JP2777598B2 - ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 - Google Patents
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法Info
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Description
ココッカス種(Synechococcus sp.)
によるポリ−β−ヒドロキシ酢酸の製造方法に関する。
は、微生物が生産するバイオポリマーの一種であり、微
生物により分解可能な熱可塑性樹脂として、医薬類、農
薬類、医療材料、工業材料等の多方面での応用が期待さ
れる材料である。PHBを微生物により生産させる方法
は、これまでに種々開示されている。例えば、特開昭5
9−220192号、特開昭64−27483号および
特開平1−222788号の各公報でPHBの製造方法
について開示されている。しかし、これらの何れの方法
も資化性炭素源として有機炭素源を必要とするという欠
点があった。また、Journal of bacte
riology,Vol.172,No.5,2791
−2792(1990)によれば、藍藻類のスピルリナ
(Spirulina)は光合成を行うことにより有機
炭素源を必要とすることなくPHBを生産することが可
能である。ところが、藍藻のPHB含有率は極めて少な
く、せいぜい6%と低かった。そこで、Advance
s in Biochemical Engineer
ing Biotechnology,Vol.41,
78−79(19)によると、藍藻類のクロログレア
(Chloroglea)は無機塩培地に酢酸を加え、
二酸化炭素を通気してやることで10%までPHBが蓄
積していることが報告されている。
ルカリゲネス・ユウトロファス(Alcaligene
s eutrophus)起源のβ−ケトチオラーゼ、
アセトアセチルCoAレダクターゼおよびポリヒドロキ
シブチレートポリメラーゼの中をクローニングしたベク
ターに藍藻由来の遺伝子を導入したものを用いること
で、PHB生産能の無いシネココッカス種(Synec
hococcus sp.)にPHBを生産させること
に成功している。しかし、この遺伝子組換え藍藻におけ
るPHB蓄積率は約1%と少なく、また細胞増殖期、P
HB生産期の二段階の培養が必要であった。
光、水、二酸化炭素および無機塩で生育する藍藻から効
率的に高収率でPHBを生産させる方法を開発すること
を課題とする。
を解決すべく鋭意研究の結果、β−ケトチオラーゼ、ア
セトアセチルCoAレダクターゼおよびポリヒドロキシ
ブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコードする構
造遺伝子群を組み込んだ組換えプラスミドを構築し、こ
の組換えプラスミドを移入した、PHB生産能を有する
遺伝子組換え藍藻シネココッカス種を通常の無機塩培地
の他に、安価な酢酸を加えて培養したところ、増殖させ
ながらPHBの生産を行わせることができること、さら
にまた、窒素源を制限した培地を用いると、さらによい
結果が得られることを見いだし、本発明を完成した。即
ち、本発明によれば、β−ケトチオラーゼ、アセトアセ
チルCoAレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレー
トポリメラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子
群を組み込んだ組換えプラスミドを含有し、ポリ−β−
ヒドロキシ酪酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻シスコ
コッカス種を酢酸を添加した培地で培養し、培養物から
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする
ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法が提供される。本
発明によれば、さらに、前記組換えプラスミドが藍藻で
の複製に必要な領域を持ち、藍藻由来のプロモーター活
性を有する配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファ
ス起源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組
換えプラスミド、特にアンピシリンおよびクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子を有するpAEN1プラスミドであ
る前記製造方法が提供される。さらに本発明によれば、
前記遺伝子組換え藍藻シネココッカス種がFERMP−
15189である製造方法が提供される。本発明はさら
に、前記培地がさらに窒素源を制限されたものである前
記製造方法にも関する。
ドを含有する藍藻シネココッカス種は例えば次のように
して得ることができる。
源のβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダク
ターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼか
らなる酵素群をコードする構造遺伝子群断片を調製す
る。この構造遺伝子群は既に配列決定されており、調製
法と共にThe Journal of Biolog
ical Chemistry,Vol.264,N
o.26,15293−15297(1989)および
The Journal of Biological
Chemistry,Vol.264,No.26,
15298−15303(1989)に記載されてい
る。このβ−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレ
ダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラー
ゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群は以下,P
HB合成遺伝子断片と呼ぶ。
ラスミド(例えばpUC19(宝酒造株式会社製))に
導入する。すなわち、例えば、10mA Tris−H
Cl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTTなどのような緩衝液中、pUC19を制限酵素、
例えばEcoRI及びSmaIで処理し、次いでアルカ
リホスファターゼを用いて脱リン酸化反応を行い、さら
に例えばフェノール抽出により精製し、制限酵素Eco
RIおよびSmaI処理pUC19(約2.7K塩基
対)を得る。これとは別にPHB合成遺伝子断片を例え
ば10mM Tris−HCl(pH7.5),10m
M MgCl2、1mM DTTなどのような公知の緩
衝液中、SmaIおよびEcoRIを用いて処理し、さ
らに例えばフェノール抽出により精製してSmaIおよ
びEcoRI処理したPHB合成遺伝子断片を得る。
UC19およびPHB合成遺伝子断片を10mM Tr
is−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,
1mM DTT,1mM ATPなどのような公知の緩
衝液中T4リガーゼを用いて連結し、pUC19にPH
B合成遺伝子断片を導入した約8K塩基対プラスミドを
構築し、これをpAE100と名付ける。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモータ活性を持つ遺伝
子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトルベ
クターを構築する。このとき使用できるプラスミドとし
ては、例えばアンピシリン耐性遺伝子を有する藍藻と大
腸菌のシャトルベクターpECAN8にプラスミドpK
K232−8(Pharmacia社製)のクロラムフ
ェニコール耐性遺伝子および藍藻由来のプロモーター活
性を有する遺伝子を組み込んだpKE4−9が挙げられ
る。前記pECAN8の製法は、FEMS Micro
biol.Lett.,Vol.27,253−256
(1985)に記載されている。pAE100からPH
B合成遺伝子断片を切り出すには、例えば10mM T
ris−HCl(pH7.5),10mM MgC
l2,1mM DTT,50mM NaClなどのよう
な緩衝液中、制限酵素、例えばEcoRIおよびHin
dIIIを用いて、pAE100を37℃で1時間反応
させ、次いで例えばフェノール抽出により精製する。こ
のようにして得られ遺伝子断片のうち約5,200塩基
の大きさのものを選択し、これをさらに例えば3mM
Tris−酢酸(pH7.9),66mM酢酸カリウ
ム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mM DTT,
0.1mg/ml BSA、0.1mM dATP,
0.1mMdCTP,0.1mM dTTP,0.1m
M dGTPなどのような緩衝液中、T4ポリメラーゼ
を用いて処理し、次いで例えばフェノール抽出すること
により精製PHB合成遺伝子断片が得られる。
入するには、例えば、50mM Tris−HCl(p
H7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,
100mM NaClなどのような緩衝液中、制限酵
素、例えばSalIを用いて、pKE4−9を37℃で
約1時間反応させ、次いで例えば3mM Tris−酢
酸(pH7.9)、66mM酢酸カリウム、10mM酢
酸マグネシウム、0.5mM DTT,0.1mg/m
l BSA,0.1mM dATP,0.1mMdCT
P,0.1mM dTTP,0.1mM dGTPなど
のような緩衝液中、T4ポリメラーゼを用いて通常37
℃で5分間処理し、さらにアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール抽
出により精製した後、PHB合成遺伝子断片との結合に
使用する。こうして得られたSAlI処理pKE4−9
とPHB合成遺伝子断片を連結するには、公知の緩衝液
中、10mM Tris−HCl(pH7.5),10
mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP中
で、PHB合成断片とpKE4−9をT4リガーゼを用
いて通常16℃で約1時間処理すればよい。このように
してpKE4−9にPHB合成遺伝子断片を導入した1
4.00kb組換えプラスミドを得、これをpAEN1
と名付けた。その構成を図1に示す。
を形質転換する。まず、シネココッカス種の細胞を例え
ば表1に示すBG−11培地や表2に示すMDM培地中
で所定量となるまで培養する。
er編集のMethod in Enzymology
Vol.167(ACADEMIC PRESS,I
NC.1988)に記載された方法等に従い、pAEN
1を用いて該藍藻を自然形質転換する。本発明に使用す
る藍藻は、上記の方法で得られた藍藻に限定されるもの
ではなく、アセチルCoAを介してPHBを生産する遺
伝子群を有する遺伝子組換え藍藻であればよい。
産させる。すなわち、形質転換藍藻を、上記BG−11
培地のような培地に酢酸を加え、通常通気撹拌培養を行
う。酢酸は最終濃度0.1〜200mMが好ましく、1
〜100mMが特に好ましい。一般に培養温度は20〜
60℃、好ましくは25〜55℃、培養液のpHは6〜
11、好ましくは7〜9が望ましい。また、光強度は1
000〜3000Luxが好ましい。次に、所定量まで
培養したら、藍藻菌体を培養液からろ過、遠心分離等の
方法により分離する。また、さらに藍藻菌体内のPHB
蓄積率を上げる為には、分離した藍藻菌体を栄養源を制
限した培養液、例えば、BG−11培地から硝酸ナトリ
