JP2757987B2 - Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術的分野 本発明は，ヒトならびに動物における炎症を処理する
分野に関係する。さらに詳細に言えば，炎症を調整する
のに効果的であるホスホリパーゼ阻害蛋白の純粋な試料
に関する。 背景技術 創傷もしくは感染部位における炎症の生理学的現象に
ついては，何世紀もの間認識されてきている。また，こ
の現象が，そのような刺激に反応して正の値を示す間，
ヒトもしくは動物の安全を確保するために，この反応の
程度をたびたび調節しなければならないことも十分に理
解されている。さらに，炎症は，例え慢性関節リウマチ
もしくは全身性エリテマトーデスの様な慢性炎症性疾患
として発現することもある。この様な状態は，本人を衰
弱させ，さらに生命にかかわったり，急性のエピソード
の結果にもなりかねない。他のこの様な疾患，喘息を伴
う炎症も，気管支の狭窄のためによる死を招くこともあ
る。 過去数十年の間に，炎症を伴う生化学的現象に関する
より詳細な情況が集積されてきた。この情況は複雑なも
のである。開始過程の部分は，組織破壊のカリクレイン
プロテアーゼによって遊離されるブラジキニンの様なペ
プチドキニンによって媒介されるものである。このキニ
ンもしくは，他のペプチドメッセンジャーは，アラキド
ネートカスケーソを開始すべく，ホスホリパーゼ酵素A2
および／もしくはＣは活性化するために，炎症部位の特
異的細胞受容体に作用するものである。 この“アラキドネートカスケード”は，炎症反応を維
持する上で，驚くべき重要性を示す。第１図に示した複
雑な反応の中で，アラキドン酸は，対象症例の膜リン肥
質より遊離され，集合してエイコサノイドとして知られ
る種々の生成物へ変換される。このエイコサノイドに
は，ロイコトリエンおよびプロスタグランジンが含まれ
ており，これらは，炎症部位に対する直接的な効果を発
揮するために細胞外へ放出される。これらは，比較的短
い半減期を示す。しかしながら，その生理学的効果は多
岐に渡り，かつ驚くべきものであり，血管拡張（例え
ば，プロスタシリンおよびロイコトリエンLTC₄ならびに
LTD₄），血管収縮（例えば，トロンボキサンおよびLT
B₄）さらにヒスタミン放出を含む。 抗戦症薬学における最近の役割はほとんどが，アラキ
ドネートカスケードに向けられている。この観点からみ
れば，第１図に示されている様に，カスケードの有意な
特徴は，次の通りである。すなわち，全生成物の生成
は，細胞リン肥質からのアラキドン酸の遊離（ホスホリ
パーゼによって媒介される）と共に始まり，その後反応
経路は，数種の反応系へと分かれるということである。
この反応系のうち，シクロオキシゲナーゼ経路は，プロ
スタグランジンを生成し，リポオキシゲナーゼ経路は，
ロイコトリエンを生成する。 アスピリンおよびインドメタシンの様な繁用されてい
る非ステロイド系抗炎症薬剤は，シクロオキシゲナーゼ
を抑制し，従って，アラキドン酸は最終生成物へ変換さ
れる経路のいくつかのみを抑制するものである。アラキ
ドネートカスケードの他の経路については，影響はみら
れない。一方，ステロイド，グルココルチコイド，ホル
モンは，一般的に，リン脂質膜からのアラキドン酸の生
成に対して効果を発揮するものであり，すなわち，全カ
スケードに対する直接的な効果を示す。Hong,S.,et al,
Proc Natl Acad Sci（USA）（1976）73:1730-1734。し
かし，ステロイド療法の欠点については，十分知られて
いる。水分停留，高グリシン血症，高脂血症，骨粗しょ
う症，緑内障ならびに冠状および大血管のアテローム硬
化症の危険性の増加の様な副作用が，この様な治療に伴
う好ましくない反応である。 近年，次の事実が証明されている。すなわち，ステロ
イドの抗炎症効果は、少なくともその一部は，結合する
蛋白の分泌を誘発する能力，さらに，アラキドン酸放出
の原因であるホスホリパーゼ酵素を抑制する能力による
ものであるということである。Hirata,F.,J Biol Chem
（1981）256:7730-7733。この抑制因子は，マクロコル
チンと呼ばれている（Black-well,R.J.,et al,Nature
（1980）287:147-149）：また，レノコルチン（Russo-M
arie,F.,et al,Biochim Biophys Acta（1982）712:177-
185）：もしくは，リポモジュリン（Hirata,F.,et alPr
oc Natl Acad Sci（USA）（1980）77:2533-2536）とも
呼ばれている。この蛋白は，一部ラットやウサギの細胞
から精製されており，免疫学的に交叉−反応性であると
思われる（Hirata,F.,et al,Biochem Biophys Res Comm
（1982）109:223-230;Rothhut,B.,et al,ibid（1983）1
17:878-884）。 最近，リポコルチンと名付けられたヒトの抑制因子
が，ヒト繊維芽細胞において確認されている（Errasfa,
M.,et al,Biochim Biophys Acta（1985）847:247-254。
さらに,Wallner,B.P.,et al,Nature（1986）320:77-81
ならびにPepinsky,R.B.,et al,J Biol Chem（1986）26
1:4239-4261,もラットリポコルチンの単離およびその結
果，ならびにヒトの類似体のクローニング,in vitroで
はPA2抑制因子である，について報告している。 グルココルチコイドよりはむしろアラキドン酸生成を
抑制する蛋白を直接投与すること（これは，これらの蛋
白の生成を刺激することになる）は，対象例を，付随す
る副作用の危険性にさらすことなく，炎症のステロイド
調整ができるという結果となると考えられる。しかし，
ヒトにおけるこの蛋白は，精製された状態ではない。言
うまでもなく，望ましくない炎症反応を直接治療できる
ために，十分に精製された十分な量の純粋なヒトホスホ
リパーゼ阻害蛋白（PIP）の開発が望まれているところ
である。 発明の開示 本発明は，精製ヒトホスホリパーゼ阻害蛋白（hPIP）
ならびに，組換え技術によるその生成において有用な物
質を提供するものである。SDS-PAGEに対する単一40kd結
合を有するヒト腹膜透析液から明らかな均質物へ精製さ
れた物質は，かなりの量のアポリポ蛋白IV（apoAIV）と
有意なPIP活性を含有している。この40kd結合から溶出
した蛋白を用いたウサギの免疫処置は,apoAIVおよびPIP
の両方と反応できる抗血清を増加させる。従って，これ
らの抗体は，スクリーニング組換え型ならびにhPIP生成
のための他の細胞に充当するものである。 これに関連して，他の蛋白から遊離しているヒトPIP
は，次の２つの方法によって得られる。すなわち，膜腔
透析液からの直接的精製によって，ならびに，組換え型
宿主を用いた生成によっての２方法である。従って，あ
る面では，この発明は，実質上純粋な型でのヒトPIPに
関するものである。他の面では，この発明は，第13図に
示したアミノ酸配列から成るヒトPIP活性を有する蛋白
に関するものである。さらに他の面においては，この発
明は，腹膜透析液からの精製hPIPの調整のための過程お
よびこの過程の生成物に関するものである。精製過程の
生成物は，それぞれ非グリコシレートもしくは，グリコ
シレート化型の36kdもしくは40kdの分子量によって特徴
付けられ，さらにPIP活性によって特徴付けられる。 純粋hPIPも，組換え方法を用いて生成されると考えら
れる。従って，本発明の他の面は，組換えによって生成
されたhPIP（非グルコシレートならびにグリコシレート
型両方において）に、組換え型宿主において，この蛋白
の生成をもたらす発現システムに，この発現システムを
含む媒介体に，このシステムにより変換される宿主に，
さらに，組換え型宿主細胞を培養することによってhPIP
を生成する方法に関連する。 さらに他の面においては，本発明は,apoAIVおよびPIP
の40kd混合物，ならびに発明自体のPIP蛋白の投与に反
応して生成された抗体に,PIPを含む薬学的組成に，さら
に，この様な成分もしくは精製PIPを用いて，ヒトなら
びに家畜における炎症を改善する方法に関する。PIPはa
poAIVの存在によって安定化され,apoAIVとの混合物にお
いてPIPを含んだ成分は，薬剤として特に有用であると
考えられる。 図面の簡単な説明 第１図は，反応計画のアラキドネートカスケードなら
びにエイコサノイド生成物を示す。 第２図は，ここで用いた精製方法の概要を示す。 第３図は，腹膜透析物の40％−60％飽和硫酸アンモニ
ウム分画を,Affi−ゲルブルー，コンカナバリＡ−セフ
ァロースならびにDEAEセルロースクロマトグラフィーに
かけた場合に得られた溶出パターンを示す。 第４図は，腹膜透析液の未精製ならびに精製された分
画に対するSDS-PAGEの結果を示す。 第５図は，精製計画の様々な段階における相対的なPI
P活性を示す。 第６図は，コンカナバリンＡ−セファロースカラムか
らの活性含有分画に対して実施された分析−反対層高性
能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）の結果を示す。 第７図は，精製段階において，種々の分画におけるhP
IPを検出するために，精製hPIPに対する多クローン性抗
血清の能力を示す。 第８図は，抗−40kd抗体によって,PA2へ結合したhPIP
の検出について示す。 第９図は,hPIPを生成する細胞に対するWestern Blot
の結果を示す。 第10図は,pU200へ挿入するためのヌクレオチドならび
に推定アミノ酸配列を示す。 第11図は,pU500へ挿入するためのヌクレオチドならび
に推定アミノ酸配列を示す。 第12図は,p600へ挿入するためのヌクレオチドならび
に推定アミノ酸配列を示す。 第13図は,hPIPに関する完全なコード配列を有するpLE
−１へ挿入するためのヌクレオチドならびに推定アミノ
酸配列を示す。 第14図は，種々のクローンhPIP cDNAとゲノム部分と
の関係を示す。 第15図は,hPIP−変換CHO細胞におけるPA2活性の抑制
を示す。 第16図は，組換え型hPIPによるPA2抑制を示す。 第17図は,hPIPならびにホスホリパーゼに関する比較
アミノ酸配列を示す。 第18図は,PGE₂放出を推定するin vitro検定における4
0kd蛋白の活性を示す。 第19図は,hPIP活性に関するin vivoにおけるラット胸
膜炎抑制検定の結果を示す。 第20図は,in vivoにおける足−浮腫検定において，カ
ラゲニンと同時に注射したhPIPの活性を示す。 第21図は,100μｇの精製hPIP,1mgのインドメタシンな
らびに200μｇのデキサメサゾンを腹膜腔内へ投与した
場合，後足の浮腫を抑制する相対的な能力を示す。 第22図は，ラットの大腿静脈から投与された場合，種
々の用量の精製hPIPが後足浮腫を抑制する相対的な能力
について示す。 第23図は，ラットに対して筋肉内投与された場合，補
助薬誘発関節炎を伴う関節腫脹を抑制する精製hPIPおよ
びデキサメサゾン（200μｇ）の相対的能力を示す。 本発明の実施態様 A.PIP蛋白の性質 本発明の蛋白は，出発物質として，透析症例から得た
ヒト腹膜透析液を用いて調製した。ここに示した精製方
法によって，均等質の蛋白であってかつそのままの状態
でみられるような蛋白に伴う不純物を含まない蛋白が得
られる。この精製方法によって，それ自体を医療に用い
られるほど十分に純粋な蛋白を得ることに成功したが，
この精製物質の効力も，選択可能な調製方法の開発にお
いて重要なステップである。hPIPのための組換え技術に
ついてここで述べる。従って，本発明のPIPは，ここで
述べた様に調製されたhPIPのみならず，選択可能な方法
を用いて得られた実質的に同様な構造の蛋白を含む。
“実質的に同じ”によって，ホスホリパーゼA2の抑制に
おける蛋白の活性（PA2抑制検定）（下記に述べるin vi
troの酵素検定方法において述べたように）は，保持さ
れるということを意味している。第13図に示したアミノ
酸配列は，この活性を示すことが知られている。 アミノ酸配列は，種々の方法において修正されても，
その基本的な活性を保持するということは十分に認識さ
れている。第１に，ペプチド配列のある部分は，活性に
関して欠くことのできないものでなく，全く純粋に生成
された蛋白の分画のみが必要とされると考えられる。従
って，第13図に示されたアミノ酸配列の部分は，活性が
保持されるならば定義内に含まれるものである。第２
に，配列中の特別な，もしくは，わずかに特別なアミノ
酸の追加，削除または修正は，機能に関しては重要でな
い変化をもたらすと考えられる。第３に，蛋白は，イオ
ン化水素を含んでいるため，中性もしくは塩のような蛋
白のイオン化状態は，周囲の培地のpHに依存するもので
であり，蛋白が液体の形で存在するならば，液体のpHに
依存するものである。このことより，蛋白は，固体の形
で調製される。さらに，配列中のアミノ酸は，その側鎖
において，それほど重要でない変化を被るものである。
例えば，スルフヒドリル群の酸化のようなものである。
修正も，活性を破壊する点において無効であると思われ
る。最後に，蛋白は，非蛋白残留分（例えば，リン酸，
アセチル群もしくは炭水化物のような）を伴い，本来の
状態で見出されることがある。本発明の精製されたもし
くは組換え型PIPは，機能的に定義されているが，すべ
ての実施態様は，第13図において例示したhPIPと相同な
広範な配列を保持することが期待される。相同性のレベ
ルは，第13図のヌクレオチド490-852によってコード化
されている興味ある部分における保存的な変化ならびに
正確な相同性の両方を考慮して,40％以上であることが
期待される。付加的な変化は，蛋白の他の部分において
受け入れられる。前述の修正はすべて,in vitroにおけ
るホスホリパーゼA2（PA2）抑制検定において示された
活性が破壊されない限り，定義内にあると言える。 “活性PIP断片”は,PIPに関しては，前述の第13図の
ヌクレオチド490-852によってコード化された配列のみ
から成るペプチドを意味する。この断片のみ用いるなら
ば,Chou-FasmanもしくはKyte-Doolittleの標準アルゴリ
ズムの適用によって定めたように，第２の構造が十分に
類似する場合には，最初の構造において,40％より幾分
少ない相同性が必要である。特に,Wallner等によって報
告されたリポコルチンにおける31-381と付されたヌクレ
オチドによってコード化されたペプチドは，最初のアミ
ノ酸配列が，この部分において,40％以下の相同性を明
らかに示しているにもかかわらず，この要求を満たす第
２の構造を備えている。従って,hPIP配列よりひき出さ
れたものと同様に，この特別な断片もまたクレームされ
る。 “動作可能な結合”は，成分が，その通常の機能の実
行するために立体配置されている近位にを意味するもの
である。従って，コード化配列に動作可能に結合した対
照配列は，コード化配列の表現をもたらせることができ
る。 “対照配列（control sequence）”は,DNA配列，もし
くは所望のコード化配列に適切につながれたとき，この
ような配列と調和できる宿主において表現をもたらせる
ことができる配列を意味する。このような対照配列は，
原核生物および真核生物宿主の両方においてプロモータ
を含み，そして原核生物においても，配列に結合するリ
ボソーム，さらに，真核細胞において，終末スグナルを
含む。表現を生じさせるのに必要もしくはその助けとな
る付加因子についても，結果的に確認され得る。ここで
用いた様に，“対照配列”は用いられた特別な宿主にお
いて表現をもたらせるのにどんなDNA配列でも必要であ
り得るということを単に意味している。 “細胞”もしくは“組換え型宿主細胞”または“宿主
細胞”は，文脈より明らかな様に交互にとり替えのきく
言葉である。これらの言葉は，直接対象細胞，さらに言
うまでもなくその結果（子孫）も含むものである。突然
変異や環境の違いのため，すべての子孫が親の細胞と精
密に同じであるというわけにはいかないことは理解され
ていることである。しかし，この様な変化した子孫は，
前記の言葉が用いられる場合に含まれるものである。 B.透析液からのPPIの精製 一般に，本発明のhPIPの精製は，第２図に示した様に
実施した。言うまでもなく，別の方法も可能であるが，
ここに記載された方法により均質性の活性試料が得られ
る。第２図に示した特異的な方法に関して要約されたア
プローチは，簡単に言えば，次の通りである。 約2lの液体を得るために充分な透析液は，連続的な腹
膜透析を受けている症例の一バッチから都合よく入手で
きる。その後，所望量の純粋生成物を得るために,2lの
バッチについて，下記の方法を実施する。その液体はま
ず，濃度が増加する硫酸アンモニウムにさらされる。約
40％〜60％の硫酸アンモニウム飽和において沈澱した分
画は，活性を含んでおり，さらに精製を受ける。40％以
下の硫酸アンモニウムにおいては不溶である蛋白を，前
もって沈澱させることは有用なことである。この沈澱物
を遠心分離によって取り出し，さらに精製を実施する。 塩濃度を低下させるために，硫酸アンモニウム含有分
画を，およそpH8の適当な緩衝剤中に溶解した後，低温
において，同じもしくは匹敵する緩衝剤に対して透析を
実施する。 その後，透析物は，アルブミン成分を取り除く処置に
供される。このアルブミン成分は最も多量の不純物であ
る。同じ緩衝剤においてこれまで平衡であった親和力支
持Affi−ゲルブルーに対するクロマトグラフィーは，こ
の目的に適合する。所望のPIP含有分画は，これらの条
件下でカラムに結合せず，流出容量中に現れる。しか
し，溶液中の不純蛋白は，カラムによって保持され，高
塩濃度下で溶出される。 PIP分画は，例えばコンカナバリン−Ａセファロー
ス，レンチルレクチン−セファロース，もしくは，ピー
ナッツアグルチニン−セファロース,pH8緩衝剤と平衡し
ているコンカナバリン−Ａセファロースの様なレクチン
支持（support）により処理される。再び，所望の活性
は，これらの条件下にてカラムに付着しない。 PIP含有流出分画を，陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによって，例えばおよそpH8において，同様な緩衝剤
中に平衡状態であるDEAEセルロース,QAE−セルロースも
しくはSP−セルロース,DEAEセルロースを用いて，さら
に精製する。hPIPはカラムへ吸収させ，分画は塩分勾配
を用いて溶出させる。溶出物分画のPA2抑制活性が測定
され所望のPIP分画を確認する。 活性分画を,SDS-PAGEにかけたとき,SDS-PAGEは，不活
性蛋白の18kD結合，ならびに活性40kD結合をもたらす。
洗浄剤を用いずに，この40kD結合を溶出させ，再形成さ
せて所望の活性を示す蛋白を得た。この調製方法は基本
的にはLaemli,U.K.,Nature（1970）23:680-685の方法に
従ったものである。そして約3mm12.5％ゲルが,10mgの総
蛋白を含む混合物を精製するために適切である。 前述の様にして得られた40kd結合は，下記のＤ章で述
べる様に，数多くのin vitroおよびin vivo効力検定に
おいて証明されているような高いPIP活性を有する。し
かし,PIPに加えて,apoAIVならびに，同様な分子量を示
す他の蛋白（複数）も含んでいる。この精製過程を通っ
たPIPに続いてみられるapoAIVは,PIPに対する安定性を
もたらすこと，さらに,PIPはapoAIV複合物として，本来
の場所にみられるであろうことが信じられている。下記
のようなapoAIVから一旦分離されると,PIPは比較的不安
定になりやすい。従って，この複合物の形で，薬学的組
成のPIPを調製することが得策であると考えられる。 PIP活性と40kd蛋白との関連性は，コンカナバリン−
Ａセファロース処置による結果の活性分画に対して分析
的RP-HPLCを実施することによって，さらに確認され
た。このRP-HPLCにより分離がなされ，そこでは多数の
蛋白（溶出ピークを含む）のうちひとつのみに活性が存
在する。この活性ピークは,SDS-PAGEにかけた場合，単
一40kd結合をもたらした。 さらに，下記に述べる様に，この40kd結合は，ウサギ
に注射した場合,PA2抑制活性を結合するために，さら
に，ホスホリパーゼＡとの複合物を生成できる蛋白を結
合するために，免疫反応が可能な多クローン性抗血清を
ひきおこした。従って，この免疫抗原もapoAIVを含有し
ているが，誘発された抗体は,PIPとの反応を示す。 しかしながら，第２図に示した様に，上述の陰イオン
交換クロマトグラフィーからの活性溶出液をpH5.5のク
エン酸ナトリウム緩衝液を用いる等電性の沈澱反応に供
することによって，付随した蛋白からヒトPIPを単離す
ることも可能である。この緩衝剤に対して活性分画を透
析することによって,apoAIVを含む非−PIP不純物の沈澱
という結果をもたらす。この上澄液は，ヒトPIPを含ん
でおり，これは，上述の様に，電気泳動によって，純粋
な40kd結合として取り出される。 C.有用性および投与 本発明のPIP蛋白はin vitroにおいて，ホスホリパー
ゼ抑制因子としての活性を示すが，細胞培養においてPG
E₂の生成を抑制することができ，いくつかのin vivoモ
デルにおいて，有効な抗炎症作用を示すものである。従
って，本発明の蛋白は，ヒトならびに家畜における望ま
しくない炎症徴候を改善，治療もしくは減少させるのに
有用である。本発明の蛋白は，次の点において有用であ
る。すなわち，感染や創傷のような外部の刺激に反応し
て生成された過剰の炎症反応を調整する点，さらに，慢
性関節リウマチ，喘息，浮腫，皮膚炎，関節炎，結膜
炎，アレルギーならびにエリテマトーデスのような炎症
性疾患を治療する点の両方である。 本発明の蛋白の投与は，一般的に0.1-100μg/kgの用
量範囲であり，宿主の体重あたり0.1-10μg/kgがより望
ましい。言うまでもなく，投与量は，対象症例の性質，
治療すべき症状の重篤度および投与の方法に依存する。
例えば，静脈内注射は一般的に他の選択可能な経路より
少量で済む。所望の効果が得られるまで，数回にわたっ
てPIP蛋白を，一回投与，もしくは，長期にわたって一
定の注入により投与する。 この蛋白は，望まれる投与方法に依存して，水溶液も
しくは，製剤的賦形剤の存在下で投与され得る。蛋白製
剤については，望ましくは，皮下，静脈内，もしくは筋
肉内注射のような注射によって，または膜を通過する非
経口投与により投与される。エロゾルもしくは経口投与
も，安定化成分の存在下で可能である。apoAIVとの複合
体は，注射用の製剤と同様に，これらの成分中のPIPに
対し安定しているものである。 注入可能物質は，注射の前の再形成に適している，液
体，もしくは懸濁液，固体としてもしくは,PIPまたはそ
のapoAIV複合体の乳濁液として調製される。適切な賦形
剤としては，例えば，水，食塩水，デキストロース他が
あげられる。緩衝剤，乳化剤他の様な少量の補助物質も
含まれ得る。 坐剤投与にはポリアルキレングリコールおよびトリグ
リセライドのような結合剤や担体が付加的に用いられ得
る。エロゾル投与は，気管支疾患の緩解に特に適してお
り，それには一般的にPIP蛋白もしくはその複合体（界
面活性剤およびプロペラントと共に微細に分離された形
で）を利用する。代表的な界面活性剤は，脂肪酸セステ
ルを含む。代表的なプロペラントは，フレオンの様な，
低アルカンもしくはフッ化アルカンである。ローション
剤もしくは軟膏剤のような局所的投与も実用的であり，
局所的治療の場合に好まれる。 PIPおよびapoAIVの両方を含有する40kd SDS-PAGE溶出
液と，本発明の精製蛋白は双方共，診断や治療のモニタ
ーに有用な免疫検定のための抗血清もしくは単クローン
抗体を調製するために有用である。免疫検定の方法は，
当該分野において良く理解されており，多くの変更が可
能である。拮抗的な抗原もしくは抗体のどちらかは，放
射性物質，蛍光物質もしくは酵素を用いて標識化でき
る。この検定は，抗原−抗体複合体の直接的検出とし
て，免疫複合のための拮抗特定として，もしくは，複合
体が，追加抗体によってさらに免疫活性化されるサンド
イッチ検定として実施され得る。この検定では，標準の
方法を用いる。本発明の貢献は，適切な抗原の提供であ
ると言える。すなわちこのような検定の実施のための標
準，もしくは拮抗的抗原として，および，適切な抗血清
の調製のための物質をひき出す抗体としての直接的使用
のための抗原である。 D.実施例 以下に,hPIPの精製のための例証となる方法を記述す
る。これに限定するつもりはない。活性かつ純粋な蛋白
質を得るためには，付加的な修正が明らかに必要だから
である。しかしながら，この特別な方法によれば，実
施,hPIP活性を有する40kd蛋白が均質に（SDS-PAGEに対
する）調製され，かつ結合蛋白から遊離したヒトPIPが
調製される。 D.1 透析液からのhPIPの精製 ヒトPIPを，精製についての検査を行うために，ホス
ホリパーゼ（PA2）抑制検定を用いて透析液から単離し
た。約2lのヒト腹腔洗浄液（これは，連続的に外来腹腔
透析を受けている患者から得た）を，粗い薄地の綿布を
通して濾過することによって清澄にした後，硫酸アンモ
ニウム分画にかけた。40％の飽和液を得るのに十分な固
体硫酸アンモニウムを供給し，得られた沈澱物を20分
間,10,000×ｇで遠心分離にかけて，上澄液を回収し
た。十分な量の固体硫酸アンモニウムを,60％の飽和液
を得るためにこの上澄液に添加し，さらに遠心分離を繰
り返した。この沈澱物（これは,PA2抑制活性を含んでい
た）を,20mMの重炭酸アンモニウム,1mMのフェニルメチ
ルスルホニルフルオライド（PMSF）を含有するpH7.8の
緩衝剤（緩衝剤Ａ）およびアプロチニンに50μg/mlで溶
解した。この再構成した溶液を，全塩濃度を低下させる
ために,4℃において緩衝剤Ａに対して透析を実施し，イ
ンビトロ中におけるPA2抑制検定（下記）において活性
であることが示された。 50mgの蛋白を含有するこの透析物の一部は，緩衝剤Ａ
においてあらかじめ平衡状態にした2.5cm×12cmのAffi
−ゲルブルー（BioRad Laboratories,Richmond,Califor
nia）カラムに適用した。0.3ml/分の流速で,2mlの分画
を集めた。このカラムは,0〜0.5M NaClの濃度勾配のNaC
lを用いて溶出させた。この分画について,PA2抑制活性
に関する検定を実施し，全活性は，第3a図に示すよう
に，容積による流量で示された。（第3a-3c図におい
て，実線はPIP活性を指示している）。 この活性分画をプールし，凍結乾燥させた後，再構成
し，緩衝剤Ａ中で，あらかじめ平衡状態にした2.5cm×1
2cmのコンカナバリン−Ａセファロースカラムに適用し
た。流速0.2ml/分で溶出したところ，第3b図に示される
溶出プロフィールが得られた。再度，全活性は，インビ
トロ中のPA2抑制検定によって検定したように，容積に
よる流量で見出された。この活性分画をプールし，凍結
乾燥した。活性分画プールの少量部分をRP-HPLC分析の
ために取っておいた。 次いで、この凍結乾燥した分画を緩衝剤Ａ中に再構成
し，緩衝剤Ａ中であらかじめ平衡状態にしたDEAE-52の
2.5cm×12cmカラムに適用した。さらに０−0.2Mの直線
的なNaCl勾配を用いて溶出を実施した。第3c図は，この
溶出のプロフィール，および約0.125M NaClにおいて溶
出した分画中の活性の存在を示す。 この活性DEAE溶出物の分画をプールし，濃縮し，脱塩
した後，約10mgの蛋白を，電気泳動分離のための3mm12.
