JP2799818B2

JP2799818B2 - 共重合体を生成する微生物及び該共重合体の製造方法

Info

Publication number: JP2799818B2
Application number: JP5233171A
Authority: JP
Inventors: 浩恵谷; 武福島; 尚子岩城
Original assignee: Japan Steel Works Ltd
Current assignee: Japan Steel Works Ltd
Priority date: 1993-09-20
Filing date: 1993-09-20
Publication date: 1998-09-21
Anticipated expiration: 2013-09-21
Also published as: JPH0782352A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医薬品、食品、衛生用
品、建設用品、工業用品、農園芸品、包装材料等広範な
分野に応用可能な生分解性のランダム共重合体の製造方
法及び該ランダム共重合体を生成する微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物の多くは、各種の共重合体を合成
することが知られている。それらの共重合体は熱可塑性
を有する、いわゆるプラスチックから、粘弾性を有する
ゴム状のものまで、多岐にわたっており、しかも、これ
らはいずれも生分解性を有するものである。

【０００３】例えば、近年、エネルギー貯蔵物質として
注目されている３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ・炭
素数４）の重合体ポリ−３−ヒドロキシブチレート〔Ｐ
（３ＨＢ）〕については特開昭５６−１１７７９３号、
同５７−７４０８４号、同５７−１５０３９３号等に、
３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシバリレート
（３ＨＶ・炭素数５）の共重合体〔Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−
３ＨＶ）〕については特開昭５７−１５０３９３号、同
５８−６９２２４号、同５８−２１２７９２号、同５９
−２２０１９２号、同５９−２０５９９２号、同６１−
２９３３８５号、同６３−２６９９８９号、特開平５−
７４９２号等に、３−ヒドロキシブチレートと４−ヒド
ロキシブチレート（４ＨＢ．炭素数４）の共重合体〔Ｐ
（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）〕については特開平１−４８
８２１号、同１−１５６３２０号、同１−２２２７８８
号、同１−３０４８９１号、同２−２７９９２号、同２
−２３４６８３号、同３−２１６１９３号、同５−２３
１８９号等に、３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロ
キシバリレートと４−ヒドロキシバリレート（４ＨＶ・
炭素数５）の共重合体〔Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃ
ｏ−４ＨＶ）〕については特開平５−３２７６８号にそ
れぞれ共重合体及びその製造方法が開示されている。

【０００４】一方、Ｒ．ＣｌｉｎｔｏｎＦｕｌｌｅｒ
らのＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５４，Ｎ
ｏ．８，ｐ１９７７−１９８２（１９８８）には、例え
ば３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ・炭素数
６）と３−ヒドロキシオクタノエート（３ＨＯ・炭素数
８）と３−ヒドロキシデカノエート（３ＨＤ・炭素数１
０）の共重合体〔Ｐ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−
３ＨＤ）〕など炭素数６〜１１の単位組成からなり、炭
素数４の３ＨＢ単位を持たない共重合体がシュードモナ
ス・オレオボランスＡＴＣＣ２９３４７によって合成さ
れることが報告されている。

【０００５】さらに、Ａ．Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌらの
ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１
１，ｐ３３６０−３３６７（１９９０）には、例えばシ
ュードモナス・セパシアＤＳＭ５０１８１等によってＰ
（３ＨＢ）が合成されること、シュードモナス・アルギ
ノサＤＳＭ２８８及びシュードモナス・フローレッセン
スＤＳＭ５００９０等によってＰ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３
ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤＤ），シュードモナ
ス・オーレオファセンスＤＳＭ５００８２及びシュード
モナス・フローレッセンスＤＳＭ５００９０等によって
Ｐ（３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ），シュードモナス・シト
ロネロリスＤＳＭ５０３３２によってＰ（３ＨＯ−ｃｏ
−３ＨＤ）、シュードモナス・ファシリスＤＳＭ５５０
によってＰ（３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤＤ）
が合成されることが報告されている。

【０００６】以上の重合体はいずれも炭素数４の単位か
らなる重合体、炭素数４の単位と炭素数５の単位とから
なる共重合体、炭素数４の単位と炭素数４の単位とから
なる共重合体、あるいは炭素数６〜１２の単位からなる
共重合体である。炭素数４の単位と炭素数６〜１２の単
位とからなるランダム共重合体は未だ見出されていな
い。