ウムを除いた酢酸入り培地にて培養を行うことが好適で
ある。このようにして遺伝子組換え藍藻菌体にPHBを
生成蓄積させ、このPHBをG.Brauneggらの
方法(European Journal of Ap
plied Microbiology and Bi
otechnology 6,29−37(197
8))等の方法により培養物から採取する。PHBの含
有率は乾燥菌体重量当り12〜25%であり、従来法で
せいぜい10%であったのに比較して格段に優れてい
る。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
genes eutrophus)からβ−ケトチオラ
ーゼ、アセトアセチルCoAレダクターゼおよびポリヒ
ドロキシブチレートポリメラーゼからなる酵素群をコー
ドする構造遺伝子群断片(PHB合成遺伝子断片)をT
he Journal of Biological
Chemistry,Vol.264,No.26,1
5293−15297および15298−15303
(1989)に記載されている方法で調製した。得られ
たPHB合成遺伝子断片をプラスミドに導入するため、
プラスミドpUC19 100μg(宝酒造株式会社
製)を用意し、緩衝液10mM Tris−HCl(p
H7.5),10mM MgCl2,1mM DTT
中、制限酵素EcoRI及びSmaIそれぞれ500ユ
ニットずつを用いて、37℃で1時間反応させ、次いで
アルカアリホスファターゼ2ユニットを用いて37℃で
1時間脱リン酸化反応を行い、さらに例えばフェノール
抽出により精製した。
びSmalI処理したpUC19(約2.7K塩基対)
と、PHB合成遺伝子とを連結するために、PHB合成
遺伝子断片200μgを緩衝液10mM Tris−H
Cl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM
DTT中、SmaIおよびEcoRIをそれぞれ500
ユニットずつ用いて、37℃で約1時間反応させ、さら
にフェノール抽出により精製した。その後、緩衝液10
mM Tris−HCl(pH7.5),10mM M
gCl2,1mM DTT,1mM ATP中で、上記
処理したPHB合成遺伝子断片100ngと上記処理し
たpUC19 50ngに対して5ユニットのT4リガ
ーゼを用いて16℃で約1時間処理した。このようにし
てpUC19にPHB合成遺伝子断片を導入した約8K
塩基対の組換えプラスミドをpAE100と名付けた。
断片を切り出し、藍藻由来のプロモーター活性を持つ遺
伝子配列の下流に組み込んだ、藍藻と大腸菌のシャトル
ベクターを構築するための、プラスミドpKE4−9を
100μg用意した。pKE4−9は、アンピリン耐性
遺伝子を有する藍藻と大腸菌のシャトルベクターpEC
AN8にプラスミドpKK232−8(Pharmac
ia社製)のクロラムフェニコール耐性遺伝子と、藍藻
由来のプロモーター活性を有する遺伝子を組み込んだも
のである。pAE100からPHB合成遺伝子断片を切
り出すため、緩衝液10mM Tris−HCl(pH
7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,5
0mM NaCl中、制限酵素EcoRIおよびHin
dIIIをそれぞれ500ユニットずつ用いて、pAE
100 200μgを37℃で1時間反応させ、フェノ
ール抽出により精製した。次に、得られた遺伝子断片の
うち約5,200塩基の大きさのものを選択し、これを
さらに緩衝液3mM Tris−酢酸(pH7.9),
66mM酢酸カリウム,10mM酢酸マグネシウム,
0.5mM DTT,0.1mg/ml BSA,0.
1mM dATP,0.1mM dCTP,0.1mM
dTTP,0.1mM dGTP中、200ユニット
のT4ポリメラーゼを用いて37℃で5分間処理し、次
いでフェノール抽出することにより精製PHB合成遺伝
子断片を得た。pKE4−9に上記切り出したPHB合
成遺伝子断片を導入するため、緩衝液50mM Tri
s−HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1
mMDTT,100mM NaCl緩衝液中、制限酵素
SalIを500ユニット用いて、pKE4−9 20
0μgを37℃で1時間反応させ、次いで3mM Tr
is−酢酸(pH7.9),66mM 酢酸カリウム,
10mM 酢酸マグネシウム,0.5mM DTT,
0.1mg/ml BSA,0.1mM dATP,
0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,0.1
mM dGTPの緩衝液中、200ユニットのT4ポリ
メラーゼを用いて37℃で5分間処理し、さらにアルカ
リホスファターゼ2ユニットを用いて37℃で1時間脱
リン酸化反応を行った後、フェノール抽出により精製し
た。
前記切り出したPHB合成遺伝子断片を連結するため、
緩衝液10mM Tris−HCl(pH7.5),1
0mM MgCl2,1mM DTT,1mM ATP
中で、PHB合成遺伝子断片100ngと前記処理pK
E4−9 50ngに対して5ユニットのT4リガーゼ
を用いて16℃で約1時間処理した。このようにしてp
KE4−9のSalIサイトにPHB合成遺伝子断片を
導入した14.00kb塩基対プラスミドをpAEN1
と名付けた。次にpAEN1を用いて形質転換藍藻を得
るため、シネココッカス種PCC7942(Synec
hococcus sp.PCC7942)をBG−1
1培地40mlにて2,000Lux,30℃にてOD
660=0.2の値になるまで培養し、pAEN1 20
μgを用いて自然形質転換した。自然形質転換の方法
は、PackerおよびA.N.Clazer編集のM
ethod in Enzymology Vol.1
67(ACADEMIC PRESS,INC.198
8)に記載されている方法を用いた。このpAEN1を
