JP2767119B2 - Human B lymphoblastoid cell line, antibody-producing hybridoma, antibody and method for producing antibody - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒトＢリンパ芽球様細胞株、抗体産生ハイ
ブリドーマ，抗体および抗体の製造法に関する。The present invention relates to a human B lymphoblastoid cell line, an antibody-producing hybridoma, an antibody, and a method for producing an antibody.

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発されたハイブリド
ーマを用いるモノクローナル抗体（以下、MoAbと略記す
ることがある）の製造法は、単一特異性を示す抗体を大
量にかつ安定的に得られるという利点を有しており、そ
の技術は広範囲に応用されている［Kohler,G.,Milstei
n,C.:ネイチャー（Nature），256,495（1975）］。特に
最近では抗原の検出・精製あるいは診断薬の開発だけで
なく、予防薬や治療薬の創製に大きく寄与しつつある。2. Description of the Related Art The monoclonal antibody (hereinafter sometimes abbreviated as MoAb) production method using a hybridoma developed by Koehler and Milstein has the advantage that a large amount of a monospecific antibody can be stably obtained. And its technology is widely applied [Kohler, G., Milstei
n, C .: Nature, 256 , 495 (1975)]. In particular, it has recently contributed not only to the detection and purification of antigens or the development of diagnostic agents, but also to the creation of prophylactic and therapeutic agents.

しかし、一方で予防薬・治療薬としてMoAbを用いる場
合、ヒトにとって異種蛋白であるマウスMoAbを投与する
ことは、ヒト体内でのマウスMoAbに対する抗体の産生に
よる治療効果の低減あるいは重篤なアレルギー反応を誘
起する危険性がある。したがって予防薬・治療薬として
は、ヒトMoAbを用いるのがはるかに望ましいが、一般に
その作製技術はマウスのそれに比べて著しく遅れてお
り、実際の成功例も少ない。ヒトMoAbはヒト−ヒトハイ
ブリドーマ，マウス−ヒテヘテロハイブリドーマあるい
はヒトリンパ球のエプスタイン−バーウイルス（以下、
EBVと略記することがある）トランスホーマントなどに
より産生されるが、後２者は抗体産生能の安定性および
増殖能に劣るため、前者のヒト−ヒトハイブリドーマに
よる産生が望ましい。しかし、ヒト−ヒトハイブリドー
マ作成における融合効率は一般に非常に低く、このため
医薬としてのヒトMoAbの開発は著しく遅れている。この
欠点を補うため、増殖能の優れた、またヒトリンパ球と
高い効率で融合できる親株の開発が進められ、山田らは
HO−323細胞株［山田耕路，村上浩紀：発酵と工業，45,
218（1987）］を、市森らはTAW−925細胞株［I chimor
i,Y.,Harada,K.,ら：バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
m.Biophym.Res.Comm.），142,805（1987）］を確立して
いる。しかし、さらに抗体産生能の安定なまた増殖能の
良いヒト−ヒトハイブリドーマを与え、かつ該ハイブリ
ドーマの製造に用いられるヒトリンパ球とさらに高い効
率で融合できる親株の開発が急がれているのが現状であ
る。However, when MoAb is used as a prophylactic or therapeutic agent, administration of mouse MoAb, which is a heterologous protein for humans, can reduce the therapeutic effect or produce a severe allergic reaction by producing antibodies against mouse MoAb in the human body. There is a risk of inducing. Therefore, it is much more desirable to use human MoAb as a prophylactic / therapeutic drug, but its production technology is generally significantly slower than that of a mouse, and there are few actual successes. Human MoAb is a human-human hybridoma, mouse-human heterohybridoma or human lymphocyte Epstein-Barr virus (hereinafter, referred to as “human Epstein-Barr virus”).
EBV (sometimes abbreviated as EBV), but the latter two are inferior in antibody production stability and proliferation ability, and therefore production by the former human-human hybridoma is desirable. However, the fusion efficiency in producing human-human hybridomas is generally very low, which has significantly delayed the development of human MoAbs as pharmaceuticals. To compensate for this drawback, the development of a parent strain with excellent proliferation ability and that can be fused with human lymphocytes with high efficiency has been developed.
HO-323 cell line [Koji Yamada, Hiroki Murakami: Fermentation and Industry, 45 ,
218 (1987)], and Ichimori et al., TAW-925 cell line [I chimor
i, Y., Harada, K., et al .: Biochemical and Biophysical Research Communications (Bioche
m. Biophym. Res. Comm.), 142 , 805 (1987)]. However, at present, the development of a parent strain that provides a human-human hybridoma having a more stable antibody-producing ability and a good growth ability and that can be fused with human lymphocytes used for the production of the hybridoma with higher efficiency has been rushed. It is.

発明が解決しようとする課題 本発明は、抗体を安定に産生し、また増殖能の優れた
ヒト−ヒトハイブリドーマ，該ハイブリドーマを用いる
抗体の製造法および該ハイブリドーマによって産生され
る抗体を提供するものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a human-human hybridoma that stably produces an antibody and has excellent proliferation ability, a method for producing an antibody using the hybridoma, and an antibody produced by the hybridoma. is there.

課題を解決するための手段 本発明者らはかかる技術的背景のもとに、ヒト癌細胞
あるいは緑膿菌外毒素Ａ（以下、PEAと略記することが
ある）に対して高い結合能を有するヒトモノクローナル
抗体を安定的に産生するヒト−ヒトハイブリドーマを作
成することを目的として鋭意研究した結果、６−チアグ
アニン（６−TG）抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細胞WI−L2
株（米国アルトンジョーンズ・セル・サイエンス・セン
ター所属のDr.G.Satoより提供を受けた）をウワバイン
添加の培養液に段階的に馴化させることにより作成され
るウワバイン抵抗性のヒトＢリンパ芽球様細胞株AC−33
（以下、AC−33株と略記することがある）が、EBVトラ
ンスホーマントと高い効率で融合し、また増殖能の優れ
たハイブリドーマが得られることを見い出し、ヒトMoAb
産生ハイブリドーマ取得のための有用な親株となること
を見い出した。Means for Solving the Problems Under such technical background, the present inventors have a high binding ability to human cancer cells or Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (hereinafter sometimes abbreviated as PEA). As a result of intensive studies aimed at producing a human-human hybridoma stably producing a human monoclonal antibody, 6-thiaguanine (6-TG) resistant human B lymphoblastoid cells WI-L2
A ouabain-resistant human B-lymphoblast created by gradually acclimating a strain (provided by Dr. G. Sato of the Alton Jones Cell Science Center, USA) to a culture solution containing ouabain. Cell line AC-33
(Hereinafter sometimes abbreviated as AC-33 strain) fused with EBV transformant with high efficiency, and found that a hybridoma having excellent growth ability was obtained.
It was found to be a useful parent strain for obtaining a produced hybridoma.

本発明者らは、さらに抗ヒト癌細胞抗体あるいは抗PE
A抗体産生EBVトランスホーマントをAC−33株と融合する
ことにより、安定に該抗体を産生するヒト−ヒトハイブ
リドーマを製造できること、さらに該ハイブリドーマか
ら抗ヒト癌細胞あるいは抗PEAヒトMoAbを製造できるこ
とを見い出し、これらの知見に基づいて、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。本明細書において、抗ヒト
癌細胞ヒトMoAbはヒト癌細胞と反応しうるヒトMoAbを示
し、抗PEAヒトMoAbはPEAと反応しうるヒトMoAbを示す。The present inventors have further developed an anti-human cancer cell antibody or anti-PE
By fusing the A antibody-producing EBV transformant with the AC-33 strain, a human-human hybridoma stably producing the antibody can be produced, and further, anti-human cancer cells or anti-PEA human MoAb can be produced from the hybridoma. As a result of further study based on these findings, the present invention has been completed. As used herein, anti-human cancer cell human MoAb refers to human MoAb capable of reacting with human cancer cells, and anti-PEA human MoAb refers to human MoAb capable of reacting with PEA.