【０００７】これら生分解性の共重合体は加水分解性を
有し、土中や河川水中、海水中、生体内の微生物の作用
で二酸化炭素と水に分解され自然環境に戻るものであ
り、近年、地球環境保全に対する意識の高まりから注目
され、研究開発がなされ、実用化が検討されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、微生物
が生成する共重合体は、その理化学的性質が多岐にわた
っており、それぞれの使用目的に適合する共重合体の探
索が要求されている。

【０００９】一方、共重合体の微生物による生産は、通
常の化学合成法による生産に比較して、培地成分が高価
である、微生物の共重合体生成速度が遅く、かつ生成効
率が低い、さらに菌体中の共重合体含有率が低い等のた
め生産コストが高くなるという欠点を有しており、この
問題の解決が望まれていた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる実
情に鑑み鋭意検討した結果、千葉県佐倉市の土壌より分
離したシュードモナス属に属する細菌を培養すれば、こ
れまでにない新規なランダム共重合体である炭素数４の
３ＨＢと炭素数８の３ＨＯ、さらに所望により、炭素数
６、１０、１２の３ＨＨｘ、３ＨＤ及び／又は３ＨＤＤ
の単位からなるランダム共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３
ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤ
Ｄ）及び、場合により、炭素数４の３ＨＢの単位からな
る重合体Ｐ（３ＨＢ）を同時に生成し得ることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、第一に、シュードモ
ナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）６
１−３株を、炭素源を含有する培地で培養することを特
徴とする、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び
（ｅ）；（ａ）下記式（１）で表わされる３−ヒドロキシブチレ
ート（３ＨＢ）単位６〜９５モル％

【００１２】

【化６】

【００１３】（ｂ）下記式（２）及び／又は（３）で表
わされる３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨｘ）単
位０〜４０モ
ル％

【００１４】

【化７】

【００１５】（ｃ）下記式（４）及び／又は（５）及び
／又は（６）で表わされる３−ヒドロキシオクタノエー
ト（３ＨＯ）単位５〜９４モ
ル％

【００１６】

【化８】

【００１７】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜２の整数
を示し、ｍ＋ｎ＝２である。）

【００１８】（ｄ）下記式（７）及び／又は（８）及び
／又は（９）で表わされる３−ヒドロキシデカノエート
（３ＨＤ）単位０〜５０モ
ル％

【００１９】

【化９】

【００２０】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜４の整数
を示し、ｍ＋ｎ＝４である。）

【００２１】（ｅ）下記式（１０）及び／又は（１１）
及び／又は（１２）で表わされる３−ヒドロキシドデカ
ノエート（３ＨＤＤ）単位０〜４０モ
ル％

【００２２】

【化１０】

【００２３】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜６の整数
を示し、ｍ＋ｎ＝６である。）からなるランダム共重合
体の製造方法を提供するものである。

【００２４】本発明は、第二に、シュードモナスエス
ピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）６１−３株
（微工研菌寄第１３１０８号）を提供するものである。

【００２５】本発明のランダム共重合体は３ＨＢ及び３
ＨＯ、さらに場合により３ＨＨｘ、３ＨＤ及び／又は３
ＨＤＤのそれぞれのモノマー単位が前記特定割合でエス
テル結合したものである。

【００２６】上記ランダム共重合体を製造する方法は、
炭素源を含有する培地に微生物を接種し、培養し、この
培養物よりランダム共重合体を採取するものである。こ
こで、本発明に使用される微生物は、上記ランダム共重
合体生産能を有するものであれば特に限定されないが、
以下の菌学的性質を有するものである。

【００２７】（１）形態学的性質寒天培地、３０℃、一夜培養で０．８〜１．１μｍ×
１．７〜３．２μｍの直状桿菌である。液体培地でも寒
天培地での形態とほぼ同様である。べん毛染色で極毛が
観察され、運動性が認められる。多形性、胞子、グラム
染色性及び抗酸性は認められない。

【００２８】（２）各種培地における生育状態（イ）肉汁寒天平板培地コロニーは平滑で周縁はなめらかである。特徴的コロニ
ー色素、拡散性色素の産生は認められない。（ロ）肉汁寒天斜面培地菌苔は平滑で周縁はなめらかである。特徴的コロニー色
素、拡散性色素の産生は認められない。（ハ）肉汁液体培地培地表面での生育及び皮膜の形成が認められる。（ニ）肉汁ゼラチン穿刺培養培地の上部に生育が認められるが、液化は認められな
い。（ホ）リトマスミルクアルカリの産生は認められるが、凝固は認められない。

