JP2775346B2 - プローブ構成物および方法 - Google Patents

プローブ構成物および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 1.技術分野 本発明はプローブ構成物、および標的ポリヌクレオチ
ドにおいて選択されたシーケンスを検出するための該構
成物を使用する方法に関する。
2.参考文献 アプライド バイオシステムズ、DNA Sequencer User
Bulletin.＃11、Synthesis of Fluorescent Dye−Labe
led Oligonucleotides for Use as Pdrimers in Fluore
scence-Based DNA Sequencing（1989）． ブレイクら、Biochemistry,24:6132（1985a）． ブレイクら、Biochemistry,24:6139（1985b）． カルサースら、J.Am Chem Soc,113（6324）（199
1）． コーエン・エイ・エスら、Anal Chem,59（７）:1201
（1987）． コンネル・シーら、Biotechniques,5（342）（198
7）． クロード・エス・ティーら、J Am Chem Soc,113:6324
（1991）． ダック・ピイら、Biotechniques,9:142（1989）． フレーラーら、Nucleic Acids Res,16:4831（198
8）． ヘルマンス・ジェイ・ジェイ、J Polymer Sci,18（25
7）（1953）． ホランドら、Proc.Nat Acad Sci,USA,88:7276（199
1）． コーンバーグ・エイら、“DNA Replication",pp46-4
7,W.H.Freeman and Co.,New York（1992）． ランデグレン・ユーら、Science,241:1077（1988）． ミラー・ピー・エスら、Biochemistry,18:5134（197
9）． ミラー・ピー・エスら、J Biol Chem,255:6959（198
0）． ミラー・ピー・エスら、Bioconjugate Chem,1（187）
（1990）． ムリス・ケイら、U.S.Patent ＃4,683,202（1987）． ムラカミら、Biochemistry,24:4041（1985）． オリベラ・ビイ・エムら、Biopolymers,2（245）（19
64）． サイキー・アール・ケイら、Science,230:1350（198
5）． スターチャク・イー・ピーら、Organic Chem,52:4202
（1987）． テラベ・エスら、Anal Chem,57（４）:834（1985）． タウンズ・ジェイ・ケイら、Anal Chem,63:1126（199
1）． ホワイトリイ・エヌ・エムら、U.S.Patent ＃4,883,7
50（1989）． ウィンーディーンら、Clin Chem,37:1522（1991）． ウ・デイ・ワイら、Genomics,4:560（1989）． 3.発明の背景 種々のDNAハイブリッド形成技法は多数のシーケンス
領域を含む試料中の１個またはそれ以上の選択されたポ
リヌクレオチドシーケンスを検出するために利用でき
る。断片捕獲および標識化の簡単な方法では選択された
シーケンスを含む断片は固定化プローブにハイブリッド
形成することによって捕獲される。捕獲した断片は検出
できるレポーター部分を含む第２のプローブにハイブリ
ッド形成によって標識を付けることができる。
別の広く用いられる方法はサザンブロット法である。
この方法では、試料中のDNA断片の混合物をゲル電気泳
動によって分別し、次にニトロセルロースフィルターに
固定する。フィルターを１個またはそれ以上の標識プロ
ーブとハイブリッド形成条件下に反応させて、プローブ
シーケンスを含むバンドの存在を同定することができ
る。この方法は特に、一定のプローブシーケンスを含む
制限酵素DNA消化物中の断片を同定するため、および制
限断片長多型（RFLPS）を分析するために有用である。
ポリヌクレオチド試料中の一定の単数または複数のシ
ーケンスの存在を検出するための別のアプローチは、ポ
リメラーゼ鎖反応（ムリス、サイキ）によるシーケンス
の選択的増幅を含む。この方法では、選択されたシーケ
ンスの向かい合った末端部分に相補的なプライマーを使
用して熱循環と共に、プライマー開始複製の次の繰り返
しを進める。増幅されたシーケンスは種々の技法によっ
て容易に同定できる。このアプローチは特にポリヌクレ
オチド含有試料中の低コピーシーケンスの存在を検出す
るため、例えば体液試料中の病原体シーケンスを検出す
るために有用である。
さらに最近、プローブ連結反応方法によって既知の標
的シーケンスを同定する方法が報告された（ウ・ホワイ
トリイ、ランデグレン、ウィン−ディーン）。オリゴヌ
クレオチド連結反応アッセイ（OLA）として知られてい
る１つのアプローチでは、関係のある標的領域に広がる
２個のプローブまたはプローブエレメントが標的領域と
ハイブリッド形成される。プローブエレメントが、プロ
ーブエレメントの向かい合った端部にて隣接する標的塩
基と（塩基対を）マッチさせると、この２個のエレメン
トが連結反応によって、例えばリガーゼを用いて処理し
て結合することができる。連結したプローブエレメント
を次に分析して、標的シーケンスの存在を証明する。
このアプローチの改良では連結したプローブエレメン
トは１対の相補的プローブエレメントに対して鋳型とし
て働く。２対の相補的プローブエレメントの存在で変
性、再アニーリングおよび連結反応の連続したサイクル
を用いて、標的シーケンスを幾何学的に増幅し、極少量
の標的シーケンスを検出および／または増幅させる。こ
のアプローチはまたリガーゼ鎖反応（LCR）と呼ばれ
る。
標的ポリヌクレオチドにおいて多数のシーケンスの各
々の存在または不在を検出する際に有用な方法に対し
て、例えば遺伝スクリーニングの分野において、成長す
る必要がある。例えば、150ほどの異なる突然変異体が
嚢胞性繊維症と関係していた。この病気に対する遺伝的
素因についてスクリーニングする際に、“嚢胞性繊維
症”の陽性の同定を行うために、関係するゲノムDNA中
の可能な異なる遺伝子シーケンスの突然変異の全部を試
験することが最適である。理想的には１回のアッセイで
可能な突然変異の部位の全部の存在または不在について
試験したい。
これら上述の従来技術の方法は、便利な自動化した１
回のアッセイフォーマットで多数の選択されたシーケン
スを検出する際に使用するために容易に採用できない。
従って、ポリヌクレオチド試料中の多数の選択されたシ
ーケンスの存在または不在を検出するために迅速な１回
のアッセイフォーマットを提供することが望ましい。
他の技術領域では、DNAの塩基配列決定の処理量と自
動化の程度を向上させる試みによりキャピラリー電気泳
動を使用する配列決定のアプローチの開発に導かれた、
例えばファングら、Anal.Chem.,64巻、2149-2154頁（19
92）；スウェルドロウら、Nucleic Acids Research,18
巻、1415-1419頁（1920）等。これらのアプローチを広
く応用するための主な障害は、キャピラリーの分離媒体
にゲルを使用する必要があることである。これは非常に
時間を要し、信頼できる便利な配列決定のために十分に
均一な品質をもつようにキャピラリー中にゲルを充填お
よび／または形成することが難しい。診断に応用するた
め、あるいはゲノム分析のための高速DNA塩基配列決定
は、ゲル分離媒体に関連する時間や品質コントロールの
問題はなくキャピラリーに容易に充填できる篩分けしな
い液体媒体中で電気泳動により大きさが異なるポリヌク
レオチドを分離することができる手段が入手できるなら
ば、大きく前進するだろう。
4.発明の概要 本発明は結合ポリマーの電荷／並進摩擦抵抗の割合を
変えるための一般的方法にあり、これにより他の状態で
は電荷／並進摩擦抵抗の割合が実質的に等しい結合ポリ
マーを篩分けしない液体媒体で電気泳動により分離する
ことができる。通常結合ポリマーはポリヌクレオチドま
たはその類似体である。好ましくは、結合ポリマーの電
荷／並進摩擦抵抗は、電荷／並進摩擦抵抗がこの結合ポ
リマーのものとは異なるポリマー鎖を結合ポリマーに結
合させて変えられる。本発明によれば、異なる種類の同
じ大きさの結合ポリマーを、異なるポリマー鎖を各種類
の結合ポリマーに結合させて分離することができ、各種
類の得られた共役物は電荷／並進摩擦抵抗が独特の比で
ある。逆に言えば、異なる大きさの結合ポリマーは篩分
けしていない液体媒体中で実質的に同じポリマー鎖を各
大きさの種類の結合ポリマーに結合させて電気泳動によ
り分離することができ、各種類の得られた共役体は篩分
けしていない液体媒体中で独特の比の電荷／並進摩擦抵
抗を有する。後者の例は特にDNA塩基配列決定に応用で
きる。
本発明は、１面では、篩分けしていない媒体中で異な
るシーケンスのポリヌクレオチドを電気泳動により識別
する方法を含む。本方法を実施する際に、（ｉ）検出で
きるレポーター標識および（ii）各異なるシーケンスの
ポリヌクレオチドに電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を分
与する結合ポリマー鎖を含む、１またはそれ以上の異な
るシーケンスのポリヌクレオチドを形成する。形成され
る異なるシーケンスのポリヌクレオチドは篩分けしてい
ないマトリックス中でキャピラリー電気泳動によって分
別され、それらの観察された電気泳動移動率に従って検
出される。
この方法に使用するポリマー鎖は実質的に非荷電の水
溶性鎖、例えば異なるシーケンス結合ポリマーに結合し
た鎖が異なる数のポリマー単位を有する、ポリエチレン
オキシド（PEO）単位から成る鎖またはポリペプチド鎖
であってもよい。また、荷電または非荷電の連結基によ
って連結した多数のサブユニットの単位からなるポリマ
ーも含まれる。
一般的な具体例では、本方法は核酸の塩基配列決定を
行うために使用され、普通の５′末端をもつ標識ポリヌ
クレオチドの混合物を大きさによって電気泳動で分離す
る。好ましくは、同じポリマー鎖は標識ポリヌクレオチ
ドと合わせて、次にキャピラリー電気泳動によって分離
される共役体を形成する。以下に詳細に述べるように、
この具体例に関連した構成物は結合したポリマー鎖をも
つプライマーを含む。１の具体例では、ポリヌクレオチ
ドはスペクトルにより解像できる染料を用いて、共役的
に標識を付けたジデオキシヌクレオチドをもつ３′末端
で終わっており、各ポリヌクレオチドの３′末端ヌクレ
オチドを識別することができる。
２番目の一般的な具体例では、本方法は試料中の１ま
たはそれ以上のシーケンスを検出するために使用され
る。本方法を実施する際に、１またはそれ以上のシーケ
ンス特異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、
各プローブは標的ポリヌクレオチドにおける標的シーケ
ンス中の隣接領域に結合するために有効な第１と第２の
プローブオリゴヌクレオチドを有する。第１と第２のプ
ローブオリゴヌクレオチドの１個はポリマー鎖で誘導さ
れる。プローブは、各プローブ中の第１と第２のオリゴ
ヌクレオチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合す
るために有効な条件下に標的ポリヌクレオチドと反応す
る。次に標的ポリヌクレオチドに結合する第１と第２の
オリゴヌクレオチドは、それらの末端サブユニットが隣
接標的塩基と塩基対であるとき、オリゴヌクレオチドの
末端サブユニットを連結するために有効な条件下に連結
する。次にこのように形成した連結プローブは、続く電
気泳動分離と検出のため、標的ポリヌクレオチドから脱
離する。
好適例では、ポリマー鎖は各プローブの第１のプロー
ブのオリゴヌクレオチドに共役結合し、各第２のプロー
ブのオリゴヌクレオチドにレポーター標識を付ける。
２番目の好適例では、連結プローブはプローブ結合と
連結反応のサイクルを繰り返して増幅される。連結した
プローブは標的シーケンスに対して連結していないプロ
ーブを繰り返して結合し連結することによって線状に増
幅される。あるいは、連結したプローブは、共に選択さ
れた連結プローブに相補的であるシーケンスを作る第１
と第２のプローブオリゴヌクレオチドの第２の対の存在
で、プローブの結合と連結のサイクルを繰り返して、指
数関数的に増幅することができる。
別の具体例では、各プローブの第２のオリゴヌクレオ
チドは、（ｉ）会合した標的シーケンスの同じ部位にお
いて代替シーケンスに相補的であり、そして（ii）異な
る検出できるレポーターを用いて誘導される、２個の代
替シーケンスオリゴヌクレオチドを含む。この方法は標
的シーケンスの突然変異状態を、（ａ）そのプローブと
会合した標的シーケンスを同定する各プローブのサイン
電気泳動の移動度、および（ｂ）その標的シーケンスの
突然変異状態を同定するサインレポーター部分に従って
決定することができる。
３番目の一般的な具体例では、本方法は試料中の１ま
たはそれ以上の標的シーケンスを検出するためのもので
ある。この方法では、１またはそれ以上のシーケンス特
異的プローブを標的ポリヌクレオチドに添加し、各プロ
ーブは、それぞれ標的ポリヌクレオチド断片の相補的鎖
の向かい合った末端領域と混成するために有効な第１と
第２のシーケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチド
をもつ。各プローブ中の第１のプライマーオリゴヌクレ
オチドはプローブ特異的ポリマー鎖を用いて誘導され
る。プローブは標的ポリヌクレオチドに両方のプライマ
ーオリゴヌクレオチドを結合するために有効な条件下
に、標的ポリヌクレオチドと反応し、そして標的ポリヌ
クレオチド中の標的断片はプライマー開始ポリメラーゼ
鎖反応によって増幅される。次に標的ポリヌクレオチド
における選択されたシーケンスの存在は電気泳動分離お
よび増幅シーケンスの検出によって決定することができ
る。
１の具体例では、各第２のプライマーオリゴヌクレオ
チドにレポーター標識を付け、電気泳動により分離され
検出される異なるシーケンスのポリヌクレオチドは二重
鎖である。
増幅シーケンスにレポーター標識を付けるため、レポ
ーター標識を付けたヌクレオシドトリホスフェートの存
在で増幅を行うことができる。あるいは、増幅された標
的シーケンスに、一本鎖の形で、１またはそれ以上のレ
ポーター標識を付けたシーケンス特異的プローブを用い
てハイブリッド形成によって、または二本鎖の形で、臭
化エチジウムのようなレポーターを共役または非共役結
合によって標識付けすることができる。
４番目の一般的な具体例では、試料中の１またはそれ
以上の標的シーケンスの存在を検出するため、１または
それ以上のシーケンス特異的プローブを標的ポリヌクレ
オチドに添加し、各プローブは第１の一本鎖DNA断片、
および一本鎖RNAを含む第２の断片を含む。１の具体例
では、ポリマー鎖は第１の断片に結合し、検出できるレ
ポーター標識は第２の断片に結合する。プローブは、第
１と第２の断片をそれらの特異的標的シーケンスに結合
するために有効な条件下に標的ポリヌクレオチドと反応
させ、ハイブリッド形成プローブをRNA/DNA基質に特異
的なRNase酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いている
修飾標識プローブを形成する。次にプローブを電気泳動
分離のための標的ポリヌクレオチドから脱離する。
第２の具体例では、ポリマー鎖とレポーター標識を各
プローブ中の第１の断片に結合し、RNase酵素とハイブ
リッド形成プローブと反応し、第２の断片を欠く修飾標
識プローブを生成する。
酵素開裂を使用する他の具体例では、ポリマー鎖とレ
ポーター標識を各プローブの第１の断片の５′末端に隣
接する塩基に結合することができ、ハイブリッド形成プ
ローブを処理してプローブから標識塩基を酵素により開
裂し、特有の電荷／並進摩擦抵抗をもつ標識プローブを
形成する。
５番目の一般的な具体例では、試料中の１またはそれ
以上の標的シーケンスを検出するため、標的ポリヌクレ
オチドを固体支持体上で固定する。
１の具体例では、１またはそれ以上の異なるシーケン
スのプローブを標的ポリヌクレオチドと反応させ、そこ
では各プローブは（ｉ）検出できるレポーター標識およ
び（ii）各異なるシーケンスのプローブに電荷／並進摩
擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を含む。標
的ポリヌクレオチドをプローブとの反応前または後に固
体支持体上に固定することができる。固定標的ポリヌク
レオチドを洗浄して非特異的結合プローブを除去した
後、標的ポリヌクレオチドを変性して標的ポリヌクレオ
チドにハイブリッド形成したプローブを脱離する。次に
脱離プローブを電気泳動により分離し検出する。好まし
くは、プローブは実質的に同じ長さである。
標的ポリヌクレオチドにおける複数の異なるシーケン
スの１またはそれ以上を検出する際に使用するためのプ
ローブ構成物もまた本発明の１部を形成する。この構成
物は複数のシーケンス特異的プローブを含み、各々は
（ａ）選択された結合条件下に、標的シーケンスの１に
ポリマーを塩基特異的結合するために設計されたサブユ
ニットのプローブ特異的シーケンスをもつ結合ポリマ
ー、および（ｂ）結合ポリマーに結合し、結合ポリマー
の電荷／並進摩擦抵抗の比とは異なる比をもつポリマー
鎖によって特徴づけられる。
１の具体例では、さらに各シーケンス特異的プローブ
は第２の結合ポリマーを含み、そこではシーケンス特異
的プローブ中の前述の第１および第２の結合ポリマーが
塩基特異的方法で、選択された標的シーケンスの隣接し
た接触する領域に結合するために有効であり、シーケン
ス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき２個の結
合ポリマーが連結することができる。好ましくは第２の
結合ポリマーは検出できる標識を含み、第１の結合ポリ
マーに結合したポリマー鎖は各連結したプローブ対に、
電荷／並進摩擦抵抗の特有の合わさった比を分与する。
他の具体例では、さらに構成物中の各シーケンス特異
的プローブは第２の結合ポリマーを含み、そこではシー
ケンス特異的プローブ中の前述の第１および第２の結合
ポリマーが、選択された二重の標的シーケンスの向かい
合った鎖の向かい合った末端領域に塩基特異的方法で結
合するために有効であり、各鎖の標的領域のプライマー
開始重合を可能にする。好ましくは第２の結合ポリマー
は検出できる標識を含み、第１の結合ポリマーに結合し
たポリマー鎖は各連結プローブ対に、電荷／並進摩擦抵
抗の特有の合わさった比を分与する。
他の具体例では、各シーケンス特異的プローブは結合
ポリマー、結合ポリマーに結合したポリマー鎖、および
結合ポリマーに結合したレポーターを含む。
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、次の本
発明の詳細な説明を添付図面と共に読むとき一層明らか
になるだろう。
図面の簡単な説明 図1A-1Dは本発明の方法の種々の具体例を行う際に使
用される３つの一般的なタイプのプローブおよびプロー
ブエレメントを示す； 図２は選択された数のヘキサポリエチレンオキシド
（HEO）ユニットを有するポリエチレンオキシドポリマ
ー鎖の合成方法を示す； 図３はHEOユニットがビスウレタントリル連鎖によっ
て連結されているポリエチレングリコールポリマー鎖の
合成方法を示す； 図4Aおよび4Bは図２および３のポリマー鎖をポリヌク
レオチドの５′末端に、それぞれ結合するためのカップ
リング反応を示す； 図５は、ホスホジエステル連鎖によって、続いて蛍光
標識を付けて、HEOユニットを連続してオリゴヌクレオ
チドに付加するための反応行程を示す； 図６はヘキサエチレンオキシド（HEO）ユニットの１
（ピーク２）、２（ピーク３）、および４（ピーク４）
ユニットを用いて誘導化する前（ピーク１）および後の
24塩基オリゴヌクレオチドの、篩分けしていない媒体中
のキャピラリー電気泳動による電気泳動図であり； 図7A-7Dは標的シーケンスが塩基適合プローブエレメ