本発明は、（１）ヒトＢリンパ芽球様細胞株AC−33
（FERM BP−2143）またはその継代株、（２）該AC−33
またはその継代株と、EBVによって形質転換されたヒト
リンパ球とのハイブリドーマ、および（３）該ハイブリ
ドーマを培地に培養し、ヒトモノクローナル抗体を採取
することを特徴とする抗体の製造法に関する。The present invention relates to (1) a human B lymphoblastoid cell line AC-33
(FERM BP-2143) or a substrain thereof, (2) the AC-33
Alternatively, the present invention relates to a hybridoma between the subculture thereof and human lymphocytes transformed with EBV, and (3) a method for producing an antibody, which comprises culturing the hybridoma in a medium and collecting a human monoclonal antibody.

ヒトＢリンパ芽球様細胞株AC−33は、HAT（ヒポキサ
ンチン，アミノプテリン，チミジン）感受性でかつウワ
バイン抵抗性であり、例えば米国アルトンジョーンズ・
セル・サイエンス・センター所属のDr.G.Satoより提供
を受けた６−TG抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細胞WI−L2株
の改良により作成できる。HAT感受性でかつウワバイン
抵抗性の細胞株は、一般的には公知の方法により調製で
きるが、本発明者らは例えばヒト由来リンパ芽球様細胞
株を培養する際に、培地中の６−TGおよびウワバイン濃
度を徐々に上昇させ、馴化させていくことにより、細胞
株の本来有している増殖性に影響を与えることなく、HA
T感受性・ウワバイン抵抗性の新しい細胞株を取得して
いる。具体的には、６−TG抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細
胞WI−L2株を0.01μＭ以下の低濃度、好ましくは0.002
〜0.005μＭ、さらに好ましくは0.003μＭ濃度のウワバ
イン含有培地にて培養し、得られる生細胞からヒト免疫
グロブリン非分泌型の細胞を選別する。得られる免疫グ
ロブリン非分泌性で低濃度ウワバイン抵抗性株は、さら
に高濃度のウワバインを含む培地、すなわち約1.5〜５
倍、好ましくは約1.5〜3.5倍、さらに好ましくは馴化の
初期段階で約1.5〜２倍，その後約２〜3.5倍にウワバイ
ンの濃度を上昇させた培地で培養を続け、免疫グロブリ
ン非分泌性であり、特にウワバインに対して強い抵抗性
を示す細胞株、好ましくは２μＭ濃度以上のウワバイン
に対して抵抗性を示す細胞株を作出・育種していく。こ
のようにしてマーカーを導入した細胞株は、ヒトモノク
ローナル抗体産生細胞との細胞融合の親株として用いら
れるが、特に高い融合効率を与える細胞株をクローニン
グなどによりあらかじめ選択しておくことが望ましい。The human B lymphoblastoid cell line AC-33 is HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) sensitive and ouabain resistant, for example, Alton Jones, USA
It can be prepared by improving the 6-TG-resistant human B lymphoblastoid cell line WI-L2 provided by Dr. G. Sato belonging to Cell Science Center. HAT-sensitive and ouabain-resistant cell lines can be prepared by generally known methods.However, the present inventors have found that, for example, when culturing a human-derived lymphoblastoid cell line, 6-TG By gradually increasing the concentration of ouabain and acclimatizing it without affecting the inherent growth potential of the cell line,
We have acquired a new T-sensitive and ouabain-resistant cell line. Specifically, the 6-TG resistant human B lymphoblastoid cell strain WI-L2 is used at a low concentration of 0.01 μM or less, preferably 0.002 μM or less.
The cells are cultured in an ouabain-containing medium having a concentration of 0.005 μM, more preferably 0.003 μM, and human immunoglobulin non-secretory cells are selected from the obtained viable cells. The resulting immunoglobulin non-secreting, low concentration ouabain resistant strain is a medium containing a higher concentration of ouabain, ie, about 1.5 to 5
The culture was continued in a medium in which the concentration of ouabain was increased about 1.5 to 3.5 times, more preferably about 1.5 to 2 times at the initial stage of adaptation, and then about 2 to 3.5 times. In particular, a cell line exhibiting strong resistance to ouabain, particularly a cell line exhibiting resistance to ouabain at a concentration of 2 μM or more, is created and bred. The cell line into which the marker has been introduced in this manner is used as a parent cell line for cell fusion with human monoclonal antibody-producing cells. It is desirable to select a cell line that gives particularly high fusion efficiency in advance by cloning or the like.

後述の実施例１（１）に示すように、低濃度のウワバ
イン含有培地から培養を開始し、ヒト免疫グロブリン非
分泌型の細胞を選別しながら、最終的に２μＭ濃度のウ
ワバイン含有培地で培養することにより得られたヒトＢ
リンパ芽球様細胞株AC−33は、免疫グロブリン非分布
性,HAT感受性，ウワバイン抵抗性を示し、第１図に示さ
れるように新規な染色体を有する細胞株である。また、
該AC−33株は、ヒト−ヒトハイブリドーマ作成における
融合効率が、HO−323細胞株,TAW−925細胞株などの従来
の親株より高く、得られたヒト−ヒトハイブリドーマは
ヒトモノクローナル抗体産生能が安定しており、増殖能
が優れている。As shown in Example 1 (1) below, the culture is started from a medium containing ouabain at a low concentration, and finally cultured in a medium containing ouabain at a concentration of 2 μM while selecting human immunoglobulin non-secretory cells. Human B obtained by
The lymphoblastoid cell line AC-33 is a cell line that exhibits no immunoglobulin distribution, HAT sensitivity, and ouabain resistance, and has a novel chromosome as shown in FIG. Also,
The AC-33 strain has a higher fusion efficiency in producing human-human hybridomas than conventional parental strains such as HO-323 cell line and TAW-925 cell line, and the obtained human-human hybridoma has a human monoclonal antibody-producing ability. It is stable and has excellent growth ability.

継代株としては、AC−33株を単に継代培養した株は勿
論、例えばこれを再びクローニングし良好な融合効率を
与えるクローニング株などAC−33株から派生した株すべ
てが挙げられる。Examples of the subcultured strain include not only a strain obtained by simply subculturing the AC-33 strain, but also all strains derived from the AC-33 strain, such as a cloning strain obtained by cloning the same again and giving good fusion efficiency.

AC−33株またはその継代株と融合させる抗体産生ヒト
リンパ球系細胞としては、正常人あるいは患者由来のリ
ンパ球が使用でき、例えば目的とする抗体がPEAのよう
な感受性物質由来のものに対する時は、該物質に感染し
たヒト由来のリンパ球を使用してもよい。これらヒトリ
ンパ球は、脾臓・リンパ節・末梢血などいずれ由来のも
のでもよいが、末梢血あるいはリンパ節由来のリンパ球
が有利に用いられる。これらのリンパ球系細胞はそのま
ま用いることもできるが、一旦試験管内で抗原やあるい
はＢリンパ球マイトージエン（例、ポークウィード・マ
イトージエンやスタフィロコッカス・アウレウス・コー
ワンＩなど）で刺激・活性化後、AC−33株と融合させて
もよい。さらに好ましくは、採取したヒトリンパ球にEB
Vを感染させ不死化後、目的とする抗体産生細胞を選別
・濃縮し、これをAC−33株と融合させるのがよい。以上
のようにEBVトランスホーマントを用いる方法で、より
効率的に抗体産生ハイブリドーマを取得できるが、かか
るEBV含有液としては、例えばアーモセット細胞B95−８
株［プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），70,1
90（1973）］の培養上清が用いられる。As the antibody-producing human lymphoid cells to be fused with the AC-33 strain or its subculture, lymphocytes derived from normal humans or patients can be used.For example, when the target antibody is derived from a sensitive substance such as PEA, May use human-derived lymphocytes infected with the substance. These human lymphocytes may be derived from any of spleen, lymph node, peripheral blood, etc., but peripheral blood or lymph node-derived lymphocytes are advantageously used. These lymphoid cells can be used as they are, but once stimulated and activated with an antigen or B lymphocyte mitogen (eg, porkweed mitogen or Staphylococcus aureus cowan I) in a test tube, It may be fused with the AC-33 strain. More preferably, EB is added to the collected human lymphocytes.
After infection with V and immortalization, the antibody-producing cells of interest are preferably selected and concentrated, and then fused with the AC-33 strain. As described above, an antibody-producing hybridoma can be obtained more efficiently by the method using the EBV transformant. Examples of such an EBV-containing solution include armoset cell B95-8.
Stock [Proceedings of National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 70 , 1
90 (1973)].

