JP2761063B2 - Method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方法に関
する。更に詳しくは、1,3−ブタンジオールのエナンチ
オマー混合物に特定の微生物或いはその処理物を作用さ
せ、生成する光学活性な３−ヒドロキシ酪酸を採取する
ことを特徴とする光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方
法に関する。The present invention relates to a method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid. More specifically, a method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid, wherein a specific microorganism or a processed product thereof is allowed to act on an enantiomeric mixture of 1,3-butanediol, and the resulting optically active 3-hydroxybutyric acid is collected. About the method.

３−ヒドロキシ酪酸の光学活性体は種々の医薬・農薬
等の重要な合成原料である。The optically active form of 3-hydroxybutyric acid is an important synthetic raw material for various medicines and agricultural chemicals.

〔従来技術及び発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by the prior art and the invention]

従来、光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方法として
は、化学合成されたラセミ体を分割剤により光学分割す
る方法（Helv.Chim.Acta.,64,1467（1981））、微生物
により生産されるポリ−β−ヒドロキシ酪酸を加水分解
して得る方法（Helv.Chim.Acta.,65,459（1982））、ア
セト酢酸エチルの微生物による不斉還元法（Helv.Chim.
Acta.,66,485（1983））、或いは酵母のβ−酸化系を用
いて酪酸から製造する方法（特開昭58−158190号公
報）、1,3−ブタンジオールのラセミ体にロドコッカス
属の微生物を作用させ製造する方法（特開昭64−74999
号公報）等が知られている。Conventionally, as a method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid, a method of optically resolving a chemically synthesized racemate using a resolving agent (Helv. Chim. Acta., 64 , 1467 (1981)), a method of producing poly (organic) produced by microorganisms, -Hydroxybutyric acid obtained by hydrolysis (Helv. Chim. Acta., 65 , 459 (1982)), asymmetric reduction method of ethyl acetoacetate by microorganism (Helv. Chim.
Acta., 66 , 485 (1983)) or a method of producing from butyric acid using the β-oxidation system of yeast (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-158190), a method of producing a racemic 1,3-butanediol of the genus Rhodococcus. Method for producing by allowing microorganisms to act (JP-A-64-74999)
Is known.

しかしながら、これらの製造法についてその特徴を見
てみると、夫々一長一短があり、分割剤を用いる方法は
分割剤が高価であること、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸を
加水分解して得る方法はこの生成物が高価であること、
微生物による不斉還元法は基質濃度が低いこと、酵母の
β−酸化系を用いて酪酸から製造する方法は微生物の培
養或いは反応に長時間を要すること等、いずれも種々の
問題点を有しており、必ずしも工業的に優れた方法とは
言い難い。However, looking at the characteristics of these production methods, there are respective advantages and disadvantages.The method using a resolving agent is expensive, and the method obtained by hydrolyzing poly-β-hydroxybutyric acid produces Things are expensive,
The asymmetric reduction method using microorganisms has various problems, such as low substrate concentration, and the method of producing from butyric acid using the β-oxidation system of yeast requires a long time for culturing or reaction of microorganisms. This is not necessarily an industrially superior method.

1,3−ブタンジオールのラセミ体に微生物を作用させ
製造する方法は、原料の価格から考えると有利な方法と
考えられるが、前述のロドコッカス属の微生物を用いる
方法では、やはり基質濃度が低く（約１％）、必ずしも
有利な方法とは言い難い。またこの方法により（Ｒ）体
の製造法は知られているが、（Ｓ）体の製造法は全く知
られていない。A method of producing a racemate of 1,3-butanediol by reacting a microorganism with the microorganism is considered to be an advantageous method from the viewpoint of the price of the raw material. However, in the method using the microorganism of the genus Rhodococcus, the substrate concentration is still low ( About 1%), which is not always an advantageous method. Although a method for producing the (R) form is known by this method, a method for producing the (S) form is not known at all.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

これらの事情に鑑み、本発明者等は1,3−ブタンジオ
ールのエナンチオマー混合物、とりわけ工業的に安価に
製造される1,3−ブタンジオールのラセミ体に微生物を
作用させ光学活性な３−ヒドロキシ酪酸を得る方法は優
れた方法であると考え、更に広い範囲の微生物を対象
に、より優秀な微生物菌株を求めてスクリーニングを行
い、（Ｒ）体を生成する菌株及び（Ｓ）体を生成する菌
株を見出し、本発明を完成させた。In view of these circumstances, the present inventors have made it possible for microorganisms to act on enantiomer mixtures of 1,3-butanediol, especially racemic 1,3-butanediol, which is industrially manufactured at low cost, by causing microorganisms to act on the mixture. The method of obtaining butyric acid is considered to be an excellent method, and screening is performed on a wider range of microorganisms in search of more excellent microbial strains, and strains producing (R) form and (S) form are produced. A strain was found and the present invention was completed.