ントの連結（OLA）によって検出される本発明の具体例
を示す； 図８は図７の方法でみられる理想化された電気泳動パ
ターンを示し、標的ポリヌクレオチドは２個の異なる標
的領域に突然変異体を含む； 図９は、ポリペプチドポリマー鎖をもち、標的分子上
の隣接プローブの連結反応によって形成された標識プロ
ーブの、篩分けしていない媒体中の、キャピラリー電気
泳動による、電気泳動図であり； 図10A-10Cは本発明の具体例を示し、突然変異体は本
発明によるリガーゼ鎖反応（LCR）により塩基適合プロ
ーブの連結反応によって検出される； 図11は、ポリエチレンオキシドポリマー鎖をもち、LC
R反応によって形成された標識プローブの、篩分けして
いないマトリックス中のキャピラリー電気泳動による、
電気泳動図であり； 図12A-12Bは本発明の第２の具体例における工程を示
し、二重鎖標識プローブを生成するためプライマー開始
増幅を用いる； 図13Aおよび13Bは図12の方法において形成された増幅
標的シーケンスに標識を付けるための代替方法を示す； 図14Aおよび14Bは本発明の第３の一般的具体例の工程
を示し、標的結合プローブにレポーター標識ヌクレオチ
ド付加を用いて、標識プローブ種を形成する； 図15Aおよび15Bは本発明の方法により、既知のシーケ
ンスポリヌクレオチド断片を変更する他の方法を示す； 図16A-16Cは本発明の方法により、修飾された標識プ
ローブを形成するための代替方法を示す；そして 図17Aおよび17Bは、本発明の他の具体例により、修飾
された標識プローブを形成するための代替方法を示す； 図18A-18Bは、本発明によるプローブ連結方法の具体
例を示す； 図19Aおよび19Bは、本発明による修飾された標識プロ
ーブを形成するための他の方法を示す； 図20A-20Cは、本発明の他の具体例を示し、プローブ
は固体支持体に固定化された標的ポリヌクレオチドに対
してハイブリッド形成される。
発明の詳細な説明 I.定義 “標的ポリヌクレオチド”は、線状または環状一本鎖
または二本鎖RNAまたはDNA分子を含む、１個またはそれ
以上の核酸分子を含むことができる。
“標的核酸シーケンス”または“標的シーケンス”
は、標的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの隣接する
シーケンスを意味する。このようなシーケンスの“複
数”は１またはそれ以上のヌクレオチド部位につき塩基
シーケンスが異なる２またはそれ以上の核酸シーケンス
を含む。
“シーケンス特有結合ポリマー”は１個の標的核酸ま
たは塩基シーケンス特異性をもつシーケンスサブセット
シーケンスに結合するために有効なポリマーを意味し、
選択されたハイブリッド形成条件下に、試験試料中の所
定の複数のシーケンスにおける任意の他の標的シーケン
スまたはシーケンスサブセットに対して、実質的に一層
低い結合親和性を有する。
“異なるシーケンスのポリヌクレオチド”は異なる塩
基シーケンスおよび／または異なる数の塩基を含むポリ
ヌクレオチドを意味する。
ポリマーの“電荷”は所定のpHでのポリマーの全体の
正味の静電気電荷であり； ポリマーの“並進摩擦抵抗”は限定された篩分けして
いない液体媒体を通って電気泳動により移動するときの
ポリマーの摩擦抵抗の測定値である。
“篩分けしていないマトリックス”は、相互に連結し
たポリマー分子のメッシュまたは網目またはマトリック
スを実質的に含まない液体媒体を意味する。
プローブの“電荷／並進摩擦抵抗の特有の割合”は、
篩分けしていない媒体中の特有の、すなわち、独特の、
電気泳動移動によって証明される。
“キャピラリィ電気泳動”はキャピラリィチューブま
たはキャピラリィプレートにおける電気泳動を意味し、
分離カラムの直径または分離プレートの厚さは約25-500
μｍであり、分離媒体を通して有効な熱放散と共に結果
的に媒体内の熱対流を下げることができる。
“標識プローブ”は、シーケンス特異的方法で、結合
ポリマーに電荷／並進摩擦抵抗の特有の割合を分与する
ポリマー鎖を、選択された標的シーケンスに結合するた
めに有効な結合ポリマー、および検出できるレポーター
または標識から成るプローブを意味する。
“レポーター”または“標識”または“レポーター標
識”は、レポーター標識抗体またはアビジンのような、
検出できる抗リガンドに特異的に高い親和力で結合でき
る、抗原またはビオチンのような、適当な検出器、また
はリガンドによって標識プローブを直接検出できる、蛍
光団、発光団、ラジオアイソトープ、またはスピン標識
を指す。
ここで用いられる語“鎖終始ヌクレオチド”は、核酸
ポリメラーゼによって成長するDNA鎖に組み込まれた後
に、さらにポリヌクレオチド鎖が伸長または拡大するこ
とを妨げるヌクレオチドまたはその類似体を意味する。
通常、このようなヌクレオチドの鎖終始の性質は糖部分
の３′ヒドロキシル基の不在または修飾による。好まし
くは鎖終始ヌクレオチドは２′,3′−ジデオキシヌクレ
オチドである。
ここで使用されるように、１組の染料に関して“スペ
クトルにより分解できる”の語は、染料の蛍光放出バン
ドが充分にはっきりしている、すなわち充分にオーバー
ラップしていないことを意味し、各染料が結合している
標的物質、例えばポリヌクレオチドが、標準光検出装置
により各染料によって生じた蛍光信号を基礎として識別
でき、例えば、米国特許4,230,558、4,811,218等、また
はフィーレスら、pgs.21-76,in Flow Cytometry:Instru
mentation and DataAnalysis（Academic Press.New Yor
k.1985）に記載されている装置によって例示されるよう
なバンドパスフィルターおよび光電子増倍管の装置を用
いる。
ここで用いられる語“ヌクレオチドトリホスフェート
前駆体”は、デオキシアデノシントリホスフェート（AT
P）、デオキシシチジントリホスフェート（CTP）、デオ
キシグアノシントリホスフェート（GTP）、およびチミ
ジントリホスフェート（TTP）、またはその類似体、例
えばデオキシイノシントリホスフェート（ITP）、７−
デアカデオキシグアノシントリホスフェート等を意味す
る。
II.プローブ構成物 このセクションでは本発明に使用するために設計され
たプローブの幾つかの具体例を述べる。代表的な場合
は、プローブは、セクションIIIに記載した方法に従っ
て、複数の標的シーケンスの１またはそれ以上を検出す
るために使用される複数のプローブを含むプローブ構成
物の１部である。図1Bおよび1Cを参照して記載したプロ
ーブは本発明に従ってプローブ構成物を作成するプロー
ブまたはプローブエレメントを代表する。
A.プローブ構造 図1Aは本発明方法の１つの具体例で使用される複数の
プローブの１つであるプローブ20を示す。以下に示すよ
うに、プローブの20のようなプローブを含むプローブ構
成物は、図1Aの点線26によって示される標的ポリヌクレ
オチドの領域24のシーケンスのような、標的シーケンス
を同定する“プローブ伸長”方法で、または、このよう
な標的シーケンスを同定するための“プローブ捕獲”方
法で使用するために設計される。両方法は以下のセクシ
ョンIVで述べる。
プローブ20は、必須の塩基対特異性のために、好まし
くは少なくとも10-20塩基を含むオリゴヌクレオチド結
合ポリマー22を含み、一本鎖形態と同様に、標的ポリヌ
クレオチド26において領域24に相補的である塩基シーケ
ンスを有する。この構成物の他のプローブは標的ポリヌ
クレオチドにおいて既知のシーケンスの他の標的領域に
対してシーケンス特異性をもつ。好適例では、異なるシ
ーケンスプローブ全部の結合ポリマーはほぼ同じ長さで
あり、実質的に同じハイブリッド形成反応の動態及び熱
力学（Ｔm）をもつ標的ポリヌクレオチドに異なるプロ
ーブのハリブリッド形成を可能にする。
チオホスホジエステル連鎖をもつデオキシヌクレオチ
ドのようなポリヌクレオチドの類似体であり、そして一
本鎖または二本鎖標的ポリヌクレオチドに塩基特異的に
結合できる他の結合ポリマーもまた予想される。荷電し
ていないがデオキシリボヌクレオチドサブユニット間の
立体異性メチルホスホネート連鎖が報告された（ミラ
ー、1979、1980、1990、ムラカミ、ブレイク、1985a,19
85b）。また種々の類似の荷電していないホスホルアミ
デート結合オリゴヌクレオチド類似体も報告された（フ
レーラー）。また、アキラルな荷電していないインター
サブユニット連鎖（スタチャク）をもつデオキシリボヌ
クレオシド類似体およびアキラルなインターサブユニッ
ト連鎖をもつ荷電していないモルホリノに基づくポリマ
ーが報告された（米国特許第5,034,506号）。このよう
な結合ポリマーはワトソン−クリック型塩基対によって
一本鎖標的分子にシーケンス特異的に結合するために、
または二本鎖核酸の主要溝中のフーグスディーン型結合
部位によって二本鎖標的ポリヌクレオチドにシーケンス
特異的に結合するために設計することができる（コンバ
ーグ）。
プローブ中の結合ポリマーは、上記のように、所定の
割合の電荷／並進摩擦抵抗を有し、この割合はプローブ
構成物を作る複数のプローブの異なるシーケンス結合ポ
リマー全部に対して実質的に同じであることができる。
これは篩分けしていない媒体において電気泳動によって
異なる大きさ（サブユニット数）およびシーケンスを有
するオリゴヌクレオチドの似ている移動速度によって証
明される。
プローブ20中のオリゴヌクレオチド結合ポリマーは、
その５′末端で、Ｎサブユニット28から成るポリマー鎖
27で誘導化される。このユニットはポリマーのサブユニ
ットまたはサブユニット群であることができる。例示的
なポリマー鎖はポリエチレンオキシド、ポリグリコール
酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリウレタ
ン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシ
ド、およびそれらのブロックポリマーから形成され、荷
電または非荷電連結基によって連結された多数のサブユ
ニットのユニットから成るポリマーを含む。
本発明の重要な特徴によれば、ポリマー鎖は結合ポリ
マーのそれとは異なる電荷／並進摩擦抵抗の比を有す
る。以下のセクションIVに詳述した本発明の方法におい
て、プローブを処理してシークエンス特異的方法で標的
シークエンスに結合したこれらのプローブを選択的に修
飾し、以下のセクションIIIに述べるように、篩分けし
ていないマトリックス中特有の電気泳動の移動によって
証拠となるように、電荷／並進摩擦係数の特徴的な比を
もつ修飾した標識プローブを生成する。以下にのべるよ
うに、電荷／並進摩擦係数の特徴的な比はポリマー鎖の
長さ（サブユニットの数）の差によって概して達成され
る。しかし、ポリマー鎖電荷の差はまた、結合するポリ
マー長の差であると考えられる。
さらに一般的に、ポリマー鎖を形成するポリマーはホ
モポリマー、ランダムポリマー、またはブロックコポリ
マーであり、ポリマーは直線、くし状、分枝状または樹
枝状構造をもつことができる。さらに、本発明は単一点
で会合した結合ポリマーに付着した一本ポリマーに関し
てここでは述べているが、本発明はまた１個以上のポリ
マー鎖エレメントによって誘導される結合ポリマーを企
図しており、そこではエレメントはポリマー鎖を集合的
に形成する。
好ましいポリマー鎖は親水性、またはオリゴヌクレオ
チド結合ポリマーに結合するときプローブが容易に水性
媒体に溶解することを保証するために少なくとも十分に
親水性であるものである。またポリマー鎖はハイブリッ
ド形成反応の影響を受けるべきではない。結合ポリマー
が、オリゴヌクレオチドの場合のように、大きく荷電し
ている場合、ポリマー鎖は荷電せず、または結合ポリマ
ーのそれよりも実質的に小さい電荷／サブユニット密度
を有する。
選択された長さのポリマー鎖を、単独にまたは単一プ
ローブ固相合成方法の一部として、合成する方法は、ポ
リマー鎖の好ましい性質と共に、以下に記載される。
以下に述べる好ましい具体例のひとつでは、ポリマー
鎖はヘキサエチレンオキシド（HEO）ユニットから形成
され、HEOユニットは両端を突き合わせて結合し、図２
に示したように、エチレンオキシドサブユニットのこわ
れていない鎖を形成するか、以下に述べるように、また
は荷電（図５）または荷電していない（図３）連鎖によ
って結合される。以下に例示する他の具体例はN12量体P
EOユニットから成る鎖、およびＮテトラペプチドユニッ
トから成る鎖を含む。
B.プローブ構成物 このセクションは、本発明方法の特定の具体例に有用
であり、それら自身、単一のプローブまたはプローブセ
ットとして、本発明による構成物を形成する３個の追加
のプローブまたはプローブエレメント対を記載する。
図1Bは一本鎖標的ポリヌクレオチド23の領域にシーケ
ンス特異的に結合するために設計されたポリマー21を結
合するシーケンス特異的オリゴヌクレオチドを有するプ
ローブ25を示す。これによって結合ポリマーは、一定の
ハイブリッド形成条件下に、それぞれ選ばれた一本鎖ま
たは二本鎖標的シーケンスと安定な二重または三重ハイ
ブリッドを形成するために有効なサブユニットのシーケ
ンスを含むことを意味する。以下の図17を参照して示さ
れるように、結合ポリマーはDNAとRNA断片の両方を含
む。Ｎユニット33から成るポリマー鎖31はその５′末端
で結合ポリマーに結合し、下記のように、特有の電荷／
並進摩擦抵抗の比を結合ポリマーに与える。結合ポリマ
ーの３′末端はレポーターまたはタグ39を用いて誘導さ
れる。ある面では、本発明は複数のこのようなプローブ
を含む構成物を含み、各々は関係する異なる標的領域に
対して標的となる異なるシーケンス結合ポリマーを有
し、各々は会合したポリマー鎖によって与えられる特有
の電荷／並進摩擦抵抗の比を有する。
図1Cは、第１および第２のプローブエレメント34、36
から成るプローブ32を示し、特に点線40によって示した
標的ポリヌクレオチドの１またはそれ以上の各領域、例
えば領域38において選択シーケンスを検出するために設
計される。
具体例で示すと、関係するシーケンスが突然変異、例
えば点突然変異、または１または少数の塩基を含む追加
または削除型突然変異を含むことができる。代表的な例
では、突然変異の期待部位は既知のシーケンス標的領域
の中心点付近であり、その領域を２つの副領域に分け
る。例示すると、突然変異が点突然変異であり、突然変
異の期待される部位が２個の隣接塩基Ｔ−Ｇの１個にあ
り、Ｔ塩基は副領域38aの５′末端を画定し、隣接Ｇ塩
基は隣接副領域38bの３′末端を画定する。以下に示す
ように、プローブエレメントはまた種々の他のタイプの
標的シーケンス、例えば病原体に関連したシーケンスま
たは特定のゲノム遺伝子シーケンスを検出するために有
用である。
プローブ構成物において第１のプローブエレメントの
代表であるプローブエレメント32は、必須の塩基対特異
性のため、好ましくは少なくとも10-20塩基を含むポリ
マーエレメント42を結合するオリゴヌクレオチドから成
り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38aに相補的であ
る塩基シーケンスを有する。特に、３′末端ヌクレオチ
ド塩基は対応する副領域、例えば図に示したA:Tマッチ
ングの５′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩基
に対して選択される。第１のプローブエレメントのオリ
ゴヌクレオチドは、その５′末端にて、ユニット28から
形成された鎖27に関して実質的に述べたように、好まし
くはユニット45を繰り返すＮから成るポリマー鎖44と共
に、誘導される。プローブ20に関して述べたように、第
１のプローブエレメントのポリマー鎖は、電荷／並進摩
擦抵抗の比を与え、これは構成物中の各シーケンス特異
的プローブエレメントに対して特有である。
プローブ構成物において第２のプローブエレメントの
代表でもある第２のプローブエレメント36は、必須の塩
基対特異性のため、好ましくは少なくとも10-20塩基を
含むオリゴヌクレオチドポリマー結合エレメント46から
成り、標的ポリヌクレオチド中の副領域38bに相補的で
ある塩基シーケンスを有する。特に、５′末端ヌクレオ
チド塩基は対応する副領域、例えば図に示したC:Gマッ
チングの３′末端ヌクレオチド塩基に対になっている塩
基に対して選択される。
図1Cに示すように、２個のプローブエレメントがそれ
らの会合標的領域に対し共にハイブリッド形成すると
き、２個のプローブにおける対面する末端サブユニッ
ト、この実施例では対面するＡおよびＣの塩基は、隣接
する塩基、例えば標的ポリヌクレオチドにおける隣接す
るＴおよびＧ塩基とマッチする。この状態では、２個の
プローブエレメントはそれらの対面する末端で連結する
ことができ、以下に述べる本発明の１具体例に従って、
両方のオリゴヌクレオチドエレメントを含む連結プロー
ブを形成し、シーケンス特異的ポリマー鎖および結合オ
リゴヌクレオチドの反対側末端に結合したレポーターを
有する。この２個のプローブにおける隣接塩基の状態
が、標的領域に対しプローブをハイブリッド形成した
後、エキソヌクレアーゼ処理によってオーバーラップす
るデオキシリボヌクレオチドを除去することにより、生
成されることもできることが認められるだろう。
第２のプローブエレメントは、好ましくは、例えばそ
の３′末端にて、図1Cにおいて、48にて示されるレポー
ターＦのような検出できるレポーターを用いて標識を付
ける。好ましくは、このレポーターは、光学レポータ
ー、例えば光学検出装置によって容易に検出できる蛍光
分子である。異なる励起波長で検出できる多くの標準蛍
光標識、例えばFAM、JOE、TAMRA、およびROX、およびオ
リゴヌクレオチドにレポーターを取り付ける方法が報告
されている（Applid Biosystems,Connell）。
１つの具体例では、各プローブは２個の第２のプロー
ブエレメントを含み、１個のエレメントは標的シーケン
スにおいてワイルドタイプの塩基と塩基対になることが
できる末端サブユニット塩基シーケンスを有し、第２の
エレメントはシーケンス中の予想される突然変異と塩基
対となる末端サブユニット塩基を有する。この２個の代
替エレメントは識別できるレポーターを用いて標識を付
け、以下のセクションIIIに記載するように、各標的領
域中の野生型または突然変異シーケンスの明確な同定を
可能にする。あるいは２個の第２のプローブエレメント
（例えばオリゴヌクレオチド）は同じレポーターを有
し、その第１のプローブエレメントは２個のプローブエ
レメントに対し異なる電荷／並進摩擦抵抗の比を与える
ポリマー鎖をもち、２個の標的領域を電気泳動の移動度
に基づき識別することができる。
図1Dは本発明方法の他の具体例で使用するために設計
された構成物中のプローブを代表するプローブ50を示
す。プローブは、第１と第２のプライマーエレメント5
2、54から成り、プライマーエレメントシーケンスによ
って結合される二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける領
域の存在または不在を検出するために特に設計されてい
る。図1Dに示す例において、プライマーシーケンスによ
って結合した領域は56で示され、二本鎖標的ポリヌクレ
オチドの二本の鎖は点線58、60で示される。
プローブ構成物において第１のプライマーエレメント
を代表するプライマーエレメント52は、必須の塩基対特
異性に対し、少なくとも７−15塩基を好ましくは含むオ
リゴヌクレオチドプライマーエレメント62から成り、そ
して２個の標的鎖の１個、この場合は、鎖58における領
域56の３′末端部位に相補的である塩基シーケンスをも
つ。
オリゴヌクレオチドプライマーは、その５′末端で、
ユニット28から形成される鎖27に関して実質的に記載し
たように、好ましくはユニット66を繰り返すＮから成る
ポリマー鎖64を用いて誘導される。プローブ20に関して
述べたように、第１のプローブエレメントのポリマー鎖
は構成物中の各シーケンスに特異的なプライマーエレメ
ントに特有な電荷／並進摩擦抵抗の比を与える。
第２のプライマーエレメント54は、これもプローブ構
成物中の第２のプローブエレメントを代表し、必須の塩
基対特異性に対し、やはり少なくとも７−15塩基対を好
ましくは含むオリゴヌクレオチドプライマーエレメント
68から成り、そして反対側の鎖−−この場合には、領域
56を形成する二重のDNAの鎖60の５′末端部位に相補的
である塩基シーケンスをもつ。第２のプライマーエレメ
ントは、上述のように、検出できるレポーターを用いて
標識を付ける。あるいは、標識付けは、以下に述べるよ
うに、増幅した標識シーケンスを形成した後に行うこと
ができる。
C.プローブ調製 プローブにおけるポリマー鎖を調製する方法は一般に
既知のポリマーサブユニット合成方法に従う。選択され
た長さのPEO（ポリエチレンオキシド）鎖の形成方法は
以下に示され、そして実施例１−４において詳述する。
これらの方法は、一定の大きさのマルチサブユニットポ
リマーユニットを直接または荷電したまたは荷電してい
ない連結基を介して、互いにカップリングすることを含
み、広範囲のポリマー、例えばポリエチレンオキシド、
ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリウレタンポリマー、
オリゴ糖に一般に応用できる。
ポリマーユニットカップリング方法は、選択されか長
さのコポリマー、例えばポリプロピレンユニットと交替
するポリエチレンオキシドユニットのコポリマーを合成
するために適当である。選択された長さのポリペプチド
とアミノ酸構成物ホモポリマーまたは混合ポリマーのい
ずれかは、実施例５に略述したように、標準の固相方法
によって合成することができる。
図２は選択された数のHEOユニットを有するPEO鎖を調
製するための１方法を示す。図に示すように、HEO（ヘ
キサチレンオキシド）はジメトキシトリチル（DMT）で
一端が保護され、その他端でメタンスルホネートで活性
化する。活性化したHEOは次にDMT−保護HEOダイマーを
形成するため、第２のDMT保護HEO基と反応することがで
きる。このユニット付加は連続して所望のPEO鎖長にな
る迄行われる。この方法の詳細は実施例１に与えられ
る。
実施例２は荷電していないビスウレタントリル基によ
ってHEOユニットを連続してカップリングすることを記
載する。簡単に述べると、図３に関して、HEOは穏和な
条件でトリレン−2,4−ジイソシアネートの２ユニット
と反応し、活性化したHEOは次にHEOと両端でカップリン
グしてHEOのビスウレタントリル結合トリマーを形成す
る。
ポリマー鎖とオリゴヌクレオチドのカップリングは従
来のホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成方法の
拡充によって、または他の標準カップリング方法によっ
て行うことができる。図4Aは、ホスホルアミダイトカッ
プリングによって、固体支持体上に形成されたオリゴヌ
クレオチドの５′末端にPEOポリマー鎖をカップリング
することを示す。図4Bは、やはりホスホルアミダイトカ
ップリングによって、上記ビスウレタントリル結合ポリ
マー鎖を固体支持体上でオリゴヌクレオチドにカップリ
ングすることを示す。２つのカップリング方法の詳細
は、それぞれ、実施例3Bおよび3Cに示される。
また、ポリマー鎖は、標準固相合成方法を用いて、ポ
リマー鎖ユニットをオリゴヌクレオチドに段階的に付加
することによって、オリゴヌクレオチド（または他のシ
ーケンス特異的結合ポリマー）に作り上げることができ
る。図５は固体支持体上に固相合成によって形成された
オリゴヌクレオチドにHEOユニットを段階的に付加する
ことを示す。本質的に、この方法は、段階的にヌクレオ
チド付加を行う際に使用される同じホスホルアミダイト
活性化および脱保護工程に従う。詳細は実施例４に示さ
れる。実施例５はオリゴヌクレオチドに選択された長さ
のポリペプチド鎖を形成するための同様の方法を記載し
ている。
上記のように、ポリマー鎖はそのプローブに、各々異
なるシーケンスプローブに特有な電荷／並進摩擦抵抗の
比を与える。ポリマー鎖が誘導結合ポリマーの移動を行
う寄与は一般にポリマー鎖のサブユニット長に依存す
る。しかし、荷電基をポリマー鎖、例えば図５に示した
PEO鎖中の荷電した連結基、またはポリペプチド鎖中の
荷電したアミノ酸に付加することも使用され、プローブ
における選択されか電荷／並進摩擦抵抗特性を達成する
ことができる。
III.篩分けしていない媒体中の標識プローブとオリゴヌ
クレオチドの電気泳動による分離 本発明の重要な特徴によれば、それ自体が篩分けして
いない媒体中で電気泳動によって分離することができな
い異なる長さおよび／または異なるシーケンス結合のポ
リマーを有するプローブは、僅かに異なる大きさおよび
／または電荷の差をもつポリマー鎖を用いる誘導化によ
って精細に分離することができる。
次の説明について、“プローブ”の語は、異なるシー
ケンスのポリヌクレオチドを含むと解釈できると理解さ
れる。
ひとつの好ましいアプローチでは、上記のように、プ
ローブは篩分けしていないマトリックスにおいてキャピ
ラリー電気泳動によって分別される。キャピラリー電気
泳動の利点は、十分な熱放散が媒体内の熱対流を減らし
または実質的に除去し、従って電気泳動によって得られ
る分解能を改善することである。
キャピラリー電気泳動（CE）のような電気泳動は標準
方法によって行われ、電気泳動媒体それ自体が篩分けマ
トリックスを含まないことを除いて、従来のCE装置を用
いる。実施例６に記載したCEプロトコルは例示である。
図６は誘導化されていない（ピーク１）、または1,2,
または４ホスホネート連結HEOサブユニットをもつ５′
末端で誘導化されている（それぞれピーク2,3,および
４）螢光標識24塩基オリゴヌクレオチドプローブの電気
泳動図である。プローブは実施例４に記載するように調
製し、キャピラリー電気泳動は実施例６に詳述した条件
下に緩衝液媒体中で行った。
図に見られるように、プローブは、20.397分、20.612
分、20.994分、および21.558分の移動時間で、４本のピ
ークに良く分解されている。ポリマー鎖の不在では、４
個のオリゴヌクレオチドプローブは同じかまたは実質的
に同じ電気泳動移動度で移動する、すなわち、単一の分
解しないピークで動く傾向がある。（これはオリゴヌク
レオチドが同じかまたは異なる大きさであるか否かが判
る（オリベラ、ヘルマンズ）。） 荷電した結合ポリマー、例えばオリゴヌクレオチド
を、篩分けマトリックスの不在で電気泳動によって分別
する能力は、多くの利点を与える。ひとつの利点はすべ
てが殆ど同じ大きさの荷電したポリマーを分別する能力
である。以下のセキションIVにおいて高く評価されるよ
うに、この特徴はプローブ構成物中のプローブが似てい
る大きさ、従って標的ポリヌクレオチドと似たハイブリ
ッド形成動力学と熱力学（Ｔm）をもつことを可能にす
る。他の利点は電気泳動、特にポリマーを篩分けするCE
が非常に便利であり、特にキャピラリーチューブ中の架
橋ゲルを形成し除去する問題が避けられる。
IV.アッセイ方法 １つの面では、本発明の方法は標的ポリヌクレオチド
において１またはそれ以上異なるシーケンス領域を検出
するために設計される。本方法は、上記タイプの１また
はそれ以上のシーケンス特異的プローブを、標的ポリヌ
クレオチドに最初に添加することを含む。このプローブ
は、標的ポリヌクレオチドにおいて対応するシーケンス
にプローブのシーケンス特異的結合に有利である条件下
に標的ポリヌクレオチドを用いて反応させる。上述のよ
うに、この結合は代表的にはワトソン−クリック型塩基
対による標的とプローブにおける相補的塩基シーケンス
のハイブリッド形成を含む。
あるいは、一本鎖プローブおよび二本鎖標的シーケン
スとの間の塩基特異的水素結合対は、フーグスティーン
型塩基対を介して、代表的には重複分子の主な慣例にお
いて（コーンバーグ）また予期される。
標的ポリヌクレオチドへのプローブ結合に続いて、プ
ローブはシーケンス特異的方法において標的シーケンス
に結合したプローブを選択的に修飾し、修飾された標識
プローブを生成するように処理され、各々は特徴的な電
荷／並進摩擦抵抗比をもつ。この修飾工程は、以下のサ
ブセクションＡ−Ｆに記載されるように、期待される突
然変異位置の全域で、酵素連結反応のような連結反応、
選択された標識シーケンスのプライマー開始増幅、標識
を付けたヌクレオチドトリホスフェート分子の存在での
プローブ伸長、標的領域に結合したプローブの酵素分
解、または固定化標的上のプローブ捕獲によって、プロ
ーブエレメントを結合することを含むことができる。標
的結合プローブの選択的修飾によって生成された標識プ
ローブは、上記セクションIIIに述べたように、篩分け
していない媒体中の電気泳動によって分別される。この
修飾された標識プローブの移動速度を使用して標識プロ
ーブと会合した特定のシーケンスを同定し、標的ポリヌ
クレオチドにおける特定のシーケンスの存在を同定する
ことができる。
A.プローブ連結方法 この具体例は１またはそれ以上の領域の標的ポリヌク
レオチドにおいて特定のシーケンスを特に検出するため
に設計される。標的ポリヌクレオチドは、二本鎖または
一本鎖のポリヌクレオチドの単一分子、例えばゲノムDN
A、cDNAまたはRNAを含むウィルスゲノム、またはポリヌ
クレオチドフラグメント、例えばゲノムDNAフラグメン
トまたは感染試料からのウィルスおよび体細胞のポリヌ
クレオチドフラグメントの混合物であってもよい。代表
的には、本具体例において、標的ポリヌクレオチドは例
えば熱により変性してプローブ結合ポリマーとハイブリ
ッド形成できる一本鎖標的分子を形成する二本鎖DNAで
ある。
図7Aは一本鎖の標的ポリヌクレオチド70の部分、例え
ば、図示した３′ないし５′配向をもつ二本鎖標的の
“＋”鎖を示す。ポリヌクレオチドは、それぞれ72、7
4、76、および78に示される複数の領域（標的シーケン
スとも呼ばれる）Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3ないしＲnを含み、それ
ぞれは異なる塩基シーケンスを含む。各領域は、好まし
くは約20-80の塩基対の間で、好ましくはほぼ同じ長
さ、すなわち、塩基対の数をもつ。本方法はまた僅かな
異なるシーケンス領域が検出される場所にも応用できる
が、本方法でアッセイされるべき領域Ｒnの全数は100ま
でまたはそれ以上であってもよい。
本方法は、点突然変異に関して図７に示されるが、ど
のようにして小さい突然変異の発生の他の型、例えば１
またはそれ以上の塩基の除去または付加が本方法によっ
て検出できるかが正しく認識されるだろう。さらに一般
的に、本方法を使用して、同時に、標的シーケンス、例
えば病原体標本の混合物と会合したシーケンス、または
ゲノムDNA断片混合物中の遺伝子シーケンスをアッセイ
することができる。
図7Bは領域74（Ｒ2）および76（Ｒ3）を含む標的ポリ
ヌクレオチド70の拡大部分を示す。領域74は、隣接する
塩基ＴおよびＣを含み、これら２つの塩基で終わる２つ
の副領域74a、74bに領域を分けることを示している。Ｔ
およびＣの塩基は野生型（突然変異していない）塩基で
あるが、これらの塩基のひとつ、例えばＴ塩基は、関係
する既知の点突然変異部位に相当する。同様に、領域76
は、この領域をこれら２個の塩基で終わる２個の副領域
76a、76bに分ける隣接塩基ＧおよびＧを含む。副領域76
aのＧ塩基は野生型Ｔ塩基から点突然変異を示し、隣接
するＧ塩基は突然変異していない。このアッセイ方法
は、このような点突然変異を含む領域74および／または
76のような標的の領域を同定するように設計される。
このアッセイ方法に使用されるプローブ構成物は好ま
しくは複数のプローブエレメント、例えば上記図1Bに関
して記載されたものから成る。この構成物を、変性した
形で、標的ポリヌクレオチドに添加し、その成分をアニ
ーリングしてプローブエレメントを、図1Bに示すよう
に、相補的シーケンス標的領域に対してハイブリッド形
成する。
構成物中のプローブのひとつは、80で示され、一対の
プローブエレメント80a、80bを含み、それらのシーケン
スはそれぞれ標的ポリヌクレオチドの領域74において対
応する副領域74a、74bに相補的である。すなわち、プロ
ーブエレメントシーケンスが標的のＲ2領域の“−”鎖
のそれらに対応している。特に、プローブエレメント
は、エレメントが図に示すように領域74の相補的副領域
にハイブリッド形成されるとき、標的領域において隣接
する塩基ＴおよびＣとワトソン−クリック型塩基対を形
成するために有効である末端サブユニットＡおよびＧ塩
基を有する。
構成物中の他のプローブは、82で示され、標的ポリヌ
クレオチドの領域76でそれぞれ対応する副領域76a、76b
にシーケンスが相補的である一対のプローブエレメント
82a、82bを含む。この場合に、プローブエレメントは、
図に示すように、領域76の相補的副領域に対してエレメ
ントがハイブリッド形成されるとき、野生型標的領域に
おける隣接する塩基ＴおよびＧ塩基とワトソン−クリッ
ク型塩基対を形成するために有効である末端サブユニッ
トＡおよびＣ塩基を有する。しかし、示した実施例で
は、ＴないしＧの突然変異は会合した標的塩基にＡ末端
サブユニットのワトソン−クリック型塩基対を妨げる。
対応する標的シーケンスに対してプローブエレメント
をアニーリングした後、反応混合物を連結試薬、好まし
くはリガーゼ酵素で処理して、対比する塩基が隣接する
標的塩基と塩基対となるプローブエレメントの対を連結
する。代表的な連結反応条件は実施例7Aに示される。連
結反応は末端サブユニットが標的塩基と塩基対となって
いるプローブエレメントに対して選択的である。従っ
て、図に示した例では、プローブエレメント80a、80bは
連結しているが、プローブエレメント82a、82bは連結し
ていない。
連結反応がシーケンス特異的ポリマー鎖を有するオリ
ゴヌクレオチドを検出できるレポーターを有するオリゴ
ヌクレオチドに結合し、１端がプローブ特異的ポリマー
鎖を用いて、その他端が検出できる（蛍光）レポーター
を用いて、標識を付けたオリゴヌクレオチドから成る、
連結したプローブ84のような、標識を付けた修飾プロー
ブを選択的に形成することは、高く評価できる。
図7Dに示されるように、標的プローブ複合体を変性す
ると、野生型の標的シーケンスに対応する連結し標識を
付けたプローブ、およびプローブエレメント末端サブユ
ニットにてあるいはその近くで、点突然変異体に対応す
る連結していないプローブエレメントとの混合物を脱離
する。各連結し標識を付けたプローブはポリマー鎖を有
し、これはプローブに対して、上記のように、特有の電
荷／並進摩擦抵抗比を与える。
図7A-7Dに示したアッセイ方法では、標的領域のひと
つ（Ｒ3）は、相補的シーケンスプローブエレメントの
連結反応を妨げる突然変異体を含む。実施例として、全
体の標的ポリヌクレオチドは関心のある８個のシーケン
ス領域を含み、その領域のＲ3とＲ7はプローブエレメン
ト連結反応を妨げるタイプの突然変異体を有し、他の６
個の領域は連結し標識を付けたプローブに導く野生型シ
ーケンスであると思われる。図８は連結反応アッセイ方
法において期待される理想化した電気泳動パターンを示
す。図中のピーク１−８は、HEOユニットを連結した
１、２、３、４、５、６、７および８のような、段々長
くなるポリマー鎖をもつ連結オリゴヌクレオチドプロー
ブの予期される溶出時間である。観察された電気泳動パ
ターンは、図に示されるように、３と７のピーク位置で
ギャップを示し、３と７の標的位置における突然変異体
の証拠となる。全部の修飾されていないDNAは実質的に
Ｎ＝Ｏのピークと共に溶出するだろう。
実施例７は本発明のこの特徴に従って、プローブ連結
および分離の一般的な原理を示す。この方法では、１ま
たは2Phe-Ala-Phe-Alaテトラペプチドユニットを用いて
誘導化された25塩基オリゴヌクレオチドおよび螢光標識
25塩基オリゴヌクレオチドを、ハイブリッド形成の条件
下に、そのシーケンスがこの２つのオリゴヌクレオチド
に広がった標的ポリヌクレオチドと混合した。ハイブリ
ッド形成したプローブエレメントはリガーゼを用いて処
理し、１または２のテトラペプチドユニットを有する螢
光標識プローブを形成させる。
篩分けしていない変性媒体におけるキャピラリー電気
泳動は実質的に上述のように、また実施例７に詳述する
ように行われた。図９は連結反応前の螢光標識プローブ
（ピーク12.621）、および４−または８−アミノ酸ポリ
マー鎖を含む、プローブで連結したときの同じプローブ
（それぞれ、ピーク18.328および18.783）の電気泳動図
を示す。図に見られるように、２つの連結プローブおよ
び非連結プローブ（ピーク12.621）は篩分けしていない
媒体中でCEによって容易に分解される。
上記のOLA連結反応方法では、プローブの濃度は、必
要ならば、繰り返されるプローブエレメントハイブリッ
ド形成と連結反応工程を用いて誘導されたプローブの増
幅によって高めることができる。簡単な追加の（線状）
増幅は標的として標的ポリヌクレオチドを用い、変性、
アニーリング、およびプローブエレメント連結反応を誘
導プローブが所望濃度に達するまで繰り返して達成する
ことができる。
あるいは、標的ハイブリッド形成および連結反応によ
って形成された連結プローブを、公表された方法（ウィ
ン−ディーン）に従って、また実施例８に述べたよう
に、リガーゼ鎖反応（LCR）によって増幅することがで
きる。図10A-10Cに示したこの方法では、図1Bに関して
述べたように２組のシーケンス特異的プローブが二本鎖
DNAの各標的領域に対して用いられ、この２本の鎖は図1
0Aでは170と172で示されている。174で示した１組のプ
ローブはプローブエレメント174a、174bを含み、これら
は、図に示したように、鎖170上の標的シーケンスの隣
接する次の領域にてシーケンス特異的結合するために設
計されており、そして176で示した第２の組のプローブ
はプローブエレメント176a、176bを含み、これらは、や
はり図に示したように、反対側の鎖172上の標的シーケ
ンスの隣接する次の領域にシーケンス特異的に結合する
ために設計されている。
図に示されるように、図1Bに関して上述したプローブ
の組32に類似して、プローブエレメント174aと176aはポ
リマー鎖を用いて誘導され、プローブエレメント174bと
176bは蛍光レポーターを用いて誘導される。２組のプロ
ーブを変性していない一本鎖標的シーケンスにハイブリ
ッド形成した後、各標的領域に結合したプローブエレメ
ントを連結し、反応生成物を変性して標的を付けたプロ
ーブ178、180を離脱する（図10B）。これらの標識を付
けたプローブは、図10Bに示すように、今は２2個の標識
プローブを生成する連結反応を用いてプローブの組17
4、176を結合するため標的基体として供することができ
る。この工程を、Ｎ−２回繰り返して、図10Cに示すよ
うに、２N個の標識プローブ178、180を全部、理想的に
生成する。
実施例８に記載した方法では２対のプローブエレメン
トを調製し、１組は、上述のように、２または４ドデカ
エチレンオキシド（DEO）のいずれかを含有するポリマ
ー鎖を用いて誘導化される第１のプローブ、および螢光
レポーター（JOE）で標識化される第２のプローブを含
む。プローブエレメントの対は嚢胞性繊維症遺伝子のF5
08領域を標的とした。
30LCRサイクルの後、２つの反応混合物からのDNAは一
緒にして、混合物中に増幅し連結したプローブをCEによ
って篩分けしていない緩衝液中で変性条件下に（8Mの尿
素）分別した。電気泳動図を図11に示す。ここで左側の
ピーク（ピーク19.058）は連結していないJOE標識プロ
ーブである。20.847と22.118のピークは、それぞれ、２
または４本のDEOユニット鎖を含む連結した増幅プロー
ブである。図に示されるように、異なる長さのポリマー
鎖をもつ２個のプローブは、互いに、そして篩分けして
いないマトリックス中でポリマー鎖を欠いているプロー
ブから良く分離される。
プローブ連結反応方法は複数の各標的領域で突然変異
体を検出することについて上述したが、この方法はま
た、例えば異なる病原体シーケンスの存在または不在に
関係がある多重標的シーケンス、または高等生物の異な
るゲノムシーケンスを検出するためにも応用できること
が理解される。
この一般的な方法の改良は図18Aと18Bに示される。こ
の方法では、各シーケンス特異的プローブ、例えばプロ
ーブ204は一対のプローブエレメント、例えばエレメン
ト206、208を含み、これらは例えば標的ポリヌクレオチ
ド212のシーケンス210のような選択されたシーケンスの
隣接する位置に結合するために設計される。プローブ20
6は結合ポリマー214、プローブエレメントに特有の電荷
／並進摩擦抵抗を与えるポリマー鎖216、およびポリマ
ー鎖または結合ポリマーに取り付けられるレポーター21
8を含む。第２のプローブエレメントは、図7A-7Dについ
て上述したように、２個のエレメントを会合した標的シ
ーケンスにハイブリッド形成させるとき、プローブエレ
メント206と連結できるオリゴヌクレオチドである。
プローブは上述のように標的ポリヌクレオチドにハイ
ブリッド形成し、連結し、そして脱離され、修飾した標
識プローブ220を生成する。このプローブの電荷／並進
摩擦抵抗比は連結後にプローブに対して、異なる比のポ
リヌクレオチド／ポリマー鎖の寄与によって変えられ
る。次に修飾プローブは、上述したように、篩分けして
いない媒体中で電気泳動によって分別し、関心のある異
なる標的シーケンスと会合したプローブを同定する。
プローブ電荷／並進摩擦抵抗は実質的にポリマー長に
よって実質的に影響を受けないままなので、ポリマー鎖
の不在で、２つのオリゴヌクレオチドの連結反応が、篩
分けしていないマトリックス中のプローブの電気泳動移
動度を変えないであろうことは高く評価されるだろう。
この場合には、しかしながら、プローブの結合した電荷
と並進摩擦抵抗に対するポリマー鎖と結合ポリマーの貢
献が異なり、この割合は結合ポリマーの長さに敏感であ
る。
図16A-16Cは、本発明に従って、ポリヌクレオチドプ
ローブを修飾するための関連した方法を示す。この方法
を使用して、フラグメントＴ1ないしＴn、例えばそれぞ
れ150および152で示した二本鎖フラグメントＴ1および
Ｔ3と会合した１個またはそれ以上のシーケンスＳ1ない
しＳnの存在を検出する。このフラグメントはこの方法
では、関心のある各標的シーケンスに対して、１対のプ
ローブエレメント、例えば図1Bに記載したプローブエレ
メントの一般的な構造をもつプローブエレメント152、1
54を含むプローブ構成物を用いてハイブリッド形成によ
って修飾される。即ち、エレメント152はフラグメント
Ｔ1の１の領域に塩基特異的に結合するために設計され
たオリゴヌクレオチド156、および選択された長さのポ
リマー鎖157を含み、エレメント154はフラグメントの第
２の領域に塩基特異的に結合するために設計されたレポ
ーター標識オリゴヌクレオチド158である。図16Aおよび
16Bに示されるように、プローブはポリマー鎖（i,j、お
よびｋ）を含み、これらはポリマー鎖が取り付けられて
いる結合ポリマーに対して特有の電荷／並進摩擦抵抗比
を与える。
この方法では、フラグメントは、一本鎖の状態で、選
択された長さのポリマー鎖をもつ１のプローブと第２の
レポーター標識プローブを用いてハイブリッド形成した
フラグメント、例えばフラグメント160を形成するプロ
ーブ構成物中のプローブエレメントを用いて、ハイブリ
ッド形成によって修飾される。標的フラグメントはこの
方法では、２個のプローブエレメントを結合するプロー
ブ連結作用に役立つと考えられる。フラグメントそれ自
体は、結合したプローブエレメントの電気泳動の移動度
をはっきりとは変化させないので、電気泳動によって分
別するとき、この方法は１個のプローブエレメントのポ
リマー鎖によって与えられる特有の電荷／摩擦抵抗の比
に従って標的シーケンスフラグメントを同定することが
できる。図16Cでは、混合物中のフラグメントＴ1および
Ｔ3に相当する２個のピークが電気泳動図において観察
される。フラグメントＴ2（図16Cの点線）に相当するピ
ークの不在は、Ｔ2が試料中に存在しないことを示して
いる。
B.標的シーケンス増幅 図12に示した本方法の第２の一般的な具体例では、プ
ローブは二本鎖標的ポリヌクレオチドの１またはそれ以
上の領域のプライマー開始増幅のために設計される。増
幅した標的領域の少なくとも１本の鎖は各増幅フラグメ
ントに特有の電荷／並進摩擦抵抗の比を与えるポリマー
鎖を有する。この増幅した領域は増幅中または増幅後に
レポーター標識を付けることができる。
図12Aおよび12Bはこの方法をを示す。図は増幅される
ための少なくとも１個の、そして代表的には複数の領
域、例えば領域96を有する通常は２本鎖の標的ポリヌク
レオチド94の２本の分離鎖90、92を示す。標的は、図1C
について上述したプローブ50において、各プローブがプ
ライマーエレメント52、54のような１対のプライマーエ
レメントから成るプローブ構成物と反応させる。図12A
はプライマーエレメント100、102から成るプローブ98を
示す。プライマーエレメント100は、一本の鎖の領域96
の３′末端にハイブリッド形成のために設計されたオリ
ゴヌクレオチドプライマー104から成り、その５′末端
で、上記プライマーエレメント52に似ている選択された
長さのポリマー鎖106を有する。エレメント102は反対側
の鎖領域96の５′末端にハイブリッド形成するために設
計されたオリゴヌクレオチドプライマーであり、その
５′末端で蛍光レポーターを有する。
本方法のこの具体例を実施する際に、プローブ構成物
は、図12Aに示したように、反対側の標的ポリマーヌク
レオチド鎖の相補的領域に対してプローブ構成物中のプ
ライマーエレメントを容易にアニーリングするハイブリ
ッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応する。こ
の反応混合物を次に数回、そして代表的には約20-40
回、よく知られたポリメラーゼ鎖反応（PCR）方法（ム
リス、サイキ）に従って、プライマー伸長、変性、プラ
イマー／標的シーケンスアニーリングによって熱循環さ
せる。プローブプライマー100、102によって生じる１個
の増幅領域は図12Bにおいて100で示される。
図に示された実施例におけるように、プライマーの１
つにレポーター標識を付けると、領域103のような２本
鎖増幅領域は１本の鎖上にあるポリマー鎖および他の鎖
上のレポーターを有する修飾した標識プローブを形成
し、ポリマー鎖は２重構造に特有の電荷／並進摩擦抵抗
比を与える。
あるいは、増幅したシーケンスに臭化エチジウムのよ
うな挿入または架橋染料を添加して２本鎖形態で標識を
付けてもよい。異なるシーケンスの増幅プローブは、２
本鎖種の異なる電荷／並進摩擦抵抗比に基づいて、上述
のように電気泳動によって２本鎖形態で分別することが
できる。
別のアプローチでは、２個のプライマーエレメントの
１つはポリマー鎖とレポーター標識を含むことができ、
これによってプライマー開始ポリメラーゼ反応は修飾し
た標識１本鎖プローブを生成する。
前記方法は、例えば、標的ポリヌクレオチド中の選択
されたシーケンスの存在に対してアッセイする際に有用
である。１例として、標的ポリヌクレオチドは多数の可
能な連結した遺伝子シーケンスをもつゲノムDNAであっ
てもよい。構成物中のプローブは関心のある連結シーケ
ンスのPCR増幅において有効なプライマー対である。シ
ーケンス増幅後に関心のあるシーケンスの存在または不
在を、標識プローブの電気泳動の移動位置から決定する
ことができる。
別の応用では、多数の可能なプライマーシーケンス、
例えば縮重シーケンスが関心のある遺伝子シーケンスに
対して相補的であることをアッセイすることを望むこと
ができる。この応用では、プローブ構成物を使用して特
定のシーケンスを増幅する。各プライマーシーケンスは
特有のポリマー鎖をもつので、シーケンス末端領域に相
補的であるプライマーシーケンスは標識プローブの移動
性から決定することができる。上記の他の応用に加え
て、本方法は分別したプローブ混合物中に既知の大きさ
のポリマー鎖を用いて誘導された一連のオリゴヌクレオ
チド、およびテストプローブ上に有する標識を付けた異
なるレポーター基を含ませることを必要とし、電気泳動
による分離に対して移動速度基準を与える。
さらに別の応用では、増幅標的フラグメントに、１本
鎖形態におけるように、レポーター標識プローブを用い
て、増幅シーケンスに対してハイブリッド形成すること
によって標識を付ける。この応用は図13Aおよび13Bに示
され、一本の鎖の上にあるポリマー鎖114を有する増幅
標的シーケンス112を示す。アッセイの目的は任意の、
そしてどちらかの、プライマープローブによって生成し
た１またはそれ以上のフラグメントがプローブシーケン
スに対し相補的なシーケンスを含むかどうかを決定する
ことである。この例では、フラグメント112は塩基シー
ケンスが既知のシーケンスプローブ118のそれに対して
相補的である領域116を含む。
フラグメント、例えばフラグメント112は標準のハイ
ブリッド形成条件下に１個またはそれ以上の標識プロー
ブとハイブリッド形成され、ポリマー鎖を含むフラグメ
ント116の鎖にプローブ118を結合し、従って、上記のよ
うに、電気泳動方法によって分別することができる修飾
した標識プローブを形成する。
図15Aと15Bは、PCR発生標的フラグメント、例えば鎖1
32、134から成る二本鎖フラグメント130を修飾するため
の別の方法を示す。この示された具体例では、鎖132は
増幅中にフラグメントの１端でレポーター136を用いて
蛍光標識を付けた。フラグメント鎖は種々の方法、例え
ば標識dNTPの存在においてニックトランスレーションま
たはホモポリマーテイリングによって、またはレポータ
ー標識プライマーを用いるPCR増幅によってレポーター
標識を付けることができる。
増幅したフラグメントは複数のプローブ、例えば標的
の１本の鎖の異なるシーケンス領域にシーケンス特異的
に結合するために設計されたプローブ138、140、142を
含むプローブ構成物と混合する。代表としてプローブ13
8は、所望する領域に特異的な塩基シーケンスを有する
オリゴヌクレオチド144、および各異なるシーケンスプ
ローブに対して特有な電荷／摩擦抵抗の比を与えるポリ
マー鎖146を含む。
この方法では、フラグメントはハイブリッド形成によ
ってプローブ構成物中のプローブを用いて修飾され、プ
ローブ結合に対応する１またはそれ以上の二本鎖領域
と、フラグメント149のようなフラグメントを形成す
る。修飾フラグメントは１本鎖に標識を付け、反対側の
鎖プローブ中に１本またはそれ以上の選択された長さの
ポリマー鎖を用いて誘導される。次に修飾フラグメント
は電気泳動によって二本鎖形態に分別され、各フラグメ
ントを会合したポリマー鎖の数と大きさに従ってフラグ
メントを分別する。
従って、例えば、図に示した方法では、フラグメント
132はプローブ138、142を結合し、このようにして全部
のｉ＋ｋ個のポリマー鎖単位を有するように修飾され
た。フラグメントは、電気泳動により、フラグメントに
会合したポリマー鎖単位の全数に依存する移動時間で移
動するので、各フラグメントに会合したプローブを同定
することができる。この方法は、例えばゲノムDNA内の
既知のシーケンス間の距離を調べるため、または連結し
たシーケンスを同定するために用いることができる。
C.プローブ伸長 本発明の方法に従って標識プローブを形成するための
第３の一般的方法は、図14Aと14Bに示される。この方法
では、図に120で示されるような一本鎖標的ポリヌクレ
オチドは、標的の選択された領域に塩基特異的に結合す
るために設計されているプローブ122のような、複数の
プローブを含むプローブ構成物と反応する。代表とし
て、プローブ122は図1Aのプローブ20に似ていて、フリ
ーの３′末端OH基を有するオリゴヌクレオチド、および
その５′末端に有する選択された長さのポリマー鎖を含
む。
プローブを標的に結合した後、プローブは、図に示し
たように、少なくとも１個のレポーター標識dNTPの存在
で,DNAポリメラーゼＩを用いて処理される。染料標識dN
TPsは市販の原料から合成することができる。例えば、
アミノ７−dUTP（クロンテク、パロアルト、CA）は標準
のカップリング条件下にフルオレセインNHSエステル
（モレキュラープローブ、ユージン,OR）と反応するこ
とができ、フルオレセイン標識dUTPを形成する。ポリメ
ラーゼは全部で４個のヌクレオシドトリホスフェートの
存在で、128で示されるような１個またはそれ以上の標
識ヌクレオチドを混入し、標的結合プローブの３′末端
を伸長し、各プローブシーケンスの特性を示している各
異なるシヒケンスプローブと会合した特有のポリマー鎖
を有する所望の修飾した標識プローブを形成するのに効
果がある。あるいは、上記例においてプローブに混入し
た後、フルオレセインを修飾ヌクレオチド、例えばアミ
ノ−７−dUにカップリングすることができる。各々の異
なるシーケンス修飾標識プローブはその特有のポリマー
によって電荷／並進摩擦抵抗の明確な比をもつ。
プローブ伸長後、プローブは標的から脱離し上述のよ
うに電気泳動によって分別し、標的ヌクレオチドに含ま
れるシーケンスに対応する標識プローブの移動位置を同
定する。
D.フラグメント開裂 図17Aと17Bは本発明の他の具体例を示す。この方法で
はプローブ構成物は、標的ポリヌクレオチド188の領域1
86のような、一本鎖標的ポリヌクレオチドの領域にシー
ケンス特異的に結合するために設計された複数のシーケ
ンス特異的プローブ、例えばプローブ184を含む。代表
として、プローブ184は、第１の一本鎖DNA切片192、お
よび一本鎖RNA領域196を含む第２の切片194から成る結
合ポリマー190のプローブを含む。結合ポリマーの第１
の切片に取り付けられたポリマー鎖198は、上記のよう
に、結合ポリマーに、特有の電荷／並進摩擦抵抗比を与
える。レポーター200は結合ポリマーの第２の切片に取
り付けられる。特に、ポリマー鎖およびレポーターはRN
A領域の反対側にあり、この領域の選択的開裂はプロー
ブを第１の切片および取り付けられたポリマー鎖にレポ
ーターから分類するであろう。
この方法では、プローブ構成物は、上述のように、ハ
イブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応
し、シーケンス特異的方法でプローブを相補的標的領域
に結合する。図18Aに見られるように、これは各結合プ
ローブにおいてRNA/DNA二本鎖の領域を生成する。反応
混合物は今は、RNase Hのような、二本鎖RNA/DNAを選択
的に切断することができる（Duck）ヌクレアーゼで処理
して、従って各プローブをそのRNA結合領域中で切断す
る。
ハイブリッド形成反応は、そのポリマー鎖を欠き、従
って篩分けしていない媒体中で電気泳動によって遊離オ
リゴヌクレオチドとして移動する修飾した標識プローブ
を、各特異的に結合するプローブに対して変性し脱離す
る。代替の具体例では（図示していない）、ポリマー鎖
はプローブのレポーター側に取り付けることができ、従
ってRNAse処理は一部の結合ポリマーを放出し、残りの
プローブ（ポリマー鎖とレポーターを含む）の合わさっ
た電荷／合わさった並進摩擦抵抗を変えて、従って開裂
していないプローブについて、篩分けしていない媒体中
のプローブの電気泳動による移動度をシフトさせる。
生成する標識プローブの開裂モードを使用する他の具
体例では、プローブ修飾はアニーリングしたプローブか
ら（その５′末端を越えて）標的ポリヌクレオチド上流
までアニーリングしたプライマーを伸長する間に行われ
る。この伸長はまた５′ないし３′エキソヌクレアーゼ
活性（Holland）を組み込むDNAポリメラーゼによって生
成される。本方法は、関心のあるシーケンス領域224を
もつ標的ポリヌクレオチド222を示す図19に示される。
この方法でのプローブはポリマーの５′末端付近にサブ
ユニット229をもつ結合ポリマー228を含むプローブ226
によって例示される。この塩基にポリマー鎖230および
標識プローブ232（これはポリマー鎖のフリー末端に取
り付けることができる）が取り付けられている。また図
には、領域224の上流で、標的にシーケンス特異的に結
合するために設計されているプライマー234が示されて
いる。
本方法を実施する際に、シーケンス特異的プローブお
よび１組のプライマー、例えばプライマー234は、ハイ
ブリッド形成条件下に標的ポリヌクレオチドと反応し、
会合したプローブおよび上流プライマーを標的の異なる
シーケンス領域に結合する。標的および取り付けたプロ
ーブは全４個のヌクレオシドトリホスフェートの存在で
上記ポリメラーゼで処理し、図19Bの複数のｘによって
示すように、５′ないし３′方向においてプライマーを
重合する。ポリメラーゼが隣接するプローブの５′末端
に達すると、それはプローブを標的領域から置換し、ま
た５′末端サブユニットをプローブから開裂して取り去
る。図19Bに示すように、プローブからのサブユニット2
29の開裂は塩基229、レポーター232、および特有の電荷
／並進摩擦抵抗の比をプローブに与えるポリマー鎖230
から成る標識プローブ234を脱離する。
分子生物学の分野において熟練した者によって、多く
の種類の開裂法が実施されることは認識されるだろう；
ポリメラーゼ活性につながらないエキソヌクレアーゼ活
性を使用する（例えば、E.ColiポリメラーゼＩからのＮ
末端選択的開裂フラグメントおよびバクテリオファージ
λのエキソヌクレアーゼ）、一定のDNAポリメラーゼの
３′→５′校正エキソヌクレアーゼ活性を使用する（こ
の場合ポリマー鎖198とレポーターＦは好ましくはプロ
ーブの３′末端に取り付けられ、この３′末端は図17A
の鋳型ポリヌクレオチド188に不適正な１個またはそれ
以上のヌクレオチドを含む）、または制限エンドヌクレ
アーゼのような広範囲のシーケンス特異的エンドヌクレ
アーゼのいくつかを用いる。これらの場合のすべては、
好適な具体例は、開裂部位の同じ側にレポーターとポリ
マー鎖を配置し、それらが開裂に続いて共有結合するよ
うにする。追加のポリマー鎖は標識を付けていないプロ
ーブから標識を付けたプローブを最適に分離するため、
レポーターから開裂部位の反対側にプローブに付加する
かまたは付加しないことができる。
E.DNA配列決定方法 本発明の重要な具体例では、DNA配列決定は篩分けし
ていない液体媒体中で電気泳動により分離するDNA断片
（即ち、異なるシーケンスのオリゴヌクレオチド）によ
って実行される。本来のDNAは２つの線形ポリマー、ま
たはヌクレオチドの鎖から成る。各鎖はホスホジエステ
ル結合によって連結したヌクレオシドの鎖である。２本
の鎖は互いに、その２本の鎖：チミジン（Ｔ）と対のデ
オキアデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン（Ｃ）と
対のデオキシグアノシン（Ｇ）、のヌクレオチドの相補
的塩基間に水素結合によって逆平行の配向で保持されて
いる。
最近DNAシーケンスの決定への２つの基本的アプロー
チがある：ジデオキシ鎖末端方法、例えばサンガーら、
Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.74p Pgs.5463-5467（197
7）；および化学分解方法、例えばマキサムら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,Vol.74,pgs.560-564（1977）。鎖末端方
法はいくつかの方法で改良され、現在得られる自動化DN
A配列決定機器全部に基礎として使われている、例えば
サンガーら、J.Mol.Biol.,Vol.143,pgs.161-178（198
0）；シュライヤーら、J.Mol.Biol.,Vol.129,pgs.169-1
72（1979）；ミルスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.76,p
gs.2232-2235（1979）；スミスら、Nucleic Acids Rese
arch,Vol.13,pgs.2399-2412（1985）；スミスら、Natur
e,Vol.321,pgs.5674-679（1987）；プロバーら、Scienc
e,Vol.238,pgs.336-341（1987）、セクションII、Meth.
Enzymol.,Vol.155,pgs.51-334（1987）；チャーチら、S
cience,Vol240,pgs.185-188（1988）；タボーら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,Vol.84,pgs.4767-4771（1987）；タボ
ーら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.86,pgs.4076-4080（19
89）；インニスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.85,pgs.9
436-9440（1988）；およびコンネルら、Biotechniques,
Vol.5,pgs.342-348（1987）。
鎖末端方法と化学分解方法の両者は標識DNA断片の１
またはそれ以上の組、即ちDNA断片を重ね入れた組の生
成を必要とし、各々は共通の出所を有し、各々は既知の
塩基で終わっている。１組または複数の組の断片はシー
ケンス情報を与えるように大きさによって分離する必要
がある。両方の方法において、DNA断片は高分解ゲル電
気泳動によって分離される。一般に、DNA断片は放射性
ヌクレオシドトリホスフェート前駆体によってまたは蛍
光染料によって標識が付けられる。
DNA配列決定への鎖末端アプローチの基本的工程は、
（１）オリゴヌクレオチドプライマーおよび、サブシー
ケンスとして、シーケンスが決定される標的核酸を含む
鋳型核酸を用意し、（２）オリゴヌクレオチドプライマ
ーを鋳型核酸にハイブリッド形成し、（３）プライマー
を核酸ポリメラーゼ、例えば、T7 DNAポリメラーゼ、Se
quenase（登録商標）、逆転写酵素等を用いて、ヌクレ
オチドトリホスフェート前駆体と少なくとも１本の鎖終
止ヌクレオチドを含む反応混合物中で伸長し、より短い
全てのDNA断片がより長い全てのDNA断片のサブシーケン
スであり、同じ大きさの全てのDNA断片が同じ鎖終止ヌ
クレオチドで終わるように、DNA断片個体群の重ね入れ
た系列を形成し、（４）大きさによってDNA断片個体群
を分離し、そして（５）各DNA断片個体群と会合した鎖
終止ヌクレオチドを同定する。
上記工程の各々の詳細は、異なる鎖終止ヌクレオチド
を同定するための標識手段の性質、異なるDNA断片の個
体群を分離するための手段、鋳型核酸をハイブリッド形
成工程のために用意する方法等を含めて、当該分野で良
く知られている幾つかの要素に従って変わる。例えば、
DNA断片の個体群をプライマーに結合した蛍光染料によ
って同定する場合、各々は異なる蛍光標識を有する４個
の異なるプライマーを用意し、プライマーは４個の異な
る鎖終止ヌクレオチドに対応する４つの分離反応混合物
中に伸長する。または、DNA断片の個体群を、伸長工程
の間に放射活性で標識を付けたヌクレオチドトリホスフ
ェートを組み込むことによって同定する場合、伸長工程
は通常４個の分離反応混合物を含み、各々は異なる鎖終
止ヌクレオチドを含み、分離工程は通常大きさに従って
別々に各反応混合物のDNA断片個体群を分離することを
含む。一般に、本背景の第２のパラグラフに引用した参
考文献は、DNA配列決定の工程およびその重要な変更例
を開示する。従って、これらの参考文献が参照のために
組み入れられる。
好ましくは、異なるDNA断片個体群を鎖終止ヌクレオ
チドに結合した蛍光染料によって同定する。従って、本
発明の方法では、プライマーはDNAポリメラーゼによっ
て、ATP、CTP、GTP、およびTTPの４つの１−チオトリホ
スフェート類似体、および各々が異なるメンバーの１組
のスペクトルにより解像できる蛍光染料で標識を付けた
４個の鎖終止ヌクレオチドを含む反応混合物中で例えば
フングら、米国特許4,855,255;プロバーら（上記）等に
よって開示されているように、伸長する。
鋳型は、当該分野の教示、例えば、Technical Manual
for Model 370A DNAシーケンサー（アプライド・バイ
オシステムズ・インコーポレイテッド、フォスターシテ
ィ、CA）に従って用意される。例えば、標的シーケンス
を適当なクローニングベクターに、例えばM13クローニ
ングベクターの複製の形で挿入し、次に標的シーケンス
のコピー数を増幅するように増殖することができる。１
本鎖形態のM13は鋳型として使用するために単離する。
或いは、鋳型を当該分野で教示されているようなポリメ
ラーゼ鎖反応（PCR）によって用意することができる；
例えば、インニスら（上記）；ウイルソンら、Biotechn
iques,Vol.8,pgs.184-189（1990）；ギレンステン,Biot
echniques,Vol.7,pgs.700-708（1989）等。増幅後、鋳
型は重合化反応で液体相でまたは固体相支持体に結合し
て、例えばスターら、Nucleic Acids Research,Vol.16,
pgs.3025-3038（1988）；ハルトマンら、Nucleic Acids
Research,Vol.17,pgs.4937-4946（1989）等によって教
示されているように、使用することができる。
本発明の方法のためのプライマーは、市販のDNA合成
器で合成することができ、または単独でまたはDNA増幅
および／または配列決定キットの成分として購入するこ
とができる、例えば、United Biochemical Corporation
（Clevelans,OH）,Clontech（Palo Alto,CA）等。鋳型
にプライマーをハイブリッド形成する工程は引用した参
考文献に充分に開示されており、本発明の任意特定の具
体例に応用するための詳細なガイダンスを提供する。
本発明のキットは一般にポリマー鎖に共役した１また
はそれ以上のオリゴヌクレオチドから成る１またはそれ
以上のプライマーを含む。好ましくは、プライマーのオ
リゴヌクレオチドは長さで16と25個の間のヌクレオシド
である。好ましくは、本発明のキットはさらに、緩衝液
中に４個のヌクレオシドトリホスフェート前駆体から成
るヌクレオシドトリホスフェート前駆体ミックスを含
む。１の具体例では、ヌクレオシドトリホスフェート前
駆体ミックスはまた１またはそれ以上の鎖終止ヌクレオ
チドを含むことができる。また、鎖終止ヌクレオチドは
キットの分離成分であることができる。好ましくは、キ
ットはさらに核酸ポリメラーゼおよびポリメラーゼ反応
を行うための反応緩衝液を含む。核酸ポリメラーゼはDN
Aポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、および逆転写酵素等
を含む。好ましくは、キットDNAポリメラーゼ、例え
ば、ゲルファンド、米国特許4,889,818によって開示さ
れているようなタグポリメラーゼ；またはタボーら、米
国特許4,962,020;4,795,699;4,942,130;4,994,372;およ
び4,921,794によって開示されているようなシーケナー
ゼを含む。
１具体例では、キットは単一プライマーおよび染料タ
ーミネーターミックスを成分として含む。染料ターミネ
ーターミックスは４個の鎖終止ヌクレオチドを含み、各
々は好ましくはスペクトルにより解像できる異なる蛍光
染料で標識を付けている。好ましくは、鎖終止ヌクレオ
チドはジデオキシヌクレオシドトリホスフェートであ
る。この具体例の一面では、各ジデオキシヌクレオシド
トリホスフェートは別々に、５−およひ６−カルボキシ
フルオレセイン、５−および６−カルボキシ−4,7−ジ
クロロフルオレセイン、２′,7′−ジメトキシ−５−お
よび６−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、
２′,7′−ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−５−およ
び６−カルボキシフルオレセイン、２′,7′−ジメトキ
シ−４′,5′−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−
4,7−ジクロロフルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジ
ベンゾ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロロフ
ルオレセイン、１′,2′,7′,8′−ジベンゾ−４′,5′
−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−4,7−ジクロ
ロフルオレセイン、２′,7′−ジクロロ−５−および６
−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、および
２′,4′,5′,7′−テトラクロロ−５−および６−カル
ボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインから成る組から
選択された染料で標識を付ける。上記染料は参考文献と
して組み入れられる次の参考文献に開示されている：ホ
ップ ジュニア、米国特許4,997,928;フングら、米国特
許4,855,255;およびメンチェンら、PCT出願US90/0660
8。あるいは、本発明のジデオキシヌクレオチドはベル
ゴットら、PCT出願US90/05565によって教示されている
ようにスペクトルにより解像できるローダミン染料で標
識を付けることができる。
代わりの具体例では、キットは４個の別のプライマー
を含み、各々は異なるスペクトルにより解像できる蛍光
染料で、例えば、フングら（上記）によって教示されて
いるように、標識を付ける。
F.プローブ捕獲 図20A-20Cに示される他の一般的具体例は、固定化し
た標的ポリヌクレオチドからのプローブ捕獲と脱離を含
む。図20Aは複数のプローブ、例えばプローブ24-246
を、Ｒi、Ｒj、およびＲnのような、関係のある異なる
シーケンス領域を含む標的ポリヌクレオチド248への付
加を示す。代表として、プローブ240は、結合ポリマー2
50、このプローブに特有の電荷／並進摩擦抵抗の比を与
えるポリマー鎖252、およびポリマー鎖に取り付けられ
たレポーター254を含む。図に示した具体例では、各異
なるシーケンスのプローブは特有の電荷／並進摩擦抵抗
の比を達成するため異なる長さのポリマー鎖をもつ。
プローブは、上記のように、ハイブリッド形成条件下
に標的ポリヌクレオチドと反応する。図20Aに示した方
法では、プローブ240、242、および246の各々はそれぞ
れ、標的ポリヌクレオチドの領域Ｒi、Ｒj、およびＲn
の相補的シーケンスとハイブリッド形成する。この例で
は、標的ポリヌクレオチドはプローブ244に相補的な領
域を含まず、このプローブは結合していないと仮定す
る。
標的およびハイブリッド形成したプローブは次に標的
ポリヌクレオチドを固定するように処理される。これは
本実施例では、標的ポリヌクレオチドの領域Ｒ1に相補
的であるオリゴヌクレオチドプローブ262を用いて誘導
された固体支持体260を付加し、このようにして図20Bに
示したように、固体支持体に標的を結合することによっ
て行われる。支持体および取り付けた標的とプローブは
洗浄して、非特異的に結合したプローブ、例えばプロー
ブ244を除去する。
最後の処理工程では、洗浄した固体支持体混合物を変
性して、結合したプローブ、例えばプローブ240、242、
および246を脱離し、これらのプローブを次に、篩分け
していない媒体中で電気泳動によって分別し、この分別
した標識プローブの特有の電気泳動位置に基づいて、標
的シーケンスを同定する。
前述のことから、本発明の種々の目的および特徴がど
のように合致しているか高く評価されるだろう。本方法
は複数の標的シーケンスを単一のアッセイフォーマット
でアッセイすることができ、シーケンス特異的標識プロ
ーブと会合した異なる長さのポリマー鎖の移動距離（移
動割合）に従ってシーケンスを迅速に同定する。
ポリマー鎖は、オリゴヌクレオチドのような荷電した
結合分子を、篩分けマトリックスを必要としない簡単な
電気泳動方法で、分離することができる。特に、このCE
分別方法は、すべてが似ているかまたは同じ大きさの複
数のオリゴヌクレオチドを有効に分別することができ
る。この特徴の１つの利点は本方法で用いられる複数の
プローブ中がすべて似ているかまたは同じ大きさをもつ
ことができ、従って殆ど同じハイブリッド形成動力学お
よび熱力学（Ｔm）で標的シーケンスを用いてハイブリ
ッド形成できることである。
本発明のプローブは従来の固相方法によって容易に合
成することができる。一つの方法では、選択された数の
ユニットのポリマー鎖を直接オリゴヌクレオチド上で、
従来の固相合成方法によって形成することができる。
次の実施例はポリマー鎖プローブの製造と使用の種々
の例を記載するものである。これらの実施例は例示であ
るが、本発明の範囲を制限するものではない。
原料 ヘキサエチレングリコール、4,4′−ジメトキシトリ
チルクロリド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチ
ルアミン、酢酸、ピリジン、メタンスルホニルクロリ
ド、水素化ナトリウム、２−シアノエチル−N,N,N′,
N′−テトライソプロピルホスホロジアミダイトは、ア
ルドリッチ、ミルウォーキィ、WIから入手した。ジイソ
プロピルアミンテトラゾール塩、FAM-NHS/DMSO、JOE-NH
S/DMSOおよびTAMRA-NHS/DMSOは、アプライド・バイオシ
ステムズ（ABI）、フォスターシティ、CAから入手し
た。LAN（リンカーアームヌクレオチド）５′−ジメト
キシル−トリチル−５−（Ｎ−（７−トリフルオロアセ
チルアミノヘプチル）−３−アクリルアミド）−２′−
デオキシウリジン−３′−ホスホルアミダイトはモレキ
ュラーバイオシステムズ インコーポレイテッド、サン
ジエゴ、CAから入手した。
セファデックス（登録商標）Ｇ−25M PD-10カラムは
ファーマシア、ウップサラ、スウェーデンから入手し
た。誘導オリゴヌクレオチドは1.5ml/分の流速と0.1Mト
リエチルアンモニウムアセテート／水pH7.0およびアセ
トニトリルのグランジエントを使用してABI RP-300（C
8）カラム（4.6×220mm）を用いてLC精製した。DNA合成
器:380B、ANI、フォスターシティ、CA. 実施例１ （HEO）N鎖の合成 この実施例に記載する反応は図２に示され、クロード
およびシェパルツのものと似ている。
A.ジメトキシトリル（DMT）保護へキサエチレンオキシ
ド（HEO） 27.0g（95.6ミリモル）のHEOを100mlのピリミジンに
溶解した。この溶液に室温で10時間かけて、27.0グラム
（79.7ミリモル）のジメトキシトリチルクロリドの150m
lピリミジン溶液を添加した。反応物を、室温で終夜撹
拌した（15時間）。溶媒を減圧除去し残渣を150mlのEtO
Acと100mlのＨ2Ｏ、２×100mlの塩水に入れ、有機相をN
a2SO4で乾燥させた。溶媒を除去して暗燈色の油（38.36
g）を与えた。粗物質を200gのキーゼルゲル60を用いて
２％のメタノール−塩化メチレンで溶出するシリカゲル
クロマトグラフィによって精製した（シリカゲルはトリ
エチルアミンで塩基性化した）。適当な画分を一緒にし
て29.52g（50.49ミリモル）の化合物１を与えた。DMT保
護HEO（図２の化合物１）の分析を示す：1 HNMR（300MHzCDCl3）δ7.5−6.8（ｍ、13H芳香族）、 3.75（Ｓ、6H、OCH3）、3.6（20H、ｍ、OCH2−CH
2Ｏ）、 3.5（2H、ｍ、CH2‐OH）、3.2（2H、ｔ、CH2ODMT）。
B.DMT保護HEOホスホルアミダイト 1g（1.7ミリモル）の上記実施例1AからのDMT保護HEO
および0.029g（0.17ミリモル）のテトラゾールジイソプ
ロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下に10mlの塩化メ
チレンに溶解させた。これに0.59グラムの２−シアノエ
チルテトライソプロピルホスホルアミダイトを添加し、
混合物を終夜室温で撹拌した。反応混合物をNaHCO3の飽
和溶液、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を除去
して1.58gの粗精油を与え、生成物をフラッシュクロマ
トグラフィによってシリカゲルに通して50％EtOAc−ヘ
キサンで溶出して精製した（シリカゲルはトリエチルア
ミンで塩基性化した）。0.8g（1.3ミリモル）の精製ホ
スホルアミダイト（図２の化合物２）を回収した。
C.DMT保護HEOメタンスルホネート（メシレート） 100mlの塩化メチレンに上記実施例1AからのDMT保護HE
Oを10.4g（17.8ミリモル）溶解した。溶液を氷冷し、4.
59g（35.6ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンを
添加し、次に2.06g（26.7ミリモル）の塩化メタンスル
ホニルを添加した。反応混合物を30分間撹拌し次にNaHC
O3の飽和溶液、塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。溶
媒を減圧除去し11.93gのメシレート（図２の化合物３）
を与えた。
D.DMT保護HEO二量体 0.62g（26.9ミリモル）の水素化ナトリウムと150mlの
新たに蒸留したテトラヒドロフランの懸濁液に10℃で１
分間かけて10.14g（36.0ミリモル）のヘキサエチレング
リコールを添加し、混合物を室温で30分間撹拌した。こ
れに、上記実施例1Cからの11.93g（17.9ミリモル）のHE
Oメシレートの50mlテトラヒドロフラン溶液を添加し
た。反応混合物を40-50℃まで３時間暖めて、その後に
溶媒を減圧除去して、残渣を150mlの塩化メチレンに入
れた。これを３×100mlのＨ2Ｏ、塩水で洗浄し、Na2SO4
で乾燥させた。溶媒を減圧除去して粗精油（13.37g）を
与えた。これを上記実施例1Aと同様にシリカゲルクロマ
トグラフィによって精製した。10.0gのDMT保護HEO二量
体（11.8ミリモル）を回収した。物質の分析（図２の化
合物４）を示す：1 HNMR（300MHzCDCl3）δ7.5−6.8（ｍ、13H芳香族）、 3.75（Ｓ、6H、OCH3）、3.6（20H、ｍ、OCH2−CH
2Ｏ）、 3.5（2H、ｍ、CH2−OH）、3.2（2H、ｔ、CH2ODMT）。
E.DMT−保護HEO二量体のホスホルアミダイド（図２の化
合物５） 実施例1Dからの1g（1.17ミリモル）のDMT保護HEO二量
体および20mg（0.12ミリモル）のテトラゾールジイソプ
ロピルアンモニウム塩を不活性雰囲気下、10mlの塩化メ
チレンに溶解した。これに室温で0.409g（1.35ミリモ
ル）の２−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジ
アミダイドを添加した。15時間後、反応物を飽和NaHC
O3、塩水で洗浄しNa2SO4で乾燥させた。溶媒を減圧除去
し粗油（1.44g）を得た、これを実施例1Bのようにフラ
ッシュクロマトグラフィで精製した。0.76g（0.73ミリ
モル）の精製した生成物を回収した。精製した物質（図
２の化合物５）の分析を示す：31 Ｐ−NMR（CD3CN、Ｈ分断）：δ151（Ｓ）。
実施例２ ビスウレタントリル基によって連結された（HEO）N鎖の
合成 この実施例に記載した反応を図３に示す。
ヘキサエチレングリコール（10.0ml）をトリレン−2,
4−ジイソシアネート（TDC）（17.0ml）に30-35℃でア
ルゴン下に適下した。氷浴を使用して発熱反応をコント
ロールした。室温で終夜反応させ；熱いヘキサン（10
×）で洗浄し過剰のジイソシアネートを除去し；そして
減圧化に濃縮して粗ビスイソシアネート生成物（化合物
６、図３）を琥珀色の油（30g）として生成した。
上記の粗ビスイソシアネート（2.3g）とヘキサエチレ
ングリコール（7.0ml）のジクロロメタン（25ml）溶液
を室温で１時間撹拌し次にジブチルチンジラウレート
（0.1ml、アルドリッチ）を添加し、室温で22時間撹拌
し；ジクロロメタンで希釈し水（４×20ml）で洗浄し；
乾燥（MgSO4）させ；そして減圧下に濃縮して粗ジオー
ル生成物（化合物７、図３）を琥珀色の油（4.6g）とし
て得た。
DMT塩化物（1.2g）のジクロロメタン（20ml）溶液を
２時間かけてアルゴン下に室温で、上記粗ジオール（4.
4g）とトリエチルアミン（0.6ml、アルドリッチ）のジ
クロロメタン（25ml）撹拌溶液に添加した。反応溶液を
室温で２時間撹拌し水で洗浄し；乾燥させ（MgSO4）；
そして減圧下に濃縮して粗DMTアルコール生成物を琥珀
色の油（5.1g）として得た。粗DMTアルコールのカラム
クロマトグラフィ（トリエチルアミン中和シリカ、５％
メタノール／ジクロロメタン）は精製したDMTアルコー
ル（化合物８、図３）を粘性琥珀色の油（0.72g）とし
て与えた。化合物の分析を示す：1 H NMR/CDCl3：δ6.7−7.5（ｍ、ArH、19H）、 δ4.3（ｍ、NC（Ｏ）OCH2、8H）、δ3.77（ｓ、CH3Ｏ、
6H）、 δ3.55−3.75（ｍ、CH2OCH2、62H）、δ3.2（ｔ、DMTOC
H2、2H）、 δ2.15（ｍ、CH3Ar、6H）。
２−シアノエチル−N,N,N,N−テトライソプロピルホ
スホロジアミダイト（0.20ml）をアルゴン下、室温で、
上記精製したDMTアルコールとテトラゾールジイソプロ
ピルアミン塩（12mg）の乾燥ジクロロメタン（5ml）撹
拌溶液に添加した。室温で４時間撹拌した後、NaHCO3溶
液を添加し40分間撹拌した。ジクロロメタン層をさらに
ジクロロメタンで希釈し、塩水で洗浄し；乾燥させ（Mg
SO4）；そして減圧下に濃縮して粗ホスホルアミダイト
生成物（化合物９、図３）を琥珀色の油（0.88g）とし
て得た。31 P NMR（CDCl3）:151ppm。
実施例３ PEO鎖を用いたオリゴヌクレオチドの誘導化 セクションＢおよびＣに記載した反応を、それぞれ、
図4Aと4Bに示す。
A.オリゴヌクレオチドの調製 シーケンス５′GCACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTC
CTATGATGAATATAカルボキシフルオレセイン−３′をもつ
48塩基オリゴヌクレオチド（図4Aの構成物10）を３′連
結カルボキシフルオレセインポリスチレン支持体（アプ
ライドバイオシステムズ インコーポレイテッド）を用
いて調製し、または３′アミン−OH（オリゴヌクレオチ
ド）CPG（クロンテク、パロアルト,CA）および発表され
た方法（アプライド バイオシステムズ、カルサーズ、
コンネル）によるFAM-NHS（ABI）、およびアプライドバ
イオシステムズ380B DNA合成器で標準のホスホルアミダ
イト化学を用いて調製することができる。
B.PEO鎖を用いて誘導されたオリゴヌクレオチド 上記実施例3Aからの支持体結合オリゴヌクレオチド
（0.1μモルオリゴヌクレオチド）をトリクロロ酢酸と
反応させて脱保護し、洗浄し、標準DNA合成サイクルを
用いて、次に実施例１のようなホスホルアミダイト−PE
Oポリマーの１つと反応させた。図4Aに示した具体例は1
2個のエチレンオキシドサブユニットをもつポリマー鎖
を用いている。誘導化オリゴヌクレオチド（図4Aの化合
物11）はトリチルでカラムから引き離され、集められた
生成物（図４の化合物12）は、ABI RP-300（Ｃ−８）4.
6×220mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムアセ
テート−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液体
クロマトグラフィによって精製された。誘導化したオリ
ゴヌクレオチドは図4Aで化合物12として示される。
C.ビスウレタントリル連結PEO鎖を用いて誘導されたオ
リゴヌクレオチド 上記の実施例3Aからの支持体結合オリゴヌクレオチド
（0.1μモルオリゴヌクレオチド）（化合物10、図4B）
を、標準のDNA合成サイクルを用いる実施例２のように
調製されたホスホルアミダイト−PEOビスウレタントリ
ル結合ポリマーと反応させた。（図4Bでサブユニット構
造DMT-HEO-Tol-HEO-Tol-HEOによって示されるトリル連
結ポリマーは図３の化合物９に相当する）。誘導化オリ
ゴヌクレオチド（図4Bの化合物13）をカラムから引き離
し、トリチルで脱保護し、ABI RP-300（Ｃ−８）4.6×2
20mmカラムおよび0.1Mトリエチルアンモニウムアセテー
ト−水およびアセトニトリル溶媒系を用いて、液体クロ
マトグラフィで精製した。集められた生成物は酢酸で脱
保護した。誘導化オリゴヌクレオチドは図4Bで化合物14
として示される。
実施例４ オリゴヌクレオチドへのPEO連続付加 この実施例に、記載した反応工程を図５に示す。
A.FAM標識オリゴヌクレオチド シーケンス５′TTG GTG TTT CCT ATG ATG AAT ATA-LA
N-T3′をもつ26塩基オリゴヌクレオチドを、標準ホスホ
ルアミダイト化学（図５の構成物15）を用いるABIモデ
ル380B DNA合成器で作成した。LANはTFA保護アミンを用
いて塩基修飾したデオキシウルジンホスホルアミダイト
（モレキュラー バイオシステムズ インコーポレイテ
ッド）である。この26量体は１μモルカラムから合成後
トリチルオンマニュアルプロトコルを用いて作成され
る。このカラム物質は10個の分離した0.1μモルカラム
に分けられた。
続くオリゴ全部をNH4OHを用いて支持体から切り離
し、1.5ml/分の流速および0.1Mトリエチルアンモニウム
アセテート−水pH7.0とアセトニトリルの溶媒グラジエ
ントを用いるABI RP-300（Ｃ−８）カラム（4.6×220m
m）を用いて最初HPLCによって精製し、次いで以下に述
べる特定修飾の後、トリチル基を除去し、生成物を上記
条件を用いるHPLCによって単離した。
切離したオリゴヌクレオチドは、15μｌのFAM・NHSの
DMSO溶液（ABI）および40μｌの1M NaHCO3/Na2CO3pH9.0
と共にアミン標識26量体の溶液を添加してFAMを用いて
標識を付けた。２時間後、反応混合物はファーマシアPD
-10セファデックス（登録商標）G25Mカラム（ファーマ
シア）を通過させ、集められた試料は次にHPLCで生成し
た。溶媒を除去した後、試料を80％酢酸−水で脱トリチ
ル化した。次に溶媒は減圧で除去し、残渣は0.5mlのＨ2
Ｏに入れて液体クロマトグラフィによって精製した。
B.FAM標識PEO誘導化オリゴヌクレオチド 実施例1BからのDMT保護ホスホルアミダイトHEOユニッ
トは実施例4Aからのオリゴの５′末端に、固体支持体の
標準ホスホルアミダイト化学によって添加され、図５の
構成物16を生成した。４ユニットに対し１ユニットを分
離反応に添加した。得られたHEO修飾オリゴを上記のよ
うに固体支持体から切り離し（化合物17、図５）FAMで
標識を付け、上述したように精製した（化合物18、図
５）。
C.PEO誘導化オリゴヌクレオチド シーケンス５′GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC T
3′をもつ25塩基オリゴヌクレオチドを実施例4Aに記載
したように作成した。DMT保護ホスホルアミダイトHEOユ
ニットをこの25量体の５′末端に添加し、実施例4Bに記
載したように精製した。
実施例５ オリゴヌクレオチドへのペプチドの共役 25量体のオリゴヌクレオチドはABI DNA合成器を用い
てCPG固体支持体に合成した。CPG支持オリゴヌクレオチ
ドの５′水酸基に標準のホスホルアミダイト化学を用い
るＮ−MMT−Ｃ6アミノモディファイヤーを添加した。こ
れはクロンテック ラボラトリイズ、パロアルト、CAか
ら市販されているモノメトキシトリチル保護アミノ結合
ホスホルアミダイトである。このモノメトキシトリチル
基はDNA合成器の標準トリチル開裂プロトコルを用いて
除去し、次いでDNA合成カラムを、FMOC化学を行うこと
ができるABIペプチド合成器に置いた。標準FMOCペプチ
ド合成プロトコルを用いて、４単位と８単位のアミノ酸
ペプチドをCPG支持オリゴヌクレオチドの５′末端アミ
ンに共役させた。合成完了後、ペプチドの末端アミンを
標準ペプチドキャッピングプロトコルを用いてアセチル
化した。
次に合成カラムをABI DNA合成器に置きペプチド−オ
リゴヌクレオチドを支持体から開裂除去し上記のような
条件を用いるHPLCによって精製し、ペプチド−オリゴヌ
クレオチドAc−（PHe-Ala）2または４−NH（CH2）6−ホ
スフェート５′GGC ACC ATT AAA GAA-AAT ATC ATC T−
３′を生成した。ペプチド−オリゴヌクレオチドをオリ
ゴヌクレオチド標的の存在で実施例7Aに記載したように
蛍光標識オリゴヌクレオチドに結合させた。CE分析は図
９に示した。
実施例６ プローブのキャピラリー電気泳動分離 キャピラリー電気泳動分離（CE）はレーザー基礎検出
器を含むCEブレッドボードを用いて行った。この装置は
高圧電力供給器、手動真空ポンプ、および検出光に530n
mRDFフィルターを備えたPMT検出器を含む。レーザーは4
0mWのArイオンレーザーであった。装置に使用したキャ
ピラリーチューブは長さ55cmで50μm i.d.および350μ
ｍの溶融シリカキャピラリーチューブであった。
アースしたカソード受容器とアノード受容器は8Mの尿
素を含む75mMトリス−ホスフェート、pH7.6で充填し
た。
実施例４と同様に調製した０、１、２、または４ホス
フェート連結HEOユニットで誘導化した26量体のオリゴ
ヌクレオチドを含有するDNA混合物を、89mMトリス−ボ
レート緩衝液、pH7.6で、約10-8Ｍの最後DNA濃度まで希
釈した。約２ナノリットルのDNA溶液を、動電注入によ
ってチューブのカソード末端に引き入れた。
電気泳動装置を実験中は約15kV（約270V/cm）の電圧
にセットして実験した。蛍光検出は530nmであった。検
出器の出力信号はHPモデル3396A積分器／プロッターで
積分しプロットした。
得られた電気泳動図は図６に示す。主ピークの上の数
字は電気泳動時間を分で示す。全実験時間は約22分であ
る。一番早い走行ピークは20.397分の走行時間であり、
誘導化していないオリゴヌクレオチドに相当する。１、
２、および4HEOグループのオリゴヌクレオチドはそれぞ
れ、20.612、20.994、および21.558の移動ピーク時間で
ある。
実施例７ 鋳型誘導プローブおよび電気泳動による分離 A.プローブエレメントの連結反応 シーケンス５′GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC T
−３′をもつ第一のプローブはテトラペプチドPhe-Ala-
Phe-Ala、または実施例５に示した方法に従ってオクタ
ペプチドPhe-Ala-Phe-Ala-Phe-Ala-Phe-Alaのいずれか
で誘導化した。シーケンス５′Ｐ−TTG GTC TTT CCT AT
G ATG AAT ATA G JOE 3′をもつ第二のプローブは標準
方法によって調製した。
プローブは嚢胞性繊維症遺伝子のF508領域を示す48−
塩基オリゴヌクレオチドに対して標的にする。標的への
プローブハイブリッド形成およびハイブリッド形成した
プローブの連結反応は次のように実質的に行われた： ペプチド誘導化オリゴヌクレオチド（50nM、20μ
ｌ）、および蛍光標識オリゴヌクレオチド（50nM、20μ
ｌ）を標識オリゴヌクレオチド（50nM、20μｌ）；鮭精
子DNA（4ug/10μｌ、20μｌ）;10×反応緩衝液（200mM
トリス・HCl pH7.1;1M KCl;100mM MgCl2;100mMジチオト
レイトール;10mMニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）（20μｌ）；リガーゼ（30ユニット、100ユニット
／μｌ、エピセントレ テクノロジイズ アンプリガー
ゼ、マジソン、WI）および100μｌの蒸留水と混合し
た。調製した試料は50ulの油を塗りパーキンエルマーセ
ッスDNAサーマルサイクラー（ノーウォーク、CT）中で9
4℃にて３分間加熱し、次に62℃にて60分間加熱した。
B.篩分けていない媒体中のプローブのキャピラリー電気
泳動分離 上記からの脱離し連結したおよび連結していないプロ
ーブをエタノール沈澱し、篩分けしていないマトリック
ス中でCE電気泳動によって分析した。キャピラリーチュ
ーブはDB−５−被覆キャピラリー（J ＆ W Scientific,
Folsom,CA）、55mm長さ、検出器に40mmであった。この
キャピラリーを電気泳動の前に0.5％界面活性剤溶液で
被覆し、キャピラリー壁をさらに親水性にした。種々の
界面活性剤、例えばBRIJ（登録商標）およびTWEEN（登
録商標）jeffamineクラスの界面活性剤が、このために
入手できる。
10μｌの試料を95℃まで２分間加熱し、チューブに入
れた。緩衝液媒体および電気泳動媒体は75mMトリス−ホ
スフェート緩衝液、pH8.0、8M尿素、10％（v/v）メタノ
ールであった。電気泳動走行条件は、実施例６に記載し
たように行った。電気泳動図の結果は上記の図９に示
す。
実施例８ 連結したプローブのLCR増幅と分離 次の４つのプローブを調製した： （１） この場合にはユニットは12量体（２または４の
12量体）のエチレンオキシドであること以外は、実施例
４に記載した合成方法に従って、２または４ユニットの
DEO（ドデシルエチレンオキシド）ポリマー鎖を用い
て、５′末端に５′GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC
T−３′を誘導した。
（２） ５′Ｐ−TTG GTG TTT CCT ATG ATG AAT ATA G
3′−JOEは実施例７のように調製した。
（３） ５′ROX-CTA TAT TCA TCA TAG GAA ACA CCA AA
3′−OHは公表された方法（アプライド バイオシスレ
ムズ）に従って調製した；そして （４） ５′−Ｐ−GAT GAT ATT TTC TTT AAT GGT GCC
−３′TAMRAは：公表された方法（アプライド バイオ
システムズ、カルサース、コンネル）を用いる３′−ア
ミン−ON CPG、５′−ホスフェート−ONおよびTAMRA-NH
S（ABI）で調製した。
プローブ１と２は、実施例７のように、嚢胞繊維症遺
伝子のF508領域の１本鎖の部分をスパンするように設計
する。プローブ３と４は、遺伝子の反対側の鎖のF508領
域の同じ部分をスパンするように設計する。リガーゼ鎖
反応は公表された方法（ウィン−ディーン）に従って行
われた。簡単に述べると、LCRアッセイは、１リットル
につき100mmolのＫ+、10mmolのMg2+、10mmolのジチオト
レイトール、1mlのトリトンＸ−100、および1mmolのNAD
+を含む20mmol/1のトリス・HCl緩衝液中、pH7.6で行わ
れた。各100μｌ反応混合物は４個のオリゴヌクレオチ
ドおよび15Uの熱安定リガーゼ（エピセントル テクノ
ロジーズ、マジソン、WI）の各々を1pmol含んでいた。
ヒトゲノムの複雑さを模倣するため、４μｇの鰊***DN
Aを各反応混合物に添加した。反応はThin Walled Gene-
Amp（登録商標、パーキン−エルマー セチュス、ノル
ウォーク、CT）反応管で100μｌの無機油でオーバーレ
イした100μｌの部分標本で行った。全LCR反応はパーキ
ン−エルマー セチュス モデル9600熱循環器中で30サ
イクルの94℃（10秒）および60℃（２分）で行った。循
環プロトコルの終わりに、反応物を４℃まで冷却した。
試料をエタノール沈澱し篩分けしていないマトリック
ス中でCE電気泳動によって分析した。キャピラリーチュ
ーブは、実施例７のように被覆キャピラリーであった。
10μｌの試料を95℃まで２分間加熱し、チューブに入れ
た。緩衝液媒体および電気泳動媒体は75mMトリス−ホス
フェート緩衝液、pH8.0、8M尿素、10％（v/v）メタノー
ルであった。電気泳動走行条件は、実施例７に記載した
ように行った。電気泳動図の結果は上記の図11に示す。
実施例９ 篩分けしていない液体媒体中のDNA配列決定 本発明によるDNA配列決定は、DNA配列決定への標準鎖
終止アプローチにおいて配列決定プライマーとして結合
するポリマー／ポリマー鎖共役体を用意して行った。好
ましくは、同じポリマー鎖を各結合ポリマーに結合させ
て配列決定用のプライマーを形成する。DNAの鋳型鎖に
アニーリングした後、プライマーはヌクレオシドホスフ
ェート前駆体および鎖終止ヌクレオチドの存在でポリメ
ラーゼで伸長し、プライマーが標識を付けているかまた
は鎖ターミネーターが標識を付けているかどうかによっ
て、１またはそれ以上の組の異なる大きさのDNA断片を
形成する。DNA断片は各々共通の起源を有し、結合ポリ
マーは、既知の塩基で終り、同じポリマー鎖に同様に共
役させる。組の各々のDNA断片は次いで篩分けしていな
い液体媒体中で大きさによって電気泳動により分離す
る。
この実施例では、次の47量体の合成ポリヌクレオチド
を配列決定鋳型として用いる。
５′−TCTATATTCATCATAGGAAACACCAATGATATTTTCTTTAATGG
TGC−３′ 11量体ヘキサエチレンオキシドポリマー鎖をもつ次のプ
ライマーを実施例１−４に記載したように合成する： ５′−（HEO）11-GCACCATTAAAGAAAATATCAT−３′ 次のことを除いては、染料標識鎖終止ヌクレオチドを
用いる配列決定反応用の製造業者のプロトコルを用い
て、アプライド バイオシステムズ モデル 373自動
化DNAシーケンサーで配列決定を行った。実施例７のキ
ャピラリー分離装置は４色蛍光測定には形成されていな
いので、分離した４回の反応を行った:4つの鎖終止ヌク
レオチドの各々について１回。製造業者のプロトコルに
従って鋳型から伸長生成物を融解した後、４つの配列決
定反応の伸長生成物を別々に実施例７に記載したように
キャピラリー電気泳動によって分離する。期待されたよ
うに、２本のピークがジデオキシシチジン伸長生成物で
観察され、７本のピークがジデオキシアデノシン伸長生
成物で観察され、10本のピークがジデオキシチミジン伸
長生成物で観察され、そして６本のピークがジデオキシ
グアノシン伸長生成物で観察される。
本発明は種々の応用、方法、および構成物に関して記
載したが、種々の変更および改変を本発明から逸脱する
ことなく行うことができることは高く評価されるだろ
う。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９７３，１１８ (32)優先日 1992年11月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 メンチェン，スティーブン，マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94536 フレモント，バンダ ウェイ 768 (72)発明者 ウー，サム，リイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94061 レッドウッド シティ，カーロ スアベニュ 450 (72)発明者 ウイン−ディーン，エミリイ，スーザン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94404 フォスター シティ，スチルト コート 239 (56)参考文献 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．42 （1989） Ｐ．601−606 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳＰＲＥＶＩＥＷＳ

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１またはそれ以上の異なるシーケンスのポ
    リヌクレオチドを形成し、各異なるシーケンスのポリヌ
    クレオチドは（ｉ）検出できるレポーター標識および
    （ii）各異なるシーケンスのポリヌクレオチドに電荷／
    並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合ポリマー鎖を含
    み、 前記ポリヌクレオチドを、篩分けしていないマトリック
    ス中でキャピラリー電気泳動によって分別し、そして 分別したポリヌクレオチドを検出する 工程から成る、篩分けしていない媒体中で電気泳動によ
    り異なるシーケンスのポリヌクレオチドを識別する方
    法。
  2. 【請求項２】ポリマー鎖が実質的に同じ長さであり、前
    記異なるシーケンスのポリヌクレオチドが異なる長さで
    ある、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】DNAをジデオキシ鎖終結によって配列決定
    するため、前記ポリヌクレオチドを前記ポリマー鎖が共
    有結合している５′−プライマーを用いて形成する、請
    求項２の方法。
  4. 【請求項４】各異なるシーケンスのポリヌクレオチドの
    ３′−末端ヌクレオチドを識別するために有効なスペク
    トルにより解像できる染料で共役的に標識を付けるジデ
    オキシヌクレオチドで３′−末端にて、前記異なるシー
    ケンスのポリヌクレオチドが終結する、請求項３の方
    法。
  5. 【請求項５】試料中の１またはそれ以上の標的シーケン
    スを検出するために、前記形成する工程が、 １またはそれ以上の異なるシーケンスプローブを用意
    し、 各異なるシーケンスプローブが（ｉ）検出できるレポー
    ター標識および（ii）各異なるシーケンスのポリヌクレ
    オチドに電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を分与する結合
    ポリマー鎖を含み、 前記プローブと標的ポリヌクレオチドとを、標的ポリヌ
    クレオチドとシーケンス相補的プローブとがハイブリッ
    ド形成するために有効な条件下に反応させ、そこでは標
    的ポリヌクレオチドは前記反応の前または後に固体支持
    体上に固定化されており、 固定化した標的ポリヌクレオチドを洗浄してシーケンス
    特異的方法で標的ポリヌクレオチドに結合していないプ
    ローブを除去し、そして 標的ポリヌクレオチドを変性して標的ポリヌクレオチド
    にハイブリッド形成した異なるシーケンスのプローブを
    脱離し、電気泳動による分離のための異なるシーケンス
    のポリヌクレオチドを形成する 各工程から成る、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】前記異なるシーケンスのプローブが実質的
    に同じ長さである、請求項５の方法。
  7. 【請求項７】試料中の１またはそれ以上の標的シーケン
    スを検出するために、前記形成する工程が、（ｉ）標的
    ポリヌクレオチドに１またはそれ以上のシーケンス特異
    的プローブを付加し、各プローブが、標的シーケンス中
    の隣接領域に結合するために有効である第１と第２のプ
    ローブオリゴヌクレオチドを有し、そして前記第１と第
    ２のプローブオリゴヌクレオチドは前記ポリマー鎖で誘
    導化され、（ii）プローブを標的ポリヌクレオチドと、
    各プローブ中で前記第１と第２のプローブオリゴヌクレ
    オチドをそれらの特異的標的シーケンスに結合するため
    に有効な条件下に反応させ、（iii）標的ポリヌクレオ
    チドに結合した前記オリゴヌクレオチドを、それらの末
    端サブユニットが隣接する標的塩基と塩基対になってい
    るとき標的結合オリゴヌクレオチドの末端サブユニット
    を連結するために有効な条件下に連結させ、連結したプ
    ローブを形成し、そして（iv）連結したプローブを標的
    ポリヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスの
    ポリヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項１の方
    法。
  8. 【請求項８】前記ポリマー鎖が前記第１のプローブオリ
    ゴヌクレオチドに共役結合しており、そして各前記第２
    のプローブオリゴヌクレオチドがレポーター標識を付け
    ている、請求項７の方法。
  9. 【請求項９】前記脱離前に、前記連結したプローブをプ
    ローブ結合および連結反応の繰り返しのサイクルによっ
    て増幅する、請求項７の方法。
  10. 【請求項１０】各プローブ中の第２のプローブオリゴヌ
    クレオチドが、（ｉ）会合した標的シーケンスの同じ位
    置において代替シーケンスに相補的であり、そして（i
    i）異なる検出できるレポーターで誘導化される２つの
    代替シーケンスオリゴヌクレオチドを含み、そして前記
    検出工程が（ａ）プローブと会合した標的シーケンスを
    同定する各プローブのサイン電気泳動移動度、および
    （ｂ）標的シーケンスの突然変異状態を同定するサイン
    レポーター部分に従って、各前記標的シーケンスの突然
    変異状態を決定することを含む、請求項７の方法。
  11. 【請求項１１】試料中の１またはそれ以上の標的シーケ
    ンスを検出するために、前記形成する工程が、（ｉ）標
    的ポリヌクレオチドに１またはそれ以上のシーケンス特
    異的プローブを付加し、各プローブは、それぞれ、標的
    ポリヌクレオチド断片の相補的鎖の向い合った末端領域
    でハイブリッド形成するために有効な第１と第２のシー
    ケンス特異的プライマーオリゴヌクレオチドを有し、そ
    こでは各プローブ中の第１のプライマーオリゴヌクレオ
    チドがプローブ特異的ポリマー鎖で誘導化され、（ii）
    プローブを標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオ
    チドの相補的鎖の向い合った末端領域に両方のプライマ
    ーオリゴヌクレオチドを結合するために有効な条件下に
    反応させ、そして（iii）プライマー開始ポリメラーゼ
    鎖反応によって標的断片を増幅し、異なるシーケンスの
    ポリヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項１の方
    法。
  12. 【請求項１２】各前記第２のプライマーオリゴヌクレオ
    チドがレポーター標識を付け、そして前記異なるシーケ
    ンスのポリヌクレオチドが２本鎖である、請求項11の方
    法。
  13. 【請求項１３】前記形成する工程が、（ｉ）標的ポリヌ
    クレオチドに１またはそれ以上のシーケンス特異的プロ
    ーブを付加し、各プローブは、第１の１本鎖DNA断片お
    よび１本鎖RNAを含む第２の断片を含み、ポリマー鎖は
    前記第１の断片に結合し、そして検出できるレポーター
    標識は前記第２の断片に結合しており、（ii）プローブ
    を標的ポリヌクレオチドと、標的ポリヌクレオチド中の
    それらの特異的標的シーケンスに前記第１と第２の断片
    を結合するために有効な条件下に反応させ、（iii）ハ
    イブリッド形成したプローブをRNA/DNA基体に対して特
    異的なRNase酵素と反応させて、ポリマー鎖を欠いてい
    る修飾した標識プローブを形成し、そして（iv）修飾し
    ていないまたは修飾した両方の標識プローブを、標的ポ
    リヌクレオチドから脱離して前記異なるシーケンスのポ
    リヌクレオチドを形成する工程を含む、請求項１の方
    法。
  14. 【請求項１４】複数のシーケンス特異的プローブを含
    み、各々は（ａ）選択された結合条件下に、標的シーケ
    ンスの１つにポリマーを塩基特異的に結合するために設
    計されたサブユニットのプローブ特異的シーケンスをも
    つ結合ポリマー、および（ｂ）結合ポリマーに結合し、
    結合ポリマーの電荷／並進摩擦抵抗の比とは異なる比を
    もつポリマー鎖によって特徴づけられて成る、 標的ポリヌクレオチドにおける複数の異なるシーケンス
    の１またはそれ以上を検出する際に使用するためのプロ
    ーブ構成物。
  15. 【請求項１５】前記ポリマー鎖は、ポリエチレンオキシ
    ド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリペプチド、オリ
    ゴ糖、およびポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホン
    アミド、ポリスルホキシド、およびそれらのブロックコ
    ポリマー、荷電または非荷電連結基によって連結された
    多数のサブユニットのユニットから成るポリマーを含
    む、から成る群から選ばれる、請求項14の方法。
  16. 【請求項１６】各シーケンス特異的プローブがさらにレ
    ポーターを有する第２の結合ポリマーを含み、シーケン
    ス特異的プローブ中の上記第１および第２の結合ポリマ
    ーは、選ばれた標的シーケンスの隣接し接触する領域に
    塩基特異的方法で結合するために有効であり、シーケン
    ス特異的方法で標的シーケンスに結合したとき２つの結
    合ポリマーを連結させ、そして第１の結合ポリマーに結
    合したポリマー鎖が各連結したプローブ対に、電荷／並
    進摩擦抵抗の合わさった特有の比を与える、請求項14記
    載の構成物。
  17. 【請求項１７】各シーケンス特異的プローブがさらに第
    ２の結合ポリマーを含み、シーケンス特異的プローブ中
    の上記第１および第２の結合ポリマーは、選ばれた２本
    鎖の標的シーケンスの向い合った鎖の向い合った末端領
    域に塩基特異的方法で結合するために有効であり、各鎖
    中の標的領域の重合をプライマーに開始させ、そして第
    １の結合ポリマーに結合したポリマー鎖が各重合した領
    域に、電荷／並進摩擦抵抗の合わさった特有の比を与え
    る、請求項14記載の構成物。
  18. 【請求項１８】各シーケンス特異的プローブが、第１の
    １本鎖DNA断片および１本鎖RNAを含む第２の断片から成
    る結合ポリマーを含み、ポリマー鎖は前記第１の断片に
    結合し、検出できるレポーターは前記第２の断片に結合
    し、そして各ポリマー鎖は前記ポリマー鎖が結合してい
    るプローブに、電荷／並進摩擦抵抗の特有の比を与え
    る、請求項14記載の構成物。
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Families Citing this family (288)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
WO1993020236A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Applied Biosystems, Inc. Probe composition and method
US5470705A (en) 1992-04-03 1995-11-28 Applied Biosystems, Inc. Probe composition containing a binding domain and polymer chain and methods of use
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
JP3419850B2 (ja) * 1993-10-26 2003-06-23 株式会社日立製作所 核酸分別方法
US5976798A (en) * 1994-03-30 1999-11-02 Mitokor Methods for detecting mitochondrial mutations diagnostic for Alzheimer's disease and methods for determining heteroplasmy of mitochondrial nucleic acid
EP0754241B1 (en) * 1994-04-04 1998-12-02 Ciba Corning Diagnostics Corp. Hibridization-ligation assays for the detection of specific nucleic acid sequences
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7323298B1 (en) 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US5849483A (en) * 1994-07-28 1998-12-15 Ig Laboratories, Inc. High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US5834181A (en) * 1994-07-28 1998-11-10 Genzyme Corporation High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
WO1996006190A2 (en) * 1994-08-19 1996-02-29 Perkin-Elmer Corporation Coupled amplification and ligation method
GB9417211D0 (en) * 1994-08-25 1994-10-12 Solicitor For The Affairs Of H Nucleotide sequencing method
US5846719A (en) * 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
DE19508366C2 (de) * 1995-03-10 1998-01-29 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum direkten Nachweisen weniger Nucleinsäurestränge
US5630924A (en) * 1995-04-20 1997-05-20 Perseptive Biosystems, Inc. Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
WO1996041011A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6027890A (en) 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6706471B1 (en) * 1996-01-24 2004-03-16 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6020481A (en) * 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
AU730633B2 (en) 1996-05-29 2001-03-08 Phillip Belgrader Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6780982B2 (en) 1996-07-12 2004-08-24 Third Wave Technologies, Inc. Charge tags and the separation of nucleic acid molecules
JP4000605B2 (ja) * 1996-07-24 2007-10-31 株式会社日立製作所 Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置
AU3829197A (en) * 1996-09-03 1998-03-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method and apparatus for single molecule two color fluorescent detection and molecular weight and concentration determination
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
ATE319855T1 (de) 1996-12-10 2006-03-15 Sequenom Inc Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung
US6299881B1 (en) * 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
US20030013115A1 (en) * 1997-06-16 2003-01-16 Diversa Corporation, A Delaware Corporation Capillary array-based sample screening
US20020015997A1 (en) * 1997-06-16 2002-02-07 Lafferty William Michael Capillary array-based sample screening
JP3938982B2 (ja) * 1997-08-29 2007-06-27 オリンパス株式会社 Ｄｎａキャピラリィ
US6559296B2 (en) * 1997-08-29 2003-05-06 Olympus Optical Co., Ltd. DNA capillary
US6008379A (en) 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US5936087A (en) 1997-11-25 1999-08-10 The Perkin-Elmer Corporation Dibenzorhodamine dyes
US6583168B1 (en) 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
US6087102A (en) 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
IL138668A0 (en) * 1998-04-03 2001-10-31 Phylos Inc Addressable protein arrays
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
ATE258946T1 (de) * 1998-08-28 2004-02-15 Gryphon Sciences Verfahren zur herstellung von polyamidketten von genauer länge und deren konjugate mit proteinen
US6238565B1 (en) * 1998-09-16 2001-05-29 Varian, Inc. Monolithic matrix for separating bio-organic molecules
US7135284B1 (en) * 1999-02-05 2006-11-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Primer extension methods for production of high specific activity nucleic acid probes
US6635419B1 (en) 1999-02-16 2003-10-21 Applera Corporation Polynucleotide sequencing method
JP3628614B2 (ja) * 1999-03-15 2005-03-16 アプレラ コーポレイション 多重核酸検出のためのプローブ／移動度モディファイア複合体
US7014994B1 (en) 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US6506594B1 (en) 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6514700B1 (en) * 1999-04-30 2003-02-04 Aclara Biosciences, Inc. Nucleic acid detection using degradation of a tagged sequence
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6627400B1 (en) 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US20040248150A1 (en) * 1999-04-02 2004-12-09 Sharat Singh Methods employing oligonucleotide-binding e-tag probes
US20030235832A1 (en) * 2000-06-21 2003-12-25 Ahmed Chenna Multiplexed analysis by chromatographic separation of molecular tags
US7001725B2 (en) 1999-04-30 2006-02-21 Aclara Biosciences, Inc. Kits employing generalized target-binding e-tag probes
US6673550B2 (en) 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US6649351B2 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Aclara Biosciences, Inc. Methods for detecting a plurality of analytes by mass spectrometry
US7037654B2 (en) 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
DE19924606A1 (de) * 1999-05-28 2000-11-30 Graffinity Pharm Design Gmbh Ligand-Anker-Konjugate
US20020045182A1 (en) * 1999-07-16 2002-04-18 Lynx Therapeutics, Inc. Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
WO2001025481A1 (fr) * 1999-10-04 2001-04-12 Olympus Optical Co., Ltd. Procede de detection d'acide nucleique
US7332275B2 (en) 1999-10-13 2008-02-19 Sequenom, Inc. Methods for detecting methylated nucleotides
EP1136569A3 (en) 2000-03-24 2004-01-28 Bayer Corporation Nucleic acid probes having highly hydrophilic non-nucleosidic tags with multiple labels, and uses thereof
JP5508654B2 (ja) 2000-04-14 2014-06-04 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド リガーゼ検出反応を用いた核酸配列の違いの検出のための位置特定可能なアレイの設計方法
US6329801B1 (en) * 2000-04-24 2001-12-11 Volterra Semiconductor Corporation Switching regulator control system and method
US20030207300A1 (en) * 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US20030170734A1 (en) * 2000-04-28 2003-09-11 Stephen Williams Multiplexed assays using electrophoretically separated molecular tags
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
US7537938B2 (en) * 2000-04-28 2009-05-26 Monogram Biosciences, Inc. Biomarker detection in circulating cells
US20040067498A1 (en) * 2000-04-28 2004-04-08 Ahmed Chenna Detection of nucleic acid sequences by cleavage and separation of tag-containing structures
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
AU2001262994B2 (en) * 2000-05-08 2005-09-15 Qtl Biosystems Llc Improvements to the fluorescent polymer-qtl approach to biosensing
JP2004507226A (ja) * 2000-05-30 2004-03-11 ピーイー　コーポレイション　（エヌワイ） ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いて標的核酸を検出するための方法
US6887664B2 (en) 2000-06-06 2005-05-03 Applera Corporation Asynchronous primed PCR
US6632606B1 (en) 2000-06-12 2003-10-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods for single nucleotide polymorphism detection
US6958214B2 (en) 2000-07-10 2005-10-25 Sequenom, Inc. Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same
FR2812658B1 (fr) * 2000-08-01 2005-04-15 De Bruno Vandiere Procede d'analyse d'acides nucleiques
AU2001296668A1 (en) * 2000-10-05 2002-04-15 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed differential displacement for nucleic acid determinations
EP1364052A2 (en) * 2000-10-10 2003-11-26 Diversa Corporation High throughput or capillary-based screening for a bioactivity or biomolecule
JP4741170B2 (ja) * 2000-10-11 2011-08-03 アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー アニオン性リンカーを有する蛍光核酸塩基結合体
US7645721B2 (en) * 2001-02-02 2010-01-12 Richard Nagler End group activated polymers with oligonucleotide ligands
ES2441412T3 (es) * 2001-03-09 2014-02-04 Trovagene, Inc. Sondas conjugadas y detección óptica de analitos
US6743905B2 (en) 2001-04-16 2004-06-01 Applera Corporation Mobility-modified nucleobase polymers and methods of using same
CA2443999A1 (en) * 2001-04-16 2002-10-24 Applera Corporation Methods and compositions for nucleotide analysis
AU2002305658A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Aclara Biosciences, Inc. Analyzing phosphorylated proteins
JP2005505749A (ja) 2001-05-21 2005-02-24 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド タンパク質を分析するための方法および組成物
AU2002344221A1 (en) * 2001-05-26 2002-12-09 Aclara Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
EP1436426A4 (en) * 2001-10-24 2005-11-02 Singulex Inc METHOD FOR DETECTION OF GENETIC HAPLOTYPES BY MEANS OF INTERACTION WITH PROBES
US7045311B2 (en) * 2001-10-25 2006-05-16 Monogram Biosciences, Inc. Whole cell assay systems for cell surface proteases
CN1166422C (zh) * 2001-11-05 2004-09-15 北京源德生物医学工程股份有限公司 用于体外高能聚焦超声波治疗机的坐位架
WO2003051174A2 (en) * 2001-11-09 2003-06-26 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on alpha-2-macroglobulin
US20040067512A1 (en) * 2001-11-09 2004-04-08 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on Alpha-2-Macroglobulin
US20050053939A1 (en) * 2001-11-09 2005-03-10 Ahmed Chenna Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
CA2466821A1 (en) 2001-11-21 2003-06-05 Applera Corporation Digital assay
AU2003201159A1 (en) 2002-01-08 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease and medication efficacy
EP1478765A4 (en) * 2002-03-05 2006-12-06 Aclara Biosciences Inc MULTIPLEX ANALYSIS WITH MEMBRANE-BONDED SENSITIVATORS
US20030177380A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-18 Woods Stanley P. Devices for storing array data and methods of using the same
JP2003294742A (ja) * 2002-03-29 2003-10-15 Inst Of Physical & Chemical Res ハイブリダイゼーション用基板及びその使用方法
US7432342B2 (en) 2002-05-03 2008-10-07 Sequenom, Inc. Kinase anchor protein muteins, peptides thereof and related documents
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229299A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Badal M. Youssouf Intracellular complexes as biomarkers
US7402397B2 (en) * 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US20040229293A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US20040229294A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US20040175765A1 (en) * 2002-07-05 2004-09-09 Sharat Singh Cell-screening assay and composition
CN1672054A (zh) * 2002-07-25 2005-09-21 阿克拉若生物科学公司 检测受体寡聚化
EP2385138A1 (en) 2002-07-31 2011-11-09 University of Southern California Polymorphisms for predicting disease and treatment outcome
US7381317B2 (en) 2002-08-12 2008-06-03 Beckman Coulter, Inc. Methods and compositions for capillary electrophoresis (CE)
JP2006500034A (ja) 2002-09-19 2006-01-05 アプレラ コーポレイション 標的を検出するための方法および組成物
US20040235005A1 (en) * 2002-10-23 2004-11-25 Ernest Friedlander Methods and composition for detecting targets
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
US20050164205A1 (en) * 2002-11-19 2005-07-28 Singulex, Inc. Charge and mass tags for detection and analysis
AU2003295745A1 (en) * 2002-11-19 2004-06-15 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays
AU2003294417A1 (en) * 2002-11-19 2004-06-15 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays and analysis
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
US20090088982A1 (en) * 2003-07-31 2009-04-02 Fukushima Noelle H Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules
CA2535510C (en) * 2003-08-11 2013-10-15 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US7570443B2 (en) 2003-09-19 2009-08-04 Applied Biosystems, Llc Optical camera alignment
US20050112634A1 (en) * 2003-09-19 2005-05-26 Woudenberg Timothy M. High density sequence detection methods and apparatus
EP1680666A4 (en) * 2003-10-27 2008-03-26 Monogram Biosciences Inc ANTI-THERAPEUTIC HUMAN ANTIBODY DETECTION
US20050094807A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-05 John Silzel Accuracy array assay system and method
WO2005066362A2 (en) * 2004-01-10 2005-07-21 Bayer Healthcare Llc Haplotypes and polymorphisms linked to human thiopurine s-methyltransferase deficiencies
US7604937B2 (en) * 2004-03-24 2009-10-20 Applied Biosystems, Llc Encoding and decoding reactions for determining target polynucleotides
US20050255485A1 (en) * 2004-05-14 2005-11-17 Livak Kenneth J Detection of gene duplications
EP2290071B1 (en) 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
US20060003337A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 John Brandis Detection of small RNAS
CA2572384A1 (en) 2004-07-01 2006-02-02 University Of Southern California Genetic markers for predicting disease and treatment outcome
PL2302055T3 (pl) 2004-11-12 2015-02-27 Asuragen Inc Sposoby i kompozycje z wykorzystaniem miRNA oraz cząsteczek inhibitorowych miRNA
EP1856280A4 (en) * 2005-01-12 2009-09-09 Applera Corp COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR SELECTIVE AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
JP2008537875A (ja) 2005-03-14 2008-10-02 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 固形臓器移植レシピエントにおいて移植片生着を評価するための方法および組成物
EP1856293A2 (en) * 2005-03-16 2007-11-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
ATE454476T1 (de) 2005-04-14 2010-01-15 Applied Biosystems Llc 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden
EP1731620A1 (en) 2005-06-07 2006-12-13 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for the diagnosis of immune graft tolerance
US20070087360A1 (en) * 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
US20070014699A1 (en) 2005-06-23 2007-01-18 Beckman Coulter, Inc, Methods and apparatus for improving the sensitivity of capillary zone electrophoresis
US20070099211A1 (en) * 2005-07-15 2007-05-03 Vissarion Aivazachvili Detection of nucleic acid amplification
WO2007011867A2 (en) * 2005-07-15 2007-01-25 Applera Corporation Fluid processing device and method
AU2006299141B2 (en) 2005-09-22 2011-11-24 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods of using IL-21
WO2007047408A2 (en) * 2005-10-12 2007-04-26 Pathologica, Llc. Promac signature application
EP1991268A4 (en) 2006-03-03 2009-08-26 Univ Southern California POLYMORPHISMS OF THE GENES OF THE PATH OF ANGIOGENESIS FOR CHOICE OF THERAPY
US20070215472A1 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Slater Gary W Electroosmotic flow for end labelled free solution electrophoresis
US20070218494A1 (en) * 2006-03-17 2007-09-20 Gary Slater Branched polymer lables as drag-tags in free solution electrophoresis
US7759062B2 (en) * 2006-06-09 2010-07-20 Third Wave Technologies, Inc. T-structure invasive cleavage assays, consistent nucleic acid dispensing, and low level target nucleic acid detection
EP2041574B1 (en) 2006-07-14 2016-11-16 The Regents of The University of California Cancer biomarkers and methods of use threof
AU2007299748A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR -31,miR -145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216 miR-331, mmu-miR-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008036765A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
US20080145898A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Applera Corporation Sequencing methods
US8114599B2 (en) 2006-12-19 2012-02-14 Northwestern University Compositions and methods for free-solution conjugate nucleic acid analysis
EP2132341A2 (en) 2007-01-18 2009-12-16 University Of Southern California Polymorphisms in the egfr pathway as markers for cancer treatment
WO2008088861A2 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 University Of Southern California Gene polymorphisms predictive for dual tki therapy
NZ579048A (en) 2007-01-30 2012-05-25 Pharmacyclics Inc Methods for determining cancer resistance to histone deacetylase inhibitors
FI20075124A0 (fi) * 2007-02-21 2007-02-21 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testikitti nukleotidivariaatioiden toteamiseksi
EP1961825A1 (en) 2007-02-26 2008-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Method for predicting the occurrence of metastasis in breast cancer patients
EP2118322A2 (en) 2007-03-13 2009-11-18 Amgen Inc. K-ras and b-raf mutations and anti-egfr antibody therapy
CA2680326A1 (en) 2007-03-13 2008-09-18 Amgen Inc. K-ras mutations and anti-egfr antibody therapy
US9121843B2 (en) 2007-05-08 2015-09-01 Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
US8008010B1 (en) 2007-06-27 2011-08-30 Applied Biosystems, Llc Chimeric oligonucleotides for ligation-enhanced nucleic acid detection, methods and compositions therefor
US8357277B2 (en) * 2007-11-27 2013-01-22 Laboratory Corp. of America Holdings Enhanced method for detecting and/or quantifying an analyte in a sample
US8658379B2 (en) 2008-01-29 2014-02-25 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Follistatin-like protein-1 as a biomarker for sepsis
WO2009097424A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Fstl-1 as a biomarker of inflammation
EP2113574A1 (en) 2008-04-28 2009-11-04 Biotype AG Substances and methods for a DNA based profiling assay
WO2009137807A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
EP2297347B1 (en) 2008-05-14 2017-03-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and kits for monitoring the effects of immunomodulators on adaptive immunity
WO2009145802A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 The Trustess Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for integrating a single dna molecule into a molecular electronic device
US8208909B2 (en) 2008-06-02 2012-06-26 West Corporation System, apparatus and method for availing a mobile call of address information
US20110201519A1 (en) 2008-08-18 2011-08-18 Sarwal Minnie M Methods and Compositions for Determining a Graft Tolerant Phenotype in a Subject
WO2010065517A1 (en) 2008-12-01 2010-06-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Electromechanical devices and methods for fabrication of the same
DE102009010563A1 (de) 2009-02-16 2010-08-26 Matthias W. Engel Vorrichtung zum Nachweis von Analyten in Körperflüssigkeiten
WO2010123625A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 University Of Southern California Cd133 polymorphisms predict clinical outcome in patients with cancer
WO2011004345A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Upstream binding protein 1 polymorphisms and their use for prognosing or diagnosing arterial blood pressure
EP2615460B1 (en) 2009-08-22 2014-06-25 The Board Of Trustees Of The University Of the Leland Stanford Junior University Imaging and evaluating embryos, oocytes, and stem cells
AU2010301128B2 (en) 2009-09-30 2014-09-18 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
WO2011058164A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Pangaea Biotech, S.A. Molecular biomarkers for predicting response to tyrosine kinase inhibitors in lung cancer
CA2782803C (en) 2009-12-02 2020-09-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarkers for determining an allograft tolerant phenotype
GB0922085D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Cambridge Entpr Ltd Cancer diagnosis and treatment
US20120288861A1 (en) 2009-12-21 2012-11-15 Heinz-Josef Lenz Germline polymorphisms in the sparc gene associated with clinical outcome in gastric cancer
WO2011085334A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 University Of Southern California Cd44 polymorphisms predict clinical outcome in patients with gastric cancer
TWI518325B (zh) 2010-02-04 2016-01-21 自治醫科大學 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
EP3214174B1 (en) 2010-03-04 2019-10-16 InteRNA Technologies B.V. A mirna molecule defined by its source and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with emt
MX2012012235A (es) 2010-04-19 2012-11-23 Procter & Gamble Firmas geneticas y matrices geneticas asociadas con la administracion de corriente de radio frecuencia conducida electricamente a la piel y metodos y tratamiento relacionados a ellos.
CN102858265A (zh) 2010-04-19 2013-01-02 宝洁公司 针对调节哺乳动物皮肤状况的组合的能量和局部用组合物应用
EP2564200B8 (en) 2010-04-27 2019-10-02 The Regents of The University of California Cancer biomarkers and methods of use thereof
WO2011143556A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Gen9, Inc. Methods for nucleotide sequencing and high fidelity polynucleotide synthesis
WO2011146725A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Bayer Healthcare Llc Biomarkers for a multikinase inhibitor
US8586301B2 (en) 2010-06-30 2013-11-19 Stratos Genomics, Inc. Multiplexed identification of nucleic acid sequences
EP3369817A1 (en) 2010-07-06 2018-09-05 InteRNA Technologies B.V. Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma , or in diseases or conditions with activated braf pathway
WO2012019099A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Follistatin-like-protein-1 as a biomarker for inflammatory disorders
EP2619574B1 (en) 2010-09-15 2020-10-28 Almac Diagnostic Services Limited Molecular test for predicting responsiveness to dna-damage therapeutic agents in individuals having cancer
WO2012051301A1 (en) 2010-10-12 2012-04-19 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying modulators of triglyceride metabolism, for modulating triglyceride metabolism and for identifying subjects at risk for abnormal triglyceride metabolism
EP2772550B1 (en) 2010-11-17 2017-03-29 Interpace Diagnostics, LLC Mirnas as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
US8486717B2 (en) 2011-01-18 2013-07-16 Symbolics, Llc Lateral flow assays using two dimensional features
EP2492688A1 (en) 2011-02-23 2012-08-29 Pangaea Biotech, S.A. Molecular biomarkers for predicting response to antitumor treatment in lung cancer
PT2678675T (pt) 2011-02-23 2018-02-07 Univ Leland Stanford Junior Métodos de deteção de aneuploidia em embriões humanos
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
CN110564819A (zh) 2011-05-19 2019-12-13 基纳生物技术有限公司 用于多重核酸鉴定的产品和方法
AU2012261820B2 (en) 2011-06-02 2017-01-19 Almac Diagnostics Limited Molecular diagnostic test for cancer
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
WO2013063519A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
WO2013063544A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Asuragen, Inc. Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors
EP2775844B1 (en) 2011-10-28 2019-12-11 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers of response to nae inhibitors
WO2013071163A2 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Millennium Pharamaceuticals, Inc. Biomarkers of response to proteasome inhibitors
WO2013071142A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers of response to proteasome inhibitors
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
US20150152499A1 (en) 2012-07-03 2015-06-04 Interna Technologies B.V. Diagnostic portfolio and its uses
US9874556B2 (en) 2012-07-18 2018-01-23 Symbolics, Llc Lateral flow assays using two dimensional features
WO2014015098A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. A method of normalizing biological samples
WO2014039092A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 Life Technologies Corporation Multiplex y-str analysis
CN104822844B (zh) 2012-10-01 2019-05-07 米伦纽姆医药公司 预测对抑制剂的反应的生物标记物和方法以及其用途
WO2014055117A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
CA2889765C (en) 2012-10-26 2021-06-22 Minna D. BALBAS Androgen receptor variants and methods for making and using
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
CA2892361A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of a wee1 inhibitor for treating a cancer characterized by low pkmyt1 expression levels
EP2925885B1 (en) 2012-12-03 2020-02-05 Almac Diagnostic Services Limited Molecular diagnostic test for cancer
US9599615B2 (en) 2013-03-13 2017-03-21 Symbolics, Llc Lateral flow assays using two dimensional test and control signal readout patterns
EP2971132B1 (en) 2013-03-15 2020-05-06 Baylor Research Institute Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer
EP3404116B1 (en) 2013-03-15 2022-10-19 The University of Chicago Methods and compositions related to t-cell activity
CA2905949A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Baylor Research Institute Ulcerative colitis (uc)-associated colorectal neoplasia markers
CA2910019A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Quantapore, Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed fret detection
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
US9670545B2 (en) 2013-06-11 2017-06-06 Coutagen Life Sciences, Inc. Methods and kits for treating and classifying individuals at risk of or suffering from TRAP1 change-of-function
GB2533173A (en) 2013-08-05 2016-06-15 Twist Bioscience Corp De Novo synthesized gene libraries
EP3084003A4 (en) 2013-12-17 2017-07-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Ifn-gamma gene signature biomarkers of tumor response to pd-1 antagonists
GB201409479D0 (en) 2014-05-28 2014-07-09 Almac Diagnostics Ltd Molecular diagnostic test for cancer
EP3126520B1 (en) 2014-04-04 2021-06-09 Amgen, Inc. Amg-337 for use in the treatment of cancers having a met amplification
WO2016025510A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Rappolee Daniel A Systems and methods to detect stem cell stress and uses thereof
AU2015330841B2 (en) 2014-10-10 2019-08-15 Quantapore, Inc. Nanopore-based polymer analysis with mutually-quenching fluorescent labels
GB201418892D0 (en) * 2014-10-23 2014-12-10 Proqr Therapeutics B V DNA editing
CA2964790C (en) 2014-10-24 2023-02-21 Quantapore, Inc. Efficient optical analysis of polymers using arrays of nanostructures
EP3227687A4 (en) 2014-12-05 2018-10-24 Prelude, Inc. Dcis recurrence and invasive breast cancer
RU2017123117A (ru) 2014-12-09 2019-01-10 Мерк Шарп И Доум Корп. Система и способы получения биомаркеров генных сигнатур ответа на антагонисты pd-1
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
EP3283882B1 (en) 2015-04-17 2020-12-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Blood-based biomarkers of tumor sensitivity to pd-1 antagonists
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
AU2016250849A1 (en) 2015-04-24 2017-11-02 Agena Bioscience, Inc. Multiplex methods for detection and quantification of minor variants
JP2018512880A (ja) 2015-04-24 2018-05-24 アジーナ バイオサイエンス， インコーポレイテッド 少量の対立遺伝子および多型の同定ならびに定量のためのマルチプレックス法
GB201512869D0 (en) 2015-07-21 2015-09-02 Almac Diagnostics Ltd Gene signature for minute therapies
EA201890763A1 (ru) 2015-09-18 2018-08-31 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантных олигонуклеиновых кислот и их синтез
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
CN108603307A (zh) 2015-12-01 2018-09-28 特韦斯特生物科学公司 功能化表面及其制备
CN109073654A (zh) 2016-04-20 2018-12-21 苏州爱尔迪思生物科技有限公司 用于预测早产的方法和组合物
WO2017197573A1 (en) 2016-05-17 2017-11-23 Ldx Prognostics Limited Co. Methods and compositions for providing preeclampsia assessment
CN109477813A (zh) 2016-07-05 2019-03-15 昆塔波尔公司 基于光学的纳米孔测序
SG11201901563UA (en) 2016-08-22 2019-03-28 Twist Bioscience Corp De novo synthesized nucleic acid libraries
CN110248724B (zh) 2016-09-21 2022-11-18 特韦斯特生物科学公司 基于核酸的数据存储
US10907274B2 (en) 2016-12-16 2021-02-02 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
US11550939B2 (en) 2017-02-22 2023-01-10 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage using enzymatic bioencryption
CA3056388A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Twist Bioscience Corporation Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
CN110719958B (zh) * 2017-04-06 2023-07-18 康博国际有限公司 构建核酸文库的方法和试剂盒
WO2018186947A1 (en) * 2017-04-06 2018-10-11 MyOmicsDx, Inc Method and kit for targeted enrichment of nucleic acids
SG11201908296VA (en) 2017-04-28 2019-10-30 Merck Sharp & Dohme Biomarkers for cancer therapeutics
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
GB2578844A (en) 2017-06-12 2020-05-27 Twist Bioscience Corp Methods for seamless nucleic acid assembly
CA3075505A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Twist Bioscience Corporation Gpcr binding proteins and synthesis thereof
WO2019079769A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 Twist Bioscience Corporation HEATED NANOWELLS FOR THE SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDES
CA3079524A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Interna Technologies B.V. Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
WO2019109016A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers and methods for treatment with nae inhibitors
JP7191448B2 (ja) 2018-01-04 2022-12-19 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｄｎａベースのデジタル情報ストレージ
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
US20210386829A1 (en) 2018-05-04 2021-12-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
KR20210013128A (ko) 2018-05-18 2021-02-03 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 하이브리드화를 위한 폴리뉴클레오타이드, 시약 및 방법
WO2020036926A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Cellecta, Inc. Multiplex preparation of barcoded gene specific dna fragments
AU2019339508A1 (en) 2018-09-14 2021-04-15 Prelude Corporation Method of selection for treatment of subjects at risk of invasive breast cancer
WO2020077135A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating resistance to bcl-2 inhibitors
WO2020176680A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
CN113766930A (zh) 2019-02-26 2021-12-07 特韦斯特生物科学公司 Glp1受体的变异核酸文库
EP3930714A4 (en) 2019-02-27 2022-10-26 Madera Therapeutics, LLC USE OF CASEINOLYTIC PROTEASE P FUNCTION AS A BIOMARKER OF DRUG RESPONSE TO IMIPRIDONE-LIKE AGENTS
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
US20220143148A1 (en) 2019-03-14 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells
EP3942023A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
US20220152148A1 (en) 2019-03-18 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling
CN113924085A (zh) 2019-04-12 2022-01-11 加利福尼亚大学董事会 用于增加肌肉量和氧化代谢的组合物和方法
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
CN110470760A (zh) * 2019-08-16 2019-11-19 谱尼测试集团吉林有限公司 塑料制品中聚乳酸含量的检测方法
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
WO2021127610A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 EDWARD Via COLLEGE OF OSTEOPATHIC MEDICINE Cancer signatures, methods of generating cancer signatures, and uses thereof
WO2022192419A2 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods of treating inflammatory bowel disease (ibd) with anti- tnf-blockade
WO2023158732A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
WO2024028794A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Temple Therapeutics BV Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4687732A (en) * 1983-06-10 1987-08-18 Yale University Visualization polymers and their application to diagnostic medicine
US5171534A (en) * 1984-01-16 1992-12-15 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5011769A (en) * 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US5093232A (en) * 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5525465A (en) * 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
US4879214A (en) * 1988-11-15 1989-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences
US5061361A (en) * 1989-03-06 1991-10-29 Hewlett-Packard Company Capillary zone electrophoresis cell system
US5108568A (en) * 1989-07-07 1992-04-28 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Controlled method of reducing electrophoretic mobility of macromolecules, particles or cells
DE69007773T2 (de) * 1990-02-13 1994-09-22 Bio Rad Laboratories Elektrophoretische Trennung in einem gelfreien Medium mittels gelösten Polymeren.
JP3889807B2 (ja) * 1990-05-03 2007-03-07 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド 遺伝病を検出するための熱安定リガーゼによるｄｎａ増幅系
US5096557A (en) * 1990-07-11 1992-03-17 Genetype A.G. Internal standard for electrophoretic separations
US5677440A (en) * 1990-07-16 1997-10-14 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates
EP0556301B1 (en) * 1990-11-08 2001-01-10 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
WO1993020236A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Applied Biosystems, Inc. Probe composition and method
US5470705A (en) * 1992-04-03 1995-11-28 Applied Biosystems, Inc. Probe composition containing a binding domain and polymer chain and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４２ （１９８９） Ｐ．６０１−６０６

Also Published As

Publication number Publication date
EP0635069B1 (en) 1997-10-29
DE69314946T2 (de) 1998-04-02
US5514543A (en) 1996-05-07
JPH07505529A (ja) 1995-06-22
US7115376B2 (en) 2006-10-03
WO1993020239A1 (en) 1993-10-14
ATE173767T1 (de) 1998-12-15
US6759202B2 (en) 2004-07-06
DE69322266D1 (de) 1999-01-07
US5624800A (en) 1997-04-29
WO1993020236A1 (en) 1993-10-14
EP0636186B1 (en) 1998-11-25
US20050112608A1 (en) 2005-05-26
US20030073108A1 (en) 2003-04-17
DE69322266T2 (de) 1999-06-02
DK0635069T3 (da) 1998-07-20
US5580732A (en) 1996-12-03
EP0636186A1 (en) 1995-02-01
ATE159765T1 (de) 1997-11-15
US5777096A (en) 1998-07-07
JP2701092B2 (ja) 1998-01-21
EP0635069A1 (en) 1995-01-25
JPH08504082A (ja) 1996-05-07
US5989871A (en) 1999-11-23
DE69314946D1 (de) 1997-12-04

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