EBVトランスホーマントの調製に際しては、培地にヒ
トリンパ球を約0.5〜５×10⁷個/ml、好ましくは約１×1
0⁷個/mlの濃度になるよう浮遊させ、これに上記のB95−
８培養上清を適量加える。約37℃で約１時間軽く振とう
し感染後、さらに約37℃で約５〜30日間培養することに
より、目的のヒトリンパ球のEBVトランスホーマントが
取得できる。When preparing EBV transformants, human culture medium contains about 0.5 to 5 × 10 ⁷ human lymphocytes / ml, preferably about 1 × 1
0 ⁷ cells / ml were suspended, and the B95-
8 Add an appropriate amount of culture supernatant. After infection with gentle shaking at about 37 ° C. for about 1 hour, culturing is further performed at about 37 ° C. for about 5 to 30 days to obtain the target EBV transformant of human lymphocytes.

AC−33株とEBVトランスホーマントとを融合させるた
めには、これらの細胞混合浮遊液にセンダイウイルスや
ポリエチレングリコール（PEG）などの融合剤を加えた
り、あるいは電気刺激を与えるなどの処理をする。PEG
を用いる方法は好ましい方法の一例であるが、もちろん
この方法に限定されるものではない。PEGを用いる方法
において、PEGの重合度は一般に約1,000〜6,000,インキ
ュベーションは約0.5〜30分,PEGの濃度は約10〜80％な
どが用いられる。好ましくは、約35〜55％のPEG6000を
用いて約37℃で５〜10分細胞を処理するのがよい。融合
細胞の選択は、HAT＋ウワバイン添加培地（HATO培地）
などにより実施でき、この操作で親株は死滅する。増殖
してきたハイブリドーマの培養上清を抗体価測定試験に
供することにより、抗体活性陽性の細胞が選別される。In order to fuse the AC-33 strain with the EBV transformant, a treatment such as adding a fusion agent such as Sendai virus or polyethylene glycol (PEG) to the cell suspension mixture or applying electrical stimulation is performed. . PEG
Is an example of a preferred method, but is not limited to this method. In the method using PEG, the degree of polymerization of PEG is generally about 1,000 to 6,000, incubation is about 0.5 to 30 minutes, and the concentration of PEG is about 10 to 80%. Preferably, cells are treated with about 35-55% PEG6000 at about 37 ° C. for 5-10 minutes. For selection of fused cells, use HAT + ouabain supplemented medium (HATO medium)
The parent strain is killed by this operation. By subjecting the culture supernatant of the grown hybridoma to an antibody titer test, cells positive for antibody activity are selected.

抗ヒト癌細胞ヒトMoAb測定のためには種々の方法が使
用できるが、例えば腫瘍細胞への指示赤血球の吸着でみ
る混合血球凝集反応（以下、MHAと略記することがあ
る）あるいはマイクロプレートに粘着した腫瘍細胞への
結合をエンザイムイムノアッセイ（以下、ELISAと略記
することがある）でみるCell−ELISA法などが挙げられ
る。抗PEAヒトMoAb測定のためには、固相抗原としてPEA
を吸着させたマイクロプレートを用いるELISAが好まし
く用いられる。抗体活性陽性ハイブリドーマは直ちにク
ローニングに供されるが、これは通常限界希釈法などで
容易に実施される。クローン化されたヒト−ヒトハイブ
リドーマの培養上清については、上記の方法でその抗体
価を測定し、安定的に力価の高い抗体を産生するハイブ
リドーマを選択することにより、目的とするモノクロー
ナルなハイブリドーマを取得することができる。Various methods can be used for the measurement of anti-human cancer cells and human MoAb. For example, mixed hemagglutination (hereinafter sometimes abbreviated as MHA) observed by adsorption of the indicated erythrocytes to tumor cells, or adhesion to microplates Cell-ELISA, and the like, in which the binding to the tumor cells thus obtained is observed by an enzyme immunoassay (hereinafter, sometimes abbreviated as ELISA). For anti-PEA human MoAb measurement, PEA was used as a solid phase antigen.
ELISA using a microplate on which is adsorbed is preferably used. The antibody activity-positive hybridoma is immediately subjected to cloning, which is usually easily performed by a limiting dilution method or the like. With respect to the culture supernatant of the cloned human-human hybridoma, the antibody titer is measured by the method described above, and a hybridoma that stably produces a high-titer antibody is selected. Can be obtained.

上記した本発明のAC−33株またはその継代株から由来
するハイブリドーマを用いてヒトモノクローナル抗体を
産生，蓄積せしめ、これを取得することにより抗体を製
造することができる。An antibody can be produced by producing and accumulating human monoclonal antibodies using hybridomas derived from the above-described AC-33 strain of the present invention or a subculture thereof, and obtaining the monoclonal antibodies.

該抗体の生成，蓄積は、本発明のハイブリドーマを培
養することにより行われ、培養は、通常液体培地中また
は動物の腹腔内（通常はヌードマウス等哺乳動物の腹腔
内）で行うが、以下に液体培地中での培養の一例を挙げ
る。The production and accumulation of the antibody is carried out by culturing the hybridoma of the present invention, and the cultivation is usually carried out in a liquid medium or intraperitoneally of an animal (usually intraperitoneally of a mammal such as a nude mouse). An example of culturing in a liquid medium will be described.

培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地〔イス
コフ培地とハムF12培地の等量混合培地（Ｉ・Ｈ培地）
やRPMI 1640培地など〕に牛胎児血清等を添加したもの
あるいはGIT培地（和光純薬工業株式会社販売）（哺乳
動物の血清を混在微生物の不活性工程および塩析，脱塩
工程を含む精製処理に付すことによって製造される哺乳
動物血清由来の動物細胞培養用組成物；特開昭60−1450
8号公報参照）などが挙げられ、特にGIT培地が以下に述
べる抗体の精製に関して有利に用いられる。As the medium, for example, a basic medium for culturing animal cells [a mixed medium of an equal volume of Iskov medium and Ham F12 medium (IH medium)
Or RPMI 1640 medium, etc.] and fetal bovine serum, etc. or GIT medium (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (purification treatment including inactivation step and salting out, desalting step of mixed microorganisms with mammalian serum) A composition for culturing animal cells derived from mammalian serum produced by subjecting the composition to
GIT medium is particularly advantageously used for the antibody purification described below.

培養は通常約３〜60日間，好ましくは約５〜10日間，
約30〜38℃，好ましくは約37℃で行う。The culture is usually performed for about 3 to 60 days, preferably for about 5 to 10 days.
It is carried out at about 30-38 ° C, preferably at about 37 ° C.

培養液中の抗体の精製については公知の生化学的手法
を組み合わせて用いることによりできる。The antibody in the culture solution can be purified by using a combination of known biochemical techniques.