本発明者らは簡便な方法で、光学活性３−ヒドロキシ
酪酸を得る方法として1,3−ブタンジオールのエナンチ
オマー混合物に微生物を作用させ製造する方法に着目
し、この目的に適した微生物を検索した結果、キャンデ
ィダ（Candida）属、ピキア（Pichia）属、或いはシゾ
ブラストスポリウム（Schizoblastosporium）属に属
し、1,3−ブタンジオールを光学活性な（Ｒ）−３−ヒ
ドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生物、或いはそ
の処理物を1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混合
物に作用させると、光学活性な（Ｒ）−３−ヒドロキシ
酪酸を生成すること、及びキャンディダ（Candida）
属、ハンセヌラ（Hansenula）属、イサッチェンキア（I
ssatchenkia）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyce
s）属、ピキア（Pichia）属、サッカロマイコプシス（S
acharomycopsis）属、バチルス（Bacillus）属、コリネ
バクテリウム（Corynebacterium）属、シトロバクター
（Citrobacter）属、或いはエンテロバクター（Enterob
acter）属に属し、1,3−ブタンジオールを光学活性な
（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微
生物、或いはその処理物を1,3−ブタンジオールのエナ
ンチオマー混合物に作用させると、光学活性な（Ｓ）−
３−ヒドロキシ酪酸を生成することを見出し、本発明を
完成した。The present inventors focused on a method for producing an optically active 3-hydroxybutyric acid by reacting a microorganism with an enantiomeric mixture of 1,3-butanediol as a method for obtaining optically active 3-hydroxybutyric acid, and searched for a microorganism suitable for this purpose. As a result, it belongs to the genus Candida, the genus Pichia, or the genus Schizoblastosporium, and has the ability to convert 1,3-butanediol into optically active (R) -3-hydroxybutyric acid. When a microorganism having the above or a processed product thereof is acted on an enantiomeric mixture of 1,3-butanediol, optically active (R) -3-hydroxybutyric acid is produced, and Candida (Candida)
Genus, Hansenula, Isatchenkia (I
ssatchenkia, Kluyveromyce
s), genus Pichia, saccharomycopsis (S
acharomycopsis, Bacillus, Corynebacterium, Citrobacter, or Enterobactor
acter), a microorganism having the ability to convert 1,3-butanediol to optically active (S) -3-hydroxybutyric acid, or a processed product thereof is allowed to act on an enantiomeric mixture of 1,3-butanediol. , Optically active (S)-
The inventors have found that 3-hydroxybutyric acid is produced, and completed the present invention.

本発明に使用する微生物としては、キャンディダ（Ca
ndida）属、ピキア（Pichia）属、シゾブラストスポリ
ウム（Schizoblastosporium）属、或いはバチルス（Bac
illus）属に属する微生物で1,3−ブタンジオールのエナ
ンチオマー混合物から（Ｒ）体の３−ヒドロキシ酪酸を
生成しうるもの、及びキャンディダ（Candida）属、ハ
ンセヌラ（Hansenula）属、イサッチェンキア（Issatch
enkia）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、
ピキア（Pichia）属、サッカロマイコプシス（Saccharo
mycopsis）属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテ
リウム（Corynebacterium）属、シトロバクター（Citro
bacter）属、或いはエンテロバクター（Enterobacter）
属に属する微生物で1,3−ブタンジオールのエナンチオ
マー混合物から（Ｓ）体の３−ヒドロキシ酪酸を生成し
うるものであればいずれも使用可能である。Microorganisms used in the present invention include Candida (Ca
ndida), Pichia, Schizoblastosporium, or Bacillus (Bac)
microorganisms belonging to the genus illus that can produce (R) -form 3-hydroxybutyric acid from a mixture of enantiomers of 1,3-butanediol; and microorganisms belonging to the genus Candida, the genus Hansenula, and Isatchenkia
enkia), Kluyveromyces,
The genus Pichia, Saccharomycopsis (Saccharo)
genus mycopsis, genus Bacillus, genus Corynebacterium, Citrobactor
bacter) or Enterobacter
Any microorganisms belonging to the genus that can produce (S) -form 3-hydroxybutyric acid from a mixture of enantiomers of 1,3-butanediol can be used.