5％ポリアクリルアミドゲルに負荷した。この電気泳動
分離は，ジスルフィド結合が，分画前に，β−メルカプ
トエタノールで還元されないこと以外は,Laemli（前
出）の方法に従う。蛋白のバンドについては,50％トリ
クロロ酢酸における0.1％クマシーブルーを用いた３分
間の染色過程，およびそれに続く５％の酢酸溶液中にお
ける５分間の脱染色によって検出された。結果として,2
つの主な蛋白のバンドのみが得られた。１つは,18KDに
おけるバンドであり，もう１つは40KDにおけるバンドで
ある。これらのバンドをゲルより切り離し,9mm³の立方
体へ切りきざみ，この蛋白を４℃において一昼夜，緩衝
剤Ａで溶出した。 この溶出物を処理してグリシン,SDSおよび染料を数段
階で除去した。第一に，この溶出物を24時間にわたって
緩衝剤Ａに対して透析し，次いでこの透析物を凍結乾燥
によって濃縮した。この凍結乾燥した物質を緩衝剤Ａ中
において再構成し,2容量の水飽和ブタノールを用いて３
回抽出を行った。界面を含んだ水層を窒素下で乾燥し
て，残りのブタノールを除去した。次いで，蛋白のレフ
ォールディングを完成させるために，少なくとも24時間
にわたって,1mg蛋白/mlの状態で,4℃において放置し
た。インビトロ検定におけるPA2抑制に関する検定で
は，この40KDバンドは，活性を示したが，この18KDバン
ドは，活性を示さなかった。 第４図は，最初の抽出物，精製の各段階における調製
物，および精製した蛋白について実施したSDS-PAGEの比
較結果を示す。このバンドは,2回の連続した酸化操作な
らびに染色操作（製造者の指令に従って）による銀染色
（BioRad Labs,Richmond,CA）を用いて展開された。１
列は分子量マーカーを含む。２列は硫酸アンモニウム処
置前の透析液である。３列は40-60％硫酸アンモニウム
沈澱物。４列は,Affi−ゲルブルークロマトグラフィー
からのプールした活性分画を含む。５列は，コンカナバ
リン−Ａセフォロースクロマトグラフィーからのプール
した活性分画を含む。７列および８列は，予備的なゲル
電気泳動から得られたそれぞれ１μｇおよび50ngの40kD
バンドを含む。この全操作により，第５図に例示された
結果にみられるように約500倍の精製が得られる。50％
抑制に必要なμｇ蛋白の比較を用いれば，この粗抽出物
の特異的活性は，精製された40kDバンドの活性の約0.2
％となる。 上述したコンカナバリン−Ａセフォロース処理から得
られる活性分画の一部分をＣ₈カラムを用いてRP-HPLCに
供し,0.1％のトリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの勾
配を用いて溶出した。第６図は，このカラムの溶出プロ
フィールを示す。多数の蛋白分画が得られ，ただひとつ
の分画のみが活性を含有している。次いで，この活性分
画を12.5％ゲルを用いて分析的SDS-PAGEに供し，この展
開したゲルをクマシーブルーＧ−250もしくは銀試薬を
用いて染色した。各場合において,40kdバンドのみが観
察された。 純粋なヒトPIPを得るために，このプールした活性溶
出物（陰イオン交換レジンからの）を,pH5.5のクエン酸
ナトリウム緩衝液に対して透析した。沈澱した蛋白を遠
心分離によって取り除き，この上澄液中蛋白をSDS-PAGE
に供した。次いで，上述のように，この40kdバンドを回
収した。必要に応じて，この上澄液をpH7.5とし,Parent
e,L.,et al,Life Sci（1985）36:1225-1231に記述され
ているようにPLA2−セファロースを用いて洗浄した後，
この結合したhPIPを,1.0M NaClもしくは0.1M酢酸のいず
れかを用いて純粋な溶出させる。 D.2 抗−PIP抗体の調整 この上記40kdバンドは，続いて,hPIPおよびアポリポ
蛋白AIV（apoAIV）を含む蛋白混合物であることが示さ
れた。（下記にさらに詳しく述べる）。しかしながら，
この混合物は,hPIPと特異的に反応する抗体を増加させ
ることが可能であった。抗−hPIPを得るために，ニュー
イングランド白ウサギに，完全フロイントアジュバント
に含まれている溶出40kdバンド分画の200μｇを，皮下
もしくは筋肉内に注射した。次いで３週間の間隔で同じ
ワクチンをこのウサギに接種した。次いで，この接種後
７−10日間に，このウサギの耳の静脈から採血し，得ら
れた血清について，対照として非−免疫血清を用いて，
その40kd溶出物（前述）を結合する能力を試験した。 この結合検定について,40kd蛋白を精製hPIPの500ng
を，ポリスチレンプレートの個々の穴に固定し，様々な
稀釈度の抗血清をこの穴に加えた。特異的に結合した抗
体の量については,I¹²⁵−標識化蛋白（Amersham,Inc.）
を用いて定量した。下記の表１に示されているように,
1:400の血清稀釈は，著しい量の抗体を示している。 これらの結果から,40kd蛋白を含む遊離hPIP,精製hPIP
をを用いた競合した置換によって確認された。この1:10
0の血清稀釈は，精製された40kd蛋白の量を変化させる
のと同時に，被覆されたポリスチレンプレートに適用し
た。この量の変化については，その結果を表２に示す。 このウエスタンブロットによる精製の過程を示すため
に，さらに，この抗血清の免疫反応性を用いた。この抗
血清に対して試験すべき標本を,2×SDSを用いて1:1に稀
釈した。標本緩衝液（Laemli,前出）および10-25μｇの
蛋白を,1.5mmの厚いSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
分画した（12.5％アクリルアミド）。この分画された蛋
白を，ニトロセルロースシート上へ電気移送した。非特
異的部位をブロックするために,5％BSA,5％オバルブミ
ンおよび５％無脂肪乾燥牛乳を含有する溶液を用いて，
免疫反応性40kd蛋白は，抗−hPIP抗体および¹²⁵Ｉ−蛋
白Ａと共に検出される。対照は，非免疫ウサギ血清と並
行して走らせた。 第７図は，第４図に示された同じ分画（様々な精製段
階で得られた）について実施したウエスタンブロットの
結果を示す。１列は,43kd¹²⁵Ｉ−オバルブミン,2列は透
析液,3−５列は，それぞれ,Affi−ゲルブルー,Con−Ａ
セファロースおよびDEAEカラムからの活性分画であり,6
列は,SDS-PAGE調製後に得られた物質である。この40kd
バンドは，精製を通して特異的に検出される。 この抗血清のhPIPと特異的に反応する能力は,40kd混
合物と反応して増加されるが，第８図に示されているよ
うに，ホスホリパーゼA2（PA2）と特異的に結合する蛋
白（PIP）を検出する能力によって示される。PA2（150p
mol）を，ポリスチレン穴に固定し，過剰の部位をヒト
血清アルブミンを用いてふさいだ。次いで，増量した40
kd蛋白を,1500pmolの遊離PA2の有無にかかわらず添加
し,22℃において30分間結合を維持した。洗浄後，抗−P
IP抗体および¹²⁵Ｉ−蛋白−Ａを用いて，この結合したP
IPを検出した。HSAだけを含有する穴もネガティブな対
照として含めた。 第８図の結果は,40kd混合物を含むPIPを添加する量を
増加した場合，穴に対する抗体結合も増加することを示
している。しかし,1500pmol PA2を40kd混合物を含むPIP
とあらかじめインキュベートした場合，この結合は,HSA
で被覆した穴の非特異的結合レベルに減少され得る。そ
れゆえ，この抗体は，それ自体がPA2に結合する蛋白に
結合する。このことは,PIPの特質であるが，この40kd混
合物の他の成分の特質ではない。 また,1:100の稀釈率において,10μｇの40kd混合物と
の抗血清のプレインキュベーションは,PA2を固定する蛋
白結合を検出する能力を中和させた。 D.3 cDNA生成のためのmRNA供給源の確認 精製40kd蛋白に対して増加した多クローン性抗血清
を,cDNAライブラリーを得るために有益なmRNAのための
供給源を確認するため,hPIPの生成のための種々のヒト
細胞供給源を評価するべく用いた。適当なスクリーニン
グ操作において,SDS−ポリアクリルアミドゲルにおける
分画後に，溶解した細胞蛋白について,hPIP免疫反応に
関し検定した。 スクリーニングについて考えられるものに，単核−マ
クロファージ細胞系U937およびHL60のような培養された
ヒト炎症細胞；多形核細胞（PMN）のような単離された
ヒト血液細胞だけでなく20％までのマクロファージを含
むことが知られている肺組織などが包含される。この細
胞を，デキサメサゾン（0.1μＭ）の有無にかかわらず
適切な培地（血清を含むもしくは含まない）において一
昼夜インキュベートした。細胞上澄液もしくは，この細
胞自体について，抗−hPIPとの蛋白免疫反応性に関し検
定した。 細胞溶解産物のために，細胞を洗浄して，血清蛋白を
取り除き,4℃において,5mM MgCl₂,0.1％NP-40,0.1mMPMS
F,50μg/mlアプロチニンを含有するリン酸塩緩衝食塩水
を添加することによって溶解した。培養皿に付着した細
胞については，直接皿上で溶解させ，一方，懸濁細胞に
ついては，遠心分離によって収集し、上記の緩衝剤に再
懸濁させた。３−５分後，この溶解産物をこの培養皿か
ら集め，遠心分離（1000×g,5分）によって核を取り除
いた。 抗血清に対してテストされるべき標本（上澄液もしく
は溶解産物）を,2×SDSを用いて1:1へ稀釈した。標本緩
衝剤（Laemmli,U.K.,前出）および50-100μｇの蛋白を,
1.5mmの厚いSDS−ポリアクリルアミドゲル（12.5％アク
リルアミド）上で分画した。このゲルは，この抗体の非
特異的結合のための対照として，精製させた40kd蛋白50
μｇとプレインキュベートした抗−hPIP抗血清の使用を
加えることによって，展開された。ニトロセルロース
を,X−線フィルムにさらした後，様々な細胞タイプにお
けるhPIP免疫反応性は，オートラジオグラムの濃度走査
によって定量できる。 ある細胞タイプにおいて,hPIPは，培養媒体へ分泌さ
れる。このような培養媒体からの部分的に精製されたhP
IPについて，上記のような検定を行う。（数例におい
て，調整された媒体について，硫酸アンモニウム分画,A
ffi−ゲルブルークロマトグラフィーおよびCon−Ａセフ
ァロースのクロマトグラフィーと供し得る。Con−Ａセ
ファロースカラムに結合しない分画は，凍結乾燥され，
上述のウエスタンゲルに対するhPIP免疫反応性について
分析される）。 第９図は,U937細胞によって48時間調整された血清含
有培地および血清を含有しない培地の両方から得られた
結果を示す。 このPIP蛋白は，血清を含まない培養細胞からの培地
において,37kd結合して現れる。〜40,000ダルトンにお
ける免疫反応性バンドはほとんどがapoAIVである。この
結合は，血清中，および血清含有U937で調整された培地
に存在するが，血清を含まないU937調整培地には存在し
ないからである。同様に，〜68,000ダルトンにおいてみ
られる免疫反応性バンドは，血清中に含まれているアル
ブミンを表している。この50,000ダルトンのバンドは,I
gG重鎖であり血清含有培地においてのみみられる。ま
た，これは，非免疫抗血清を用いた場合にも検出され
る。このIgG重鎖は，このウエスタンを調べるために用
いられる抗体とは無関係の¹²⁵Ｉ−蛋白Ａと結合し得
る。 これらの結果は，培養されたマウスの線維肉腫細胞に
おけるPGE₂生成の抑制によって示されるように（下記を
参照）,PA2抑制活性について，血清を含まないU937調整
培地由来の同じ標本を検定することによって確認され
た。従って,U937細胞は，ひき続いた抗体スクリーニン
グのためのcDNA発現ライブラリーを調製するために選択
された。 D.4 選択された細胞からのcDNAライブラリーのhPIP cD
NA構成の調製 cDNAライブラリーは，最初はU937細胞から調製され
た。しかし,PMNおよび肺細胞の調製物も用いられた。 全細胞RNAは，標準方法によって，選択細胞から調製
された（Chirgwin,J.M.,et al.Biochemistry（1979）18
5294-5299）。ポリＡ⁺RNAは，オリゴーdTセルロースカ
ラムを通るこのRNAの２つの連続経路によって単離され
た。 hPIPをコード化するcDNAクローンを得る最大限の可能
性を提供するために,2つの分離したcDNAライブラリーが
構成され得る。そのうちのひとつは，無作為のプリマー
（P.L.Biochemicals）を使用し，もう１つは，オリゴー
dTプリマーを使用した。両方の場合において，最初の鎖
の合成は，この適当なプリマーとともに15μｇのポリＡ
⁺RNAを使用し，標準反応状態を用いた逆のトランスリプ
ターゼ（Avian Myeloblastosis Virus）により合成し
た。 各cDNA調製物の第２鎖は，このRNAをDNA-RNAハイブリ
ッドから加水分解するためにRNAse H（Gubber,U.,et a
l,Gene（1983）25:263-269）を用いて合成され，続い
て，得られた単一鎖領域に満たすためにDNAポリメラー
ゼ（Klenow断片）を用いて合成された。それゆえ，二重
鎖で平滑末端のcDNAsが生成する。内部のEcoRI限定部位
については，製造者の指示に従って,EcoRIメチラーゼ
（New England Biolabs）を用いてメチル化することに
よって保護される。さらにEcoRI部位（P.L.Biochemical
s）を含む合成オリゴヌクレオチド連鎖については，そ
の後,T₄リガーゼを用いて，平滑末端cDNAsへ結紮する。
重合体連鎖は，その後のEcoRIによる消化によて単量体
へ還元され、その断片は，低融点アガロース（1.5％ア
ガロース）を通した電気泳動によって特異的な大きさに
分類するべくスクリーニングされ得る。さらに必要であ
れば取り出すこともできる。 得られた二重鎖cDNAは，バクテリオファージの独特な
EcoRI部位（Young,R.A.およびDavis,R,W.,Science（198
3）222:778-782によって示されているような発現ベクタ
ーλgtll）へ結紮する。このベクターにおけるEcoRI部
位が，β−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ酸位1015に
おける正しい読み枠に存在するため,EcoRI部位に関し
て，読み枠および配位も正しいcDNAは，イソプロピルチ
オガラクトシド（IPTG）の誘導によって，β−ガラクト
シダーゼとの融合蛋白として表され得る。この発生率
（無作為）は６回中１回である。（２配位×３読み
枠）。このように誘導されたファージプラークによって
表される蛋白についても，この40kd蛋白を用いて調製し
たhPIPに対して，多クローン性抗血清を用いて評価を行
った。 このcDNAの結紮後，この組換えDNAを，市販のパッキ
ング抽出物（Amersham,Inc.）を用いてin vitroにおい
てパッケージし，組換えファージについては,Young,R.