例えば、細胞培養液を遠心分離し、培養上清を取り出
し、塩析（通常は硫酸アンモニウムを用いる）を実施す
る。得られたタンパク沈澱物を適当な溶液に溶解し、透
析後カラムクロマトグラフィー（イオン交換カラム，ゲ
ルろ過カラム等）に付し、目的とする抗体を分離精製す
ることができる。以上のような分離精製操作により、例
えば６の培養上清からタンパク重量比で95％以上の純
度の抗ヒト癌細胞ヒトMoAbを約30mg得ることができる。
また、この精製抗体標品においては、異種タンパクであ
るウシ血清アルブミンおよびウシ血清グロブリンの含有
量は各々約0.1％以下であり、EBV混入の可能性もないた
め、医薬などとして人体に投与する場合、好都合であ
る。For example, the cell culture solution is centrifuged, the culture supernatant is taken out, and salting out (usually using ammonium sulfate) is performed. The obtained protein precipitate is dissolved in an appropriate solution, dialyzed, and then subjected to column chromatography (ion exchange column, gel filtration column, etc.) to separate and purify the target antibody. By the above separation and purification operations, for example, about 30 mg of anti-human cancer cell human MoAb having a protein weight ratio of 95% or more can be obtained from 6 culture supernatants.
In addition, in this purified antibody preparation, the content of each of the heterologous proteins bovine serum albumin and bovine serum globulin is about 0.1% or less, and there is no possibility of EBV contamination. It is convenient.

以上のようにして得られたヒトMoAbを蛋白分解酵素
（パパイン，ペプシンなど）処理ならびに還元剤処理な
どにより、ヒト癌細胞あるいはPEAに対する結合能を保
持するFab,Fab′,F（ab′）_２断片などを得ることがで
き、本発明のヒトMoAbと同様の目的で用いることができ
る。The human MoAb obtained as described above is treated with proteolytic enzymes (such as papain and pepsin) and treated with a reducing agent to produce Fab, Fab ', F (ab') ₂ which retains the binding ability to human cancer cells or PEA. A fragment or the like can be obtained and used for the same purpose as the human MoAb of the present invention.

本発明により製造される抗ヒト癌細胞ヒトMoAbは腫瘍
細胞表面上の腫瘍関連抗原を特異的に認識し、腫瘍細胞
には結合するが、正常細胞には結合しない。また同じく
本発明により製造される抗PEAヒトMoAbは、PEA分子の抗
原決定基を特異的に認識し、PEAに対する強い結合能を
有する。かかる抗体は均質で高力価なため、生化学的製
剤として用いるのにきわめて適している。例えば、メン
ブレンフィルター等によるろ過除菌操作の後に、それ自
体あるいは適宜の薬理的に許容され得る担体，賦形剤，
希釈剤などと混合し、注射剤などとして製造化すること
ができる。投与量は、対象疾患，疾患の症状，投与ルー
トによりことなるが、例えば感染症の患者に静脈注射す
る場合、投与量は約0.01〜50mg/kg/日、好ましくは約0.
1〜2mg/kg/日である。The anti-human cancer cell human MoAb produced according to the present invention specifically recognizes a tumor-associated antigen on the surface of a tumor cell and binds to a tumor cell but does not bind to a normal cell. Similarly, the anti-PEA human MoAb produced according to the present invention specifically recognizes an antigenic determinant of the PEA molecule and has a strong binding ability to PEA. Such antibodies are highly suitable for use as biochemicals because of their homogeneity and high titer. For example, after a filtration and sterilization operation using a membrane filter or the like, itself or an appropriate pharmacologically acceptable carrier, excipient,
It can be mixed with a diluent or the like to produce an injection or the like. The dosage varies depending on the target disease, the symptoms of the disease, and the administration route. For example, in the case of intravenous injection into a patient with an infectious disease, the dosage is about 0.01 to 50 mg / kg / day, preferably about 0.
1-2 mg / kg / day.

以上のようにして得られたヒトモノクローナル抗体製
剤は、単に腫瘍関連抗原の分析，血中抗原の検出あるい
は診断薬への応用のみならず、予防薬・治療薬として哺
乳動物（マウス，ラット，ネコ，イヌ，ブタ，ウシ，サ
ル，ヒドなど）に投与することが可能である。The human monoclonal antibody preparation obtained as described above can be used not only for analysis of tumor-associated antigens, detection of blood antigens or application to diagnostic agents, but also as a preventive or therapeutic agent for mammals (mouse, rat, cat). , Dogs, pigs, cows, monkeys, hides, etc.).

特に抗癌剤としての抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル
抗体は、それ自体の抗腫瘍効果のみならず、しかるべき
抗癌剤のキャリヤーすなわちミサイル治療剤として癌患
者に投与して癌を根治せしめることが期待されている。
また抗PEA抗体は、感染症治療剤として従来のポリクロ
ーナルヒト免疫グロブリン製剤よりも安定性・安全性で
優れており、大きな治療効果を上げることができる。In particular, anti-human cancer cell human monoclonal antibodies as anti-cancer agents are expected to not only have their own anti-tumor effect, but also be administered to cancer patients as carriers of appropriate anti-cancer agents, ie, therapeutic agents for missiles, to cure cancer.
In addition, anti-PEA antibodies are more stable and safer than conventional polyclonal human immunoglobulin preparations as therapeutic agents for infectious diseases, and can have a large therapeutic effect.

以上のように本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒ
ト由来のため、マウス，ラットなどの異種動物由来の抗
体に比べて、ヒトに対する抗原性，毒性が極めて低く、
副作用もほとんどないため、疾病の予防・治療のために
直接ヒトに投与することが可能である。また特定される
確立された細胞株より産生される抗体であるため、不特
定多数のヒト末梢血より製造された従来の免疫グロブリ
ン製剤にくらべ、未知のバイオハザードの混入の可能性
が低い。さらに該抗体産生ハイブリドーマは、生体外で
安定的にヒトモノクローナル抗体を産生しうるので、結
合能・中和能の高い品質の一定したヒトモノクローナル
抗体を安定的に大量製造することができる。As described above, since the human monoclonal antibody of the present invention is derived from humans, it has extremely low antigenicity and toxicity to humans compared to antibodies derived from xenogeneic animals such as mice and rats.
Since it has almost no side effects, it can be directly administered to humans for prevention and treatment of diseases. In addition, since it is an antibody produced from a specified and established cell line, the possibility of contamination with unknown biohazard is lower than that of conventional immunoglobulin preparations produced from an unspecified number of human peripheral blood. Furthermore, since the antibody-producing hybridoma can stably produce a human monoclonal antibody in vitro, it is possible to stably mass-produce a high-quality human monoclonal antibody having high binding ability and neutralizing ability.

また、本発明に用いられる新規ヒトＢリンパ芽球様細
胞株AC−33は高い融合効率を与えるので、ヒトモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの作成に好都合に使用で
きる。また、得られるハイブリドーマは増殖能が優れ、
ヒトモノクローナル抗体産生能が安定しており、長期に
わたり効率良くヒトモノクローナル抗体を製造できる。In addition, the novel human B lymphoblastoid cell line AC-33 used in the present invention provides high fusion efficiency, and thus can be conveniently used for preparing a human monoclonal antibody-producing hybridoma. In addition, the obtained hybridoma has excellent growth ability,
Human monoclonal antibody production ability is stable, and human monoclonal antibodies can be produced efficiently over a long period of time.

本発明は、ヒト−ヒトハイブリドーマ作成において高
い融合効率を当える新規なヒトＢリンパ芽球様細胞株AC
−33を提供するものである。The present invention relates to a novel human B lymphoblastoid cell line AC that addresses high fusion efficiency in producing human-human hybridomas.
−33.

以下、参考例および実施例により本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.

なお、実施例１に開示するヒトＢリンパ芽球様細胞株
AC−33は、昭和62年12月14日から財団法人発酵研究所
（IFO）に寄託番号IFO50155として、また昭和62年12月2
4日から通商産業省微生物工業技術研究所（FRI）に寄託
番号FERM P−9788として寄託され、該寄託はブタペスト
条約に基づく寄託に切り換えられて、受託番号FERM BP
−2143として同研究所に保管されている。The human B lymphoblastoid cell line disclosed in Example 1
AC-33 was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the deposit number IFO50155 on December 14, 1987, and on December 2, 1987.
From the 4th, the deposit was deposited with the Research Institute of Microbial Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERM P-9788, and the deposit was changed to the deposit based on the Budapest Treaty, and the deposit number FERM BP was deposited.
It is kept at the Institute as -2143.

実施例５に開示するヒト−ヒトハイブリドーマPA−10
・１は、昭和62年12月14日からIFOに寄託番号IFO 50158
として、また昭和62年12月24日からFRIに寄託番号FERM
P−9791として寄託され、該寄託はブダペスト条約に基
づく寄託に切り換えられて、受託番号FERM BP−2146と
して同研究所に保管されている。Human-human hybridoma PA-10 disclosed in Example 5
・ 1 is the deposit number IFO 50158 from IFO on December 14, 1987
As of December 24, 1987, accession number FERM to FRI
Deposited as P-9791, which has been converted to a deposit under the Budapest Treaty and deposited with the Institute under the accession number FERM BP-2146.

実施例７に開示するヒト−ヒトハイブリドーマKu102
およびヒト−ヒトハイブリドーマKu105は、昭和62年12
月14日からIFOに寄託番号IFO 50156およびIFO50157とし
て、また昭和62年12月24日からFRIに寄託番号FERM P−9
787およびFERM P−9790としてそれぞれ寄託され、該寄
託はブダペスト条約に基づく寄託に切り換えられて、受
託番号FERM BP−2144およびFERM BP−2145としてそれぞ
れ保管されている。The human-human hybridoma Ku102 disclosed in Example 7
And human-human hybridoma Ku105,
From the 14th of March as IFO 50156 and IFO50157, and from December 24, 1987 to the FRI as the deposit number FERM P-9.
787 and FERM P-9790, respectively, which have been converted to deposits under the Budapest Treaty and deposited under accession numbers FERM BP-2144 and FERM BP-2145, respectively.

参考例１ 混合血球凝集反応（MHA） ヒト赤血球を用いる指示細胞の作製 IgG抗体検出の場合には、リン酸食塩緩衝液（以下、P
BSと略記することがある）に懸濁した２％ヒト赤血球に
抗Ｄ抗体を添加し、室温で３時間インキュベートした。
PBSで洗浄後再び２％懸濁液とし、ヤギ抗ヒトIgG抗体を
添加して一夜室温でインキュベートした。PBSで３回洗
浄し、指示細胞として使用した。Reference Example 1 Mixed hemagglutination (MHA) Preparation of indicator cells using human erythrocytes In the case of IgG antibody detection, phosphate buffered saline (hereinafter referred to as P
Anti-D antibody was added to 2% human erythrocytes suspended in BS (abbreviated as BS) and incubated at room temperature for 3 hours.
After washing with PBS, the suspension was made into a 2% suspension again, and a goat anti-human IgG antibody was added thereto and incubated overnight at room temperature. Washed three times with PBS and used as indicator cells.

IgG抗体検出の場合には、PBSに懸濁した２％ヒト赤血
球に、モルモット乾燥補体を加え、ただちに指示細胞と
して使用した。In the case of IgG antibody detection, guinea pig dried complement was added to 2% human erythrocytes suspended in PBS and used immediately as indicator cells.

ヌンクのテラサキプレートに標的腫瘍細胞をウエル当
り1,000〜2,000固播種し、炭酸ガスインキュベーター中
で37,一昼夜培養した。２％牛胎児血清（以下、FCSと略
記することがある）添加PBSで洗浄後、被検ハイブリド
ーマ培養上清を添加し、室温で１〜２時間インキュベー
トした。２％FCS添加PBSで洗浄後で作製した指示細胞
の0.2％懸濁液をウエル当り１滴滴下し、さらに室温で
1.5〜２時間反応させ、２％FCS添加PBSで洗浄後、顕微
鏡下で腫瘍細胞への血球吸着を観察した。Target tumor cells were fixedly seeded on a Nunc Terrasaki plate at 1,000 to 2,000 cells per well, and cultured in a carbon dioxide gas incubator for 37, day and night. After washing with PBS supplemented with 2% fetal calf serum (hereinafter sometimes abbreviated as FCS), a test hybridoma culture supernatant was added and incubated at room temperature for 1 to 2 hours. One drop per well of a 0.2% suspension of indicator cells prepared after washing with PBS containing 2% FCS was added.
The mixture was reacted for 1.5 to 2 hours, washed with 2% FCS-added PBS, and observed under a microscope for adsorption of blood cells to tumor cells.

参考例２ 腫瘍細胞を用いるCell−ELISA ヌンクの96穴マイクロプレートに標的腫瘍細胞をウエ
ル当り10.000〜40,000個播種し、炭酸ガスインキュベー
ター中で37℃，一昼夜培養した。培養上清を除去後、抗
ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次いで
0.2％牛血清アルブミン（以下、BSAと略記することがあ
る）添加培地で洗浄後、ホースラディッシュ・ペルオキ
シダーゼ（以下、HRPと略記することがある）で標識し
たヤギ抗ヒトIgG抗体を添加した。さらに室温で２時間
反応させ、洗浄後酵素基質としてオルソフェニレンジア
ミンおよびH₂O₂を含有する0.1Mクエン酸緩衝液を各ウエ
ルに加え、室温で酸素反応を実施した。1N硫酸で反応停
止後、マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長492n
mで発色色素量を測定した。Reference Example 2 Cell-ELISA Using Tumor Cells 10.000 to 40,000 target tumor cells were seeded per well in a 96-well Nunc microplate and cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C. overnight. After removing the culture supernatant, the culture supernatant of the anti-human cancer cell human monoclonal antibody-producing hybridoma was added and reacted at room temperature for 2 hours. Then
After washing with a medium supplemented with 0.2% bovine serum albumin (hereinafter sometimes abbreviated as BSA), a goat anti-human IgG antibody labeled with horseradish peroxidase (hereinafter sometimes abbreviated as HRP) was added. After further reacting at room temperature for 2 hours, 0.1 M citrate buffer containing orthophenylenediamine and H ₂ O ₂ as enzyme substrates was added to each well after washing, and oxygen reaction was performed at room temperature. After terminating the reaction with 1N sulfuric acid, use a multiscan (manufactured by Flow Corporation) at a wavelength of 492n.
The amount of coloring pigment was measured in m.

参考例３ 抗緑膿菌外毒素Ａ（PEA）抗体測定用ELISA PEA2.5μg/ml溶液を96穴マイクロプレートに100mlず
つ分注し、４℃で一昼夜放置後、さらに２％カゼイン含
有PBSを添加して感作プレートを作成した。ELISA測定時
には、上記の液を除去し、PBSで洗浄後、被検ハイブリ
ドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次
いでPBSで洗浄後、HRP標識ヤギ抗ヒトIg抗体を添加し、
さらに室温で２時間反応させた。以下、参考例２に記載
の方法で酵素反応を実施し、抗体価を測定した。Reference Example 3 Anti-Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (PEA) antibody measurement ELISA A 2.5 μg / ml solution of PEA was dispensed into a 96-well microplate in 100 ml portions, left at 4 ° C. for 24 hours, and further added with PBS containing 2% casein. To make a sensitized plate. At the time of ELISA measurement, the above solution was removed, and after washing with PBS, a test hybridoma culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours. Then, after washing with PBS, HRP-labeled goat anti-human Ig antibody was added,
The reaction was further performed at room temperature for 2 hours. Hereinafter, an enzymatic reaction was carried out by the method described in Reference Example 2, and the antibody titer was measured.

参考例４ EBVトランスホーマット 健康人の末梢血からFicoll−Hypagueを用いた比重遠
心法でリンパ球を分離し、20％FCSを含むイスコフ・ハ
ム培地（Ｉ・Ｈ−20F）に１×10⁷固/mlになるように浮
遊させた。このリンパ球浮遊液１に対し、EBVを含有す
るB95−８細胞培養上清を容量にして10の割合に加え、3
7℃で１時間軽く振とうしながら感染させた。感染後、9
6ウエルマイクロプレートに１ウエル当り２×10⁴個播種
し、37℃炭酸ガスインキュベーター中２〜４週間培養を
行ない、トランスホーマントを得た。このようにして得
られるトランスホーマントを、AC−33株との融合に使用
した。Reference Example 4 EBV Transform Mat Lymphocytes were separated from peripheral blood of a healthy person by specific gravity centrifugation using Ficoll-Hypague, and 1 × 10 ⁷ cells were collected in an Iscove ham medium (IH-20F) containing 20% FCS. / ml. To this lymphocyte suspension 1, the volume of the B95-8 cell culture supernatant containing EBV was added in a volume of 10 to give a volume of 3.
The infection was carried out at 7 ° C for 1 hour with gentle shaking. 9 after infection
2 × 10 ⁴ cells were seeded per well in a 6-well microplate, and cultured in a 37 ° C. carbon dioxide incubator for 2 to 4 weeks to obtain a transformant. The transformants thus obtained were used for fusion with the AC-33 strain.

実施例１ （１）ヒトＢリンパ球芽様細胞AC−33の取得 米国アルトンジョーンズ・セル・サイエンス・センタ
ーより提供された６−TG抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細胞
WI−L2株を、まず0.003μＭ濃度のウワバインを含有す
る10％FCSを含むイスコフ・ハム培地（Ｉ・Ｈ−10F）中
で培養した。低濃度ウワバイン抵抗性株の中から免疫グ
ロブリン非分泌性の細胞を選別し、ウワバイン濃度を順
次0.005μM,0.01μM,0.02μM,0.05μM,0.15μM,0.5μＭ
さらに１μＭと上昇させながら免疫グロブリン非分布性
の細胞を選別し、最終的に２μＭ濃度のウワバインに抵
抗性を示す免疫グロブリン非分泌性AC−33株（FERM BP
−2143,IFO 50155）を得た。Example 1 (1) Acquisition of human B lymphoblastoid cells AC-33 6-TG resistant human B lymphoblastoid cells provided by Alton Jones Cell Science Center, USA
The WI-L2 strain was first cultured in an Iskov ham medium (IH-10F) containing 10% FCS containing ouabain at a concentration of 0.003 μM. Non-immunoglobulin non-secreting cells were selected from the low-concentration ouabain-resistant strains, and ouabain concentrations were sequentially adjusted to 0.005 μM, 0.01 μM, 0.02 μM, 0.05 μM, 0.15 μM, 0.5 μM.
The immunoglobulin non-distributing cells were selected while further increasing the concentration to 1 μM, and finally, an immunoglobulin non-secreting AC-33 strain (FERM BP) showing resistance to ouabain at a concentration of 2 μM.
−2143, IFO 50155).

（２）AC−33株の染色体分析 実施例１（１）で得られた免疫グロブリン非分泌性・
HAT感受性・ウワバイン抵抗性AC−33株（FERM BP−214
3,IFO 50155）の染色体の解析を実施した。(2) Chromosome analysis of AC-33 strain The immunoglobulin non-secretor obtained in Example 1 (1)
HAT-sensitive, ouabain-resistant AC-33 strain (FERM BP-214)
3, IFO 50155) was analyzed.

細胞約10⁶固を２μg/mlのコルヒチン（和光純薬工業
株式会社製）を含む10mlの増殖用培地に浮遊し、37℃で
1.5時間培養した。次いで250×ｇで10分間遠心分離し、
沈渣を3mlの75mM KClに浮遊し24℃で15分間静置した。
その後、遠心法により固定液（酢酸：メタノール＝1:
3）を用いて細胞を２度洗った後、数滴の同固定液に浮
遊し、スライドグラス上に乗せ風乾した。このようにし
て得た標本をギムザ染色液で染色し、顕微鏡下で観察し
た（ギムザ法）。この染色標本を同固定液を用いて脱染
色後、0.02％トリプシン（ギブコ社製）溶液を含むリン
酸緩衝液（PBS,pH5.8）で０℃,6分間処理したのち、PBS
で洗い、再びギムザ溶液で染色し、顕微鏡下で観察した
（Ｇバンド法）。About 10 ⁶ cells were suspended in 10 ml of a growth medium containing 2 μg / ml of colchicine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and incubated at 37 ° C.
The cells were cultured for 1.5 hours. Then centrifuge at 250 xg for 10 minutes,
The precipitate was suspended in 3 ml of 75 mM KCl and allowed to stand at 24 ° C. for 15 minutes.
Then, fixation solution (acetic acid: methanol = 1: 1) by centrifugation
After washing the cells twice using 3), the cells were suspended in a few drops of the same fixative, placed on a slide glass, and air-dried. The specimen thus obtained was stained with Giemsa staining solution and observed under a microscope (Giemsa method). The stained sample was destained using the same fixative, treated with a phosphate buffer (PBS, pH 5.8) containing 0.02% trypsin (manufactured by Gibco) at 0 ° C. for 6 minutes, and then washed with PBS.
And stained again with Giemsa solution and observed under a microscope (G-band method).

結果は第１図に示すとおりとなった。 The results were as shown in FIG.

第１図から明らかなように、染色体数は46本,XYで、
3,12,20,22座においてTAW−925株［Biochem.Biophys.Re
s.Comm.,142,805（1987）］と異なる特徴を示した。As is clear from FIG. 1, the number of chromosomes is 46, XY,
At the 3,12,20,22 loci, the TAW-925 strain [Biochem. Biophys.
s.Comm., 142 , 805 (1987)].

（３）AC−33株とEBVトランスホーマントとの細胞融合 参考例４により得られるEBVトランスホーマントとAC
−33株とを1:1の細胞比になるように混合し、45％PEG60
00（コッホライト社製）で７分間処理して細胞融合を実
施した。融合後、トランスホーマントをＩ・Ｈ−10F培
地に６×10³〜８×10⁴個/mlになるように浮遊させ、リ
ンブロ24ウエルマルチディッシュに1mlずつ播種し、37
℃炭酸ガスインキュベーター中で培養した。24時間後、
HAT・ウワバイン（ヒポキサンチン:1×10^-4M,アミノプ
テリン:4×10^-7M,チミジン:1.6×10^-5M,ウワバイン:2×
10^-6M）含有Ｉ・Ｈ−10F（HATO）培地を1ml加え、HATO
選択培養を開始した。さらに3,5,7日の奇数日後に1mlず
つのHATO新鮮培地の交換を実施し、HATO選択培養を継続
した。(3) Cell fusion between AC-33 strain and EBV transformant EBV transformant obtained in Reference Example 4 and AC
-33 strain was mixed to a cell ratio of 1: 1 and 45% PEG60
The cells were treated with 00 (manufactured by Kochlite) for 7 minutes to carry out cell fusion. After the fusion, the transformants were suspended in an I · H-10F medium at a concentration of 6 × 10 ³ to 8 × 10 ⁴ cells / ml, and seeded in a Limbro 24 well multi-dish at 1 ml each.
The cells were cultured in a carbon dioxide gas incubator. 24 hours later
HAT and ouabain (hypoxanthine: 1 × 10 ^-4 M, aminopterin: 4 × 10 ^-7 M, thymidine: 1.6 × 10 ^-5 M, ouabain: 2 ×
1-6 ml of ^10-6 M) -containing I.H-10F (HATO) medium was added.
Selection culture was started. Further, after 3, 5, and 7 odd days, the HATO fresh medium was replaced by 1 ml each, and the HATO selective culture was continued.

結果は第１表に示すとおりとなった。 The results were as shown in Table 1.

比較のため、TAW−925株［Bicohem.Biophys.Res.Com
m.,142,805（1987）］を親株として用い、同様の実験を
実施した。For comparison, the TAW-925 strain [Bicohem. Biophys. Res.
m., 142 , 805 (1987)] as a parent strain, and the same experiment was performed.

AC−33株の場合、ハイブリドーマの増殖は融合９〜15
日後に認められ、その融合効率（増殖ウエル数／播種ウ
エル数）は４種のEBVトランスホーマントに対して59〜1
00％，平均±標準偏差:85±16％であった。一方、良好
な融合効率を与えると考えられているTAW−925株の場
合、４種のEBVトランスホーマントに対して41〜81％，
平均±標準偏差:63±17％であった。In the case of the AC-33 strain, the growth of the hybridoma was 9 to 15 fusions.
Days later, the fusion efficiency (number of growth wells / number of seeded wells) was 59-1 for 4 EBV transformants.
00%, mean ± standard deviation: 85 ± 16%. On the other hand, in the case of the TAW-925 strain, which is considered to give good fusion efficiency, 41-81% against four EBV transformants,
Mean ± SD: 63 ± 17%.

実施例２ 抗PEA抗体産生ハイブリドーマの取得 抗PEA抗体陽性ヒト末梢血リンパ球（PBL）を参考例４
に記載の方法で形質転換し、抗PEA抗体産生EBVトランス
ホーマントを作成した。次いでこのEBVトランスホーマ
ントとAC−33株とを実施例１（３）に記載の方法で細胞
融合し、HATO選択培養を実施した。細胞融合後９〜15日
で、播種した944ウエル中729ウエルにハイブリドーマの
増殖が認められ、培養上清中の抗PEA抗体を参考例３に
記載のELISAで測定した。その結果、729ウエル全ての培
養上清中に抗PEA抗体の存在が認められた。 Example 2 Obtaining an anti-PEA antibody-producing hybridoma Reference example 4 using anti-PEA antibody-positive human peripheral blood lymphocytes (PBL)
And EBV transformants producing anti-PEA antibodies were prepared. Next, the EBV transformant was fused with the AC-33 strain by the method described in Example 1 (3), and HATO selective culture was performed. 9 to 15 days after the cell fusion, hybridoma growth was observed in 729 wells of the seeded 944 wells. The anti-PEA antibody in the culture supernatant was measured by ELISA described in Reference Example 3. As a result, the presence of the anti-PEA antibody was observed in all the culture supernatants of the 729 wells.

実施例３ 抗PEA抗体産生ハイブリドーマのクローニング 実施例２で得られる抗体活性陽性の２ウエル（PA−1,
PA−10）の各ハイブリドーマを限界希釈法によるクロー
ニングに供した。すなわち、ハイブリドーマが３個/ml
になるようＩ・Ｈ−10F培地に浮遊させ、96穴マイクロ
プレートに１ウエル当り0.1mlずつ分注した。分注する
際、フィーダー細胞としてBALB/Cマウスの胸線細胞をウ
エル当り５×10⁵個になるよう加えた。約10〜15日後に
細胞の増殖が認められ、その上清を採取して抗体の有無
を参考例３記載のELISAで測定した。その結果、PA−１
およびPA−10から得られた各40クローン全てに強い抗体
活性が認められた。このことから、本発明のハイブリド
ーマの増殖能および抗体産生能が優れていることは明ら
かである。上記クローンの中から、特に増殖能および抗
体産生能の優れたヒト−ヒトハイブリドーマ PA−10・
１が選別・育種された（FERM BP−2146,IFO 50158）。Example 3 Cloning of Anti-PEA Antibody Producing Hybridoma 2 wells (PA-1, 2 wells) having positive antibody activity obtained in Example 2
Each hybridoma of PA-10) was subjected to cloning by the limiting dilution method. That is, 3 hybridomas / ml
The suspension was suspended in an I · H-10F medium and dispensed at 0.1 ml per well into a 96-well microplate. At the time of dispensing, thymus cells of a BALB / C mouse were added as feeder cells at 5 × 10 ⁵ cells per well. After about 10 to 15 days, cell proliferation was observed. The supernatant was collected and the presence or absence of the antibody was measured by ELISA described in Reference Example 3. As a result, PA-1
And all 40 clones obtained from PA-10 showed strong antibody activity. From this, it is clear that the hybridoma of the present invention has excellent growth ability and antibody production ability. Among the above clones, human-human hybridoma PA-10.
1 were selected and bred (FERM BP-2146, IFO 50158).

実施例４ モノクローナル抗体の製造 ヒト−ヒトハイブリドーマPA−10・１（FERM BP−214
6,IFO 50158）をGIT培地（大五栄養化学社製）に浮遊さ
せ、37℃で培養を継続し、順次培養容量を増加した。得
られた培養上清６に硫酸アンモニウムを47％の濃度に
なるように加え、４℃で撹拌しながら60分間塩析を行な
い、遠心分離（10,000回転,15分間）した。得られた沈
澱物を50mM NaCl含有20mMトリス緩衝溶液（pH7.9）に溶
解し、同じ緩衝液１に対して透析を実施した。２時間
後、透析液を交換し、さらに15時間透析を実施し、10,0
00回転,15分間遠心分離した。上清を充分量の50mM NaCl
含有トリス緩衝溶液で順化した10mlのDEAE−セルロース
カラム（ワットマン DE52）にかけ、50mM NaCl含有トリ
ス緩衝溶液で素通りする画分を濃縮してヒトモノクロー
ナル抗体PA−10・１を得た。抗体の純度の確認にはラエ
ムリらの方法［ネイチャー（Nature），227,680（197
0）］に従いSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いた。すなわち硫安塩析し、DEAE−セルロースカラムで
素通りした画分を、２−メルカプトエタノールで還元し
て10％SDS−ポリアクリルアミドゲル,180ボルト,22時間
の条件で泳動した。その結果、分子量約52キロダルトン
前後にＨ鎖，約28キロダルトン前後にＬ鎖の２つのバン
ドが認められ、不純物にもとづくバンドは観察されなか
った。Example 4 Production of monoclonal antibody Human-human hybridoma PA-10.1 (FERM BP-214)
6, IFO 50158) was suspended in a GIT medium (manufactured by Daigo Kunitachi Chemical Co., Ltd.), and cultivation was continued at 37 ° C., and the culture volume was gradually increased. Ammonium sulfate was added to the obtained culture supernatant 6 to a concentration of 47%, salting out was performed at 4 ° C. with stirring for 60 minutes, and centrifuged (10,000 rotations, 15 minutes). The obtained precipitate was dissolved in a 20 mM Tris buffer solution (pH 7.9) containing 50 mM NaCl, and the same buffer 1 was dialyzed. Two hours later, the dialysate was changed, and dialysis was performed for another 15 hours.
Centrifugation was performed at 00 rpm for 15 minutes. Wash the supernatant with a sufficient amount of 50 mM NaCl
The fraction was passed through a 10 ml DEAE-cellulose column (Whatman DE52) which had been acclimated with a Tris buffer solution containing the same, and the fraction passed through with a Tris buffer solution containing 50 mM NaCl was concentrated to obtain a human monoclonal antibody PA-10.1. The method of Raemli et al. [Nature, 227 , 680 (197)
0)], and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was used. That is, the fraction that had been subjected to ammonium sulfate precipitation and passed through a DEAE-cellulose column was reduced with 2-mercaptoethanol and electrophoresed on a 10% SDS-polyacrylamide gel, 180 volts, for 22 hours. As a result, two bands of an H chain were observed at a molecular weight of about 52 kDa and an L chain of about 28 kDa, and no band based on impurities was observed.

実施例５ 抗癌抗体産生ハイブリドーマの取得およびそのクローニ
ング ヒトPBLを参考例４に記載の方法で形質転換し、EBVト
ランスホーマントを作成した。次いでこのEBVトランス
ホーマントとAC−33株とを実施例３に記載の方法で細胞
融合し、HATO選択培養を実施した。細胞融合後、４〜６
×10⁴細胞/mlの濃度でマイクロプレートに播種し、12〜
14日でヒト−ヒトハイブリドーマの増殖が認められたウ
エルについて、その培養上清を参考例１および２にそれ
ぞれ記載のMHAおよびCell−ELISA試験に供した。Example 5 Obtaining and cloning an anti-cancer antibody-producing hybridoma Human PBL was transformed by the method described in Reference Example 4 to prepare an EBV transformant. Next, the EBV transformant was fused with the AC-33 strain by the method described in Example 3, and HATO selective culture was performed. After cell fusion, 4-6
Seed the microplate at a concentration of × 10 ⁴ cells / ml and
The culture supernatant of wells in which human-human hybridoma growth was observed on day 14 was subjected to the MHA and Cell-ELISA tests described in Reference Examples 1 and 2, respectively.