具体的には、（Ｒ）体の生成菌株としては、キャンデ
ィダ・ユチリス（Candida utillis）IFO 1086,IFO 063
9、ピキア・ヒーディー（Pichia heedii）IFO 10020、
ピキア・リンデネリー（Pichia lindnerii）ATCC 3265
8、シゾブラストスポリウム・コバヤシ（Schizoblastos
porium kobayashi）IFO 1644等を挙げることができる。Specifically, as the producing strain of the (R) form, Candida utillis IFO 1086, IFO 063
9. Pichia heedii IFO 10020,
Pichia lindnerii ATCC 3265
8. Schizoblastosporium Kobayashi
porium kobayashi) IFO 1644 and the like.

また、（Ｓ）体の生成菌株としては、キャンディダ・
ユチリス（Candida utilis）IFO 0619,IFO 0988、キャ
ンディダ・ロブスタ（Candida robusta）AHU 3402、キ
ャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）IFO 1364、キャ
ンディダ・クルセイ（Candida krusei）DSM 70073、キ
ャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）
IFO 1396、ハンセヌラ・ポリモルファDL1（Hansenula p
olymorpha DL1）ATCC 26012、ハンセヌラ・ミヌタ（Han
senula minuta）IFO 0975、ハンセヌラ・ヘンリシー（H
ansenula hericii）DSM 70272、ハンセヌラ・ウィッカ
ーハミー（Hansenula wickerhamii）IFO 1706、イサッ
チェンキア・スクツラータ・バー・スクツラータ（Issa
tchenkia scutulata var.scutulata）IFO 10070、クル
イベロマイセス・ドラスフィラルム（Kluyveromyces dr
asphilarum）IFO 1012、クルイベロマイセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）IFO 1903、ピキア・ファリノ
サ（Pichia farinosa）IFO 1163、ピキア・クェルシー
ム（Pichia quercuum）IFO 1276、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris）DSM 70382、ピキア・ヒーディー
（Pichia heedii）IFO 10019、サッカロマイコプシス・
リポリティカ（Saccharomycopsis lipolytica）IFO 155
0、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）IFO 31
34、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）ATCC 706
1、コリネバクテリウム・ミシガネンセ（Corynebacteri
um michiganense）IFO 13762、シトロバクター・フロイ
ンディー（Citrobacter freundii）AHU 1534、或いはエ
ンテロバクター・クロアカアエ（Enterobacter cloaca
e）ATCC 7256等を挙げることができる。In addition, as the strain producing the (S) body, Candida
Candida utilis IFO 0619, IFO 0988, Candida robusta AHU 3402, Candida rugosa IFO 1364, Candida krusei DSM 70073, Candida parapsilosis parapsilosis)
IFO 1396, Hansenula polymorpha DL1 (Hansenula p
olymorpha DL1) ATCC 26012, Hansenula Minuta (Han
senula minuta) IFO 0975, Hansenula Henricy (H
ansenula hericii) DSM 70272, Hansenula wickerhamii IFO 1706, Isatchenkia scuturata bar scuturata (Issa
tchenkia scutulata var.scutulata) IFO 10070, Kluyveromyces dr
asphilarum IFO 1012, Kluyveromyces lactis IFO 1903, Pichia farinosa IFO 1163, Pichia quercuum IFO 1276, Pichia pastoris DS Pichia heedii IFO 10019, Saccharomycopsis
Ripolitica (Saccharomycopsis lipolytica) IFO 155
0, Bacillus subtilis IFO 31
34, Bacillus pumilus ATCC 706
1. Corynebacterium mishiganense (Corynebacteri)
um michiganense) IFO 13762, Citrobacter freundii AHU 1534, or Enterobacter cloacae
e) ATCC 7256 and the like.