A..et al,（前出）によって記述のように，宿主株E.col
i.C600Hflsに対し力価検定を行った。約200,000の組換
えが得られた。 このcDNAライブラリーについては,hPIPに対して抗体
を用いて評価を行った。約５×10⁵の適切な力価のファ
ージを,E.coli Y1090とインキュベートし，（平板培
養），所望のファージ濃度を得るために,10の15mm板上
で20時間生長させた（Yong,R,A.et al,前出）。β−gal
−融合PIP蛋白が，溶解産物中にみられるため，寒天上
にニトロセルロースを重ね，板を37℃において一昼夜イ
ンキュベートした。次いで，このニトロセルロースフィ
ルターについて，組換え融合蛋白の抗体検出を実施す
る。この抗体検出は，抗体がファージベクター（λgt1
1）のみに感染したバクテリアからの溶解産物に前吸収
されること以外は，ウエスタンブロットと実質的に同じ
である。 より詳細に言えば，このフィルターは，まず,PBS,0.1
％NP-40に溶解した57％の無脂肪乾燥牛乳を用いて非特
異的結合をブロックすることにより，処理した。このフ
ィルターを,PBS,0.1％NP-40,5％BSA,5％オバルブミン中
で調製した抗血清の1:100稀釈液を用いて２時間インキ
ュベートを行った後,PBS,0.1％NP-40中で洗浄した。結
合抗体は，¹²⁵Ｉ−蛋白Ａ（10⁵cpm/フィルター）および
洗浄フィルターのオートラジオグラフを用いて検出し
た。 この検出方法を用いて，各プールにおける全プラーク
がポジティブとなるまで，連続的なスクリーニングを通
してポジティブクローンを精製した。誤ったポジティブ
については，次のように確認した。すなわち，これは,2
cm²のニトロセルロースディスクを重ねた100プラーク/2
cm²において，重複を用いてスクリーニングを実施し，
さらにこの重複ニトロセルロースディスクを,40kd蛋白
を含む10μｇのhPIPによる前処置を受けた抗体，もしく
は受けなかった抗体とともにインキュベートすることに
よって確認した。誤ったポジティブクローンと結合する
抗体は,hPIPによる前処置を受けた抗血清と共に現れる
はずである。 ５つの最も強いポジティブクローンから調製されたフ
ァージDNAについて,cDNA挿入の大きさおよび連鎖−関連
性に関する分析を行った。 ５つの全cDNA挿入は約200bpであった。そのうちのひ
とつ（λＵ−200で表される）を,pU200にするためにpBR
329のEcoRI部位へサブクローンし，そしてさらに引き続
いて分析を行うためにM130mp9およびM13mp8へサブクロ
ーンした。第10図に得られたヌクレオチド配列およびそ
の起源のアミノ酸配列を示す。生成された融合蛋白の長
さから，正しい読み枠を推定することが可能であった。
これらの蛋白は，このβ−galより，およそ70アミノ酸
分長かった。従って，このリンカーに続いて，挿入した
配列は，おそらくこのPIP蛋白の内部の部分から,200bp
の開放読み枠を維持した。従って，付加的なcDNAライブ
ラリーを調べるためにPU200を用いた。 付加的なライブラリーPMN 0.15M NaCl中の６％デキストランを通して，血液を沈
澱させることによってヒト白血球を調製した。この上澄
液中の白血球細胞を遠心分離によって集め,PBS中で洗浄
し,RNA単離のために用いた。λgt10におけるcDNAライブ
ラリーは，クローン化ベクターとしてλgt10を用いるこ
と以外は，上記のように調製した。このライブラリー
は，このPMNライブラリーを意味する。λgt10ライブラ
リーも上記の如く,U937細胞より調製した。 各cDNAライブラリーは,E.coli.C600Hf1上で約10⁶ファ
ージを生長させることにより，さらに，ニトロセルロー
スフィルターへプラーク溶解産物を移送することによっ
て，スクリーニングのために調製した。このフィルター
についてBenton,W.E.,et al,Science（1977）196:180-1
82に記述のように交雑を実施した。探針については,Man
iatis,T.,et al,Cloning Manualに従ってニックトラン
スレーションによって，標識化を行った。次いで,42℃
において16時間にわたり,1mlの交雑緩衝剤中10⁷cpm PU2
00を用いて，各フィルターを処理した。その後，このフ
ィルターを,22℃において５分間,2×SSC,0.1％SDS中で
２回洗浄した。さらに，より高い温度（60℃）におい
て,0.2×SSC,0.1％SDS中で洗浄した。次いで，この交雑
されたフィルターを乾燥し，オートラジオグラフィーに
よってポジティブなシグナルを検出した。 このU937λgt10ライブラリーは，数種の交雑cDNAを生
成した。そのうちで最も長いcDNAは約500bpであり，λU
500で表されている。λU500のヌクレオチド配列は，ジ
デオキシ配列によって決定され，それは第11図に示され
ている。第11図を第10図と比較することによって，λU2
00およびλU500は，各々の５′末端の約50bpを共有し，
その後分岐していることがわかる。この分析は，下記の
ごとく，イントロンスプライシングのためであることが
後に証明された。 このλgt10PMNライブラリーは，その大きさ400-600bp
の４つの交雑ポジティブを生じた。そのうち最も長いcD
NAは,PMN600で表され，ジデオキシ配列であった。推論
したアミノ酸配列に沿って,PMN600に対し決定された配
列を第12図に示す。PMN600は,50bp区分をλU200および
λU500と共有しているだけでなく，λU500との相同性
は，他の約200bpにまで及ぶ。次いで，これらの配列も
分岐する。この分岐は，以下のように遺伝子における任
意の３′末端エキソンの存在によるものであることが示
された。 ヒト肺のcDNAライブラリー λgtにおけるcDNAライブラリーは，上述の方法を用い
てヒト肺組織から調製されたものである。２つのライブ
ラリーが得られ，ひとつは胎児の肺組織からのものであ
り，他は成人肺からのものであった。肺組織は，重畳に
して約20％のマクロファージを含有しており，モルモッ
トの肺からのPA2抑制因子の生成について報告されてい
る（Flower,R.J.,et al,Nature（1979）278:456-45
9）。 胎児の肺ライブラリーについては,5′−GAAGGTAGCCAC
AGCCACGG−３′の配列を有する合成オリゴヌクレオチド
を用いて，上述の如く検索を実施した。この配列は,PMN
600の配列の塩基23-42を表している（第12図）。陽性に
ハイブリダイズするcDNAは，付加的な上流配列を含有し
ていた。この配列は実際，以下に示すゲノムクローンの
上流のエキソン上にマップできた。このcDNAを,pBR329
へサブクローン化し,pSR−１と名付け,PIPコードmRNAの
大きさを測定するために，次のように用いた。 ヒト肺ポリ−Ａ⁺RNAについて，ナザンブロットを実施
した場合（プローブとしてpSR−１を使用する），成熟
したmRNAは，長さにして約1400塩基であることが証明さ
れた。プライマーとしてpSR−１からの586amHI分画を用
いたプライマー伸長分析が，付加的な500塩基が，完全
長のcDNAを得るために必要であることを証明した。 完全長のhPIP cDNA 成人ヒト肺cDNAライブラリーについては２つのプロー
ブを用いてスクリーニングを実施した。すなわち,pBR32
9へクローン化したPMN600（p600），および合成オリゴ
ヌクレオチド５′−ATGAGCTGTGAGAGGGGCCG−３′（これ
はpSR−１の５′末端を表している）である。４つの陽
性にハイブリダイズするプラークを精製し，サイズを決
め,1360もしくは1340bpのどちらかを含有することがわ
かった。これらのcDNAをジデオキシ配列決定用にM13mp8
およびM13mp9へクローン化した後，そのうちのひとつ
は,hPIPに対する完全長のコード配列を含有しているこ
とが証明された。第13図は，完全なDNA配列およびこの
クローンによってコード化された推定アミノ酸配列を示
したものである。このクローン,pLE−１は，約36.5kdの
蛋白を表す331アミノ酸の最初の翻訳産物に相当するも
のである。成熟した蛋白は，ロイシンをコードするヌク
レオチド112-114で始まると信じられている。 pLE−１のin vitroにおける翻訳産物は，製造者の指
示に従ってRNAポリメラーゼ（SP6システム,Amersham Co
rporation,Arlington,Heights,IL）を添加して,pLE−１
挿入を転写ベクターSP−６へサブクローン化することに
よって，さらにその後網状赤血球ライゼートシステム
（Bethesda Research Laboratories,Bethesda MD）にお
いて生成（in vitroにおいて）されたmRMAを翻訳するこ
とによって得られた翻訳産物は，予想した大きさの36kd
を示していた。コード化された36kd蛋白と腹腔液に関連
した40kd蛋白との間の相違は，グルコシル化のためであ
ると信じられている。pLE−１の配列は，塩基625,595,7
09および808で開始する４つの模範的なグルコシル化部
位（Asn−Ｘ−Ser/Thr）を有する。このことは,SP6-pLE
−１から上述のように転写されたRNAをXenopus laevis
卵母細胞（最初の翻訳産物をグリコシル化できる）へ，
注入し，さらに，卵母細胞の膜分画における成熟40kd産
物を局在化させることによって確認した。 D.5 hPIPをコード化するゲノムクローンの単離 hPIPをコード化する完全なDNA配列もヒトゲノムライ
ブラリーより単離した。pU200,およびp600からの塩基19
8-590を含有する。NcoI断片をプローブとして用いた。
これらには共通の配列をもたない。λCharonファージに
おけるライブラリーは,Maniatis,T.（前出）pp270の方
法によって,Sau3AI−分解ヒトDNAから構築した。スクリ
ーニングのために,10⁶ファージを増殖させ，三重のニト
ロセルロースフィルターを用いて，上述のようにプラー
クの釣り上げを実施する。このフィルターを，上記のプ
ローブを用いてハイブリダイズさせた後，このフィルタ
ーを0.2×SSC,0.1％SDS中,50℃の厳しい条件下で洗浄し
た。二重に陽性であるプラークを取り出し，溶出させ，
第２のスクリーニングを実施するため再びまく。ファー
ジがプラーク−精製されるまで，この方法を繰り返す。 pU200プローブに対しハイブリダイズするプラーク−
精製済ファージ組換体２つ，およびNcoI断片に対してハ
イブリダイズする７つの陽性のものが得られた。これら
のクローンの各々からの精製DNAを,EcoRIで制限分解
し，その結果の断片をpU200またはNcoI断片でのプロー
ビング用にニトロセルロースへブロットした。組換え型
ファージのひとつ，λ12−３は，両ブローブに陽性であ
る断片をもたらした。λ12−３はエキソンII,III,IVお
よびＶを含有していたが，エキソンＩのみが欠けてい
た。付加的制限酵素マッピングは，λ12−３が他のクロ
ーンに重なっていることを示していた。エキソンＩはλ
CM-14に含まれているものであり，λCM-14は断片とハイ
ブリダイズしないが,pU200とハイブリダイズするゲノム
クローンである。λ12−３クローンの制限分析および配
列決定，さらに他の陽性クローンを分析することによっ
て，エキソンＶは、第14図に示されているように，もう
ひとつの型VAで供給されると考えられるということが証
明された。エキソンVAは，λ12−３に存在せず，λ12−
１にみられるものであり，λ12−１はNcoI断片およびpU
500とハイブリダイズするゲノムクローンである。 遺伝子および得られたcDNAクローンにおける配列を比
較することによって,50bp後における、他のクローンと
のpU200の相違は，イントロンをスプライスさせるのに
失敗したためであるということ，また,PMN600およびλU
500間の相違（これらの250bp相同性の下流）は，代替Ｖ
ならびにVAを含有しており,PMN600はエキソンＶを含有
している（pLE−１のように）。 D.5,発現ベクターの構築およびhPIPの発現 哺乳類ベクター hPIPをコード化するcDNAクローンは，様々な宿主にお
して組換え型蛋白を生成するのに通常用いられる（後述
のE.1.参照）。しかし，宿主が自然に生産された蛋白に
よって経験したのと類似の，その後の翻訳処理が可能で
あるため，哺乳類系における発現が好ましい。宿主はま
た，イントロンを複写することもできるため,cDNAもし
くはゲノム連鎖が用いられ得る。 hPIPをコード化する完全長のcDNAクローン,pLE−１
は,EcoRI断片として後述の哺乳類発現ベクターpHS1へ挿
入される。 pHS1の構築宿主発現ベクター プラスミドpHS1は,p84Hからの840bpのhMT-II配列を含
有する（Karin,M.,et al,Nature（1982）299:297-80
2）。これは,hMT-II遺伝子の０−765におけるHind III
部位から，塩基＋70におけるRamHI割線までにおよぶ。
プラスミドp84HをBamHIを用いて完全に分解させ，端末
のヌクレオチドを取り除くため，エキソヌクレアーゼBa
l-31を用いて処理した。そして次に,Hind IIIを用いて
分解させた。所望の840bp断片をpUC8へ連結させた（Vie
ira,J.,et al,Gene（1982）19:259-268）。これは,Hind
IIIおよびHinc II消化で切り開いたものである。この
連結混合物をAmp^Rに対するE.coli.へ形質転換させ，ひ
とつのプラスミド（pHS1で表される）を単離し，ジデオ
キシ配列決定法によって配列決定した。pHS1は，適当な
制限部位を含むポリリンカーの上流に,hMT-II制御配列
を含有する。 hPIP発現ベクターの構築 hPIPをコード化するEcoRI断片（上記のように調製）
をEcoRI消化phs1へ連結し，連結混合物はAmp^Rに対する
E.coli.MC1061へ形質転換させた。その後の形質転換物
を，制限分析によってスクリーニングし，所望のプラス
ミドを含有する株,pMT-PIPを，多量のプラスミドDNAを
調製するために増殖させた。 hPIP蛋白に対する修飾されたコード配列を有する別の
発現ベクターもまた,pLE−２およびpLE−３と呼ばれる
修飾コード配列から調製した。pLE−２には,hPIP蛋白の
2C−末端部分における配列が欠けている。このことは，
その細胞膜への結合のためであると考えられる。pLE−
２は，第13図に示されるpLE−１の配列を有するM13ファ
ージについて,TAC（チロシン残基をコード化する）を置
換するために，塩基951においてTAA終止コドンを配置す
る位置特異的変異を被らせることによって構成されたも
のである。オリゴヌクレオチド５′−CACTGCGTTACTGGA
−３′をプライマーとして使用し，変異させた配列は,5
5℃3Mテトラメチルアンモニウムクロライドによる洗浄
下において，プローブとして賦活されたオリゴヌクレオ
チド５′−GCAGCCCCACTGCGTTACTGGACATCCAG−３′を使
用し，組替えファージプラークをスクリーニングするこ
とによって回復させた。 突然変異は，ジデオキシ配列決定および二重鎖DNAへ
変換される単一形鎖により確認された。終止コドンの正
確な機能についても,EcoRI挿入物SP6ベクターシステム
へのサブクローニング,RNAポリメラーゼを用いた転写，
それに続く網状赤血球溶解産物システムにおける翻訳に
より確認した。単離生成物のSDS-PAGEは,hPIPをコード
化する完全長の配列から得られる36.4kd蛋白と比較する
と,34kdの蛋白であることが示される。SP6mRNAもまたXe
nopus卵母細胞へ注入された。注入された細胞によって1
8時間にわたり調整された培地は，チモサン刺激マウス
腹腔マクロファージからの標識化アラキドネートの放出
によって検定したところ,PIP活性を示した。SP6へクロ
ーン化されたLE−１配列からのmRNAを注入された卵母細
胞によって調整された培地は，この検定において活性を
示さない。EcoRI挿入物は,pMT-PIP（−）を得るためにp
LE−１を構築したのと同様に,pHS−１へ形質転換させ
た。連結混合物を,Amp^Rに対するE.coli.HB101へ形質転
換させ，正しい方向性および配置は，制限分析によって
確認した。 pLE−３は，上記pU500中に回復されたVAエキソンによ
ってコード化されたもうひとつの３′−末端配列を含ん
でいる。pLE−３は,pLE−１における下流の配列を，適
切なPU500からの断片で置換することにより構築された:
pLE−１は,NcoIおよびEco RIならびに精製された独特の
718bp断片で分解された。 pU500は,EcoRIおよびNcoI,ならびに精製されたcDNA挿
入物の独特の419bp下流部分で分解された。これらの断
片の連結により,1137bp断片が得られ，この断片は,pUC8
のEcoRI部位へ挿入され，増殖およびプラスミド精製の
ためにE.coli.HB101細胞へトランスフェクションされ
た。挿入物の正しい方向性および配置を含むプラスミド
は,pLE−３と表された。 pLE−３コード配列は,AvrIIによるpLE−３の分解，ブ
タスト末端化，らにhPIPコード化断片を得るためEcoRI
による分解，による３′末翻訳配列に対するポリアデニ
レーションシグナルの付加により修復された。次に独自
の1037bp cDNA挿入物を単離した。apoAI cDNA由来のpol
y−Ａ付加部位を,NarIを用いたプラスミドpBL13Al（Sei
lhamer,J.,et al,DNA（1984）3:309-317）による分解，
ブラント末端化，さらにEco RIによる分解，ならびに全
apoAI3′未翻訳領域を含む独自の65bp断片の精製により
単離した。この65bp断片をhPIP cDNA連結し,Eco RI分解
pHSIと混合し，そしてさらに，連結させpMT-PIP/Aを生
成させた。次にこの連結混合物を,Amp^Rに対するE.coli
MC1061へ形質転換させた。Amp抵抗性のコロニーからの
プラスミドについて，正確なサイズの挿入物を得るため
にスクリーニングを実施した。 発現hPIPの充分な分泌のために，ヒト成長ホルモン，
ヒトアロリポ蛋白AI,ヒト肺界面活性物質もしくはヒト
レニンから誘導されるようなもうひとつのシグナル配列
を採用することが，好都合であり得る。これは，標準的
な方法により達成される。それは，例えばcDNAの５′末
端を除去するためにSphIを用いてpLE−1,pLE−２もしく
はpLE−３を分解し，成熟した蛋白の損失コドンを配置
し，さらに，上流にある適切なシグナル配列を連結する
方法である。成熟したhPIPの第一のアミノ酸は，第13図
の塩基112におけるロイシン開始および，塩基124におけ
るSphIで切断であると予想されるため,Leu-Arg-Cys-Met
をコード化するオリゴヌクレオチドを用いて最初の４個
のアミノ酸を再構築することが必要である。 哺乳類の組換え型によるhPIPの生成 中国産ハムスター卵巣（CHO）−K1細胞をF12培地およ
びDME培地の1:1混合物および12％ウシ胎児血清よりを含
む培地において成長させた。相当な細胞が,pMT-PIP,PMT
-PIP（−）pMT-PIP/AもしくはpAc-PIP/AおよびpSV2:NEO
と共同断片される（Southern,P.,et al,J Mol Appl Gen
et（1982）1:327-341）。pSV2:NEOは，ネオマイシン類
似物G418に対して抵抗性を示す機能的遺伝子を含有す
る。形質転換においては,Wigler,M.,et al,Gell（197
9）16:777-785,のプロトコール（DNAに対し４時間暴露
した後15％グリセロールを用いた２分間の“ショック”
を含む）に従って,500ngのpSV2-NEOおよび５μｇのpMT-
hPIPを，リン酸カルシウム−DNA中の共沈澱した細胞を
含む16mmの皿上に付与した。一日後，この細胞を1mg/ml
のG418へさらし,G418−抵抗性コロニーを得た。 得られた形質転換物は，またPIP−コード化プラスミ
ドの安定した遺伝子形質を有する。この形質転換物を低
濃度でプレートし，クローン単離物の精製を行なった。
MTプロモーターの制御下のおいて,PIP配列を含む形質転
換物については，検定のためにこれらの単離物の少量
を，マルチウェルプレートにおいて生長させ,10^-4Ｍの
塩化亜鉛を用いて誘導した。hPIP生成物については，培
養細胞中の誘導されたPA2活性の抑制を証明することに
よって検定した。 pSV2:NEOもしくは,pSV2:ENO/pMT-PIP1のいずれかを用
いたトランスフェクションの72時間後に，細胞はＣ−14
アラキドン酸により２時間にわたり標識化された。細胞
を洗浄し,10％のウシ胎児血清もしくは10μM A₂₃₁₈₇，
カルシウムイオノフォア（いずれも細胞PA2の活性化因
子）のいずれかを用いて刺激し，そして細胞膜から放出
された標識化アラキドン酸を測定した。pSV2:NEOのみで
形質転換された細胞は,PMT-PIPを用いてコトランスフェ
クションされたもの（第14図参照）より,30〜90％を越
える量のアラキドン酸の放出（20分後）がみられた。PA
2抑制によって示されるように，多量の所望のhPIPを生
成するクローン単離物は，直接検定のために取り出され
る。 PIP生成の直接検定のために，これらの細胞を,10％の
ウシ胎児血清が補足された基本培地において1/10の融合
において接種し,850cm²の回転びん内において融合まで
生長させた。次に，この細胞を洗浄し，血清を含まない
培地へ,10^-4Mの塩化亜鉛および10^-6のデキサメタゾンを
添加することにより,24時間にわたり,hPIP生成を誘発し
た。 培地および細胞膜の両方について,PIP活性についての
検定を行なった。培地を取り出し,Amicon UM-100限外濾
過装置により濃縮した。膜を得るために，細胞を1mMのE
DTAを用いて処理した，そして100×ｇで５分間遠心分離
を行うことによって採取した。細胞ペレットを,10mM Ti
rs,pH8,250mMショ糖,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM PMSFを
含む2ml溶液中に再懸濁させ，そして，ガラスホモジナ
イザーで破壊した後，移相差顕微鏡を用いて，細胞の破
壊度について検査した。1000×ｇにおいて５分間遠心分
離を行うことによって核を取り除き，上澄板ライセート
については,100,000×ｇにおいて１時間遠心分離を行う
ことによって可溶部分と，膜分画とに分割した。核分画
は,0.1％のTween-20を用いて抽出し，不溶物質は，遠心
分離によって取り除いた。上澄板ライセートからの膜ペ
レットは，均質化緩衝剤（さらに10％のグリセロールを
含む）中に再懸濁させた。 次に，培地，細胞ライセート可溶分画，膜，および核
抽出物分画について,2つの異なった検定法を用いてPIP
活性に関する検定を行なった。すなわち,Bonney R.J.et
al,(Biochem Ｊ（1979）176:433-440）に記載されて
いる様に，チモサン刺激マウス固有の腹膜マクロファー
ジの細胞膜からの標識化アラキドン酸の放出の抑制；お
よび,Vadas P.,et al,(Life Sci（1985）36:579-583）
に記載されている様に，ブタのすい臓PA−２を用いたin
vitro検定において,E.coli膜へとり込まれたＣ−14−
標識化オレイン酸の放出の抑制である。これらの両検定
において，膜分画のみが，活性を示している。得られた
他の分画においては，活性はみられなかった。これらの
結果を，第15図に示す。E.coli検定において,pMT-PIP−
形質転換細胞からの膜は,E.coli膜の加水分解を，対照
によって示された約50％から約30％へ減少させた。チモ
サン−介在マクロファージ検定において，放出は，対照
の80％のみであった。 これらの検定における同様な結果が,pMT-PIP（−）形
質転換CHO細胞から得られた。ただし，活性は，膜結合
分画よりはむしろ培地中にみられる。 必要に応じて，自然の蛋白を精製する方法に従って，
もしくは，公知の他の標準的な方法を用いて，培地中へ
分泌されるhPIPを精製することがでかきる。 バクテリアベクターおよび発現 pTRP-233バクテリア発現プラスミドの構築 下記の10個のオリゴデオキシヌクレオチドは，合成tr
pプロモーター／オペレータを構成するために使用され
た：１および10を除いて,500pmolの各オリゴデオキシヌクレ
オチドを，³²Ｐ−γATPを用いて個々にキナーゼ処理し
た。これらのオリゴの対，例えば,1＋2,3＋4,5＋６など
を,90℃において２分間各々16.7pmolesをインキュベー
トし，室温までゆっくりと冷却することによってアニー
リルさせ，そして，フェノール／クロロホルム抽出およ
びエタノール沈澱によって回収した。この対のセット
を,T4リガーゼと共に連結し，そして回収した連結DNAを
Eco RIおよびPstIを用いて分解させた。得られたDNA断
片を，湿性ゲルオートラジオグラフィーによって視覚化
し，上記所望の二重鎖配列をするために100bp断片を溶
出させ，ジデオキシ配列決定法で確認した。この二重鎖
には,trpオペロンのプロモーターおよびオペレーター領
域，およびtrp誘導ペプチドのリボゾーム結合部位が含
まれている。 プラスミドpKK233−２（Amann,E.et al,;Gene（198
5）40:183-190）をNde Iを用いて完全に分解させ，ブラ
ント末端化し，連結し,NdeI部位を欠き，相当するプラ
スミド,pKK-233−２−Ndeを得た。 pKK-233−２−Nde10ngを,Eco RIおよびPst Iを用いて
完全に分解し,CIPで処理し，そして,50ngの合成Eco RI/
PstI trpプロモーター／オペレーター配列（上記）と混
合した。この混合物をT4 DNA−リガーゼと連結し,E.col
i JA221 1pp^-/I′lacI⁹へ形質転換させた。形質転換物
について，所望の挿入物（pTRP-233で表される）を含有
うるプラスミドDNAの存在を調べた。 PIPのためのバクテリア発現ベクター 本来のシグナル配列を欠くhPIPコード化区分を,Sph I
（これは，第13図に示されるように，ヌクレオチド114
において切断する）を用いて分解し，クレノーによりブ
ラント末端化し，そして,Hind III（これは，挿入物の
ちょうど３′のベクター部位において切断する）を用い
て分解することにより,pLE−1,pLE−２およびpLE−３か
ら取り除いた。SphI（ブラント）/Hind III断片を,Kpn
I（ブラント）Hind III分解pTRP233へ連結し,trpプロモ
ーターの制御下においてコード配列を配置し,pTRP-PIP,
pTRP-PIP（−）およびpTRP-PIP/Aをそれぞれ得た。この
連結混合物を，正確な方向性を証明するために,E.coli.
