぞれのタイムポイントにおいて検出された主ピーク
（％）を示す。

11日後、光から保護された対照はその主ピーク面積の
96％を維持していたが、光に暴露された対照は完全に分
解されていた。窒素ヘッドスペースによる分解の遅延は
なかった。0.5％アスコルビン酸および20％エタノール
はほぼ同程度にレラキシンを安定化するようであった。
11日目に、レラキシン残存率（％）は55−60％の範囲で
あった。最も良い結果は20％グリセロール製剤の場合に
得られた。光照射11日目に主ピークの90％が回収され
た。“活性化”ゲル試料は、光から保護されている場合
でも、活性タンパク質の９％の損失を示した。負対照
（光から保護された単純なそのままのゲル製剤）と比較
して、ゲルの“活性化”はタンパク質の分解を早めるよ
うである。これは、ゲルの製造中における過剰な光への
暴露が好ましくないことを暗示するものである。メタビ
サルファイトを含有する製剤については、これら試料に
おいてレラキシンのピークが検出されず、後に研究対象
から除外されたので、ここに結果を示していない。メタ
ビサルファイトとレラキシンとが反応して全タンパク質
の喪失を招いた可能性がある。

これらの実施例から明らかに、光暴露は分解過程の開
始に重要な役割を担っている。レラキシンを光一誘導酸
化から保護するには、製剤中にグリセロールを20％含有
させることが最も効果的である。アスコルビン酸および
エタノールも、より低い程度に製剤を安定化する。メチ
ルセルロース粉末の分散時に、添加エタノールのかなり
の部分が蒸発すると思われるので、本研究におけるエタ
ノールの効果はまだ評価されていない。グリセロール、
エタノール、およびアスコルビン酸の組み合わせで相加
的な安定化が得られるかもしれない。

上記の結果はメチルセルロースゲル中のレラキシンの
光酸化がグリセロール、エタノール、またはアスコルビ
ン酸の製剤への導入で遅延され得ることを示している。
これらの賦形剤の利点と、生産物の光への過剰な暴露か
らの保護により、許容し得る有効期限（シェルフライ
フ）を有する最終的な製剤を設計することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 47/22 Ａ６１Ｋ 47/22 47/26 47/26 (72)発明者シャイア，スティーブン・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア94002、ベルモント、リンカーン・アベニュー 2417番 (56)参考文献特開昭62−221697（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−127315（ＪＰ，Ａ) 米国特許4624804（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/22 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】組成物のpHを４から６に維持し得るバッフ
ァー中に有効量のヒトレラキシンと製剤的に許容しうる
担体とを含有する、生物学的に活性で、安定かつ均質
な、妊娠及び分娩の期間中、哺乳類の生殖生理学の調整
に非経口的に用いるための医薬組成物。
【請求項２】pHが５である請求項１記載の組成物。
【請求項３】バッファーが有機酸バッファーまたはヒス
チジンバッファーである請求項１記載の組成物。
【請求項４】バッファーがクエン酸バッファーまたは酢
酸バッファーである請求項３記載の組成物。
【請求項５】イオン強度が少なくとも0.1モル、浸透圧
重量モル濃度が200〜300mmol/kgである請求項１記載の
組成物。
【請求項６】イオン強度が0.1〜0.2モルの範囲であり、
浸透圧重量モル濃度が250mmol/kgである請求項５記載の
組成物。
【請求項７】イオン強度が0.15モルである請求項６記載
の組成物。
【請求項８】等張性である請求項１記載の組成物。
【請求項９】さらに、組成物を等張性にする物質をも含
有する請求項８記載の組成物。
【請求項１０】物質がアルカリ金属の塩またはアルカリ
土類金属の塩、あるいは糖アルコールである請求項９記
載の組成物。
【請求項１１】物質がアルカリ金属またはアルカリ土類
金属のハロゲン化物、またはマンニトールである請求項
10記載の組成物。
【請求項１２】物質が塩化ナトリウムである請求項11記
載の組成物。
【請求項１３】バッファーがクエン酸バッファーであっ
て、pHが５である請求項12記載の組成物。
【請求項１４】さらに、多価糖アルコール、エタノー
ル、またはポリプロピレングリコールをも含有する請求
項１記載の組成物。
【請求項１５】多価糖アルコールが、グリセリン、エリ
スリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトー
ル、ソルビトールおよびマンニトールからなる群から選
択されるものである請求項14記載の組成物。
【請求項１６】糖アルコールが組成物に対して１〜25重
量％の量で加えられている請求項15記載の組成物。
【請求項１７】糖アルコールが組成物に対して２〜５重
量％の量で加えられている請求項16記載の組成物。
【請求項１８】滅菌されている請求項１記載の組成物。
【請求項１９】液状形である請求項１記載の組成物。
【請求項２０】凍結乾燥形である請求項１記載の組成
物。
【請求項２１】凍結液体の形である請求項１記載の組成
物。
【請求項２２】生物学的に活性なゲル形の医薬組成物で
あって、ゲルの２−５％のメチルセルロースおよびゲル
1mlあたり100−1000μｇのヒトレラキシンを、組成物の
pHを４から６に維持しうるバッファー中に含有する組成
物。
【請求項２３】メチルセルロースがゲルの３−４％を構
成し、レラキシンがゲル1mlあたり300−1000μｇの量で
存在する請求項22記載の組成物。
【請求項２４】ゲルが滅菌されている請求項22記載の組
成物。
【請求項２５】さらに、組成物で処置されている宿主へ
のレラキシンの供給（デリバリー）を増大する物質をも
含有する請求項22記載の組成物。
【請求項２６】物質がオレイン酸、ナイアシンアミド、
ニコチン酸またはサリチル酸、またはその塩またはエス
テル、アゾン、グリココーレート、コーレート、フシジ
ン酸、またはフシジン酸の塩またはエステルである請求
項25記載の組成物。
【請求項２７】さらに、ゲルの光酸化を防止する物質を
も含有する請求項22記載の組成物。
【請求項２８】物質が抗酸化剤または補助溶剤、あるい
はその混合物である請求項27記載の組成物。
【請求項２９】物質がアスコルビン酸、エタノールまた
はグリセロール、あるいはその混合物である請求項28記
載の組成物。