これらの微生物は、野生株、変異株、又は細胞融合も
しくは遺伝子操作法などの遺伝的手法により誘導される
組み替え株等、いずれの株でも好適に用いることができ
る。Any of these microorganisms can be suitably used, such as a wild-type strain, a mutant strain, or a recombinant strain derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic engineering.

尚、IFO番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所
（IFO）発行のList of Cultures,第８版，第１巻（198
8）に記載されており、該IFOから入手することができ
る。AHU番号の付された微生物は、日本微生物株保存連
盟（JFCC）発行のCatalogue of Cultures,第４版（198
7）に記載されており、北海道大学農学部から入手する
ことができる。ATCC番号の付された微生物は、American
Type Culture Collection（ATCC）発行のCatalogue of
Bacteria Phages rDNA Vectors,第16版（1985）に記載
されており、該ATCCから入手することができる。DSM番
号の付された微生物はDeutsch Sammlung von Mikroorga
nismen（DSM）発行のCatalog of strains（1983）に記
載されており、該DSMから入手することができる。Microorganisms with IFO numbers are described in List of Cultures, 8th edition, vol.
8) and can be obtained from the IFO. Microorganisms with AHU numbers are described in the Catalog of Cultures, 4th edition (198
It is described in 7) and can be obtained from the Faculty of Agriculture, Hokkaido University. Microorganisms with ATCC numbers are American
Catalog of the Type Culture Collection (ATCC)
Bacteria Phages rDNA Vectors, 16th edition (1985), which can be obtained from the ATCC. Microorganisms with DSM numbers are Deutsch Sammlung von Mikroorga
It is described in Catalog of strains (1983) issued by nismen (DSM) and can be obtained from the DSM.

本発明に用いる微生物を培養するための培地はその微
生物が増殖し得るものであれば特に制限はない。例え
ば、炭素源としては、上記微生物が利用可能であればい
ずれも使用でき、具体的には、グルコース、フルクトー
ス、シュクロース、デキストリン等の糖類、ソルビトー
ル、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマ
ール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類及
びその塩類、パラフィン等の炭化水素類等、或いはこれ
らの混合物を使用することができる。窒素源としては、
例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アン
モニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニ
ウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ
ー、カゼイン加水分解物、尿素等の無機有機含窒素化合
物、或いはこれらの混合物を使用することができる。他
に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用
いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。ま
た、必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明
の目的化合物の生成能力を高める因子、例えば1,3−ブ
タンジオールのエナンチオマー混合物、或いは培地のpH
保持に有効な物質も添加できる。The medium for culturing the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as the microorganism can grow. For example, as the carbon source, any of the above microorganisms can be used.Specifically, glucose, fructose, sucrose, saccharides such as dextrin, sorbitol, ethanol, alcohols such as glycerol, fumaric acid, Organic acids and salts thereof such as citric acid, acetic acid and propionic acid, hydrocarbons such as paraffin and the like, and mixtures thereof can be used. As a nitrogen source,
For example, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium salts of inorganic acids such as ammonium phosphate, ammonium fumarate, ammonium salts of organic acids such as ammonium citrate, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, urea, etc. An inorganic organic nitrogen-containing compound or a mixture thereof can be used. In addition, nutrients used for ordinary cultivation, such as inorganic salts, trace metal salts, and vitamins, can be appropriately mixed and used. Further, if necessary, a factor that promotes the growth of microorganisms, a factor that enhances the ability to produce the target compound of the present invention, for example, an enantiomeric mixture of 1,3-butanediol, or the pH of the medium
Substances effective for retention can also be added.

本発明でいう1,3−ブタンジオールのエナンチオマー
混合物とは、1,3−ブタンジオールの（Ｒ）体或いは
（Ｓ）体の比率がいかなるものでも良いことを意味する
が、実質的には、この比率が1:1のラセミ体が安価であ
り、好適であることは言うまでもない。The enantiomer mixture of 1,3-butanediol referred to in the present invention means that the ratio of (R) form or (S) form of 1,3-butanediol may be any, but substantially, It goes without saying that a racemate having a ratio of 1: 1 is inexpensive and suitable.