HB101へ形質転換させ，これらの形質転換物を，標準M9
塩＋0.5％カザミノIII（Difco）において，生長させ
た。つまり，誘導前のOD-550の値が0.1となるまで，そ
して25μg/mlIAAによる処理を行い，生長させた後のOD
値が1.0となるまで生長させた。次に，バクテリアを採
取し,French pressを用いて溶解し，もしくは音波破砕
によって溶解した。そしてそのライセートについて,Vad
asら（前出）のin vitro検定を用いて,PA2抑制に関する
検定を行った。 hPIP蛋白は，非グリコシレート化型で得られ，標準方
法を用いて精製が可能であり，精製の後,PA2抑制検定を
実施する。40〜60％の飽和硫酸アンモニウムにより生成
する沈澱分画と,25mM Tris-Hcl,pH8.0,2mM EDTA中に再
溶解させ，同じ緩衝剤に平衡化させたDEAEセファデック
スにかける。蛋白を0.125MにおいてNaCl勾配で溶出さ
せ,C8HPLCカラムもしくは他の疎水性カラムにおいて，
均質になるまで精製する。このカラムにおいては，活性
分画が,1％TFAにおける20〜100％アセトニトリル勾配に
おいて，およそ50％のアセトニトリル時に溶出する。活
性分画中の蛋白の乾燥物を20mM Tris,pH8.0に再溶解さ
せ，必要に応じ,Van ScherrenbergG.M.,et al,Hoppe-Se
yler's Z Physiol Chem（1980）361:571-576の方法に従
って，ジスルフィドにまで再酸化する。 D.6.hPIPの活性断片 第17図は，第13図のhPIPのアミノ酸配列との比較，す
なわち，すい臓およびC.atrox毒物ホスホリパーゼの既
知の配列と，ヌクレオチド490〜852間の比較を示す。こ
の部分の相同性は,Viperaシステムとの類似性から，活
性のために十分であることが示唆されており，これはま
た，酵素および抑制因子間の相同性も示している。（Ma
ncheva,I.,et al,Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem（198
4）345:885-894）。hPIPのこの領域（種々の下流の配列
を有する）は,pLE−1,pLE−２およびpLE−３からのBstE
II（ブラント）/Hind III断片として得られる。（BstE
IIは，塩基465において切断する。）上記のように，そ
の断片は,Kpn I（ブラント）/Hind III分解pTRP233に連
結され,pTRP-PIP（Ｆ）,pTRP-PIP（Ｆ−）およびpTRP-P
IP（F/A）がそれぞれ得られる。これらのプラスミド
は，上述のようにE coli中に発現された。 さらに上記ベクターのいずれをも修飾して所望の均質
領域を示す所望の断片のみをコード化することができ
る。これは，ヌクレオチド位853〜855におけるCAAグル
タミンコドンを，位置特異的変異によって,TAA終末コド
ンへ変換することにより達成できる。 pTRP-PIP（Ｆ）をHind III及びEcoR Iを用いて分解
し,Hind III/EcoR I分解M13mp18へクローン化した。単
一鎖DNAを，プライマーとして,5′−GCATGTTAGCACATT−
３′を使用し,DNAポリメラーゼで処理する。そして得ら
れた二重鎖DNAを完全な細胞へトランスフェクションさ
せる。突然変異ファージについて，厳密な条件下で５′
−AGGTGGGCATGTTAGCACATTGATT−３′を用いて検査す
る。そして，精製プラークを用い，正確な構築を確認す
るために，配列決定する。回収したDNAは，二重鎖を再
形成させ,EcoR IおよびHind IIIを用いて分解し,EcoR I
/Hind III直線化pTRP-PIP（Ｆ）へ連絡させる。得られ
たベクター（pTRP-PIP（465〜852）で表される）は，発
現のためにE coliへ形質転換させる。次に，生成した活
性PIP断片を精製し，上述のように還元／酸化させる。 D.7.アポAIV配列およびhPIP配列 SDS-PAGE上の40kdバンドとしてD.1.において得られた
蛋白は,N−末端がブロックされた形のhPIPおよびＮ−末
端が配列決定に利用可能なアポAIVを含んでいた。Appli
ed Biosystems470Aガス相シークエンサーを用いて，全
分画を配列決定にかけた場合に，アポAIVN−末端の存在
が確認された。 約50μｇの蛋白について,N−末端配列決定を実施し,P
THアミノ酸をHunkapiller,M,W.およびHood,L.E.,Meth E
nzym（1083）91:486-492.によって報告されているよう
に,IBMCNカラムを用いて,Beckman334T HPLCで固定し
た。得られたＮ−末端配列は次の通りである。 Glu-Val-Ser-Ala-Asp-Gln-Val-Ala-Thr-Val-Met-Trp-
Asp-Tyr-Phe-Ser-Gln-Leu-Ser-Asn-Asn-Ala-Lys-Glu-Al
a-Val-Gln-Leu-Lys-Ser-Arg。 40kd混合物の小さい２次的配列は次の通りである。 Glu-Asn-Leu-Pro-Gln-Asn-Gly。 おそらく，この配列は，ブロックされたhPIP分子の内
部蛋白分解性クリップから生じたものであり，過剰のジ
スルフィド結合を含んでいる。この配列は，第13図に示
されている塩662から始まり，塩基693で終わる。 D.8.40kdバンドの活性内容 ホスホリパーゼＡ₂抑制の検定 in vitroにおける標準の抑制検定（PA2抑制検定）
を，次のように実施した。 100ngのブタのすい臓ホスホリパーゼAII（Sigma Chem
ical Co,St.Louis,MO）および試験する種々の濃度の蛋
白（10μｇまで）を,20mM Tris,pH8.0および2mMカルシ
ウムイオンを含む50μｌの緩衝液中に入れた。その溶液
を30℃にて10分間インキュベートした後，前述の緩衝液
中,20μｇのヒト血清アルブミンおよび２μCiのα−β
−〔Ｉ¹⁴−Ｃ〕−アラキドニルホスファチジルコリンス
テアロイル〔³Ｈ）（Amersham.Inc.）を含む100μｌの
溶液（添加直前に,22℃において超音波破砕水浴中で,2
分間超音波処理された溶液）を添加した。30℃において
15分後,25μｌの10N酢酸を添加することによって，この
反応を中止させた。 反応混合液の25-50μｌを，クロロホルム，メタノー
ル，酢酸（90:10:1）を含む増加溶液システムにおいて
分析するために，シリカＧ型TLC板へ塗布した。アラキ
ドン酸バンドの位置付けのため，標準としてアラキドン
酸を用いた。ホスファチジルコリンバンドはもとの位置
にとどまる。スポットは，ヨウ素蒸気で染色することに
よって視覚化し，そして，標準化されたアラキドン酸塩
およびホスファチジルコリンスポットを板より削り取
り，トルエン−オムニフルオア（New England Nuclea
r）においてシンチレーション計数を用いて放射能を測
定した。加水分解の％は，分画100×cpmアラキドン酸／
（cpmアラキドン酸＋cpmホスファチジルコリン）で算出
した。 PGE₂生成抑制による検定 hPIPは，培養線維肉腫細胞によるPGE₂の生成を抑制す
ることができることも証明された。この検定において,A
TCC（ATCC＃CCL148）から得たマウスの線維肉腫細胞の
融合性培養物を,150μlHAMMs F10培値（Gibco）中で検
定すべき様々な濃度の蛋白および25μｌリン酸緩衝食塩
水と,37℃において15分間前培養した。２％の胎児牛血
清を含む100μｌのF10培地を添加し，その細胞を,5％CO
₂/95％空気で湿らせた培養器を用いるデキサメタゾン
（DEX）を誘導16時間前に，細胞に加えた。培地を取
り，市販の放射免疫検定キット（Seragen,Inc.,Boston,
MA）を用いてPGE₂について検定した。 第18図は，精製された（SDS-PAGEによって）PIPによ
る，またDEXによるPGE₂産生の抑制を示している。ゲル
からの18KDバンドを，対照として用いた（白丸）。黒丸
は,Gon−Ａセファロースカラムからの活性分画を用いた
結果である。四角は,40KDバンドからの蛋白の結果であ
り，三角形は,DEXを使用した結果である。反応は，活性
蛋白およびDEXに関しては用量依存である。細胞に100μ
ｇのアラキドン酸を添加（PIPが適用されるのと同時に
添加）することによって,PIPおよびDEXの両方による抑
制を取り消すことができた。 in Vivo検定 PIPの活性を証明するために,3種のin vivoモデルを用
いた。ラット胸膜炎モデル，ラット足浮腫モデルおよび
アジュバント誘導関節炎である。 ラット胸膜炎モデルにおいて,3群のラットの胸膜腔
に，食塩水中0.5％カラゲーニンの0.1mlを注入すること
によって炎症を誘発し，試験物質がこの炎症を抑制する
能力を調べた。PIP蛋白の活性検出のため,10μｇのPIP
をカラゲーニンとともに注入した。200μｇのDEXを含む
カラゲーニン注入を，陽性の対照として用いた。５時間
後，胸膜腔を開け,1mlの食塩水で洗浄し，液体容量を記
録した。さらに，液体中の蛋白濃度についても,Bradfor
d,et al,Aanl Biochem（1976）72:248-254.の方法によ
って測定した。抑制活性は，滲出容量および滲出蛋白の
減少によって証明された。第19図に示されているよう
に,10μｇの精製PIPは，この両パラメーターを抑制する
という点で200μgDEXと，同じ効果を示した。 左のデータは，滲出した蛋白の量（mg/キャビティ）
を記録したものである。この量は,50μgDEXもしくは10
μgPIPのどちらかの存在において，実質的に正常レベル
へと減少する。滲出容量の測定結果は，右側に示す（m
l）。同様に,50μgDEXもしくは10μgPIPのどちらかが，
滲出液体容量を正常レベルへ減少させる。 ラット後足浮腫モデルにおいて,Sprague-Dawleyラッ
ト（180-200g）の雄群を，エーテル下で軽く麻酔し,0.5
％重量／容量のカラゲーニン懸濁液0.1mlを，右後足の
足底組織へ注射することによって後肢浮腫を誘発した
（Van Arnien,C.,et al,J Pharm Exp Therap（1965）15
0:328-334。 試験物質の抗炎症活性は，次の３方法のうちひとつを
用いて試験物質を投与することによって調べた。すなわ
ち，静脈内注射，腹腔内注射もしくはカラゲーニンとの
共−注射である。特別な場合を除いて,3時間前に腹腔内
へ投与したデキサメタゾンを対照として用いた。結果
は，ゼロ時（試験物質の注射の時間）に開始する一定圧
力のカリパスを用いて，その後１時間前に後足の厚さを
測定することによって評価した。 第20図は，試験的注射には,SDS-PAGEより単離した０
−５μｇの精製hPIP,対照注射には,25μｇのデキサメタ
ゾンを，共にカラゲーニンと一緒に投与した場合の足パ
ッドの厚さ（mm×10²）の増加の結果を示したものであ
る。hPIPは，用量に依存して，有意に浮腫を減少させ
た。対照DEXも炎症を減少させたが，第20図に示されて
いるように，時間依存性がPIPとわずかに異なってい
る。 第21図は，試験物質の注射を，炎症誘発前30分に腹腔
内へ行った場合の結果を示したものである。DEXと同様
に，インドメタシンを対照として用いた。このデータ
は,PIPおよびインドメタシンが，足腫脹を抑制するとい
う点において同等に効果的であることを示しているが，
両者共,DEXよりは，わずかに効果が劣っている。従っ
て,hPIPは循環の中へ入り，炎症部位に作用することが
できることを示している。 第22図は，投与を，カラゲーニン注射２分前に大腿静
脈への注射として行った場合の結果を示したものであ
る。同様に,hPIPは，用量に依存して,IV投与後3,4もし
くは５時間にわたり，炎症を抑制するのに効果的であっ
た。さらに,25μｇのPIPは,3または４時間後に,200μgD
EXの効果と同等になった。この結果より,PIPの生物学的
半減期は,2−３時間であることがわかった。 残りのin vivo検定は，アジュバント誘発関節炎モデ
ルであり，これは,Colpaert,F.C.,et al,Life Sci（198
2）3167-75の方法に従ったものである。誘発後30日に，
動物に，食塩水，精製hPIPもしくはデキサメタゾンを筋
注により投与した。第23図に示されているように,hPIP
は後足および関節の腫脹（10時間までに最大値に達す
る）をすばやく減少させることに成功したが，この腫脹
は,28時間後に，対照レベルへもどった。DEXは,3時間後
に腫脹の減少をもたらし,28時間の実験期間の間十分に
その効果を維持した。 E.標準法 細胞の形質転換，ベクター構築，メッセンジヤーRNA
の抽出,cDNAライブラリーの調製などに使用される技法
の大部分は当業者に広範に実施されているものであり、
またたいていの当業者はその特別な条件と操作が記載さ
れている標準的な源材料に精通している。しかし，便宜
上，次の節はガイドラインとなるであろう。 E.1.宿主と制御配列 原核生物系と真核生物系の両方がPIPコード配列の発
現に使用できる。クローニング操作には原核生物宿主が
最も好都合であることはいうまでもない。原核生物とし
てはE.coliの種々の菌株で示されることがほとんどであ
るが，他の微生物の菌株も使用できる。宿主と和合可能
な種由来の制御配列および複製部位を含有するプラスミ
ドベクターを使用する。例えば,E.coliは典型的には,Bo
livar,et al,Gene（1977）2:95によるE.coli種由来のプ
ラスミドでるpBR322の誘導体を用いて形質転換する。pB
R322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性の遺伝子を
含み，従って，所望ベクターの構築の際に保持されるか
または破壊されるかのいずれかが可能な付加的なマーカ
ーを提供する。通常使用する原核生物の制御配列は，こ
こでは転写開始用プロモーター，任意にオペレーター，
およびリボソーム結合部位配列を含むものと定義される
が，β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトース
（lac）のプロモーター系（Chang,et al,Nature（197
7）198:1056），トリプトファン（trp）プロモーター系
（Goeddel,et al Nucleic Acids Res（1980）8:4057）
およびλ由来のＰ_Lプロモーターのような普通に用いら
れるプロモーター，およびＮ−遺伝子リボソーム結合部
位（Shimatake,et al,Nature（1981）292:128）を含ん
でいる。 細菌の他に，酵母のような真核微生物も宿主として使
用できる。サッカロマイセス セレビシエ（Saccgaromy
ces cerevisiae）の研究室用菌株であるBakerの酵母が
最も繁用されるが，他の多くの菌株も普通入手可能であ
る。例えばBroach,J.R.,Meth Enz（1983）101:307の２
μ複製起点あるいは酵母と和合可能な他の複製起点（例
えばStinchcomb,et al,Nature（1979）282:39,Tschemp
e,et al,Gene（1980）10:157およびClarke,L,et al,Met
h Enz（1983）101:300を参照せよ）を用いたベクターが
使用できる。酵母ベクターに対する対照の配列には解糖
系酵素合成用のプロモーター（Hess,et al,J Ady Enzym
e Req（1968）7:149;Holland,et al,Biochemistry（197
8）17:4900）が含まれる。当業者に既知の他のプロモー
ターとしては,3−ホスホグリセレートキナーゼのプロモ
ーター（Hitzeman,et al,J Biol Chem（1980）255:207
3）および他の解糖系酵素のプロモーターがある。増殖
条件により転写が制御されるという付加的な利点を有す
る他のプロモーターは，アルコールデヒドロゲナーゼ2,
イソチトクロムC,酸ホスファクターゼ，窒素代謝に関連
した分解用酵素，およびマルトースやガラクトース利用
を担う酵素のプロモーター領域である。またターミネー
ター配列はコード配列の３′末端にあることが望ましい
と考えられる。このようなターミネーターは，酵母由来
の遺伝子中のコード配列に続く３′の非翻訳領域に見出
される。 また，ポリペプチドをコードする遺伝子はもちろん多
細胞生物由来の真核宿主細胞培養物で発現させることも
できる。例えばAxel等の米国特許第4,399,216号を参照
せよ。これらの系はさらに，イントロンをスプラインシ
ングでき，よってゲノム断片の発現に直接使用できると
いう利点を有する。有用な宿主細胞系にはVEROやHeLa細
胞，そしてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が
ある。このような細胞に対する発現ベクターは通常，哺
乳動物細胞に和合可能な制御配列およびプロモーター，
例えば普通用いられるシミアンウイルス40（SV40）の初
期および後期プロモーター（Fiers,et al,Nature（197
8）273:113），あるいはポリオーマ，アデノウイルス2,
ウシ乳頭腫ウイルスまたは鳥肉腫ウイルスに由来するよ
うな他のウイルス性プロモーターのようなものを含む。
制御可能なプロモーターhMT-II（Karin,M.,et al,Natur
e（1982）299:797-802）も使用できる。哺乳動物細胞宿
主系形質転換に関する一般的な面はAxel（前出）に記載
されている。ここでまた，発現を最適化するには“エン
ハンサー”領域が重要であると考えられる。これは一般
的には，非コードDNA領域中のプロモーター領域の上流
または下流に見出される配列である。必要に応じて，複
製起点をウイルス源から得る。しかし，染色体への組み
込みが真核生物におけるDNA複製の共通の機構である。 E.2.形質転換 用いる宿主細胞に従って，この細胞に適切な標準技法
により形質転換を行う。Cohen,S.N.,Proc Natl Acad Sc
i(USA)（1972）69:2110に記載のような塩化カルシウム
によるカルシウム処理，あるいはManiatis,T.,et al,Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual（1982）Cold Sp
ring Harbor Press,p.254に記載のRbCl₂法を，実質的な
細胞壁の障壁を有する原核生物や他の細胞に使用する。
このような細胞壁をもたない哺乳動物細胞については,G
raham and van der Eb,Virology（1978）52:546のリン
酸カルシウム沈澱法を使用し，これはWigler,M.,et al,
Cell（1978）16:777-785に従い改変してもよい。酵母の
形質転換はVan Solingen,P.,et al,J Bact（1977）130:
946あるいはHsiao,C.L.,et al,Proc Natl Acad Sci(US
A)（1979）76:3829の方法に従って行う。 E.3.ベクターの構築 所望のコード配列と制御配列とを有する適切なベクタ
ーの構築には，当業者に周知の標準的な連結技術および
制限技術を使用する。単離したプラスミド,DNA配列ある
いは合成オリゴヌクレオチドを切断し，手を入れ，そし
て所望の型に再連結する。 部位特異的DNA切断は，適当な制限酵素を当業者に一
般的に理解されている条件で用いて処理することにより
行うが，この条件の詳細はこれら市販の制限酵素の製造
者により特定されている。例えば,New England Biolabs
の製品カタログを見よ。通常，約１μｇのプラスミドま
たはDNA配列を，約20μｌの緩衝溶液中のい酵素１単位
で切断する。ここでの実施例では，典型的には，過剰の
制限酵素を使用してDNA基質の分解を完全にしている。
約37℃での約１時間から２時間のインキュベート時間で
作用可能であるが，変更も許される。各インキュベーシ
ョンの後，フェノール／クロロホルム抽出により蛋白を
除去し，続いてエーテル抽出を行ってもよく，その後エ
タノール沈澱による水性画分から核酸を回収する。必要
に応じて，切断断片のサイズによる分離を，標準的な技
術を使用したポリアクリルアミドゲルまたはアガロース
ゲルの電気泳動により行なってもよい。サイズによる分
離の一般的な記述はMethods in Enzymology（1980）65:
499-560にある。 制限切断断片は,50mM Tris（pH7.6）,50mM NaCl,6mM
MgCl₂,6mM DTTおよび５−10μM dNTP中で,20から25℃に
て約15から25分のインキュベーション時間で,4種のデオ
キシヌスレオチド三リン酸（dNTP）存在下,E.coliDNAポ
リメラーゼＩの巨大断片（クレノー）を用いて処理する
ことによりブラント末端化する。クレノー断片は４種の
dNTPが存在しても５′の粘着末端は埋めるが３′の突出
している一本鎖は削り取る。必要に応じて，粘着末端の
性質によって決まる制限内でdNTPを１種のみあるいは選
択されたdNTPを供することにより選択的修復を行うこと
ができる。クレノーでの処理後，混合液をフェノール／
クロロホルムで抽出し，エタノール沈澱を行う。適当な
条件下でのS1ヌクレアーゼまたはBal-31による処理によ
り，あらゆる一本鎖部分がpo水分解される。 合成オリゴヌクレオチドはEfimov,V.A.等の方法（Nuc
leic Acids Res（1982）6875-6894により調製するが，
市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製でき
る。アニーリング前のあるいは標識するための一本鎖の
キナーゼ処理は，過剰の例えば基質1nmolに対して約10
単位のポリヌクレオチドキナーゼを,50mM Tris（pH7.
6）,10mM MgCl₂,5mMジチオスレイトール,1−2mM ATP,1.
7pmolγ32P-ATP（2.9mCi/mmol）,0.1mMスペルミジンお
よび0.1mMEDTA存在下で使用することにより行う。 連結は15-50μｌ容量中で，下記の標準条件および温
度で行う:20mM Tris-Cl（pH7.5）,10mM MgCl₂,10mM DT
T,33μg/ml BSA,10mM NaCl,そして40μM ATP,0.01-0.02
（Weiss）単位のT4DNAリガーゼを０℃にて（“粘着末
端”連結用），あるいは1mm ATP,0.3-0.6（Weiss）単位
のT4DNAリガーゼを14℃にて（“ブラント末端”連結
用）を用いる。分子間の“粘着末端”連結は通常DNA総
濃度33-100μg/ml（最終総濃度５−100nM）で行う。分
子間のブラント末端連結（普通10-30倍モル過剰のリン
カーを使用する）は最終総濃度１μＭで行う。 “ベクター断片”を使用したベクターの構築において
は，一般にベクター断片を細菌アルカリ性ホフファター
ゼ（BAP）あるいはウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（C
IP）で処理することにより,5′のホスフェートを除去し
てベクターの再連結を防ぐ。分解は約150mMのTris中pH8
にて,Na⁺およびMg²⁺存在下，ベクター１μｇあたり約１
単位のBAPあるいはCIPを用いて,60℃にて約１時間で行
う。核酸断片を回収するため，この調製液をフェノール
／クロロホルム抽出し，エタノール沈澱する。あるい
は，再連結は，さらなる制限酵素分解で望ましくない断
片を二重分解してあるベクターを使用することにより防
げる。 cDNAあるいはゲノムDNA由来のベクター部分で配列の
修飾を必要とする部分については，部位特異的プライマ
ーによる突然変異形成を使用する。これは限られたミス
マッチ以外の突然変異形成予定の一本鎖ファージDNAに
相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行
われ，これにより所望の突然変異が生じる。簡単に言え
ば，合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて
ファージの相補鎖を直接合成し，得られた二本鎖DNAを
用いてファージ支持用の宿主細菌を形質転換する。形質
転換した細菌の培養物を上層寒天にまき，ファージを保
持する単細胞のプラーク形成を可能にする。 理論的には，新しいプラークの50％が一本鎖として変
異型を有するファージを含み,50％はもとの配列を有す
るであろう。得られたプラークをキナーゼ処理した合成
プライマーとハイブリダイズさせる。このときの温度は
正確なマッチのハイブリダイゼーションを可能にするも
のとするが，この温度ではもとの鎖とのミスマッチはハ
イブリダイゼーションを防ぐに充分なものである。次に
プローブとハイブリダイズするプラークを拾い，培養
し,DNAを回収する。 E.4.構築の確認 以下に述べる構築では，プラスミド構築のための正確
な連結は，まずM.Casabadan博士から入手したE.coli株M
C1061（Casabadan,M.,et al,J Mol Biol（1980）138:17
9-207）あるいは他の適当な宿主を連結混合液で形質転
換することにより確証される。成功した形質転換体をア
ンピシリン，テトラサイクリンまたは他の抗生物質の耐
性により，あるいは当業者に理解されているようにプラ
スミド構築の様式に従い他のマーカーを用いて，選択す
る。次に形質転換体のプラスミドをClewell,D.B.,et a
l,Proc Natl Acad Sci(USA)（1969）62:1159の方法に従
って，続いて任意にクロラムフェニコール増幅（Clewel
l,D.B.,J Bacteriol（1972）110:667）を行って調製す
る。単離したDNAを制限処理および／もしくはSanger,
F.,et al,Proc Natl Acad Sci(USA)（1977）74:5463の
ジデオキ法をさらにMessing,et al,Nucleic Acids Res
（1981）9:309により述べられているように用いたまた
はMaxam,et al,Methods in Enzymology（1980）65:499
の方法による配列決定により分析する。 E.5.cDNAまたはゲノムライブラリーの製作 ヒトゲノムライブラリーを当業者に既知のようにλフ
ァージで構築する。例えばManiatis,T.,et al,Cell（19
78）15:687-701を参照せよ。cDNAライブラリーは上述の
ようにλgt11ファージ内で調製でき，あるいは標準技法
により単離したmRNAから合成した二本鎖cDNAを調製し，
仔ウシ胸腺ターミナルトランスフェラーゼが媒介するホ
モポリマー性テーリング（Sutcliffe,J.G.,Nucleic Aci
d Res（1978）5:2721-2732）によりpBR322のようなプラ
スミドベクターへ挿入することができる。第１鎖cDNA
を，鳥骨髄芽球症ウイルスのRNA依存DNAポリメラーゼを
用いて,5μgmRNA上オリゴ（dT）12-18によりプライム合
成する。次に100℃にて５分間変性させ続いて氷上で冷
却することにより,RNA鋳型を初期DNA鎖から離す。第２
鎖DNAは,E.coliのDNAポリメラーゼＩの巨大断片を用い
て，第１鎖分子の３′−末端での自己プライミングによ
り合成し，これにより二本鎖ヘアピンDNAが形成され
る。これらの分子の開放終結末端をブラント末端化し，
またヘアピンループをアスペルギラス オリザエ（Aspe
rgillus oryzae）のS1ヌクレアーゼで切り開く。二本鎖
cDNAのS1ヌクレアーゼ分解は,300mM NaCl,30mM NaOAc,p
H4.5,3mM ZnCl₂中で600単位の酵素により,37℃,30分間
で行う。cDNAをフェノール：クロロホルムで抽出し，酢
酸アンモニウム存在下でエタノール沈澱を３回行って小
さなオリゴヌクレオチドを除去する。これは次のように
して行う:1/2容量の7.5M酢酸アンモニウムおよび２容量
のエタノールをcDNA溶液に加え，これを−70℃で沈澱さ
せる。ブラント末端化した二本鎖cDNAを次に，ゲル濾過
によりカラム（0.3×14cm）セファロース4B（ファルマ
シアファインケミカルス，ピスカタウェイ,NJ）を通し
てサイズにより分画するか，あるいは５−20％グリセロ
ール勾配中で超遠心分離して勾配を分画する。所望の長
さ例えば300塩基対よりざっと大きいcDNAを保有し,70％
エタノール沈澱により回収する。デオキシシトシンの短
い（10-30ヌクレオチド）ポリマー性テールをcDNAの
３′末端につける。このときの反応は0.2Mカコジル酸カ
リウム,25mM Tris（pH6.9）2mMジチオスレイトール,0.5
mM CoCl₂,200mM cDTP,400μg/ml BSAおよび40単位の仔
ウシ胸腺ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェ
ラーゼを含む中で22℃にて５分間行う。反応液をフェノ
ール：クロロホルムで抽出し，酢酸アンモニウム存在下
でエタノール沈澱を３回行って小さなオリヌクレオチド
を除去する。 テールもついたcDNAをpBR322のような宿主ベクターと
アニーリングさせるが，このベクターは前もって例えば
PstIで切断しオリゴdGのテールをつけておく。１つの実
施可能な実施態様では,2.5μｇのpBR322-dG DNAおベク
ター濃度５μg/mlでcDNAとアニーリングさせ，そしてこ
のハイブリッドをCasabadan,M.,et al,Mol Biol（198
0）138:179-207に記載のCaCl₂処理によりE.coli MC1061
へ移す。 E.6.cDNAまたはゲノムライブラリーのプロービング cDNAまたはゲノムライブラリーを，必要に応じてコロ
ニーまたはプラークのハイブリダイゼーション操作を用
いて，選別する。コロニーあるいはプラークを二重ノヒ
トロセルロースフィルター紙（Ｓ＆ＳタイプBA-85）上
にレプリカし，コロニーを15μg/mlテトラサイクリンを
含むＬ寒天上で37℃にて14-16時間増殖させる。コロニ
ーを10％SDSで溶解し,500mM NaOH/1.5M NaCl,次に0.5M
Tris HCl（pH8.0）/1.5M NaCl続いて２×標準クエン酸
生理食塩水（SSC）で５分間連続処理することにより,DN
Aをフィルター上に固定する。フィルターを風乾し,80℃
にて２時間焼く。 ニックトランスレーションしたプローブについては，
二重フィルターを１フィルターあたり10mlのDNAハイブ
リダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド（厳重性を
低下させる場合は40％ホルムアミド）,5×SSC,pH7.0,5
×デンハート溶液（ポリビニルポロリドンにフィコール
およびウシ血清アルブミンを加えたもの;1x＝各0.02
％）,50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）,0.2％SDS,
50μg/ml酵母tRNA,および50μg/mlの変性、剪断済サケ
***DNA）で,42℃にて16-18時間プレハイブリダイズさ
せる。 試料をこの同じDNAハイブリダイゼーション緩衝液5ml
中に含まれるニックトランスレーションしたDNAプロー
ブと，同種起源の場合は42℃にて12-36時間，異種起源
の場合は37℃にてハイブリダイズさせる。同種のハイブ
リダイゼーションの場合はフィルターを0.2×SSC,0.1％
SDS中で各回50℃にて30分間,2回洗浄し，異種のハイブ
リダイゼーションの場合はフィルターを３×SSC,0.1％S
DS中で50℃にて洗浄する。フィルターを風乾し，−70℃
にて１−３日間オートラジオグラフィーにかける。 合成（15-30マー）オリゴヌクレオチドプローブにつ
いては，二重フィルターを１フィルターあたり10mlのオ
リゴハイブリダイゼーション緩衝液（６×SSC,0.1％SD
S,1mM EDTA,5×デンハート溶液,0.05％リン酸ナトリウ
ムおよび50μg/mlの変性、剪断済サケ***DNA）で,42℃
にて２−８時間プレハイブリダイズさせる。 試料をキナーゼ処理した15-30ヌクレオチドのオリゴ
ヌクレオチドプローブと，オリゴヌクレオチドの組成に
応じた条件下でハイブリダイズさせる。典型的な条件と
しては,30-42℃の温度,24-36時間，プローブを含有する
この同じオリゴハイブリダイゼーション緩衝液5ml/フィ
ルターを使用する。フィルターを，各回６×SSC,0.1SDS
および50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7）で23℃にて1
5分間,2回洗浄し，次いで６×SSCおよび0.1％SDSで算定
したハイブリダイゼーション温度にて２分間洗浄し，風
乾し，−70℃にて２−３日間オートラジオグラフィーに
かける。 所望蛋白のアミノ酸配列あるいはそれをコードするmR
NA中のヌクレオチド配列がわかっている場合は，本発明
の宿主ベクターへの挿入用のDNAは合成手段にするか，
あるいはこのような配列を含むベクターが寄託されてい
るか入手可能であれば，このようなベクターをクローニ
ングすることにより，得ることができる。コード配列の
合成では，センスとアンチセンスとが交互に重なり合っ
ている一本鎖オリゴヌクレオチドを調製し，センスとア
ンチセンスとが交互になっている一本鎖部分をDNAポリ
メラーゼとdNTPで処理して酵素的に埋める。オリゴマー
をEfimov,V.A.等の方法（Nucleic Acids Res（1982）68
75-6894）により調製するが，これは市販の自動オリゴ
ヌクレオチド合成機を使用して調製できる。アニーリン
グ前のあるいは標識するための一本鎖のキナーゼ処理
は，過剰の例えば基質1mmolに対し約10単位のポリヌク
レオチドキナーゼを用いて,50mM Tris（pH7.6）,10mM M
gCl₂,5mMジチオスレイトール,1−2mM ATP,17pmolγ³²Ｐ
−ATP（2.9m Ci/mmol）,0.1mMスペルミジンおよび0.1mM
EDTA存在下で行う。 E.7.宿主例 ここでクローニングおよび発現に使用する宿主株は以
下の通りである： クローニングおよび配列決定用に，またたいての細菌
プロモーターの制御下での構築物の発現用には,E.coli
株MC1061を使用した。 哺乳動物発現のために使用する細胞はチャイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Technical fields   The present invention treats inflammation in humans and animals
Related to the field. More specifically, regulates inflammation
Sample of phospholipase inhibitor protein that is effective for
About. Background art   To the physiological phenomenon of inflammation at the wound or infected site
Has been recognized for centuries. In addition,
While the phenomena show a positive value in response to such a stimulus,
To ensure human or animal safety,
It is well understood that the degree must be adjusted frequently.