【００２９】（３）生理的性質（イ）硝酸塩の還元：陽性（ロ）脱窒反応：陽性（ハ）ＭＲテスト：陰性（ニ）ＶＰテスト：陰性（ホ）インドールの生成：陰性（ヘ）硫化水素の生成ＴＳＩ寒天：陰性酢酸鉛寒天：陰性（ト）デンプンの加水分解：陰性（チ）クエン酸の利用Ｋｏｓｅｒの培地：陽性Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：陽性（リ）無機窒素源の利用硝酸塩：陽性アンモニウム塩：陽性（ヌ）色素の生成コロニー：陰性水溶性：微弱（ル）ウレアーゼ：陰性（ヲ）オキシダーゼ：陽性（ワ）カタラーゼ：陽性（カ）生育の範囲ｐＨ：５．５〜８．５温度：−２〜３３℃ （ヨ）酸素に対する態度：好気性（タ）Ｏ−Ｆテスト（ＨｕｇｈＬｅｉｆｓｏｎ法）：Ｏ（レ）グルコン酸からのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ，３ＨＯ，３ＨＤ，３ＨＤＤ）産生：陽性（ソ）オクタン酸からのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ，３ＨＯ）産生：陽性（ツ）糖類からの酸及びガスの生成：下記表１に記載

【００３０】

【表１】

【００３１】以上の菌学的性質から、この微生物はシュ
ードモナス属に属する菌であり、さらに公知の菌株と比
較しても同じものが存しないため新規の菌株と判断し、
シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）６１−３と命名して、工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１３１０８号（ＦＥＲＭＰ−
１３１０８）として寄託した。

【００３２】本発明の微生物は自然又は紫外線、Ｘ線、
化学薬剤等により変異を起す。従って、本発明の共重合
体の製造方法には、これら変異株を用いることもでき
る。

【００３３】上記ランダム共重合体の製造方法において
使用される培地には、資化し得る炭素源の他、所望によ
り窒素源及びその他の栄養源を適当量含有せしめてお
く。これらは特に制限はないが、具体的には炭素源とし
てはオクタン酸、グルコン酸、吉草酸もしくはそれらの
ナトリウム塩、グルコサミン、ブイヨン、シュクロー
ス、デンプン、糖蜜、アラビノース、ソルビトール、メ
タノール、エタノール、二酸化炭素、オレイン酸、パル
ミチン酸、リノール酸、ステアリン酸、リノレン酸等の
脂肪酸、さらに天然油脂であるコーン油、オリーブ油、
大豆油、なたね油等の植物油や魚油、豚脂、牛脂等の動
物油等が挙げられ、窒素源としては塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機窒素源の
他、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、トリプトン、尿
素、大豆粉、油粕などの有機窒素源も挙げることがで
き、その他の添加物としては、必要に応じてマグネシウ
ム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン、
銅、モリブデン、亜鉛、鉄等の金属塩、リン酸塩、硝酸
塩、塩化物、炭酸塩等、クエン酸ナトリウム等の有機酸
塩、さらに必要に応じてビタミン等の発育素が挙げられ
る。

【００３４】培養は好気的条件下で行うのが好ましく、
静置、振とう、通気攪拌培養のいずれも可能であるが、
振とうあるいは通気攪拌培養が有利である。このとき、
培養方式は回分培養、連続培養のいずれであってもよ
い。培養温度は約１０〜３３℃が好ましく、特に約２０
〜３０℃が好適である。また、培地のｐＨは約５．５〜
８．５が適当であるが、特に６．０〜８．０が最適であ
る。

【００３５】また、このとき主として菌体を増殖させる
前段の培養と、窒素及び／又はリンを制限して菌体内に
共重合体を合成、蓄積させる後段の培養との二段階によ
り培養したほうが、通常、共重合体の生成量が多くなる
ため好ましい。すなわち、上記の培養条件で前段の培養
を行い、得られた培養液から菌体を濾過あるいは遠心分
離のような手段で分離回収し、その菌体を後段の窒素及
び／又はリンを制限した培地での培養に移行させるか、
又は、前段の培養において窒素及び／又はリンを枯渇さ
せ、菌体を分離回収することなく、その培養液を後段の
培養に移行させてもよい。この後段の培養は培養液中に
窒素及び／又はリンを実質的に含有させない点でのみ前
段の培養と異なる。