培養方法としては、培地pHは3.0〜9.5、好ましくは５
〜８、培養温度は20〜45℃、好ましくは25〜37℃で、嫌
気的或いは好気的に、その微生物の生育に適した条件下
５〜120時間、好ましくは12〜72時間程度培養する。As a culture method, the medium pH is 3.0 to 9.5, preferably 5 to 5.
-8, culturing at 20-45 ° C, preferably 25-37 ° C, under anaerobic or aerobic conditions suitable for the growth of the microorganism for 5-120 hours, preferably about 12-72 hours .

1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混合物から光
学活性な３−ヒドロキシ酪酸を生成させる方法として
は、微生物の培養時に培地の中に最初から或いは途中か
ら1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混合物を添加
する方法、培養終了後の培養液に1,3−ブタンジオール
のエナンチオマー混合物を添加する方法、或いは培養液
から遠心分離等により菌体を分離し、これをそのまま或
いは洗浄した後、緩衝液、水等に再懸濁したものに1,3
−ブタンジオールのエナンチオマー混合物を添加し、反
応させる方法等がある。As a method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid from a mixture of enantiomers of 1,3-butanediol, a method of adding an enantiomer mixture of 1,3-butanediol to a culture medium from the beginning or in the middle during culture of a microorganism. A method of adding an enantiomer mixture of 1,3-butanediol to a culture solution after completion of the culture, or a method of separating cells from the culture solution by centrifugation or the like, and then directly or after washing the cells, to a buffer solution, water, etc. 1,3 in resuspended
A method of adding an enantiomeric mixture of butanediol and reacting the mixture.

培養時の最初或いは途中から1,3−ブタンジオールの
エナンチオマー混合物を添加する場合は、添加濃度は特
に制限されないが0.1〜10％程度が好ましい。When the enantiomer mixture of 1,3-butanediol is added at the beginning or during the culturing, the addition concentration is not particularly limited, but is preferably about 0.1 to 10%.

分離菌体を用いて反応させる場合はpH3〜９、好まし
くはpH5〜８の範囲で、温度は10〜60℃、好ましくは20
〜40℃の温度で１〜120時間程度、撹拌下或いは静置下
で行う。1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混合物
の使用濃度は特に制限されないが、0.1〜10％程度が好
ましい。この際、1,3−ブタンジオールのエナンチオマ
ー混合物は、そのまま或いは水に溶解し、又は反応に影
響を与えないような有機溶媒に溶解したり、界面活性剤
等に分散させたりして、反応の初めから一括に或いは分
割して添加しても良い。When the reaction is carried out using the isolated cells, the reaction is carried out at pH 3 to 9, preferably pH 5 to 8, and at a temperature of 10 to 60 ° C, preferably
The reaction is performed at a temperature of 4040 ° C. for about 1 to 120 hours under stirring or standing. The use concentration of the enantiomer mixture of 1,3-butanediol is not particularly limited, but is preferably about 0.1 to 10%. At this time, the enantiomeric mixture of 1,3-butanediol is dissolved as it is or dissolved in water, or dissolved in an organic solvent that does not affect the reaction, or dispersed in a surfactant or the like, to cause the reaction. It may be added all at once or dividedly from the beginning.

また、分離菌体を用いて反応を行う場合は生菌体のま
までも良いし、菌体破砕物、アセトン処理、凍結乾燥等
の処理を施したものでも良い。また、これらの菌体或い
は菌体処理物を、例えばポリアクリアミドゲル法、含硫
多糖ゲル法（カラギ−ナンゲル法等）、アルギン酸ゲル
法、寒天ゲル法等の公知の方法で固定化して用いること
もできる。When the reaction is carried out using the isolated cells, the cells may be used as they are, or may be those obtained by crushing the cells, treating with acetone, freeze-drying, or the like. Further, these cells or the treated cells are immobilized by a known method such as a polyacrylamide gel method, a sulfur-containing polysaccharide gel method (such as a carrageenan gel method), an alginic acid gel method, or an agar gel method. You can also.

生成した光学活性な３−ヒドロキシ酪酸の採取は、培
養液或いは反応液から直接或いは菌体分離後、有機溶媒
で抽出し、カラムクロマトグラフィー、蒸留等の通常の
精製方法を用いれば容易に得られる。The produced optically active 3-hydroxybutyric acid can be easily obtained by directly extracting from a culture solution or a reaction solution or after separating cells, extracting with an organic solvent, and using ordinary purification methods such as column chromatography and distillation. .

〔実施例〕〔Example〕

以下、本発明を具体的に実施例にて説明するが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

実施例１ ラセミ体の1,3−ブタンジオール0.5％、酵母エキス0.
5％、ペプトン１％、肉エキス0.5％、リン酸二カリウム
0.1％、硫酸マグネシウム７水塩0.05％（pH7.0）より成
る培地100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、滅菌後、表
１に示す菌株を夫々植菌し、30℃で48時間往復振盪培養
を行った。Example 1 Racemic 1,3-butanediol 0.5%, yeast extract 0.1%
5%, peptone 1%, meat extract 0.5%, dipotassium phosphate
100 ml of a medium consisting of 0.1% and magnesium sulfate heptahydrate 0.05% (pH 7.0) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, sterilized, and each of the strains shown in Table 1 was inoculated, followed by reciprocal shaking culture at 30 ° C. for 48 hours. went.

培養終了後、培養液40mlを取り、遠心分離により菌体
を分離、生理食塩水で１回洗浄し、生菌体を得た。After completion of the culture, 40 ml of the culture solution was taken, and the cells were separated by centrifugation and washed once with physiological saline to obtain viable cells.

この生菌体に水4mlを加え菌体懸濁液とした後、ここ
から4mlを径18mmの試験管に採取した。これにラセミ体
の４％1,3−ブタンジオール溶液4mlを加え、30℃で24時
間振盪しながら反応させた。反応終了後、遠心分離にて
除菌し、上澄液を得た。After adding 4 ml of water to the viable cells to form a cell suspension, 4 ml of the suspension was collected in a test tube having a diameter of 18 mm. To this, 4 ml of a 4% solution of racemic 1,3-butanediol was added and reacted at 30 ° C. with shaking for 24 hours. After completion of the reaction, the bacteria were removed by centrifugation to obtain a supernatant.

この上澄液の５μを取り、高速液体クロマトグラフ
ィー（カラム：島津SCR−101H、溶媒:0.1％リン酸、流
速:1ml/分、検出:210nm）により生成した３−ヒドロキ
シ酪酸を定量した。5 μ of the supernatant was taken and the amount of 3-hydroxybutyric acid produced was quantified by high performance liquid chromatography (column: Shimadzu SCR-101H, solvent: 0.1% phosphoric acid, flow rate: 1 ml / min, detection: 210 nm).

また、こうして生成した３−ヒドロキシ酪酸の絶対配
置と光学純度は次のようにして求めた。The absolute configuration and optical purity of the thus produced 3-hydroxybutyric acid were determined as follows.

即ち、反応上澄液をイオン交換樹脂（Dowex1−x8,cl
型）のカラム（2ml）に通し、３−ヒドロキシ酪酸を吸
着させた。次いで、水洗後、1N塩酸4mlで溶出した。減
圧下、塩酸を除去した後、常法によりメタノールでメチ
ルエステル化を行った。次いで、このサンプルを光学分
割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラ
ム：ダイセル化学工業製キラルセルOD、4.6mmID×250m
m、溶媒:n−ヘキサン/2−プロパノール＝9:1、流速:0.5
ml/分、検出:220nm）により分析し、生成物の絶対配置
及び光学純度を求めた。That is, the reaction supernatant was used as the ion exchange resin (Dowex1-x8, cl).
Through the column (2 ml) to adsorb 3-hydroxybutyric acid. Then, after washing with water, elution was performed with 4 ml of 1N hydrochloric acid. After removing hydrochloric acid under reduced pressure, methyl esterification was performed with methanol by a conventional method. Next, this sample was subjected to high performance liquid chromatography using an optical resolution column (column: Chiral Cell OD manufactured by Daicel Chemical Industries, 4.6 mm ID × 250 m
m, solvent: n-hexane / 2-propanol = 9: 1, flow rate: 0.5
ml / min, detection: 220 nm) to determine the absolute configuration and optical purity of the product.

得られた結果を表１に示す。 Table 1 shows the obtained results.