Is understood. In addition, inflammation may be associated with rheumatoid arthritis.
Or chronic inflammatory diseases such as systemic lupus erythematosus
It may be expressed as Such a condition degrades the person himself.
Weak, more life-threatening, acute episodes
Could be the result of Other such diseases, accompanied by asthma
Inflammation can also result in death due to bronchial stenosis.
You.   In the last few decades, biochemical phenomena with inflammation
More detailed circumstances have been accumulated. This situation is complicated
It is. Part of the initiation process is the kallikrein of tissue destruction
Bradykinin-like markers released by proteases
It is mediated by peptidekinin. This kini
Or other peptide messengers are arachid
To initiate natto cascade, phospholipase enzyme A2
And / or C may be activated by
It acts on foreign cell receptors.   This “arachidonate cascade” maintains an inflammatory response.
It is surprisingly important to maintain. The duplicate shown in FIG.
Among the complex reactions, arachidonic acid was found to be
Known as eicosanoids, liberated from quality and assembled
To various products. This eicosanoid
Contains leukotrienes and prostaglandins
And these have a direct effect on the site of inflammation.
Released outside the cell for volatility. These are relatively short
Half-life. However, its physiological effects are numerous.
Divergent and surprising, vasodilation (eg
For example, prostacilin and leukotriene LTC_FourAnd
LTD_Four), Vasoconstriction (eg, thromboxane and LT
B_Four) Also including histamine release.   Most of the recent roles in antiwar war pharmaceuticals have been
Pointed to the Donate Cascade. From this perspective
Then, as shown in FIG.
The features are as follows. That is, generation of all products
Is the release of arachidonic acid (phosphoryl
Mediated by pase) and then reacts
The route is split into several types of reaction systems.
In this reaction system, the cyclooxygenase pathway is
Produce staglandins, and the lipoxygenase pathway
Produces leukotriene.   Commonly used like aspirin and indomethacin
Non-steroidal anti-inflammatory drugs include cyclooxygenase
Arachidonic acid is therefore converted to the final product.
Only some of the routes that are to be controlled. Araki
For other pathways of the donate cascade, the effect is not apparent.
Not. On the other hand, steroids, glucocorticoids,
Mont generally produces arachidonic acid from phospholipid membranes.
Is effective for
Shows a direct effect on cade. Hong, S., et al,
Proc Natl Acad Sci(USA) (1976)73: 1730-1734. I
However, the shortcomings of steroid therapy are well known
I have. Water retention, hyperglycinemia, hyperlipidemia, osteoporosis
Dementia, glaucoma, and coronary and large vascular atherosclerosis
Side effects such as an increased risk of keratosis are associated with such treatments.
This is an undesirable reaction.   In recent years, the following facts have been proven. That is, Stero
Anti-inflammatory effects of ids bind, at least in part
Ability to induce protein secretion, plus arachidonic acid release
The ability to suppress the phospholipase enzyme responsible for
It is a thing. Hirata, F.,J Biol Chem
(1981)256: 7730-7733. This inhibitor is
It is called Chin (Black-well, R.J., et al,Nature
(1980)287: 147-149): Also, renocortin (Russo-M
arie, F., et al,Biochim Biophys Acta(1982)712: 177-
185): Alternatively, lipomodulin (Hirata, F., et alPr
oc Natl Acad Sci(USA) (1980)77: 2533-2536)
being called. This protein is found in some rat and rabbit cells
Purified from, and immunologically cross-reactive
(Hirata, F., et al,Biochem Biophys Res Comm
(1982)109: 223-230; Rothhut, B., et al,ibid(1983)1
17: 878-884).   A human inhibitor recently named lipocortin
Has been identified in human fibroblasts (Errasfa,
M., et al,Biochim Biophys Acta(1985)847: 247-254.
Further, Wallner, B.P., et al, Nature (1986) 320: 77-81.
And Pepinsky, R.B., et al,J Biol Chem(1986)26
1: 4239-4261, Isolation of rat lipocortin and its binding
, And cloning of human analogs in vitro
Reports that it is a PA2 inhibitor.   Arachidonic acid formation rather than glucocorticoid
Direct administration of the inhibitory protein (this is the
Will stimulate the generation of white).
Inflammatory steroids without exposure to the risk of side effects
It is believed that this can be adjusted. However,
This protein in humans is not purified. Word
Needless to say, it can directly treat unwanted inflammatory reactions
Therefore, a sufficient amount of pure human phospho
Where the development of lipase inhibitor protein (PIP) is desired
It is. Disclosure of the invention   The present invention relates to purified human phospholipase inhibitory protein (hPIP)
And those useful in their production by recombinant technology
It provides quality. Single 40kd result for SDS-PAGE
Purified from human peritoneal dialysis solution with union
The substances that were collected had significant amounts of apolipoprotein IV (apoAIV).
Contains significant PIP activity. Elution from this 40kd bond
Immunization of rabbits with the purified protein is apoAIV and PIP
Increase the antiserum that can react with both. Therefore, this
These antibodies were screened recombinant and produced hPIP.
For other cells.   In this context, human PIP released from other proteins
Is obtained by the following two methods. That is, the membrane cavity
By direct purification from dialysate and recombinant
Two methods are based on production using a host. Therefore,
In terms of aspects, the present invention relates to human PIP in substantially pure form.
It is about. In another aspect, the invention is illustrated in FIG.
A protein with human PIP activity consisting of the amino acid sequence shown
It is about. In yet another aspect, this
Akira describes a process and procedure for the preparation of purified hPIP from peritoneal dialysate.
And the products of this process. Purification process
Products are non-glycosylated or glycosylated, respectively.
Characterized by silylated 36kd or 40kd molecular weight
And is further characterized by PIP activity.   Pure hPIP may also be produced using recombinant methods.
It is. Therefore, another aspect of the present invention is that
HPIP (non-glucosylate and glycosylate)
In both recombinant and recombinant hosts)
This expression system to the expression system that produces
To the intermediary, including the host transformed by this system,
Furthermore, by culturing recombinant host cells, hPIP
Related to the method of generating.   In yet another aspect, the invention relates to apoAIV and PIP
Against the administration of a 40 kd mixture of
The antibody generated in response to the pharmaceutical composition containing PIP
In addition, using such components or purified PIP, human
And methods for ameliorating inflammation in livestock. PIP is a
Stabilized by the presence of poAIV, the mixture with apoAIV
And components containing PIP are particularly useful as drugs
Conceivable. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Fig. 1 shows the arachidonate cascade in the reaction plan.
And eicosanoid products.   FIG. 2 shows an outline of the purification method used here.   Fig. 3 shows 40% -60% saturated ammonium sulfate in peritoneal dialysate.
The Aum-Gel Blue, Concanavali A-Sef
For cellulose and DEAE cellulose chromatography
The elution pattern obtained when applied is shown.   Figure 4 shows the unpurified and purified fractions of the peritoneal dialysate.
The results of SDS-PAGE for the images are shown.   Figure 5 shows the relative PI at various stages of the refinery plan.
Shows P activity.   Fig. 6 shows the results for the Concanavalin A-Sepharose column.
Performed on active-containing fractions of these-reverse layer height
3 shows the results of high performance liquid chromatography (RP-HPLC).   FIG. 7 shows that hP in various fractions was
To detect IP, a polyclonal antibody against purified hPIP
Shows the ability of serum.   Fig. 8 shows hPIP bound to PA2 by anti-40kd antibody.
The detection of is described.   Fig. 9 shows Western Blot against cells that produce hPIP.
The result is shown.   Figure 10 shows the nucleotides and sequences for insertion into pU200.
Shows the deduced amino acid sequence.   Fig. 11 shows the nucleotides and sequence for insertion into pU500.
Shows the deduced amino acid sequence.   Fig. 12 shows the nucleotide sequence for insertion into p600.
Shows the deduced amino acid sequence.   FIG. 13 shows pLE with the complete coding sequence for hPIP.
-1 and nucleotides for insertion into -1
2 shows an acid sequence.   Fig. 14 shows various clone hPIP cDNAs and genomic parts.
Shows the relationship.   FIG. 15 shows suppression of PA2 activity in hPIP-converted CHO cells.
Is shown.   FIG. 16 shows PA2 suppression by recombinant hPIP.   Figure 17 shows a comparison of hPIP and phospholipase.
1 shows an amino acid sequence.   Figure 18 shows the PGE_Two4 in in vitro assays to estimate release
Shows the activity of 0kd protein.   FIG. 19 shows rat breast in vivo for hPIP activity.
The results of the meningitis inhibition assay are shown.   Figure 20 shows the in vivo foot-edema assay.
3 shows the activity of hPIP injected simultaneously with lagenin.   Figure 21 shows 100 μg of purified hPIP and 1 mg of indomethacin.
200 μg of dexamethasone was intraperitoneally administered to Rabi
If present, indicates the relative ability to suppress hind paw edema.   Fig. 22 shows the species when administered through the femoral vein of rats.
Relative ability of different doses of purified hPIP to suppress hind paw edema
It shows about.   Figure 23 shows that when administered intramuscularly to rats,
Purified hPIP and anti-adjuvant induced arthritis
And the relative potency of dexamethasone (200 μg). Embodiment of the present invention A. Properties of PIP protein   The protein of the present invention was obtained from dialysis cases as a starting material.
It was prepared using human peritoneal dialysate. Purification method shown here
By the method, it is a homogeneous protein and intact
Protein free of impurities associated with proteins as seen in
Can be This purification method makes it possible to use
Succeeded in obtaining a protein pure enough to
The potency of this purified material also contributes to the development of selectable preparation methods.
This is an important step. Recombinant technology for hPIP
This is described here. Therefore, the PIP of the present invention
Not only hPIP prepared as described, but also selectable methods
And proteins having substantially the same structure obtained by using
"Substantially the same" suppresses phospholipase A2
Protein activity (PA2 inhibition assay)
(as described in the tro enzyme assay method)
Means that Amino shown in FIG.
Acid sequences are known to exhibit this activity.   Even if the amino acid sequence is modified in various ways,
It is well recognized that it retains its basic activity.
Have been. First, certain parts of the peptide sequence may be active.
Is absolutely pure, not indispensable
It is likely that only a fraction of the selected protein is needed. Obedience
Therefore, the amino acid sequence shown in FIG.
If retained, they are included in the definition. Second
Special or slightly special amino in the sequence
The addition, deletion or modification of acids is not important for function.
It will bring about a change. Third, proteins are
Neutral or salt-like protein
The white ionization state depends on the pH of the surrounding medium.
And if the protein is present in liquid form, the pH of the liquid
It depends. This indicates that protein is in solid form.
Is prepared. In addition, the amino acids in the sequence
At the same time.
For example, the oxidation of sulfhydryls.
Modifications also seem to be ineffective at destroying activity
You. Finally, proteins are non-protein residues (eg, phosphate,
Acetyl group or carbohydrate)
May be found in the state. Purified If
Or recombinant PIP is functionally defined,
All embodiments are homologous to the hPIP illustrated in FIG.
It is expected to retain a wide range of sequences. Level of homology
Is encoded by nucleotides 490-852 in FIG.
Conservative changes in the areas of interest being
Taking into account both exact homology, it should be more than 40%
Be expected. Additional changes can occur in other parts of the protein
Accepted. All of the above modifications are in vitro.
Phospholipase A2 (PA2) inhibition assay
As long as the activity is not destroyed, it is within definition.   “Active PIP fragment” refers to the PIP
Only the sequence encoded by nucleotides 490-852
Means a peptide consisting of If only this fragment is used
For example, the standard algorithm of Chou-Fasman or Kyte-Doolittle
As determined by the application of the
If similar, in the original structure some more than 40%
Low homology is required. In particular, reports by Wallner et al.
Nucleus labeled 31-381 in lipocortin reported
The peptide encoded by the otide is the first amino acid.
Acid sequence reveals less than 40% homology in this region.
Despite the clear indication, the first meeting this requirement
2 is provided. Therefore, it is more pronounced than the hPIP sequence
This particular piece, as well as the one that was
You.   “Operable linkage” means that a component performs its normal function.
What is meant to be proximally arranged to run
It is. Therefore, a pair operably linked to a coding sequence
A reference array can provide a representation of a coded array.
You.   A “control sequence” is a DNA sequence, if
Or, when properly linked to the desired coding sequence,
Can produce expression in a host that can harmonize with such sequences
Means an array that can Such a control sequence is
Promoters in both prokaryotic and eukaryotic hosts
And in prokaryotes also bind to sequences.
In vosomes and eukaryotic cells, terminal signals
Including. Necessary or helpful in producing expression
Can be confirmed as a result. here
As used, the “control sequence” is specific to the particular host used.
Any DNA sequence is needed to
It simply means that you can.   “Cell” or “recombinant host cell” or “host”
“Cells” are interchangeable as is apparent from the context
It is a word. These words are directly related to the target cell,
Needless to say, the result (offspring) is also included. suddenly
Due to mutations and environmental differences, all progeny must be
It is understood that they cannot be exactly the same
That is. However, such changed offspring
It is included when the above words are used. B. Purification of PPI from dialysate   Generally, the purification of hPIP of the present invention is performed as shown in FIG.
Carried out. Of course, other methods are possible,
The method described here yields a homogeneous active sample.
You. An abbreviated version of the specific method shown in FIG.
The approach is simply as follows.   Sufficient dialysis fluid to obtain about 2 liters of fluid
Conveniently obtain from a batch of patients undergoing membrane dialysis
Wear. Then, to obtain the desired amount of pure product, 2 l
Perform the following procedure on the batch. The liquid
And exposed to increasing concentrations of ammonium sulfate. about
40% to 60% ammonium sulfate saturation
Fractions contain activity and undergo further purification. 40% or less
Proteins that are insoluble in the ammonium sulfate below
Precipitation is useful. This precipitate
Is removed by centrifugation and further purification is carried out.   Ammonium sulfate content to reduce salt concentration
After dissolving the fraction in a suitable buffer of about pH 8,
Dialysis against the same or comparable buffer
carry out.   The dialysate is then used to remove the albumin component.
Provided. This albumin component is the most abundant impurity.
You. Previous equilibrium affinity in the same buffer
Chromatography for Affi-gel blue
Fits the purpose. The desired PIP-containing fraction is
Does not bind to the column under the conditions and appears in the effluent volume. Only
However, impure proteins in the solution are retained by the column,
Eluted under salt concentration.   PIP fractionation can be performed, for example, by using Concanavalin-A Sepharose.
Lentil lectin-sepharose or pea
Nut agglutinin-sepharose, equilibrated with pH 8 buffer
Lectins such as concanavalin-A sepharose
Handled by support. Again, the desired activity
Does not adhere to the column under these conditions.   The effluent containing PIP is subjected to anion exchange chromatography.
, For example, at about pH 8, a similar buffer
DEAE cellulose and QAE-cellulose in equilibrium
Or using SP-cellulose or DEAE cellulose.
To purify. hPIP is absorbed on the column, and the fraction is salinity gradient
Elute with. Measure PA2 inhibitory activity of eluate fraction
And confirm the desired PIP fraction.   When the active fraction was subjected to SDS-PAGE, SDS-PAGE was inactive.
This results in 18 kD binding of the sex protein as well as active 40 kD binding.
The 40 kD bonds were eluted without detergent and reconstituted.
As a result, a protein having the desired activity was obtained. This preparation method is basic
Laemli, U.K.,Nature(1970)twenty three: 680-685 method
It follows. And about 3mm 12.5% gel, 10mg total
Suitable for purifying mixtures containing proteins.   The 40 kd bond obtained as described above is described in Section D below.
As can be seen, many in vitro and in vivo potency assays
High PIP activity as demonstrated in I
However, in addition to PIP, apoAIV and similar molecular weight
It also contains other proteins. Through this purification process
ApoAIV, which is observed after PIP,
In addition, PIP, as an apoAIV complex,
It is believed that it will be found in a place. following
PIP is relatively uncomfortable once separated from apoAIV
It is easy to be fixed. Therefore, in the form of this complex,
It is considered advantageous to prepare a mature PIP.   The relationship between PIP activity and the 40 kd protein was determined by concanavalin-
Analysis on the active fraction resulting from A Sepharose treatment
Is further confirmed by performing dynamic RP-HPLC
Was. Separation is performed by this RP-HPLC, where a large number of
Only one protein (including elution peak) has activity
Exist. This activity peak, when subjected to SDS-PAGE,
Resulted in one 40 kd bond.   In addition, as described below, this 40 kd
When injected into the liposome, additional PA2 inhibitory activity
And a protein capable of forming a complex with phospholipase A
Polyclonal antiserum capable of immune response
I caused it. Therefore, this immunizing antigen also contains apoAIV
However, the elicited antibodies show a reaction with PIP.   However, as shown in FIG.
The active eluate from the exchange chromatography is
Provide for isoelectric precipitation using sodium enoate buffer.
To isolate human PIP from associated proteins
It is also possible. Pass the active fraction through this buffer
Precipitation of non-PIP impurities including apoAIV by precipitation
That results. This supernatant contains human PIP
Which, as described above, can be purified by electrophoresis.
Taken out as a 40kd bond. C. Utility and Administration   The PIP protein of the present invention is
Demonstrates activity as a lysate inhibitor.
E_TwoGeneration can be suppressed and some in vivo
In Dell, it shows an effective anti-inflammatory effect. Obedience
Therefore, the protein of the present invention is desirable in humans and livestock.
To ameliorate, treat or reduce unfavorable signs of inflammation
Useful. The protein of the present invention is useful in the following points.
You. That is, it responds to external stimuli such as infections and wounds.
To regulate the excess inflammatory response produced by
Rheumatoid arthritis, asthma, edema, dermatitis, arthritis, conjunctiva
Inflammation such as inflammation, allergies and lupus erythematosus
In treating sexually transmitted diseases.   The administration of the protein of the present invention is generally performed at a dose of 0.1-100 μg / kg.
0.1-10 μg / kg / body weight of the host
Good. Needless to say, the dose depends on the nature of the target case,
It depends on the severity of the condition to be treated and on the method of administration.
For example, intravenous injection is generally more convenient than other
Only a small amount is needed. Repeat several times until the desired effect is obtained.
Administration of PIP protein once or over a long period of time.
Administered by constant infusion.   The protein may also be in aqueous solution, depending on the desired mode of administration.
Alternatively, it can be administered in the presence of a pharmaceutical excipient. Made of protein
For agents, preferably subcutaneously, intravenously, or intramuscularly
By injection, such as intrameal injection, or through a membrane
It is administered by oral administration. Aerosol or oral administration
Is also possible in the presence of a stabilizing component. Combination with apoAIV
The body, as well as injectable preparations, will be exposed to PIP in these components.
On the other hand, it is stable.   Injectable substances are suitable for reconstitution before injection.
Body or suspension, as a solid or as PIP or its
Prepared as an apoAIV complex emulsion. Proper shaping
Examples of agents include water, saline, dextrose, and the like.
can give. Small amounts of auxiliary substances such as buffers, emulsifiers, etc.
May be included.   For suppositories, use polyalkylene glycol and trig
Binders and carriers such as lyserides can be used additionally.