【００３６】以上の培養において、後段の培養における
培養条件が重要である。後段における培養液中の炭素源
は共重合体合成の原料であり、通常、この炭素源の構造
がランダム共重合体の構造を決定する場合が多い。例え
ば、炭素数６のグルコン酸ナトリウムを炭素源として培
養すると、炭素数４の３ＨＢ、炭素数８の３ＨＯ及び炭
素数１０の３ＨＤ単位が比較的高モル％となっているラ
ンダム共重合体を合成し、炭素数８のオクタン酸ナトリ
ウムを炭素源として培養すると炭素数８の３ＨＯ及び炭
素数６の３ＨＨｘ単位が比較的高モル％となっているラ
ンダム共重合体を合成する。また、二重結合を有する炭
素源で培養すると、側鎖に二重結合を含んだ不飽和単位
を有するランダム共重合体が通常得られる。さらに、二
重結合を有しない炭素源で培養した場合でも、炭素数１
２の３ＨＤＤ単位の側鎖には二重結合を含むことがあ
る。

【００３７】これらの炭素源の量は、共重合体を合成す
ることができ、かつ、微生物の生育を阻害しない量であ
ればよいが、共重合体を構成するモノマー単位の種類あ
るいはモノマー単位数の割合により変化させることが好
ましい。通常は培養液１１あたり０．１〜１００ｇ程
度、好ましくは０．５〜３０ｇ程度である。

【００３８】上記により培養された培養物中から、濾過
あるいは遠心分離などの通常の手段によって菌体を分離
回収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得る。菌
体の収量は０．５〜８ｇ／ｌ程度である。この菌体から
目的のランダム共重合体を採取するには、常法により、
例えばクロロホルムのような有機溶剤で生成した共重合
体を抽出し、例えば共重合体を溶解しにくいメタノー
ル、ヘキサンなどの貧溶媒を加えて上記共重合体を沈澱
させる。

【００３９】乾燥菌体中には上記ランダム共重合体Ｐ
（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３Ｈ
Ｄ−ｃｏ−３ＨＤＤ）（Ａ）５〜９５％に加え重合体Ｐ
（３ＨＢ）（Ｂ）０〜９５％が含まれ（Ａ＋Ｂは５〜９
５％である）、これを分別したい場合には、例えばアセ
トンを用いれば共重合体（Ａ）は可溶抽出、一方、重合
体（Ｂ）は沈澱される。

【００４０】上記重合体（Ｂ）の含有量は、炭素源の種
類、濃度及び窒素源その他の栄養源の種類、濃度等を変
えて培養することにより調節できる。

【００４１】かくして３ＨＢ及び３ＨＯ、さらに場合に
より３ＨＨｘ、３ＨＤ及び／又は３ＨＤＤのモノマー単
位がエステル結合したランダム共重合体が得られ、ま
た、上記培養条件により３ＨＢ単位がエステル結合した
重合体も同時に得られる。各モノマー単位の割合及び分
子量は、オクタン酸、グルコン酸などの炭素源の種類や
濃度を変えることによって、制御することができる。

【００４２】

【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００４３】実施例１保存菌株の復元と予備培養スクリーニングした菌株のうち、千葉県佐倉市の土壌よ
り分離したシュードモナスエスピー６１−３株（微工
研菌寄第１３１０８号）を凍結保存から、３７℃で解凍
し、１％グルコース添加ブイヨン寒天培地に植菌して、
３０℃、２４時間培養し復元した。この復元菌株を１％
グルコース添加ブイヨン液体培地５ｍｌに植菌し、３０
℃、２４時間往復振とう培養した。

【００４４】前段培養下記に示す組成の培地２１をジャーファメンターに入
れ、予備培養した前記シュードモナスエスピー６１−
３株をジャーファメンターの攪拌速度２５０ｒｐｍ、空
気通気量１０ｌ／ｈとし、３０℃で３０時間好気培養し
た。

【００４５】

【表２】（培地組成）ＮＨ_４Ｃｌ０．４ｇＫＨ_２ＰＯ_４２．７ｇＮａＨ_２ＰＯ_４３．２ｇＭｇＳＯ_４０．２ｇミネラル溶液^＊１．０ｍｌ蒸留水１，０００ｍｌｐＨ７．０

【００４６】

【表３】＊：次の成分を含むＣｏＣｌ_２１１９．０ｍｇＣａＣｌ_２７．８ｍｇＣｒＣｌ_２６２．２ｍｇＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ９．７ｍｇＮｉＣｌ_３１１８．０ｍｇＣｕＳＯ_４１５６．０ｍｇ０．１Ｎ−ＨＣｌ水溶液１．０ｌ

【００４７】後段培養次に、前段培養を行った培地組成のうちＮＨ_４Ｃｌを無
しとし、グルコン酸ナトリウム２０ｇ／ｌを加えた培地
を２１ジャーファメンターに入れ、前段培養で得られた
菌体を１０ｇ懸濁させ、ジャーファメンターの攪拌速度
２５０ｒｐｍ、空気通気量５ｌ／ｈとし、３０℃で１８
時間好気培養した。ｐＨは無調整で７．０〜７．５であ
った。菌の分離得られた培養物から遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）に
よって、菌体を分離した。次に、得られた菌体を凍結乾
燥し乾燥菌体３．５ｇ／ｌを得た。合成物の分離・精製ソックスレー抽出装置を用いて、得られた乾燥菌体にク
ロロホルム（ウォーターバス９０℃）を加え化合物を抽
出して濃縮し、これにメタノールを加えて合成物を沈澱
させた後、上澄のメタノールを取り除き、真空乾燥機で
乾燥し、１．４ｇ／ｌ（乾燥菌体中４５％）の合成物を
得た。重合体の分別ソックスレー抽出装置を用いて、この生成物にアセトン
（ウォーターバス８０℃）を加えアセトン可溶部を抽出
して濃縮し、真空乾燥機で乾燥し、ランダム共重合体
（１）０．８４ｇ／ｌを得た。また、アセトン不溶部を
乾燥し重合体（２）０．５６ｇ／ｌを得た。重合体（１）及び（２）の理化学的性質以上のようにして得られた重合体（１）及び（２）の構
造・組成、数平均分子量、融点、ガラス転移点及び溶解
性を下記により測定した。

【００４８】

【表４】単位組成：ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）測定（日立製作所製Ｇ−３０００，カラム：ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ− １）構造：^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（日本分光工業製）分子量：ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）測定（日立製作所製Ｌ−６２００，データ処理装置Ｄ−２５２０）融点：示差走査熱量計（ＤＳＣ）測定（１０℃／ｍｉｎ）（島津製作所製ＤＳＣ−５０）ガラス転移点：示差走査熱量計（ＤＳＣ）測定（２０℃／ｍｉｎ）溶解性：各種溶剤に対する溶解性

【００４９】測定結果を併せて表７に示す。重合体
（１）は新規なランダム共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３
ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤ
Ｄ）であった。このとき、３ＨＤＤには側鎖に二重結合
があるものもあった。溶解性はクロロホルム、ジクロロ
メタン、１，２−ジクロロエタン、アセトンに可溶で、
水に不溶であった。ランダム共重合体（１）はクロロホ
ルム溶融キャスティング法でフィルムに成形すると、か
なり軟らかいプラスチックになった。重合体（２）はＰ
（３ＨＢ）であり、クロロホルム、ジクロロメタン、
１，２−ジクロロエタンに可溶で、アセトン、水に不溶
であった。

【００５０】それぞれの重合体のＧＣ測定チャートを図
１及び図２に、１００ＭＨ_２ ^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル
を図３及び図４に、ＧＰＣ測定チャートを図５及び図６
に、ＤＳＣ測定チャートを図７（融点）並びに図８及び
図９（ガラス転移点）に示す。

【００５１】重合体（１）及び（２）の化学式を以下に
示す。ここで、それぞれの炭素原子に付された数字は図
３及び図４におけるＮＭＲチャートのピーク位置に対応
する。