実施例２ 酵母エキス0.3％、麦芽エキス0.3％、ペプトン0.5
％、ラセミ体1,3−ブタンジオール２％の組成の培地（p
H6.0）１を2.6容ミニジャーファーメンターに入
れ、滅菌後、表２に示す菌株を夫々植菌し、30℃,1vvm,
400rpmの条件下で48時間培養を行った。 Example 2 Yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5
%, Racemic 1,3-butanediol 2% medium (p
H6.0) 1 was placed in a 2.6-volume mini-jar fermenter, sterilized, and inoculated with the strains shown in Table 2 at 30 ° C., 1 vvm,
Culture was performed for 48 hours under the condition of 400 rpm.

培養終了後、遠心分離により菌体を除き上澄液を得
た。このサンプルに塩酸を加えpHを２にした後、飽和食
塩溶液とし、酢酸エチル１にて３回抽出した。この抽
出液を合わせ、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒
を留去し、次いで減圧蒸留し、無色油状物質を得た。こ
れらについて実施例１の場合と同様に生成物の絶対配置
及び光学純度の測定を行った。After completion of the culture, the cells were removed by centrifugation to obtain a supernatant. Hydrochloric acid was added to the sample to adjust the pH to 2, then the solution was made into a saturated saline solution, and extracted three times with ethyl acetate 1. The extracts were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, evaporated, and then distilled under reduced pressure to obtain a colorless oil. For these, the absolute configuration and optical purity of the product were measured in the same manner as in Example 1.

得られた結果を表２に示す。 Table 2 shows the obtained results.

〔発明の効果〕 本発明の微生物を用いた光学活性な３−ヒドロキシ酪
酸の製造方法は工業的に比較的簡便な方法で光学活性な
３−ヒドロキシ酪酸を製造できることを可能にさせるも
のであり、極めて有利である。 [Effect of the Invention] The method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid using the microorganism of the present invention makes it possible to produce optically active 3-hydroxybutyric acid by an industrially relatively simple method, It is very advantageous.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12P 41/00 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG) REGISTRY (STN) CA (STN)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混
合物に、キャンディダ（Candida）属、ピキア（Pichi
a）属、或いはシゾブラストスポリウム（Schizoblastos
porium）属に属し、1,3−ブタンジオールを光学活性な
（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸に変換する能力を有する微
生物、或いはその処理物を作用させ、生成する光学活性
な（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴と
する光学活性３−ヒドロキシ酪酸の製造方法。1. An enantiomeric mixture of 1,3-butanediol is added to a mixture of Candida and Pichia.
a) Genus or Schizoblastosporium
(R) -3, which is produced by the action of a microorganism belonging to the genus porium and capable of converting 1,3-butanediol into optically active (R) -3-hydroxybutyric acid, or a processed product thereof. -A method for producing optically active 3-hydroxybutyric acid, comprising collecting hydroxybutyric acid. 【請求項２】1,3−ブタンジオールのエナンチオマー混
合物に、キャンディダ（Candida）属、ハンセヌラ（Han
senula）属、イサッチェンキア（Issatchenkia）属、ク
ルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、ピキア（Pichi
a）属、サッカロマイコプシス（Saccharomycopsis）
属、バチルス（Bacillus）属、コリネバクテリウム（Co
rynebacterium）属、シトロバクター（Citrobacter）
属、或いはエンテロバクター（Enterobacter）属に属
し、1,3−ブタンジオールを光学活性な（Ｓ）−３−ヒ
ドロキシ酪酸に変換する能力を有する微生物、或いはそ
の処理物を作用させ、生成する光学活性な（Ｓ）−３−
ヒドロキシ酪酸を採取することを特徴とする光学活性３
−ヒドロキシ酪酸誘導体の製造方法。2. The method according to claim 1, wherein the enantiomeric mixture of 1,3-butanediol is prepared by adding Candida genus, Hansenula
senula), Issatchenkia, Kluyveromyces, Pichia
a) Genus, Saccharomycopsis
Genus, Bacillus, Corynebacterium (Co
rynebacterium), Citrobacter
Or a microorganism belonging to the genus Enterobacter and having the ability to convert 1,3-butanediol into optically active (S) -3-hydroxybutyric acid, or an optically active substance produced by treating the microorganism. Na (S) -3-
Optical activity 3 characterized by collecting hydroxybutyric acid
-A method for producing a hydroxybutyric acid derivative.