You. Aerosol administration is particularly suitable for remission of bronchial disease.
In general, PIP proteins or their complexes (boundaries)
Finely divided form with surfactant and propellant
At). Typical surfactants are fatty acid esters.
Including Typical propellants are freon-like,
It is a low alkane or a fluorinated alkane. lotion
Topical administration such as ointments or ointments is also practical,
Preferred for topical treatment.   40 kd SDS-PAGE elution containing both PIP and apoAIV
The solution and the purified protein of the present invention are both used for monitoring diagnosis and treatment.
Antiserum or monoclonal for immunoassay
Useful for preparing antibodies. The method of immunoassay is
Well understood in the art and many changes
Noh. Either antagonistic antigen or antibody is released.
Can be labeled with radioactive substances, fluorescent substances or enzymes
You. This assay is a direct detection of the antigen-antibody complex.
Or as an antagonist specification for immune complex or complex
Sandwich where the body is further immunoactivated by additional antibodies
It can be performed as an itch test. In this test, the standard
Method. A contribution of the present invention is the provision of appropriate antigens.
It can be said. That is, the standard for performing such a test
As a sub- or antagonistic antigen and appropriate antiserum
Use as an antibody to extract substances for the preparation of liposomes
Is an antigen for D. Example   The following describes an exemplary method for purification of hPIP.
You. I do not intend to limit to this. Active and pure protein
Obviously additional modifications are needed to get the quality
It is. However, according to this special method,
When the 40 kd protein with hPIP activity was homogenized (SDS-PAGE
Human PIP prepared and released from the binding protein
Prepared. D.1 Purification of hPIP from dialysate   Human PIPs are used for host
Isolated from dialysate using the follipase (PA2) inhibition assay
Was. About 2 liters of human peritoneal lavage fluid (this is
From a patient undergoing dialysis) and a coarse, thin cotton cloth.
Clarified by filtration through
It was subjected to a fractionation of nickel. Enough solids to obtain a 40% saturated liquid
And feed the resulting precipitate for 20 minutes.
And centrifuged at 10,000 xg to collect the supernatant.
Was. Remove enough solid ammonium sulfate to 60% saturated
To the supernatant, and centrifuge again.
I returned. This precipitate, which contains PA2 inhibitory activity
20 mM ammonium bicarbonate, 1 mM phenylmethyl
PH 7.8 containing Rusulfonyl Fluoride (PMSF)
Dissolved in buffer (buffer A) and aprotinin at 50 μg / ml
I understand. Use this reconstituted solution to reduce total salt concentration
For this purpose, dialysis was performed at 4 ° C against buffer A,
Active in in vitro PA2 suppression assay (below)
It was shown to be.   A portion of this dialysate containing 50 mg of protein was buffer A
2.5cm x 12cm Affi previously equilibrated in
-Gel Blue (BioRad Laboratories, Richmond, California)
nia) applied to the column. 2 ml fractionation at a flow rate of 0.3 ml / min
Collected. This column uses NaC with a concentration gradient of 0 to 0.5 M NaCl.
Eluted with l. For this fraction, PA2 inhibitory activity
The total activity was determined as shown in Figure 3a.
The figure shows the flow rate by volume. (See Figure 3a-3c
The solid line indicates PIP activity).   Pool the active fractions, freeze-dry and reconstitute
2.5 cm x 1 previously equilibrated in buffer A
Apply to a 2 cm Concanavalin-A Sepharose column
Was. Elution at a flow rate of 0.2 ml / min is shown in Figure 3b
An elution profile was obtained. Again, the total activity is
Volume as measured by the tobacco PA2 suppression assay.
At the same flow rate. Pool the active fractions and freeze
Dried. A small portion of the active fraction pool was used for RP-HPLC analysis.
Set aside.   The lyophilized fraction is then reconstituted in buffer A
Of DEAE-52 previously equilibrated in buffer A
Applied to a 2.5 cm × 12 cm column. 0-0.2M straight line
Elution was performed using a typical NaCl gradient. Figure 3c shows this
Elution profile and dissolution at about 0.125M NaCl
Indicates the presence of activity in the output fraction.   The fractions of this active DEAE eluate are pooled, concentrated and desalted.
Approximately 10 mg of the protein was transferred to 3 mm12.
Loaded on a 5% polyacrylamide gel. This electrophoresis
Separation is carried out before the disulfide bond is separated by β-mercap
Laemli (ex.
Follow the method of out). For protein bands, 50% bird
3 min with 0.1% Coomassie Blue in chloroacetic acid
During the staining process, followed by a 5% acetic acid solution.
For 5 minutes. As a result, 2
Only one major protein band was obtained. One is 18KD
The other is the band at 40KD
is there. Separate these bands from the gel and 9 mm^ThreeCubic
Cut into the body, buffer this protein overnight at 4 ° C.
Eluted with Agent A.   Process this eluate to remove glycine, SDS and dye in several stages.
Removed on the floor. First, the eluate was
Dialyze against buffer A, then freeze-dry the dialysate
And concentrated. This lyophilized substance is placed in buffer A
And reconstituted with 2 volumes of water-saturated butanol.
A single extraction was performed. Dry the aqueous layer containing the interface under nitrogen
To remove the remaining butanol. Next, the protein reflex
At least 24 hours to complete the Colding
For 1 mg protein / ml at 4 ° C.
Was. Assay for PA2 suppression in in vitro assay
Showed that this 40KD band showed activity, but this 18KD band
Did not show any activity.   Figure 4 shows the initial extract and the preparation at each stage of purification.
Ratio of SDS-PAGE performed on product and purified protein
The comparison results are shown. This band shows two consecutive oxidations.
Silver staining by rabbi staining operation (according to manufacturer's instructions)
(BioRad Labs, Richmond, CA). 1
Rows contain molecular weight markers. Two rows are treated with ammonium sulfate
This is the dialysate before placing. 3 rows are 40-60% ammonium sulfate
Precipitate. Four rows: Affi-gel blue chromatography
From the pooled active fractions. 5th row is Conkanaba
Pool from Phosphorus-A Sepharose chromatography
Containing active fractions. Rows 7 and 8 are preparative gels
1 μg and 50 ng of 40 kD each obtained from electrophoresis
Including band. By this whole operation, it is illustrated in FIG.
About 500-fold purification is obtained as can be seen in the results. 50%
Using a comparison of μg protein required for suppression, this crude extract
Specific activity is approximately 0.2% of the activity of the purified 40 kD band.
%.   Obtained from the concanavalin-A cellophores treatment described above.
Part of the active fraction₈RP-HPLC using column
And a gradient of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid.
And eluted. Figure 6 shows the elution profile of this column.
Show the feel. Many protein fractions were obtained, only one
Only the fraction contains the activity. Then, this active ingredient
The fraction was subjected to analytical SDS-PAGE using 12.5% gel,
Open gel with Coomassie Blue G-250 or silver reagent
And stained. In each case, only the 40 kd band was observed.
Was guessed.   To obtain pure human PIP, use this pooled active solution.
The product (from the anion exchange resin) is converted to pH 5.5 citric acid
Dialyzed against sodium buffer. Remove the precipitated protein
The protein in the supernatant was removed by SDS-PAGE
Was served. Then, as described above, this 40 kd band is
Received. If necessary, adjust the supernatant to pH 7.5
e, L., et al,Life Sci(1985)36: 1225-1231
After washing with PLA2-Sepharose as described
The bound hPIP is prepared using either 1.0 M NaCl or 0.1 M acetic acid.
Pure elution is performed using this. D.2 Preparation of anti-PIP antibody   This 40 kd band is followed by hPIP and apolipo.
Shown to be a protein mixture containing protein AIV (apoAIV)
Was. (Detailed below). However,
This mixture increases antibodies specifically reactive with hPIP.
Was possible. To obtain anti-hPIP, a new
English white rabbit with complete Freund's adjuvant
200μg of the eluted 40kd band fraction contained in
Or they were injected intramuscularly. Then the same at three week intervals
The rabbit was vaccinated with the vaccine. Then, after this inoculation
Blood was collected from the vein of the rabbit's ear for 7-10 days.
Of the serum obtained, using non-immune serum as a control,
The ability to bind the 40 kd eluate (described above) was tested.   For this binding assay, 40 kd protein was purified to 500 ng of hPIP.
Are fixed in the individual holes of the polystyrene plate.
Dilution antiserum was added to this well. Specifically bound anti
For body mass, I¹²⁵-Labeled protein (Amersham, Inc.)
Quantification was performed using As shown in Table 1 below,
A serum dilution of 1: 400 indicates significant amounts of antibody.   These results indicate that free hPIP containing 40kd protein and purified hPIP
Was confirmed by a competing substitution using This 1:10
Serum dilution of 0 changes the amount of purified 40kd protein
At the same time as applying to the coated polystyrene plate
Was. Table 2 shows the results of the change in the amount.   To illustrate the process of purification by Western blot
In addition, the immunoreactivity of this antiserum was used. This anti
Samples to be tested for serum are diluted 1: 1 using 2 × SDS.
I shouted. Sample buffer (Laemli, supra) and 10-25 μg
Proteins were run on 1.5 mm thick SDS-polyacrylamide gels.
Fractionated (12.5% acrylamide). This fractionated protein
White was electrotransferred onto a nitrocellulose sheet. Non-special
5% BSA, 5% ovalbumin to block extraneous areas
And a solution containing 5% fat-free dry milk,
The immunoreactive 40 kd protein contains anti-hPIP antibody and¹²⁵I-protein
Detected with white A. The control was the same as non-immune rabbit serum.
I ran and ran.   FIG. 7 shows the same fraction (various purification stages) shown in FIG.
Western blot performed on (obtained on the floor)
The results are shown. One row is 43kd¹²⁵I-Ovalbumin, 2 rows transparent
The eluate, rows 3-5 are Affi-Gel Blue and Con-A, respectively.
Active fractions from Sepharose and DEAE columns.
Rows are the materials obtained after SDS-PAGE preparation. This 40kd
Bands are specifically detected through purification.   The ability of this antiserum to specifically react with hPIP is 40 kd mixed.
It is increased in response to the compound, as shown in Figure 8.
Thus, proteins that specifically bind to phospholipase A2 (PA2)
Indicated by the ability to detect white (PIP). PA2 (150p
mol) in a polystyrene hole, and the excess site
Blocked with serum albumin. Then, the increased 40
kd protein added with or without 1500 pmol free PA2
And maintained binding at 22 ° C for 30 minutes. After washing, anti-P
IP antibodies and¹²⁵Using I-protein-A, this bound P
IP detected. Holes containing only HSA are also negative
Included as control.   The results in FIG. 8 show that the amount of PIP containing the 40 kd mixture was added.
If increased, antibody binding to holes also increases
doing. However, PIP containing 1500pmol PA2 with 40kd mixture
When pre-incubated with
Can be reduced to the level of non-specific binding of holes covered with. So
Therefore, this antibody is a protein that binds itself to PA2.
Join. Although this is a characteristic of PIP, this 40kd mixed
It is not a property of the other ingredients of the compound.   Also, at a dilution of 1: 100, 10 μg of the 40 kd mixture
Pre-incubation of the antiserum with PA2
The ability to detect white binding was neutralized. D.3 Identification of mRNA source for cDNA production   Polyclonal antiserum increased against purified 40kd protein.
For mRNA that is useful for obtaining a cDNA library.
Different humans for the generation of hPIP to identify sources
Used to evaluate cell sources. Suitable screening
In the SDS-polyacrylamide gel
After fractionation, the lysed cell proteins were used for hPIP immunoreaction.
Tested for   Mononuclear-ma
Cultured like clophage cell lines U937 and HL60
Human inflammatory cells; isolated like polymorphonuclear cells (PMN)
Contains not only human blood cells but also macrophages up to 20%
And lung tissue that is known to be affected. This fine
Vesicles with or without dexamethasone (0.1 μM)
In a suitable medium (with or without serum)
Incubated day and night. Cell supernatant or this cell
The cells themselves were tested for protein immunoreactivity with anti-hPIP.
Specified.   Wash cells and remove serum proteins for cell lysates
Remove, at 4 ° C, 5 mM MgCl_Two, 0.1% NP-40,0.1mMPMS
F, phosphate buffered saline containing 50 μg / ml aprotinin
Was dissolved by adding. Thin cells attached to the culture dish
Vesicles are lysed directly on the dish, while suspended cells
Then collect by centrifugation and reconstitute in the above buffer.
Suspended. After 3-5 minutes, remove the lysate from the culture dish.
Nuclei are removed by centrifugation (1000 xg, 5 minutes)
Was.   Specimens to be tested for antiserum (supernatant or
Lysate) was diluted 1: 1 using 2 × SDS. Specimen relaxation
The powder (Laemmli, U.K., supra) and 50-100 μg of protein were
1.5mm thick SDS-polyacrylamide gel (12.5%
(Rilamide). This gel contains the non-
As a control for specific binding, purified 40 kd protein 50
Use of anti-hPIP antiserum preincubated with μg
It was expanded by adding. Nitrocellulose
To various cell types after exposure to X-ray film.
HPIP immunoreactivity is measured by autoradiogram concentration scanning.
Can be quantified by   In some cell types, hPIP is secreted into the culture medium.
It is. HP partially purified from such culture media
Perform the above test for IP. (Some examples
Then, ammonium sulphate fraction, A
ffi-gel blue chromatography and Con-A SEFF
It can be subjected to agarose chromatography. Con-A
Fractions that do not bind to the Faroose column are lyophilized,
About hPIP immunoreactivity to the above-mentioned western gel
Analyzed).   FIG. 9 shows serum containing serum prepared by U937 cells for 48 hours.
Obtained from both media with and without serum
The results are shown.   This PIP protein is used as a medium from cultured cells without serum.
At 37kd. ~ 40,000 daltons
Most of the immunoreactive bands are apoAIV. this
Binding was performed in serum and in medium conditioned with serum-containing U937
But present in serum-free U937 conditioned medium.
Because there is no. Similarly, at ~ 68,000 daltons
The immunoreactive bands that are produced are those contained in serum.
Represents Bumin. This 50,000 dalton band
It is a gG heavy chain and is found only in serum-containing media. Ma
This was also detected when non-immune antiserum was used.
You. This IgG heavy chain was used to study this western
Unrelated to the antibody¹²⁵Can bind to I-protein A
You.   These results show that cultured mouse fibrosarcoma cells
PGE_TwoAs indicated by suppression of production (below
See), U937 adjustment without serum for PA2 inhibitory activity
Confirmed by testing the same specimen from the medium
Was. Therefore, U937 cells were not
To prepare a cDNA expression library for
Was done. D.4 hPIP cD of cDNA library from selected cells
Preparation of NA configuration   cDNA libraries were initially prepared from U937 cells.
Was. However, preparations of PMN and lung cells were also used.   Total cell RNA is prepared from selected cells by standard methods
(Chirgwin, J.M., et al.Biochemistry(1979)18
5294-5299). Poly A⁺RNA is oligo-dT cellulose
Isolated by two successive pathways of this RNA through the lamb
Was.   Maximum potential for obtaining cDNA clones encoding hPIP
Two separate cDNA libraries to provide
Can be configured. One of them is a random primer
(P.L.Biochemicals) and the other is oligo
dT primer was used. In both cases, the first chain
Is synthesized with 15 μg of poly A together with the appropriate primer.
⁺Reverse translip using RNA and standard reaction conditions
Synthesized by Atase (Avian Myeloblastosis Virus)
Was.   The second strand of each cDNA preparation converts this RNA into a DNA-RNA hybrid.
RNAse H (Gubber, U., et a)
l,Gene(1983)twenty five: 263-269), followed by
DNA polymerase to fill the resulting single-stranded region
Synthesized using ze (Klenow fragment). Therefore double
Strands produce blunt-ended cDNAs. EcoRI-only site inside
For EcoRI methylase according to the manufacturer's instructions
(New England Biolabs)
Therefore, it is protected. In addition, EcoRI site (P.L.Biochemical
For synthetic oligonucleotide chains containing s),
After, T_FourLigation to blunt-ended cDNAs using ligase.
The polymer chain is converted to monomer by subsequent digestion with EcoRI.
To a low melting point agarose (1.5% agarose).
To specific size by electrophoresis through
It can be screened for classification. More needed
Can be taken out.   The resulting double-stranded cDNA is unique to bacteriophage
EcoRI site (Young, R.A. and Davis, R, W.,Science(198
3)222Expression vectors as indicated by: 778-782
-Λgtll). EcoRI part in this vector
Position is at amino acid position 1015 of the β-galactosidase gene.
EcoRI site because it is in the correct reading frame
CDNA with correct reading frame and coordination
O-galactoside (IPTG) induces β-galactoside.
It can be expressed as a fusion protein with a sidase. This incidence
(Random) is 1 out of 6 times. (2 coordination x 3 readings
frame). By the phage plaque induced in this way
The expressed protein was also prepared using this 40 kd protein.
HPIP was evaluated using polyclonal antisera.
Was.   After ligation of the cDNA, the recombinant DNA is
In vitro using a staining extract (Amersham, Inc.)
Package, and for recombinant phage, refer to Young, R.
As described by A. et al, supra, the host strain E.col
A titer test was performed on i.C600Hfls. About 200,000 recombination
Was obtained.   For this cDNA library, antibodies against hPIP
The evaluation was performed using. About 5 × 10^FiveOf appropriate titer
Incubate with E. coli Y1090 and plate
), To obtain the desired phage concentration on 10 15mm plates
For 20 hours (Yong, R, A. et al, supra). β-gal
-On the agar because the fusion PIP protein is found in the lysate
And nitrocellulose at 37 ° C overnight.
Incubated. Next, the nitrocellulose filter
Detection of recombinant fusion protein antibodies
You. In this antibody detection, the antibody was detected using a phage vector (λgt1
1) Pre-absorption into lysates from bacteria infected only
Substantially the same as Western blot except that
It is.   More specifically, this filter is first used in PBS, 0.1
Non-fat using non-fat dry milk of 57% dissolved in NP-40%
It was processed by blocking heterozygous binding. This file
Filter in PBS, 0.1% NP-40, 5% BSA, 5% ovalbumin
For 2 hours using 1: 100 dilution of antiserum prepared in
After washing, the cells were washed in PBS, 0.1% NP-40. Conclusion
Synthetic antibodies¹²⁵I-protein A (10^Fivecpm / filter) and
Detection using the autoradiograph of the washing filter
Was.   Using this detection method, all plaques in each pool
Through continuous screening until is positive
Then, a positive clone was purified. False positive
Was confirmed as follows. That is, this is 2
cm^TwoPlaque with nitrocellulose disc
cm^TwoIn, screening was performed using duplication,
In addition, this duplicate nitrocellulose disc was
Pretreated with 10 μg of hPIP containing
To incubate with antibodies that did not
Therefore, it was confirmed. Binds to the wrong positive clone
Antibodies appear with antiserum pretreated with hPIP
Should be.   Files prepared from the five strongest positive clones
Size and linkage-association of cDNA inserts for large DNA
An analysis on gender was performed.   All five cDNA inserts were approximately 200 bp. One of them
To make pU200 the pBR (represented by λU-200)
Subclone into 329 EcoRI sites and continue
To the M130mp9 and M13mp8 for analysis.
I got it. Fig. 10 shows the nucleotide sequence obtained and
Shows the amino acid sequence of the origin. Length of generated fusion protein
Thus, it was possible to estimate the correct reading frame.
These proteins are approximately 70 amino acids smaller than this β-gal.
It was long. Therefore, following this linker, the inserted
The sequence is probably 200 bp from the interior of this PIP protein.
The open reading frame was maintained. Therefore, additional cDNA live
PU200 was used to examine the rally. Additional library PMN   Blood was precipitated through 6% dextran in 0.15M NaCl.
Human leukocytes were prepared by precipitation. This supernatant
Collect white blood cells in the liquid by centrifugation and wash in PBS
And used for RNA isolation. cDNA live at λgt10
Rally uses λgt10 as a cloning vector.
Except for and were prepared as described above. This library
Means this PMN library. λgt10 library
Lee was also prepared from U937 cells as described above.   Each cDNA library is approximately 10 on E. coli C600Hf1.⁶Fa
Nitrocellulose
Transfer the plaque lysate to
And prepared for screening. This filter
Benton, W.E., et al,Science(1977)196: 180-1
Crossing was performed as described in 82. For the probe, see Man
iatis, T., et al,Cloning ManualAccording to Nick Tran
Labeling was performed by slation. Next, 42 ° C
For 10 hours in 10 ml of hybridization buffer.⁷cpm PU2
Each filter was processed using 00. After that,
Filter in 2 × SSC, 0.1% SDS for 5 minutes at 22 ° C.
Washed twice. In addition, at higher temperatures (60 ° C)
And washed in 0.2 × SSC, 0.1% SDS. Then, this cross
Dried filter and autoradiography
Therefore, a positive signal was detected.   This U937λgt10 library produces several types of hybrid cDNAs.
Done. The longest cDNA is about 500bp, and λU
Represented by 500. The nucleotide sequence of λU500 is
Determined by the deoxy sequence, which is shown in FIG.
ing. By comparing FIG. 11 with FIG. 10, λU2
00 and λU500 share about 50 bp of each 5 'end,
It turns out that it has branched after that. This analysis is based on
As in the case of intron splicing
Proven later.   This λgt10PMN library is 400-600bp in size.
Of the four cross positives. The longest CD of them
NA was represented by PMN600 and was a dideoxy sequence. inference
Determined for PMN600 along the amino acid sequence
The columns are shown in FIG. PMN600 has a 50bp segment of λU200 and
Not only shared with λU500, but also homology with λU500
Extends to about another 200 bp. Then these arrays
Branch. This divergence is defined in the gene as follows:
This is due to the presence of the desired 3 'terminal exon.
Was done. Human lung cDNA library   The cDNA library at λgt is prepared using the method described above.
Prepared from human lung tissue. Two live shows
Rallies were obtained, one from fetal lung tissue.
Others were from adult lung. Lung tissue is superimposed
About 20% of macrophages
Report on the production of PA2 inhibitor from human lung
(Flower, R.J., et al,Nature(1979)278: 456-45
9).   For the fetal lung library, 5'-GAAGGTAGCCAC
Synthetic oligonucleotide having the sequence of AGCCACGG-3 '
The search was performed as described above using. This array is the PMN
It represents bases 23-42 of the 600 sequence (FIG. 12). Positive
The hybridizing cDNA contains additional upstream sequences.
I was This sequence is actually the genomic clone shown below.
You could map on the exon upstream. This cDNA was converted to pBR329
To pSR-1 and named PSR-1
In order to measure the size, it was used as follows.   Human lung poly-A⁺Performed Nathan blot for RNA
(When pSR-1 is used as a probe)
MRNA has been proven to be approximately 1400 bases in length.
Was. Using 586amHI fraction from pSR-1 as primer
Primer extension analysis shows that an additional 500 bases are complete
Proved necessary to obtain long cDNAs. Full length hPIP cDNA   Two protocols for the adult human lung cDNA library
Screening was performed using That is, pBR32
PMN600 (p600) cloned into 9, and synthetic oligos
Nucleotide 5'-ATGAGCTGTGAGAGGGGCCG-3 '(this
Represents the 5 'end of pSR-1). Four suns
Purify plaques that hybridize to
Contains either 1360 or 1340 bp.
won. These cDNAs were converted to M13mp8 for dideoxy sequencing.
And one of them after cloning into M13mp9
Contains the full-length coding sequence for hPIP.
And it was proved. Figure 13 shows the complete DNA sequence and
Shows the deduced amino acid sequence encoded by the clone
It was done. This clone, pLE-1, is approximately 36.5 kd
Equivalent to the first translation product of 331 amino acids representing protein
It is. Mature protein is a nucleic acid encoding leucine
It is believed to begin with Leotide 112-114.   The translation product of pLE-1 in vitro is the manufacturer's
RNA polymerase (SP6 system, Amersham Co.
rporation, Arlington, Heights, IL) and add pLE-1
Subcloning the insert into the transcription vector SP-6
Therefore, the reticulocyte lysate system
(Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD)
Translation of the generated (in vitro) mRMA
And the translation product obtained is 36 kd of the expected size.