保有するシネココッカス種PCC7942の形質転換体
は、pAEN1−1と命名し、工業技術院生命工学工業
技術研究所に平成7年9月19日に寄託した(受託番号
=FERMP−15189)。
g/mlおよびクロラムフェニコール10mg/mlを
含有する10mM酢酸入りBG−11培地200mlに
植菌し、2,000Lux、30℃にて14日間培養を
行った。この培養物を30℃、1580G,10分間の
条件で遠心し、培養液から藍藻菌体を分離した。藍藻菌
体によるPHB蓄積率は12%であった。また、PHB
蓄積率を上げるため、分離した藍藻菌体をBG−11培
地から硝酸ナトリウムを除いた10mM酢酸入り培地に
懸濁させ、2,000Lux、30℃でさらに14日間
培養を行った。培養後の藍藻菌体によるPHB蓄積率は
乾燥菌体重量当たり25%であった。なお、酢酸を入れ
ず、窒素源を制限した培地PHBの蓄積は、約1%であ
った。PHBの定量は、ガスクロマトグラフにて下記の
ように行った。すなわち、凍結乾燥した菌体40mgを
スクリューキャップ付き10ml試験管に入れ、クロロ
ホルム2mlと、3wt%硫酸−メタノール溶液2ml
を加え、栓をして100℃で3.5時間反応させた。反
応終了後、水1mlを加えて激しく10分間振とうした
後に、2層に分離した下層のクロロホルム層を取り出
し、このクロロホルム層をガスクロマトグラフィーにか
けて、ヒドロキシ酪酸メチルのピークの面積からPHB
量を計算して求めた。
G−11培地200mlに植菌し、2,000Lux、
30℃にて14日間培養を行った。さらに、この培養液
を30℃、1580G、10分間の条件で遠心し、培養
物から藍藻菌体を分離し、PHBの蓄積量を定量した。
また、分離した藍藻菌体をBG−11培地から硝酸ナト
リウムを除いた10mM酢酸入り培地に懸濁させ、2,
000Lux、30℃で、さらに14日培養を行った場
合の蓄積量も定量した。しかし、どちらの場合もPHB
の蓄積は認められなかった(乾燥菌体重量当たり0.0
01%未満)。PHBの定量は、実施例1と同様にして
行った。
酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻から、高収量でPH
Bを効率的に生産することが可能となった。
図である。
に必要な領域 No.9 :藍藻由来のプロモーター phb C:ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺
伝子 phb A:β−ケトチオラーゼ遺伝子 phb b:アセトアセチルCoAレダクターゼ遺伝子 CAT:クロラムフェニコール耐性遺伝子 Amp:アンピシリン耐性遺伝子 ORI:大腸菌で複製する為に必要な領域
Claims (4)
- 【請求項1】 β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルC
oAレダクターゼおよびポリヒドロキシブチレートポリ
メラーゼからなる酵素群をコードする構造遺伝子群を組
み込んだ組換えプラスミドを含有し、ポリ−β−ヒドロ
キシ酪酸生産能を有する遺伝子組換え藍藻シスココッカ
ス種を酢酸を添加した培地で培養し、培養物からポリ−
β−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とするポリ−
β−ヒドロキシ酪酸の製造方法。 - 【請求項2】 前記組換えプラスミドが藍藻での複製に
必要な領域を持ち、藍藻由来のプロモーター活性を有す
る配列の下流にアルカリゲネス・ユウトロファス起源の
β−ケトチオラーゼ、アセトアセチルCoAレダクター
ゼおよびポリヒドロキシブチレートポリメラーゼからな
る酵素群をコードする遺伝子群を組み込んだ組換えプラ
スミドである請求項1記載の製造方法。 - 【請求項3】 前記プラスミドがアンピシリンおよびク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するpAEN1プラ
スミドである請求項1記載の製造方法。 - 【請求項4】 前記形質転換藍藻シネココッカス種がF
ERM P−15189である請求項1記載の製造方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7318592A JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7318592A JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH09131182A JPH09131182A (ja) | 1997-05-20 |
JP2777598B2 true JP2777598B2 (ja) | 1998-07-16 |
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ID=18100866
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7318592A Expired - Lifetime JP2777598B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | ポリ−β−ヒドロキシ酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2777598B2 (ja) |
-
1995
- 1995-11-13 JP JP7318592A patent/JP2777598B2/ja not_active Expired - Lifetime
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Publication number | Publication date |
---|---|
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