【００５２】

【化１１】

【００５３】実施例２保存菌株の復元と予備培養、前段培養は実施例１と同様
に行った。前段培養前段培養を行った培地組成のうちＮＨ_４Ｃｌを無しと
し、オクタン酸ナトリウム１ｇ／ｌを加えた培地を２１
ジャーファメンターに入れ、前段培養で得られた菌体１
０ｇ／ｌ懸濁させ、ジャーファメンターの攪拌速度２５
０ｒｐｍ、空気通気量５ｌ／ｈとし、３０℃で１２時間
好気培養した。ｐＨは無調整で７．０〜７．５であっ
た。菌の分離得られた培養物から遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）に
よって、菌体を分離した。次に、得られた菌体を凍結乾
燥し乾燥菌体１．５ｇ／ｌを得た。合成物の分離・精製ソックスレー抽出装置を用いて、得られた乾燥菌体にク
ロロホルム（ウォーターバス９０℃）を加え合成物を抽
出して濃縮し、これにメタノールを加えて合成物を沈澱
させた後、上澄のメタノールを取り除き、真空乾燥機で
乾燥し、０．９０ｇ／ｌ（乾燥菌体中６０％）の合成物
を得た。重合体の分別ソックスレー抽出装置を用いて、合成物にアセトン（ウ
ォーターバス８０℃）を加えてアセトン可溶部を抽出し
て濃縮し、真空乾燥機で乾燥し、ランダム共重合体
（３）０．６４ｇ／ｌを得た。また、アセトン不溶部を
乾燥し重合体（４）０．２６ｇ／ｌを得た。重合体（３）及び（４）の理化学的性質実施例１と同様に行った。測定結果を併せて表７に示
す。重合体（３）はランダム共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ
−３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ）であった。
溶解性はクロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジク
ロロエタン、アセトンに可溶で、水に不溶であった。ラ
ンダム共重合体（３）は粘度の高い油様でドロドロとし
た性状を呈していた。重合体（４）はＰ（３ＨＢ）であ
り、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロ
エタンに可溶で、アセトン、水に不溶であった。また、
ＧＣ測定チャートを図１０及び図１１に、ＧＰＣ測定チ
ャートを図１２及び図１３に、ＤＳＣ測定チャートを図
１４及び図１５（融点）並びに図１６及び図１７（ガラ
ス転移点）に示す。

【００５４】実施例３保存菌株の復元と予備培養は実施例１と同様に行った。本培養（１段培養）下記に示す組成の培地１００ｍｌを三角フラスコに入
れ、予備培養した前記シュードモナスエスピー６１−
３株を往復振とう数１３０ｒｐｍで、３０℃、６０時間
好気培養した。

【００５５】

【表５】（培地組成）グルコン酸ナトリウム１８．０ｇＮＨ_４Ｃｌ０．４ｇＫＨ_２ＰＯ_４２．７ｇＮａＨ_２ＰＯ_４３．２ｇＭｇＳＯ_４０．２ｇミネラル溶液^＊１．０ｍｌ蒸留水１，０００ｍｌｐＨ７．０

【００５６】

【表６】＊：次の成分を含むＣｏＣｌ_２１１９．０ｍｇＣａＣｌ_２７．８ｍｇＣｒＣｌ_２６２．２ｍｇＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ９．７ｍｇＮｉＣｌ_３１１８．０ｍｇＣｕＳＯ_４１５６．０ｍｇ０．１Ｎ−ＨＣｌ水溶液１．０ｌ

【００５７】菌の分離、合成物の分離・精製、重合体の分別実施例１及び２と同様に行った。その結果、乾燥菌体
２．０ｇ／ｌから合成物０．６６ｇ／ｌ（乾燥菌体中３
３％）を得た。この合成物はランダム共重合体（５）
０．４７ｇ／ｌと重合体（６）０．１９ｇ／ｌに分別さ
れた。重合体（５）及び（６）の理化学的性質実施例１と同様に行なった。測定結果を併せて表７に示
す。重合体（５）はランダム共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ
−３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３Ｈ
ＤＤ）であった。このとき、３ＨＤＤには側鎖に二重結
合があるものもあった。溶解性はクロロホルム、ジクロ
ロメタン、１，２−ジクロロエタン、アセトンに可溶
で、水に不溶であった。ランダム共重合体（５）は粘度
の高い油様でゴム状に近いものであった。重合体（６）
はＰ（３ＨＢ）であり、クロロホルム、ジクロロメタ
ン、１，２−ジクロロエタンに可溶で、アセトン、水に
不溶であった。また、ＧＣ測定チャートを図１８及び図
１９に、１００ＭＨ_２ ^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図２
０及び図２１に示す。

【００５８】なお、共重合体（５）の化学式は前記共重
合体（１）のそれと同様であり、各モノマーの存在量比
率が異なっていた。また、重合体（６）の化学式は前記
重合体（２）のそれと同様であった。

【００５９】実施例４保存菌株の復元と予備培養は実施例１と同様に行った。本培養（１段培養）実施例３の本培養に用いた培地組成のうち、グルコン酸
ナトリウムを無しとし、グルコサミン２５ｇ／ｌを加え
た培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、予備培養した
シュードモナスエスピー６１−３株を往復振とう数９
０ｒｐｍで、３０℃、８０時間好気培養した。菌の分離、合成物の分離・精製、重合体の分別実施例１及び２と同様に行った。その結果、乾燥菌体
１．８ｇ／ｌから合成物０．５４ｇ／ｌ（乾燥菌体中３
０％）を得た。この合成物からは分別されず、ランダム
共重合体（７）０．５４ｇ／ｌのみを得た。重合体（７）の理化学的性質実施例１と同様に行った。測定結果を併せて表７に示
す。重合体（７）は新規なランダム共重合体Ｐ（３ＨＢ
−ｃｏ−３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ
−３ＨＤＤ）であった。溶解性はクロロホルム、アセト
ンに可溶で、水に不溶であった。ランダム共重合体
（７）は粘度の高い油様でドロドロとした性状を呈して
いた。