Was shown. Encoded 36kd protein and associated with peritoneal fluid
The difference between the 40 kd protein and
Is believed to be. The sequence of pLE-1 consists of bases 625,595,7
Four exemplary glucosylation units starting at 09 and 808
Position (Asn-X-Ser / Thr). This is because SP6-pLE
-1 was transcribed as described above from Xenopus laevis
To the oocyte (where the first translation product can be glycosylated)
Injection and production of mature 40 kd in membrane fraction of oocytes
Confirmed by localizing the thing. D.5 Isolation of genomic clones encoding hPIP   The complete DNA sequence encoding hPIP is also
Isolated from Berry. base 19 from pU200, and p600
Contains 8-590. The NcoI fragment was used as a probe.
They do not have a common sequence. λCharon phage
The library to be used is Maniatis, T. (supra) pp270
It was constructed from Sau3AI-degraded human DNA by the method. Screw
10⁶Propagating the phage, triple nitro
Using a cellulose acetate filter as described above.
Conduct fishing. This filter is
After hybridization using lobes, this filter
Was washed in 0.2 × SSC, 0.1% SDS under severe conditions of 50 ° C.
Was. Remove and elute the double positive plaque,
Sow again to perform a second screening. fur
This procedure is repeated until the plaque is plaque-purified.   Plaque hybridizing to pU200 probe
For the two purified phage recombinants and the NcoI fragment
Seven positives that hybridized were obtained. these
Restriction digestion of purified DNA from each of the clones with EcoRI
And probe the resulting fragment with the pU200 or NcoI fragment.
Blotted to nitrocellulose for bing. Recombinant type
One of the phages, λ12-3, is positive for both probes.
Resulting fragments. λ12-3 is exon II, III, IV and
And V, but only exon I was missing
Was. Additional restriction enzyme mapping shows that λ12-3 is
It was indicated that it overlapped with the Exon I is λ
CM-14 is included in CM-14.
A genome that does not hybridize but hybridizes to pU200
It is a clone. Restriction analysis and distribution of λ12-3 clone
By sequencing and analyzing the other positive clones,
Then, exon V, as shown in FIG.
Proof that it is considered to be supplied in one type VA
It was revealed. Exon VA does not exist at λ12-3,
Λ12-1 is an NcoI fragment and pU
Genomic clone that hybridizes with 500.   Compare the sequence in the gene and the resulting cDNA clone
By comparison with other clones after 50 bp
PU200 differences in intron splicing
Failure, and PMN600 and λU
Differences between the 500 (downstream of these 250 bp homology)
And VA, PMN600 contains exon V
(Like pLE-1). D.5, Construction of expression vector and expression of hPIP Mammal vector   cDNA clones encoding hPIP can be used in a variety of hosts.
Used to produce recombinant proteins (see below).
E.1.). However, the host may not be able to
Thus, the subsequent translation process is possible, similar to that experienced.
As such, expression in mammalian systems is preferred. Host
Also, since introns can be copied, cDNA
Alternatively, genomic linkage can be used.   Full length cDNA clone encoding hPIP, pLE-1
Is inserted into the mammalian expression vector pHS1 described below as an EcoRI fragment.
Is entered. pHS1 Construction Host Expression Vector   Plasmid pHS1 contains the 840 bp hMT-II sequence from p84H.
(Karin, M., et al,Nature(1982)299: 297-80
2). This is due to Hind III at 0-765 of the hMT-II gene.
From the site to the RamHI secant at base +70.
Plasmid p84H is completely digested with BamHI,
Exonuclease Ba to remove nucleotides
Treated with l-31. And then, using Hind III
Disassembled. The desired 840 bp fragment was ligated to pUC8 (Vie
ira, J., et al,Gene(1982)19: 259-268). This is Hind
 It was cut open by digestion with III and Hinc II. this
Amp concatenated mixture^RAnd transformed into E.coli.
Two plasmids (represented by pHS1)
Sequenced by xy sequencing. pHS1 is suitable
HMT-II regulatory sequence upstream of the polylinker containing restriction sites
It contains. Construction of hPIP expression vector   EcoRI fragment encoding hPIP (prepared as above)
Was ligated to EcoRI digested phs1, and the ligation mixture was Amp^RAgainst
It was transformed into E. coli MC1061. Subsequent transformants
Are screened by restriction analysis and
A pmid-containing strain, pMT-PIP, was used to generate large amounts of plasmid DNA.
Propagated to prepare.   another with a modified coding sequence for the hPIP protein
Expression vectors are also called pLE-2 and pLE-3
Prepared from modified coding sequence. pLE-2 contains hPIP protein
The sequence at the 2C-terminal portion is missing. This means that
It is thought to be due to its binding to the cell membrane. pLE−
2 is an M13 file having the sequence of pLE-1 shown in FIG.
Place a TAC (encoding tyrosine residue)
Place a TAA stop codon at base 951 to replace
By constructing a position-specific mutation
It is. Oligonucleotide 5'-CACTGCGTTACTGGA
Using -3 'as a primer, the mutated sequence was 5
Washing with 5M 3M tetramethylammonium chloride
Below, oligonucleotides activated as probes
Use 5'-GCAGCCCCACTGCGTTACTGGACATCCAG-3 '
To screen for recombinant phage plaques
And recovered.   Mutation into dideoxy sequencing and double-stranded DNA
Confirmed by the converted single form strand. Stop codon positive
For exact function, EcoRI insert SP6 vector system
Subcloning into RNA, transcription using RNA polymerase,
For subsequent translation in the reticulocyte lysate system
More confirmed. SDS-PAGE of isolated product encodes hPIP
To a 36.4 kd protein from a full-length sequence
Indicates that the protein is 34 kd. SP6 mRNA is also Xe
injected into nopus oocytes. 1 by injected cells
The medium conditioned for 8 hours was thymosan-stimulated mice
Release of labeled arachidonate from peritoneal macrophages
Showed PIP activity. Black to SP6
Oocytes injected with mRNA from the cloned LE-1 sequence
The medium conditioned by the vesicles shows activity in this assay.
Not shown. EcoRI insert is used to obtain pMT-PIP (-)
It was transformed into pHS-1 in the same manner as LE-1 was constructed.
Was. Connect the concatenated mixture to Amp^RTo E. coli HB101
In other words, the correct direction and arrangement can be determined by restriction analysis.
confirmed.   pLE-3 is derived from the VA exon recovered in pU500 above.
Contains another 3'-terminal sequence encoded by
In. pLE-3 binds downstream sequences in pLE-1 to the appropriate
Constructed by replacing with a fragment from the sensible PU500:
pLE-1 contains NcoI and EcoRI as well as purified and unique
It was digested with a 718 bp fragment.   pU500 is compatible with EcoRI and NcoI, as well as purified cDNA inserts.
Degraded at the unique 419 bp downstream portion of the input. These cuts
Ligation of the pieces gave a 1137 bp fragment, which was pUC8
Into the EcoRI site for growth and plasmid purification.
Transfected into E.coli.HB101 cells
Was. Plasmid containing the correct orientation and placement of the insert
Was designated as pLE-3.   The pLE-3 coding sequence is used for digestion of pLE-3 by AvrII,
EcoRI to obtain hPIP-encoded fragments, with tast termination
Polyadenylation of 3'-terminal translated sequence
It was repaired by the addition of a translation signal. Then your own
Of the 1037 bp cDNA insert were isolated. pol from apoAI cDNA
The yA addition site was created using the plasmid pBL13Al (Sei
lhamer, J., et al,DNA(1984)Three: 309-317),
Blunt termination, further degradation by Eco RI, and total
Purification of a unique 65 bp fragment containing the apoAI3 'untranslated region
Isolated. This 65 bp fragment was ligated with hPIP cDNA and digested with Eco RI.
Mix with pHSI and further ligate to produce pMT-PIP / A
Was completed. Next, this concatenated mixture is^RAgainst E.coli
It was transformed into MC1061. From Amp resistant colonies
To obtain the correct insert size for plasmids
Screening was performed.   For sufficient secretion of expressed hPIP, human growth hormone,
Human allolipoprotein AI, human lung surfactant or human
Another signal sequence as derived from renin
It may be advantageous to employ This is a standard
Is achieved by a simple method. It is, for example, the 5 'end of cDNA
PLE-1, pLE-2 or pLE-2 using SphI to remove edges
Degrades pLE-3 and places the lost codon of the mature protein
And then join the appropriate upstream signal sequence
Is the way. Figure 13 shows the first amino acids of mature hPIP.
Start of leucine at base 112 and at base 124
Leu-Arg-Cys-Met
First four using oligonucleotides encoding
Need to be reconstructed. Production of hPIP by mammalian recombinants   Chinese hamster ovary (CHO) -K1 cells were
And a 1: 1 mixture of DME medium and 12% fetal bovine serum.
Medium. Considerable cells are pMT-PIP, PMT
-PIP (-) pMT-PIP / A or pAc-PIP / A and pSV2: NEO
(Southern, P., et al,J Mol Appl Gen
et(1982)1: 327-341). pSV2: NEO is a neomycin
Contains a functional gene that is resistant to the analog G418
You. In transformation, Wigler, M., et al,Gell(197
9)16: 777-785, protocol (4 hours exposure to DNA
"Shock" for 2 minutes with 15% glycerol
500 ng of pSV2-NEO and 5 μg of pMT-
hPIP was used to co-precipitate cells in calcium phosphate-DNA.
On a 16 mm dish. One day later, remove the cells at 1 mg / ml
To obtain G418-resistant colonies.   The resulting transformants are also PIP-encoded plasmids.
Have stable genetic traits. Reduce this transformant
The clonal isolate was purified at a concentration.
Transformation containing PIP sequences under the control of the MT promoter
For exchange, small amounts of these isolates are used for the assay.
Were grown in a multiwell plate and 10^-FourM's
Induction was performed using zinc chloride. For hPIP products,
To prove suppression of induced PA2 activity in feeder cells
Therefore, it was tested.   Use either pSV2: NEO or pSV2: ENO / pMT-PIP1
72 hours after the transfection, the cells were exposed to C-14.
Labeled with arachidonic acid for 2 hours. cell
And wash with 10% fetal bovine serum or 10 μM A₂₃₁₈₇,
Calcium ionophore (both activators of cellular PA2)
Stimulated with any of
Labeled arachidonic acid was measured. pSV2: NEO only
The transformed cells are cotransfected using PMT-PIP.
More than 30% to 90% of the
Release of arachidonic acid was observed (after 20 minutes). PA
2 Generate large amounts of the desired hPIP, as indicated by suppression.
The resulting clone isolate is removed for direct assay.
You.   For direct assays of PIP production, these cells were
1/10 fusion in basal medium supplemented with fetal bovine serum
Inoculated at 850cm^TwoUntil fusion in a rotating bottle
Grew. The cells are then washed and free of serum
To medium, 10^-FourM zinc chloride and 10^-6Dexamethasone
The addition induces hPIP formation for 24 hours.
Was.   For both media and cell membrane,
The test was performed. Take out the medium and use Amicon UM-100 ultrafiltration
The mixture was concentrated by filtration. In order to obtain a membrane, cells should be 1 mM E
Treated with DTA and centrifuged at 100 xg for 5 minutes
Was collected. Transfer the cell pellet to 10 mM Ti
rs, pH 8, 250 mM sucrose, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
Resuspend in 2 ml solution containing
After disrupting the cells with a riser, use a phase-contrast microscope to break the cells.
It was inspected for breakage. Centrifuge at 1000 xg for 5 minutes
The nuclei are removed by separation and the supernatant lysate
Centrifuge at 100,000 xg for 1 hour
Thereby, it was divided into a soluble part and a membrane fraction. Nuclear fractionation
Is extracted using 0.1% Tween-20.
Removed by separation. Membrane sheet from supernatant lysate
Lett is homogenized buffer (additional 10% glycerol
).   Next, the medium, soluble fraction of cell lysate, membrane, and nucleus
PIP was performed on extract fractions using two different assays.
An assay for activity was performed. That is, Bonney R.J.et
 al,(Biochem  J (1979)176: 433-440)
As shown, the peritoneal macrophages specific to zymosan-stimulated mice
Inhibiting the release of labeled arachidonic acid from the cell membranes of di;
And Vadas P., et al,(Life Sci(1985)36: 579-583)
In porcine pancreas PA-2 as described in
 In vitro assay, C-14- incorporated into E. coli membrane
Inhibition of release of labeled oleic acid. Both of these tests
In, only the membrane fraction shows activity. Got
No activity was observed in the other fractions. these
The results are shown in FIG. In the E. coli test, pMT-PIP-
Membranes from transformed cells control hydrolysis of E. coli membranes.
From about 50% as indicated by に よ っ て to about 30%. Chimo
In the Sun-mediated macrophage assay, the release is
Was only 80%.   Similar results from these tests are indicated by the pMT-PIP (-)
Obtained from transgenic CHO cells. However, the activity is membrane-bound
It is found in the medium rather than in fractions.   If necessary, follow the procedures for purifying natural proteins,
Alternatively, into the medium using other known standard methods
The secreted hPIP can be purified. Bacterial vectors and expression Construction of pTRP-233 bacterial expression plasmid   The following 10 oligodeoxynucleotides are synthetic tr
Used to construct p promoter / operator
Was:Except for 1 and 10, 500 pmol of each oligodeoxynucleotide
Otide,³²Individually kinased with P-γATP
Was. Pairs of these oligos, eg 1 + 2,3 + 4,5 + 6
And incubate 16.7 pmoles at 90 ° C for 2 minutes each.
Annealed by slowly cooling to room temperature.
And phenol / chloroform extraction and
And ethanol precipitation. This pair set
Was ligated with T4 ligase, and the recovered ligated DNA was
Degraded using Eco RI and PstI. Obtained DNA fragment
Pieces visualized by wet gel autoradiography
And dissolve the 100 bp fragment to form the desired double-stranded sequence.
And confirmed by dideoxy sequencing. This double strand
Include the promoter and operator regions of the trp operon.
Region and the ribosome binding site of the trp-derived peptide
It is rare.   Plasmid pKK233-2 (Amann, E. et al ,;Gene(198
Five)40: 183-190) using Nde I to completely decompose
End, ligated, lacked the NdeI site,
A sumid, pKK-233-2-Nde, was obtained.   pKK-233-2-Nde10ng was prepared using Eco RI and Pst I.
Complete digestion, treatment with CIP, and 50 ng of synthetic Eco RI /
Mixed with PstI trp promoter / operator sequence (above)
I combined. This mixture was ligated with T4 DNA-ligase and
i JA221 1pp^-/ I'lacI⁹Was transformed. Transformant
Contains the desired insert (represented by pTRP-233)
The presence of the resulting plasmid DNA was examined. Bacterial expression vector for PIP   HPIP-encoded segments lacking the native signal sequence
(This corresponds to nucleotide 114 as shown in FIG.
) And dissociate with Klenow.
Runt terminated and Hind III (this is the insert
(Cut at just the 3 'vector site)
PLE-1, pLE-2 and pLE-3
Removed. SphI (blunt) / Hind III fragment
Ligation to I (blunt) Hind III digested pTRP233 and trp promoter
Placing the coding sequence under the control of the pTRP-PIP,
pTRP-PIP (-) and pTRP-PIP / A were obtained, respectively. this
E. coli.
HB101, and these transformants were transformed into standard M9
Growing in salt + 0.5% casamino III (Difco)
Was. In other words, until the value of OD-550 before induction reaches 0.1,
OD after treatment with 25 μg / ml IAA and growing
They were grown to a value of 1.0. Next, the bacteria were collected.
And dissolve using a French press or sonicate
And dissolved. And about that lysate, Vad
As for the inhibition of PA2 using the in vitro assay of as et al.
The test was performed.   hPIP protein is obtained in non-glycosylated form and is
After purification, PA2 inhibition assay can be performed.
carry out. Produced by 40-60% saturated ammonium sulfate
Precipitate fraction and reconstitute in 25 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 2 mM EDTA.
DEAE Sephadec dissolved and equilibrated in the same buffer
Hang on Protein eluted with 0.125 M NaCl gradient
On a C8 HPLC column or other hydrophobic column.
Purify to homogeneity. In this column, the activity
Fractionation on 20-100% acetonitrile gradient in 1% TFA
Elute at about 50% acetonitrile. Activity
Dried protein in the soluble fraction was redissolved in 20 mM Tris, pH 8.0
And, if necessary, Van Scherrenberg G.M., et al, Hoppe-Se
yler's ZPhysiol Chem(1980) 361: 571-576
To re-oxidize to disulfide. D.6. Active fragment of hPIP   FIG. 17 shows a comparison with the amino acid sequence of hPIP in FIG.
That is, the pancreatic and C. atrox toxic phospholipases
1 shows a known sequence and a comparison between nucleotides 490-852. This
The homology of the part is based on the similarity with the Vipera system.
Has been suggested to be sufficient for sex.
It also shows the homology between the enzyme and the inhibitor. (Ma
ncheva, I., et al, Hoppe-Seyler's ZPhysiol Chem(198
Four)345: 885-894). This region of hPIP (various downstream sequences
Has BstE from pLE-1, pLE-2 and pLE-3
 Obtained as II (blunt) / Hind III fragment. (BstE
 II cleaves at base 465. ) As mentioned above,
Fragment was linked to Kpn I (blunt) / Hind III digested pTRP233.
PTRP-PIP (F), pTRP-PIP (F-) and pTRP-P
IP (F / A) is obtained respectively. These plasmids
Was expressed in E coli as described above.   Further, any of the above vectors can be modified to
Only the desired fragment representing the region can be encoded
You. This is the CAA glue at nucleotide positions 853-855.
Tamin codon is changed by site-specific mutation
Can be achieved by converting to   Decomposition of pTRP-PIP (F) using Hind III and EcoRI
And cloned into Hind III / EcoR I digested M13mp18. single
Using single-stranded DNA as a primer, 5'-GCATGTTAGCACATT-
Use 3 'and treat with DNA polymerase. And got
Transfected double-stranded DNA into whole cells.
Let For the mutant phage, 5 '
-Inspect using AGGTGGGCATGTTAGCACATTGATT-3 '
You. Then, use purified plaques to confirm correct construction.
To determine the sequence. The recovered DNA is double-stranded.
Formed and digested with EcoR I and Hind III to give EcoR I
/ Hind III linearized Contact pTRP-PIP (F). Obtained
Vector (represented by pTRP-PIP (465-852))
Transform into E. coli for expression. Next, the generated activity
The purified PIP fragment is purified and reduced / oxidized as described above. D.7. Apo AIV sequence and hPIP sequence   Obtained in D.1. As a 40 kd band on SDS-PAGE
Proteins include hPIP and N-terminal N-terminal blocked form
The ends contained apoAIV available for sequencing. Appli
ed Biosystems 470A gas phase sequencer
Presence of apoAIVN-terminal when the fraction is subjected to sequencing
Was confirmed.   N-terminal sequencing was performed on about 50 μg of protein and P
TH amino acids are converted to Hunkapiller, M, W. and Hood, L.E.,Meth E
nzym(1083)91: 486-492. As reported by
Then, using an IBMCN column, immobilize it with a Beckman 334T HPLC.
Was. The N-terminal sequence obtained is as follows.   Glu-Val-Ser-Ala-Asp-Gln-Val-Ala-Thr-Val-Met-Trp-
Asp-Tyr-Phe-Ser-Gln-Leu-Ser-Asn-Asn-Ala-Lys-Glu-Al
a-Val-Gln-Leu-Lys-Ser-Arg.   The small secondary sequence of the 40 kd mixture is as follows:   Glu-Asn-Leu-Pro-Gln-Asn-Gly.   Presumably, this sequence is one of the blocked hPIP molecules.
From excessive proteolytic clips
Contains sulfide bonds. This arrangement is shown in Figure 13.
Starting with the salt 662 and ending with the base 693. D. Activity of 8.40kd band Phospholipase A_TwoTest for suppression   In vitro standard inhibition assay (PA2 inhibition assay)
Was carried out as follows.   100 ng of porcine pancreatic phospholipase AII (Sigma Chem
ical Co, St. Louis, MO) and various concentrations of the protein to be tested.
White (up to 10 μg) was added to 20 mM Tris, pH 8.0 and 2 mM calcium.
The cells were placed in 50 μl of a buffer solution containing uranium ions. The solution
After incubating at 30 ° C for 10 minutes,
Medium, 20 μg of human serum albumin and 2 μCi of α-β
-[I¹⁴-C] -arachidonylphosphatidylcholine
Tearoil [^ThreeH) (Amersham. Inc.)
Solution (just before addition) in an ultrasonic crushing water bath at 22 ° C.
Sonicated solution for 10 minutes). At 30 ° C
After 15 minutes, the addition of 25 μl of 10N acetic acid
The reaction was stopped.   Add 25-50 μl of the reaction mixture to chloroform, methanol
, Acetic acid (90: 10: 1) in an increasing solution system
It was applied to a silica G-type TLC plate for analysis. Araki
Arachidone as standard for positioning the donate band
Acid was used. Phosphatidylcholine band in its original position
Stay in. Spots were stained with iodine vapor.
Thus visualized and standardized arachidonic acid salt
And phosphatidylcholine spots from the plate
, Toluene-omnifluor (New England Nuclea
Measure radioactivity using scintillation counting in r)
Specified. The percentage of hydrolysis is the fraction 100 × cpm arachidonic acid /
Calculated as (cpm arachidonic acid + cpm phosphatidylcholine)
did. PGE_TwoTest by generation suppression   hPIP is a PGE from cultured fibrosarcoma cells_TwoSuppress generation of
It was proved that it could be done. In this test, A
Of mouse fibrosarcoma cells obtained from TCC (ATCC # CCL148)
Check the confluent culture in 150 μl HAMMs F10 medium (Gibco).
Various concentrations of protein to be determined and 25 μl phosphate buffered saline
Pre-cultured with water at 37 ° C for 15 minutes. 2% fetal bovine blood
Add 100 μl F10 medium containing clarified cells and allow the cells to
_Two/ Dexamethasone using incubator moistened with 95% air
(DEX) was added to the cells 16 hours before induction. Remove the medium
Commercial radioimmunoassay kit (Seragen, Inc., Boston,
MA) using PGE_TwoWas tested.   FIG. 18 shows the results of purified PIP (by SDS-PAGE).
PGE by DEX_TwoThis shows suppression of production. gel
The 18 KD band from was used as a control (open circles). Black circle
Used the active fraction from the Gon-A Sepharose column
The result. The squares are the results of the protein from the 40 KD band.
The triangle is the result of using DEX. The reaction is active
It is dose dependent for protein and DEX. 100μ for cells
g of arachidonic acid (at the same time PIP is applied)
Addition), the suppression by both PIP and DEX
We were able to cancel the system. in Vivo test   Three in vivo models were used to demonstrate PIP activity
Was. Rat pleurisy model, rat paw edema model and
Adjuvant induced arthritis.   Pleural cavity of three groups of rats in a rat pleurisy model
The injection of 0.1 ml of 0.5% carrageenan in saline
Induces inflammation, and the test substance suppresses this inflammation
The ability was checked. 10 μg of PIP for detection of PIP protein activity
Was injected with carrageenan. Contains 200 μg DEX
Carrageenin injection was used as a positive control. 5 hours
Afterwards, open the pleural cavity, wash with 1 ml of saline, and note the fluid volume.
Recorded. In addition, Bradfor
d, et al,Aanl Biochem(1976)72: 248-254.
Was measured. Inhibitory activity depends on effusion volume and effusion protein
Proven by a decrease. As shown in Figure 19
In addition, 10 μg of purified PIP suppresses both parameters
In this respect, 200 μg DEX showed the same effect.   The data on the left is the amount of exuded protein (mg / cavity)
Is recorded. This amount is 50 μg DEX or 10 μg.
Substantially normal levels in the presence of either μg PIP
To decrease. The measurement results of the exudation volume are shown on the right (m
l). Similarly, either 50μg DEX or 10μg PIP
Reduce exudate liquid volume to normal levels.   In the rat hind paw edema model, Sprague-Dawley
Group (180-200 g) was lightly anesthetized under ether,
0.1 ml of a carrageenin suspension with a weight / volume of
Induction of hind limb edema by injection into plantar tissue
(Van Arnien, C., et al,J Pharm Exp Therap(1965)Fifteen
0: 328-334.   The anti-inflammatory activity of a test substance can be determined by one of the following three methods.