比較のため、TAW−925株を親株として用い、同様に実
験を実施した。結果は第２表に示すとおりとなった。For comparison, the same experiment was performed using the TAW-925 strain as a parent strain. The results were as shown in Table 2.

AC−33株の場合、播種した7,851ウエルに対して融合
効率は35％で、２種の抗癌抗体産生ハイブリドーマが得
られたが、TAW−925株では、播種した48,239ウエルに対
して融合効率は４〜31％，平均±標準偏差:18±８％
で、抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマが１株のみ得られた。第２表の結果から、AC−33
株は融合効率が優れており、抗ヒト癌細胞ヒトモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマの取得に有利に用いられ
ることが明らかである。In the case of the AC-33 strain, the fusion efficiency was 35% with respect to the seeded 7,851 wells, and two kinds of anti-cancer antibody-producing hybridomas were obtained. In the case of the TAW-925 strain, the fusion efficiency was increased with respect to the seeded 48,239 wells. Is 4 to 31%, average ± standard deviation: 18 ± 8%
As a result, only one hybridoma producing an anti-human cancer cell human monoclonal antibody was obtained. From the results in Table 2, AC-33
It is clear that the strain has excellent fusion efficiency and is advantageously used for obtaining a hybridoma producing an anti-human cancer cell human monoclonal antibody.

上記のように、AC−33株を親細胞株として用いた融合
実験では、胃癌細胞AZ−521および肺癌細胞CADO−LC3に
結合性を示したウエルと、肝癌細胞HEP−G2とhu−H4に
結合性を示したウエル、各１種ずつが得られた。これら
２種のウエルに含まれるハイブリドーマを限界希釈法に
よるクローニングに供し、実施例５に記載の方法と同じ
手法で、フィーダー細胞としての胸線細胞共存下でマイ
クロプレートの各ウエルに播種した。約２週間後に細胞
増殖の認められたウエルの上清の抗体活性をMHAおよびC
ell−ELISAで測定し、増殖能および抗体産生能の優れた
ヒト−ヒトハイブリドーマを選別・育種した。As described above, in a fusion experiment using the AC-33 strain as a parent cell line, wells showing binding properties to gastric cancer cells AZ-521 and lung cancer cells CADO-LC3, and liver cancer cells HEP-G2 and hu-H4 One well each showing binding properties was obtained. The hybridomas contained in these two wells were subjected to cloning by the limiting dilution method, and were seeded in each well of a microplate in the same manner as described in Example 5 in the presence of thymus cells as feeder cells. Approximately two weeks later, the antibody activity of the supernatant of the well in which cell proliferation was observed was determined by MHA and C
As determined by ell-ELISA, human-human hybridomas having excellent proliferation ability and antibody production ability were selected and bred.

その結果、AZ−521およびCADO−LC3反応性ヒトモノク
ローナル抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマ Ku102と、
HEP−G2およびhu−H4反応性ヒトモノクローナル抗体産
生ヒト−ヒトハイブリドーマ Ku105とがそれぞれ得られ
た（それぞれFERM BP−214,IFO 50156およびFERM BP−2
145,IFO 50157）。As a result, human-human hybridoma Ku102 producing AZ-521 and CADO-LC3 reactive human monoclonal antibody,
HEP-G2 and hu-H4 reactive human monoclonal antibody-producing human-human hybridoma Ku105 were obtained (FERM BP-214, IFO 50156 and FERM BP-2, respectively).
145, IFO 50157).

発明の効果 本発明に用いられるヒトＢリンパ芽球用細胞株AC−33
は増殖能および融合能に優れ、特にEBVトランスホーマ
ントとの融合効率が高く、例えば抗ヒト癌細胞ヒトモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマあるいは抗緑膿菌外
毒素ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ取得の
ための親株として有用で、また本細胞株を用いることに
よって得られたハイブリドーマは増殖能が優れ、ヒトモ
ノクローナル抗体産生能が安定しており、長期にわたり
効率良く抗体を製造できる。 Effect of the Invention Cell line AC-33 for human B lymphoblast used in the present invention
Has excellent growth ability and fusion ability, especially high fusion efficiency with EBV transformant, and is useful, for example, as a parent strain for obtaining a hybridoma producing an anti-human cancer cell human monoclonal antibody or an anti-Pseudomonas aeruginosa exotoxin human monoclonal antibody In addition, the hybridoma obtained by using the present cell line has excellent growth ability, stable human monoclonal antibody production ability, and can efficiently produce antibodies for a long period of time.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、実施例１で得られたAC−33株の染色体図を示
す。FIG. 1 shows a chromosome diagram of the AC-33 strain obtained in Example 1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−155083（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−77400（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−204134（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−204200（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-62-155083 (JP, A) JP-A-62-77400 (JP, A) JP-A-61-204134 (JP, A) JP-A-61-204134 204200 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12N 15/00-15/90 C12P 21/00-21/08 C12N 5/00-5/28 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】HAT感受性でかつウワバイン抵抗性であ
り、免疫グロブリン非分泌性のヒトＢリンパ芽球様細胞
株AC−33（FERM BP−2143）またはその継代株。1. An immunoglobulin non-secreting human B lymphoblastoid cell line AC-33 (FERM BP-2143) which is HAT-sensitive and ouabain-resistant, or a subculture thereof. 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のヒトＢリンパ
芽球様細胞株AC−33またはその継代株と、エプスタイン
−バーウイルスによって形質転換されたヒトリンパ球と
のハイブリドーマ。2. A hybridoma of the human B lymphoblastoid cell line AC-33 or a subculture thereof according to claim 1, and a human lymphocyte transformed by Epstein-Barr virus. 【請求項３】抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体を産
生する特許請求の範囲第２項記載のハイブリドーマ。3. The hybridoma according to claim 2, which produces an anti-human cancer cell human monoclonal antibody. 【請求項４】抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナル抗体
を産生する特許請求の範囲第２項記載のハイブリドー
マ。4. The hybridoma according to claim 2, which produces an anti-Pseudomonas aeruginosa exotoxin A human monoclonal antibody. 【請求項５】特許請求の範囲第１項記載のヒトＢリンパ
芽球様細胞株AC−33またはその継代株と、エプスタイン
−バーウイルスによって形質転換されたヒトリンパ球と
のハイブリドーマを培地に培養し、抗体を採取すること
を特徴とする抗体の製造法。5. A method for culturing a hybridoma of the human B lymphoblastoid cell line AC-33 or a subculture thereof according to claim 1 and a human lymphocyte transformed with Epstein-Barr virus in a medium. And collecting the antibody. 【請求項６】抗体が抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗
体である特許請求の範囲第５項記載の製造法。6. The method according to claim 5, wherein the antibody is a human monoclonal antibody against anti-human cancer cells. 【請求項７】抗体が抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナ
ル抗体である特許請求の範囲第５項記載の製造法。7. The method according to claim 5, wherein the antibody is an anti-Pseudomonas aeruginosa exotoxin A human monoclonal antibody. 【請求項８】特許請求の範囲第１項記載のヒトＢリンパ
芽球様細胞株AC−33またはその継代株と、エプスタイン
−バーウイルスによって形質転換されたヒトリンパ球と
を融合させることを特徴とする特許請求の範囲第２項記
載のハイブリドーマの製造法。8. A method according to claim 1, wherein the human B lymphoblastoid cell line AC-33 or a subculture thereof is fused with an Epstein-Barr virus-transformed human lymphocyte. The method for producing a hybridoma according to claim 2, wherein