【００６０】実施例５保存菌株の復元と予備培養は実施例１と同様に行った。本培養（１段培養）実施例３の本培養に用いた培地組成のうち、グルコン酸
ナトリウムを無しとし、オクタン酸ナトリウム１．０ｇ
／ｌを加え、ＮＨ_４Ｃｌの量０．４ｇ／ｌを０．０４ｇ
／ｌに変えた培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、予
備培養したシュードモナスエスピー６１−３株を往復
振とう数１３０ｒｐｍで、３０℃、４８時間好気培養し
た。菌の分離、合成物の分離・精製、重合体の分別実施例１及び２と同様に行った。その結果、乾燥菌体
１．４ｇ／ｌから合成物０．７８ｇ／ｌ（乾燥菌体中５
６％）を得た。この合成物はランダム共重合体（８）
０．５３ｇ／ｌと重合体（９）０．２５ｇ／ｌに分別さ
れた。重合体（８）及び（９）の理化学的性質実施例１と同様にして行った。測定結果を併せて表７に
示す。重合体（８）は新規なランダム共重合体Ｐ（３Ｈ
Ｂ−ｃｏ−３ＨＨｘ−ｃｏ−３ＨＯ）であった。溶解性
はクロロホルム、アセトンに可溶で、水に不溶であっ
た。ランダム共重合体（８）は粘度の低い油様であっ
た。重合体（９）は共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ
ｘ−ｃｏ−３ＨＯ）であった。溶解性はクロロホルムに
可溶で、アセトン、水に不溶であった。共重合体（９）
はクロロホルム溶融キャスティング法でフィルムに成形
すると、硬くてもろいプラスチックになった。また、Ｇ
Ｃ測定チャートを図２２及び図２３に示す。

【００６１】実施例６保存菌株の復元と予備培養は実施例１と同様に行った。本培養（１段培養）実施例３の本培養に用いた培地組成のうち、グルコン酸
ナトリウムを無しとし、吉草酸ナトリウム１．０ｇ／ｌ
を加えた培地１００ｍｌを三角フラスコに入れ、予備培
養したシュードモナスエスピー６１−３株を往復振と
う数１８０ｒｐｍで、３０℃、７０時間好気培養した。菌の分離、合成物の分離・精製、重合体の分別実施例１及び２と同様に行った。その結果、乾燥菌体
０．９ｇ／ｌから合成物０．０８ｇ／ｌ（乾燥菌体中９
％）を得た。この合成物は共重合体（１０）０．０３ｇ
／ｌと重合体（１１）０．０５ｇ／ｌに分別された。重合体（１０）及び（１１）の理化学的性質実施例１と同様に行った。測定結果を併せて表７に示
す。重合体（１０）は新規なランダム共重合体Ｐ（３Ｈ
Ｂ−ｃｏ−３ＨＯ−ｃｏ−３ＨＤ−ｃｏ−３ＨＤＤ）で
あった。このとき、３ＨＤＤには側鎖に二重結合がある
ものもあった。溶解性はクロロホルム、アセトンに可溶
で、水に不溶であった。ランダム共重合体（１０）はク
ロロホルム溶融キャスティング法でフィルムに成形する
と、やや軟らかいプラスチックになった。重合体（１
１）はＰ（３ＨＢ）であり、クロロホルムに可溶で、ア
セトン、水に不溶であった。

【００６２】

【表７】

【００６３】

【発明の効果】本発明の微生物を用いるランダム共重合
体の製造方法により、モノマー単位３ＨＢ、３ＨＨｘ、
３ＨＯ、３ＨＤ及び３ＨＤＤからなるランダム共重合体
を得ることができる。これにより、従来の共重合体に比
し、理化学的性質の異った、優れたランダム共重合体を
生産することが可能であり、産業上の利用価値が大であ
る。さらに、本発明により得られるランダム共重合体は
医薬品、食品、衛生用品、建設用品、工業用品、農園芸
品、包装材料等広範な分野での応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られたランダム共重合体（１）の
ＧＣ測定チャートを示す図面である。

【図２】実施例１で得られた重合体（２）のＧＣ測定チ
ャートを示す図面である。

【図３】実施例１で得られたランダム共重合体（１）の
¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。

【図４】実施例１で得られた重合体（２）の¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを示す図面である。

【図５】実施例１で得られたランダム共重合体（１）の
ＧＰＣ測定チャートを示す図面である。

【図６】実施例１で得られた重合体（２）のＧＰＣ測定
チャートを示す図面である。

【図７】実施例１で得られた重合体（２）のＤＳＣ
（融点）測定チャートを示す図面である。

【図８】実施例１で得られたランダム共重合体（１）の
ＤＳＣ（ガラス転移点）測定チャートを示す図面であ
る。

【図９】実施例１で得られた重合体（２）のＤＳＣ（ガ
ラス転移点）測定チャートを示す図面である。

【図１０】実施例２で得られたランダム共重合体（３）
のＧＣ測定チャートを示す図面である。

【図１１】実施例２で得られた重合体（４）のＧＣ測定
チャートを示す図面である。

【図１２】実施例２で得られたランダム共重合体（３）
のＧＰＣ測定チャートを示す図面である。

【図１３】実施例２で得られた重合体（４）のＧＰＣ測
定チャートを示す図面である。

【図１４】実施例２で得られたランダム共重合体（３）
のＤＳＣ（融点）測定チャートを示す図面である。

【図１５】実施例２で得られた重合体（４）のＤＳＣ
（融点）測定チャートを示す図面である。

【図１６】実施例２で得られたランダム共重合体（３）
のＤＳＣ（ガラス転移点）測定チャートを示す図面であ
る。

【図１７】実施例２で得られた重合体（４）のＤＳＣ
（ガラス転移点）測定チャートを示す図面である。

【図１８】実施例３で得られたランダム共重合体（５）
のＧＣ測定チャートを示す図面である。

【図１９】実施例３で得られた重合体（６）のＧＣ測定
チャートを示す図面である。

【図２０】実施例３で得られたランダム共重合体（５）
の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図面である。

【図２１】実施例３で得られた重合体（６）の¹³Ｃ−Ｎ
ＭＲスペクトルを示す図面である。

【図２２】実施例５で得られたランダム共重合体（８）
のＧＣ測定チャートを示す図面である。

【図２３】実施例５で得られたランダム共重合体（９）
のＧＣ測定チャートを示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:38） (56)参考文献特開昭57−150393（ＪＰ，Ａ) 特開平３−277656（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／11656（ＷＯ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 7/62 C12N 1/20 C08G 63/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｐ．）６１−３株を、炭素源を含有す
る培地で培養することを特徴とする下記（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）；（ａ）下記式（１）で表わされる３−ヒドロキシブチレ
ート単位６〜９５モル％【化１】（ｂ）下記式（２）及び／又は（３）て表わされる３−
ヒドロキシヘキサノエート単位０〜４０モル％【化２】（ｃ）下記式（４）及び／又は（５）及び／又は（６）
で表わされる３−ヒドロキシオクタノエート単位５〜９４モル％【化３】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜２の整数を示し、ｍ＋
ｎ＝２である。）（ｄ）下記式（７）及び／又は（８）
及び／又は（９）で表わされる３−ヒドロキシデカノエ
ート単位０〜５０モル％【化４】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜４の整数を示し、ｍ＋
ｎ＝４である。）（ｅ）下記式（１０）及び／又は（１
１）及び／又は（１２）で表わされる３−ヒドロキシド
デカノエート単位０〜４０モル％【化５】（式中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜６の整数を示し、ｍ＋
ｎ＝６である。）からなるランダム共重合体の製造方
法。
【請求項２】請求項１記載のシュードモナスエスピ
ー６１−３株を、炭素源を含有する培地で培養する工程
を含み、請求項１記載のランダム共重合体（Ａ）を乾燥
菌体中に５〜９５％及び請求項１記載の式（１）で表さ
れる３−ヒドロキシブチレート単位からなる重合体
（Ｂ）を乾燥菌体中に０〜９５％（但し、Ａ＋Ｂは５〜
９５％である）同時に生成することを特徴とする重合体
の製造方法。
【請求項３】シュードモナスエスピー（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｓｐ．）６１−３株（微工研菌寄第１３
１０８号）。