And tested by administering the test substance. Sand
Or intravenous, intraperitoneal or carrageenan
Co-injection. 3 hours before intraperitoneal injection, except in special cases
Dexamethasone was used as a control. result
Is a constant pressure starting at time zero (time of injection of test substance)
One hour before using a force caliper, measure the thickness of the hind legs
It was evaluated by measuring.   FIG. 20 shows that, for test injection, 0 isolated from SDS-PAGE.
-5 μg of purified hPIP, 25 μg of dexamethas for control injection
Feet when both zons are administered together with carrageenin
Thickness of the pad (mm × 10^Two) Shows the result of the increase
You. hPIP significantly reduces edema in a dose-dependent manner
Was. Control DEX also reduced inflammation, as shown in FIG.
The time dependency is slightly different from PIP
You.   Figure 21 shows that the injection of the test substance was performed 30 minutes before the induction of inflammation.
It shows the result when going inside. Same as DEX
In addition, indomethacin was used as a control. This data
States that PIP and indomethacin suppress foot swelling
Is equally effective in this regard,
Both are slightly less effective than DEX. Follow
HPIP can enter the circulation and act on inflammatory sites.
Indicates that you can do it.   Fig. 22 shows that administration was performed 2 minutes before injection of carrageenan.
This shows the results when performed as an injection into the pulse.
You. Similarly, hPIP could be dose-dependent 3,4 post-IV.
For up to 5 hours to reduce inflammation.
Was. In addition, 25 μg of PIP was given 200 μg DIP after 3 or 4 hours.
Equivalent to EX effect. From these results, the biological
The half-life was found to be 2-3 hours.   The remaining in vivo assays are based on the adjuvant-induced arthritis model.
This is Colpaert, F.C., et al,Life Sci(198
2)31According to the method of 67-75. 30 days after the trigger,
Animals receive saline, purified hPIP or dexamethasone
Administered by injection. As shown in Fig. 23, hPIP
Swelling of the hind paws and joints (maximum by 10 hours
Was rapidly reduced, but this swelling
Returned to control levels after 28 hours. DEX after 3 hours
Causes a reduction in swelling and is sufficient during the 28-hour experimental period.
The effect was maintained. E. Standard method   Cell transformation, vector construction, messenger RNA
Used for DNA extraction, cDNA library preparation, etc.
Is largely implemented by those skilled in the art,
Also, most skilled persons are advised of their particular conditions and operations.
Be familiar with standard source materials. But for convenience
Above, the next section will be a guideline. E.1. Host and control sequences   Prokaryotic and eukaryotic systems both generate PIP coding sequences.
Can actually be used. Prokaryotic host for cloning
Needless to say, this is the most convenient. As prokaryotes
Most of the E. coli strains
However, strains of other microorganisms can also be used. Compatible with host
Containing regulatory sequences and replication sites from different species
Use a vector. For example, E. coli is typically Bo
livar, et al,Gene(1977)Two: 95 from E. coli species
Transform using a derivative of pBR322 as a rasmid. pB
R322 has genes for ampicillin and tetracycline resistance
Included and therefore retained during the construction of the desired vector
Additional markers that can either be destroyed
Offer. The commonly used prokaryotic control sequences are
Here, a transcription initiation promoter, optionally an operator,
And ribosome binding site sequences
But β-lactamase (penicillinase) and lactose
(Lac) promoter system (Chang, et al,Nature(197
7)198: 1056), tryptophan (trp) promoter system
(Goeddel, et alNucleic Acids Res(1980)8: 4057)
And P from λ_LCommonly used like promoter
Promoter and N-gene ribosome binding site
(Shimatake, et al,Nature(1981)292: 128)
In.   In addition to bacteria, eukaryotic microorganisms such as yeast can also be used as hosts.
Can be used. Saccharomyces cerevisiae (Saccgaromy
ces cerevisiae), a yeast strain of Baker, a laboratory strain
Most commonly used, but many other strains are also commonly available.
You. For example, Broach, J.R.,Meth Enz(1983)101: 307 of 2
μ origin of replication or other origin of replication compatible with yeast (eg
For example, Stinchcomb, et al,Nature(1979)282: 39, Tschemp
e, et al,Gene(1980)Ten: 157 and Clarke, L, et al,Met
h Enz(1983)101: 300).
Can be used. Glycolysis as control sequence for yeast vector
Promoters for enzyme synthesis (Hess, et al,J Ady Enzym
e Req(1968)7: 149; Holland, et al,Biochemistry(197
8)17: 4900). Other promotions known to those skilled in the art
The promoter is a 3-phosphoglycerate kinase promoter.
(Hitzeman, et al,J Biol Chem(1980)255: 207
3) and there are promoters of other glycolytic enzymes. Proliferation
Has the additional advantage that transcription is controlled by the conditions
Other promoters are alcohol dehydrogenase 2,
Isocytochrome C, acid phosphatase, related to nitrogen metabolism
Use of degraded enzymes and maltose and galactose
Is the promoter region of the enzyme responsible for Also Terminator
Is preferably at the 3 'end of the coding sequence
it is conceivable that. Such terminators are derived from yeast
Found in the 3 'untranslated region following the coding sequence in the gene
Is done.   In addition, many genes encode polypeptides.
Can be expressed in eukaryotic host cell cultures from cell organisms
it can. See, e.g., Axel et al. U.S. Patent No. 4,399,216
Please. These systems also add introns to spline systems.
That can be used directly for the expression of genomic fragments
This has the advantage of: Useful host cell lines include VERO and HeLa cells.
Vesicles and Chinese hamster ovary (CHO) cells
is there. Expression vectors for such cells are usually
Regulatory sequences and promoters compatible with mammalian cells,
For example, the first of the commonly used Simian virus 40 (SV40)
Early and late promoters (Fiers, et al,Nature(197
8)273: 113) or polyoma, adenovirus 2,
It is derived from bovine papillomavirus or avian sarcoma virus
Such as other viral promoters.
Controllable promoter hMT-II (Karin, M., et al,Natur
e(1982)299: 797-802) can also be used. Mammal cell lodging
General aspects of main transformations are described in Axel (supra).
Have been. Again, to optimize expression
The "Hanser" region is considered important.
Typically, upstream of the promoter region in the non-coding DNA region
Or a sequence found downstream. If necessary,
The origin of origin is obtained from the virus source. However, chromosome integration
Is a common mechanism of DNA replication in eukaryotes. E.2. Transformation   Standard techniques appropriate for the host cell used
For transformation. Cohen, S.N.,Proc Natl Acad Sc
i (USA)(1972)69: Calcium chloride as described in 2110
Calcium treatment, or Maniatis, T., et al,Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual(1982) Cold Sp
RbCl described in ring Harbor Press, p.254_TwoThe law
Used for prokaryotes and other cells that have cell wall barriers.
For mammalian cells without such cell walls, G
raham and van der Eb,Virology(1978)52: 546 phosphorus
The calcium acid precipitation method was used, which is described in Wigler, M., et al.
Cell(1978)16: 777-785. Yeast
Transformation was performed by Van Solingen, P., et al,J Bact(1977)130:
946 or Hsiao, C.L., et al,Proc Natl Acad Sci (US
A)(1979)76: 3829. E.3. Construction of vector   A suitable vector with the desired coding and control sequences
The construction of the key consists of standard coupling techniques well known to those skilled in the art.
Use restriction techniques. Has an isolated plasmid and DNA sequence
Or cut the synthetic oligonucleotide, tweak it,
To reconnect to the desired mold.   For site-specific DNA cleavage, appropriate restriction enzymes are available to those skilled in the art.
By processing under conditions generally understood,
The details of these conditions are described in the production of these commercially available restriction enzymes.
Have been identified. For example, New England Biolabs
See our product catalog. Usually, about 1 μg of plasmid
Or 1 unit of DNA sequence in about 20 μl of buffer solution
Disconnect with In the examples here, typically, excess
Restriction enzymes are used to complete the degradation of the DNA substrate.
Incubation time of about 1 to 2 hours at about 37 ° C
Works, but changes are allowed. Each incubation
After extraction, the protein is extracted by phenol / chloroform extraction.
Removal, followed by ether extraction.
The nucleic acid is recovered from the aqueous fraction by the ethanol precipitation. necessary
Separation according to the size of the cut fragments, according to standard techniques,
Using polyacrylamide gel or agarose
It may be performed by gel electrophoresis. Minute by size
A general description of separation isMethods in Enzymology(1980)65:
499-560.   The restriction fragments were 50 mM Tris (pH 7.6), 50 mM NaCl, and 6 mM.
MgCl_Two, 6 mM DTT and 5-10 μM dNTP at 20-25 ° C
Incubation time of about 15 to 25 minutes
E. coli DNA in the presence of xinus reotide triphosphate (dNTP)
Treat with large fragment of limerase I (Klenow)
In this way, blunt termination is achieved. The Klenow fragment consists of four
Fills 5 'sticky ends but protrudes 3' even if dNTPs are present
Single strands that have been cut off. If necessary,
Select or select only one dNTP within the limits determined by its properties
Perform selective repair by providing selected dNTPs
Can be. After treatment with Klenow, mix the mixture with phenol /
Extract with chloroform and perform ethanol precipitation. Appropriate
Treatment with S1 nuclease or Bal-31
In addition, all single-stranded parts are hydrolyzed by po.   Synthetic oligonucleotides can be prepared by methods such as Efimov, V.A.Nuc
leic Acids Res(1982) 6875-6894,
Can be prepared using commercially available automated oligonucleotide synthesizers
You. Single-stranded before annealing or for labeling
Kinase treatment is performed with about 10
The unit of polynucleotide kinase is 50 mM Tris (pH 7.
6), 10mM MgCl_Two, 5 mM dithiothreitol, 1-2 mM ATP, 1.
7 pmolγ32P-ATP (2.9mCi / mmol), 0.1mM spermidine
And in the presence of 0.1 mM EDTA.   Ligation is performed in a volume of 15-50 μl under the following standard conditions and temperature.
Perform in degrees: 20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM MgCl_Two, 10mM DT
T, 33 μg / ml BSA, 10 mM NaCl, and 40 μM ATP, 0.01-0.02
(Weiss) unit of T4 DNA ligase at 0 ° C (“sticky powder”
1mm ATP, 0.3-0.6 (Weiss) unit
T4 DNA ligase at 14 ° C ("blunt end" ligation
Use). "Sticky end" ligation between molecules is usually
Perform at a concentration of 33-100 μg / ml (final total concentration 5-100 nM). Minute
Blunt-end ligation between offspring (usually a 10-30 fold molar excess of phosphorus
Is performed at a final total concentration of 1 μM.   In vector construction using "vector fragments"
Is generally used to convert vector fragments into bacterial alkaline
(BAP) or bovine intestinal alkaline phosphatase (C
IP) to remove the 5 'phosphate
To prevent religation of the vector. Degradation is about 150mM Tris pH8
At⁺And Mg²⁺In the presence, about 1 per μg of vector
Using BAP or CIP in units of about 1 hour at 60 ° C
U. To recover nucleic acid fragments, use this preparation in phenol.
/ Extract with chloroform and precipitate with ethanol. There
Religation is an undesirable break in further restriction digestion.
This is prevented by using a vector whose fragment has been double digested.
I can.   cDNA or genomic DNA derived vector sequence
For sites requiring modification, use site-specific primers.
Mutagenesis is used. This is a limited mistake
For single-stranded phage DNA to be mutated other than match
Run using complementary primer synthesis oligonucleotides
This results in the desired mutation. Easy to say
Using synthetic oligonucleotides as primers
Direct synthesis of the complementary strand of the phage and the resulting double-stranded DNA
To transform a host bacterium for phage support. Trait
Spread the transformed bacterial culture onto the upper agar to retain the phage.
Enables the formation of plaques in single cells.   Theoretically, 50% of new plaques change as single-stranded
Contains atypical phage, 50% have original sequence
Will be. Kinase-treated synthesis of the resulting plaque
Hybridize with primer. The temperature at this time is
Allows for exact match hybridization
At this temperature, mismatch with the original chain is
It is sufficient to prevent hybridization. next
Pick up plaque that hybridizes with probe and culture
And recover the DNA. E.4.Confirmation of construction   In the construction described below, the exact
First, the E. coli strain M obtained from Dr. M. Casabadan
C1061 (Casabadan, M., et al,J Mol Biol(1980)138: 17
9-207) or other suitable host with the ligation mixture
It is confirmed by changing. Select successful transformants
Resistance to ampicillin, tetracycline or other antibiotics
By nature or as understood by those skilled in the art.
Select using other markers according to the mode of sumid construction.
You. Next, the transformant plasmid was transferred to Clewell, D.B., et a.
l,Proc Natl Acad Sci (USA)(1969)621159
Chloramphenicol amplification (Clewel
l, D.B.,J Bacteriol(1972)110: 667)
You. Restriction treatment of the isolated DNA and / or Sanger,
F., et al,Proc Natl Acad Sci (USA)(1977)74: 5463
In addition to the method of Messing, et al,Nucleic Acids Res
(1981)9: 309
Is Maxam, et al,Methods in Enzymology(1980)65: 499
And by sequencing according to the method described above. E.5. Production of cDNA or genomic library   The human genomic library can be used as a λ
Build with the old version. For example, Maniatis, T., et al,Cell(19
78)Fifteen: 687-701. The cDNA library is described above.
Can be prepared in λgt11 phage as described in
To prepare double-stranded cDNA synthesized from mRNA isolated by
Calf thymus terminal transferase-mediated
Mopolymeric tailings (Sutcliffe, J.G.,Nucleic Aci
d Res(1978)Five: 2721-2732)
It can be inserted into a sumid vector. First strand cDNA
Avian myeloblastosis virus RNA-dependent DNA polymerase
Primed with oligo (dT) 12-18 on 5 μg mRNA
To achieve. Then denature at 100 ° C for 5 minutes, then cool on ice
By rejecting, the RNA template is separated from the initial DNA strand. Second
For the strand DNA, a large fragment of E. coli DNA polymerase I was used.
Self-priming at the 3'-end of the first-strand molecule.
To form double-stranded hairpin DNA.
You. The open-ended ends of these molecules are blunt-ended,
In addition, the hairpin loop is used for Aspergillus oryzae (Aspe
rgillus oryzae) with S1 nuclease. Double strand
S1 nuclease digestion of cDNA was performed at 300 mM NaCl, 30 mM NaOAc, p
H4.5,3mM ZnCl_Two30 minutes at 37 ℃ with 600 units of enzyme
Do with. cDNA is extracted with phenol: chloroform and vinegar
Perform ethanol precipitation three times in the presence of ammonium acid
Remove the small oligonucleotide. This is as follows
Perform: 1/2 volume 7.5 M ammonium acetate and 2 volumes
Of ethanol was added to the cDNA solution, which was precipitated at -70 ° C.
Let Next, blunt-ended double-stranded cDNA is subjected to gel filtration.
(0.3 × 14cm) Sepharose 4B (Pharma
Through Shea Fine Chemicals, Piscataway, NJ)
And fractionate according to size, or 5-20% glycero
Ultracentrifuge in a gradient to fractionate the gradient. Desired length
For example, it has a cDNA that is roughly 300 base pairs larger,
Collect by ethanol precipitation. Deoxycytosine short
(10-30 nucleotides) polymeric tail of cDNA
At the 3 'end. The reaction at this time was 0.2 M cacodylic acid
Lium, 25 mM Tris (pH 6.9) 2 mM dithiothreitol, 0.5
mM CoCl_Two, 200 mM cDTP, 400 μg / ml BSA and 40 pups
Bovine thymus terminal deoxynucleotide transfer
Perform for 5 minutes at 22 ° C in the presence of the enzyme. Phenothe reaction solution
: Extract with chloroform, in the presence of ammonium acetate
Ethanol precipitation three times to give small oligonucleotides
Is removed.   The tailed cDNA is combined with a host vector such as pBR322.
Annealing, but this vector is
Cleave with PstI and keep the oligo dG tail. One fruit
In a possible embodiment, 2.5 μg of pBR322-dG DNA vector
With the cDNA at a 5 μg / ml
Hybrid of Casabada, M., et al,Mol Biol(198
0)138: CaCl described in 179-207_TwoE.coli MC1061 by processing
Move to E.6. Probing cDNA or genomic libraries   Copy the cDNA or genomic library as needed.
Use knee or plaque hybridization procedure
And sort them out. Double colonies or plaques
On trocellulose filter paper (S & S type BA-85)
And clone the colony to 15 μg / ml tetracycline.
Grow for 14-16 hours at 37 ° C. on containing L agar. Colony
Was dissolved in 10% SDS, 500 mM NaOH / 1.5 M NaCl, then 0.5 M
Tris HCl (pH 8.0) /1.5M NaCl followed by 2x standard citric acid
By continuously treating with saline (SSC) for 5 minutes, DN
A is fixed on the filter. Air dry the filter, 80 ℃
Bake for 2 hours.   For nick translated probes,
10 ml DNA hive per filter
Redidation buffer (50% formamide (strict
40% formamide to lower), 5 × SSC, pH7.0,5
× Denhardt's solution (Ficoll with polyvinyl porolidone
Plus bovine serum albumin; 1x = 0.02 each
%), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.2% SDS,
50 μg / ml yeast tRNA and 50 μg / ml denatured, sheared salmon
Prehybridized at 42 ° C for 16-18 hours with sperm DNA)
Let   Sample 5 ml of this same DNA hybridization buffer
Nick-translated DNA probe contained therein
12 to 36 hours at 42 ° C for allogeneic sources
In the case of, hybridize at 37 ° C. Hive of the same kind
In the case of redidation, the filter is 0.2 × SSC, 0.1%
Wash twice in SDS at 50 ° C for 30 minutes each time.
In the case of redidation, filter is 3 × SSC, 0.1% S
Wash in DS at 50 ° C. Air-dry the filter at -70 ° C
Autoradiography for 1-3 days.   Synthetic (15-30mer) oligonucleotide probes
Therefore, use a double filter with 10 ml of filter per filter.
Rigo Hybridization Buffer (6 × SSC, 0.1% SD
S, 1mM EDTA, 5x Denhardt's solution, 0.05% sodium phosphate
And 50μg / ml denatured, sheared salmon sperm DNA) at 42 ° C
And prehybridize for 2-8 hours.   Sample kinased 15-30 nucleotide oligo
For nucleotide probe and oligonucleotide composition
Hybridize under the appropriate conditions. Typical conditions and
30-42 ° C for 24-36 hours, contains probe
5 ml of this same oligo hybridization buffer / filtration
Use Luther. Filter each time 6 × SSC, 0.1SDS
And 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7) at 23 ° C
Wash twice for 5 minutes, then calculate with 6 × SSC and 0.1% SDS
Wash for 2 minutes at the hybridization temperature
Dry and autoradiograph at -70 ° C for 2-3 days
Multiply.   Amino acid sequence of desired protein or mR encoding it
If the nucleotide sequence in NA is known,
DNA for insertion into a host vector should be a synthetic means,
Alternatively, a vector containing such a sequence has been deposited.
Or, if available, clone such a vector.
Can be obtained by performing Code array
In synthesis, sense and antisense alternately overlap
Prepared single-stranded oligonucleotide,
The single-stranded portion where antisense is
Treat with merase and dNTP and enzymatically fill. Oligomer
To Efimov, V.A.Nucleic Acids Res(1982) 68
75-6894), which is a commercially available automated oligo.
It can be prepared using a nucleotide synthesizer. Anilin
Single-stranded kinase treatment before labeling or labeling
Is about 10 units of polynuclein per 1 mmol of substrate
Using Reotide Kinase, 50 mM Tris (pH7.6), 10 mM M
gCl_Two, 5 mM dithiothreitol, 1-2 mM ATP, 17 pmol γ³²P
-ATP (2.9m Ci / mmol), 0.1mM spermidine and 0.1mM
 Perform in the presence of EDTA. E.7. Host example   Here, the host strain used for cloning and expression is as follows.
It is as follows:   Bacteria for cloning and sequencing
For expression of constructs under the control of a promoter, E. coli
Strain MC1061 was used.   The cells used for mammalian expression are Chinese
Muster ovary (CHO) cells.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロンジェネッカー，ジョン ピー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94087 サニーヴェイル，シドニー ド ライブ 1363 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, 122（３）Ｐ．1117−1124（1984) 新実験化学講座20「生物化学〔１〕」 Ｐ．14−77（1978) レニンジャー「生化学−細胞の分子的 理解−．上」Ｐ．52（1976)   ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Inventors Ron Genecker, John P.               United States California               94087 Sunnyvale, Sydney               Live 1363                (56) References Biochemical and B               iophysical Research               h Communications,               122 (3) P. 1117-1124 (1984)                 New Experimental Chemistry Lecture 20 “Biochemistry [1]”               P. 14-77 (1978)                 Renninger "Biochemistry-Cellular Molecular               Understanding-. Above "P. 52 (1976)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】 １．以下のヌクレオチド112-1050によりコードされるア
ミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、ヒトホスホ
リパーゼ阻害蛋白（hPIP）：２．以下の工程により得られるhPIP/アポAIV複合体であ
って、 （ａ） ヒト腹膜間透析液を40〜60％硫酸アンモニウム
処理して沈澱を得る工程； （ｂ） 該沈澱をAffi−ゲルブルーにかけて非結合画分
を得る工程； （ｃ） （ｂ）の非結合画分をコンカナバリン−Ａセフ
ァロースで処理して非結合画分を得る工程； （ｄ） （ｃ）の非結合画分をpH7〜９で陰イオン交換
クロマトグラフィーにかけて活性画分を得る工程； （ｅ） （ｄ）の活性画分を調製用のSDS-PAGEで処理し
て40kd画分を得る工程；および （ｆ） （ｅ）の40kd画分を回収および再生する工程； ここで、該40kd画分が、以下のヌクレオチド112-1050に
よりコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を
有する蛋白に対して惹起される抗血清との反応性を有す
る蛋白を含む、hPIP/アポ複合体：３．組換えで産生される、請求項１に記載のhPIP。 ４．組換え宿主に和合可能な制御配列に動作可能に連結
されたhPIPをコードする組換えDNA配列で形質転換され
た組換え宿主細胞を培養することにより調製される、請
求項１に記載のhPIP。 ５．ベクターを含む形質転換された宿主細胞を、hPIPの
発現可能な条件下で培養する工程、および続いて該hPIP
を回収する工程を包含する、hPIPの産生方法であって、
該ベクターが、以下のヌクレオチド112-1050によりコー
ドされるアミノ酸配列と同一の一次アミノ酸配列を有す
る蛋白をコードする単離されたDNA分子を含有する、方
法： (57) [Claims] A human phospholipase inhibitor protein (hPIP) having an amino acid sequence identical to the amino acid sequence encoded by nucleotides 112-1050: 2. An hPIP / apoAIV complex obtained by the following steps: (a) treating a human interperitoneal dialysate with 40 to 60% ammonium sulfate to obtain a precipitate; (b) subjecting the precipitate to Affi-Gel Blue for non-binding (C) treating the non-bound fraction of (b) with concanavalin-A sepharose to obtain a non-bound fraction; (d) removing the non-bound fraction of (c) at pH 7-9. (E) treating the active fraction of (d) by preparative SDS-PAGE to obtain a 40 kd fraction; and (f) 40 kd of (e). Recovering and regenerating a fraction; wherein the 40 kd fraction reacts with an antiserum raised against a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence encoded by the following nucleotides 112-1050. HPIP / apo complex comprising a protein having the following: 3. 2. The hPIP of claim 1, which is produced recombinantly. 4. 2. The hPIP of claim 1, prepared by culturing a recombinant host cell transformed with a recombinant DNA sequence encoding hPIP operably linked to control sequences compatible with the recombinant host. 5. Culturing a transformed host cell containing the vector under conditions capable of expressing hPIP, and subsequently,
A method for producing hPIP, comprising recovering
The method wherein the vector contains an isolated DNA molecule encoding a protein having a primary amino acid sequence identical to the amino acid sequence encoded by nucleotides 112-1050 below: