JP2756606B2 - 動的連続流酵素リアクター - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、血液凝固反応速度及び体内と非常に近い環
境中で活性を燐脂質に依存しているその他の動的酵素反
応の速度をin vitroで測定するための動的連続流酵素リ
アクター及び方法に関するものである。
境中で活性を燐脂質に依存しているその他の動的酵素反
応の速度をin vitroで測定するための動的連続流酵素リ
アクター及び方法に関するものである。
人及び動物の凝固系は、止血の維持及び血栓（血液凝
塊）形成にも大きく貢献している。凝固は本質的には連
続的段階（cascade）であり、通常は血液及び他の組織
中に不活性は酵素前駆物質、即ちチモーゲンとして存在
する各凝固因子が順次活性化されて蛋白質分解酵素にな
り、それが系列中の次のチモーゲンを選択的に襲い、そ
れによってこれが活性酵素に変るのである。プロセスの
各段階で増幅がおこり、最初は小さかった刺激が究極的
にはかなりの量のフィブリン凝塊を生成する。
塊）形成にも大きく貢献している。凝固は本質的には連
続的段階（cascade）であり、通常は血液及び他の組織
中に不活性は酵素前駆物質、即ちチモーゲンとして存在
する各凝固因子が順次活性化されて蛋白質分解酵素にな
り、それが系列中の次のチモーゲンを選択的に襲い、そ
れによってこれが活性酵素に変るのである。プロセスの
各段階で増幅がおこり、最初は小さかった刺激が究極的
にはかなりの量のフィブリン凝塊を生成する。
凝血の連続段階は二つの別々の径路として始まり、そ
れらは最後は一つになる。一つの径路は血液に固有であ
るが、もう一つの径路は“外因性”といわれている。な
ぜならばその径路は通常は血液中に存在しない凝固因子
によって引き金をひかれるからである。固有の径路は負
傷後の止血に大きな役割を演じる。外因性径路は種々の
病的状態、例えば広汎性内皮損傷，進行癌，内毒素血
（endotoxemia）及び妊娠合併症において活性化され得
る。
れらは最後は一つになる。一つの径路は血液に固有であ
るが、もう一つの径路は“外因性”といわれている。な
ぜならばその径路は通常は血液中に存在しない凝固因子
によって引き金をひかれるからである。固有の径路は負
傷後の止血に大きな役割を演じる。外因性径路は種々の
病的状態、例えば広汎性内皮損傷，進行癌，内毒素血
（endotoxemia）及び妊娠合併症において活性化され得
る。
現在、因子VII,ビタミンＫ−依存血漿凝固因子蛋白質
及び組織因子、通常は血球と結合していない細胞結合蛋
白質が相互作用するとき体内で凝固が開始するというこ
とを示す証拠がかなりある。［例えばネマーソン（Neme
rson）の“血液（Blood）"71巻,1−８ページ,1988参
照］。この相互作用の結果、活性化されたコンプレクス
が生成し、それは酵素活性をもち、他の二つの蛋白質，
因子Ｘ及び因子IXをそれらの酵素的活性型、因子Ｘa及
び因子IXaにそれぞれ変換することによって凝固を開始
する。（一般的には、活性血液凝固因子の前駆物質，即
ちチモーゲンはローマ数字であらわし、その活性型は下
付き文字“a"によって示される。例えば因子Ｘはチモー
ゲンを、因子Ｘaは活性化された因子を表す。
及び組織因子、通常は血球と結合していない細胞結合蛋
白質が相互作用するとき体内で凝固が開始するというこ
とを示す証拠がかなりある。［例えばネマーソン（Neme
rson）の“血液（Blood）"71巻,1−８ページ,1988参
照］。この相互作用の結果、活性化されたコンプレクス
が生成し、それは酵素活性をもち、他の二つの蛋白質，
因子Ｘ及び因子IXをそれらの酵素的活性型、因子Ｘa及
び因子IXaにそれぞれ変換することによって凝固を開始
する。（一般的には、活性血液凝固因子の前駆物質，即
ちチモーゲンはローマ数字であらわし、その活性型は下
付き文字“a"によって示される。例えば因子Ｘはチモー
ゲンを、因子Ｘaは活性化された因子を表す。
組織因子は殆どすべての細胞の表面に存在する血液凝
固促進（procoagulatnt）蛋白質であり、普通は血液と
直接接触することはない。しかし組織因子は種々の薬物
学的仲介物質、例えば腫瘍壊死因子，インターロイキン
−１及び内毒素によって刺激されて内皮細胞及び単球内
に誘発される。外因性凝血径路は、因子VII−ビタミン
Ｋ−依存性セリンプロテアーゼチモーゲンを錯体化し、
活性化する組織因子によって引き金をひかれる。組織因
子による因子VIIの活性化はカルシウムイオンの存在下
でおこり、因子VIIの構造変化に起因すると信じられて
いる。例：ネマーソンら（1982）の“止血の進歩及び血
栓症（Progress in Hemostasis and Thrombosis）"Spae
t,T.H.編,Grune ＆ Stratton,ニューヨーク,6巻,237-26
1ページ；カールソン（Carson）,Prog,Clin.Pathol.9
巻,1−14ページ参照。因子VIIチモーゲンから因子VIIa
活性酵素への変換は、チモーゲンのarg-ileペプチド結
合を切断し、Gla部分を含む軽鎖と酵素活性部位を含む
重鎖とを有する因子VIIaを生成することによって実現す
る。
固促進（procoagulatnt）蛋白質であり、普通は血液と
直接接触することはない。しかし組織因子は種々の薬物
学的仲介物質、例えば腫瘍壊死因子，インターロイキン
−１及び内毒素によって刺激されて内皮細胞及び単球内
に誘発される。外因性凝血径路は、因子VII−ビタミン
Ｋ−依存性セリンプロテアーゼチモーゲンを錯体化し、
活性化する組織因子によって引き金をひかれる。組織因
子による因子VIIの活性化はカルシウムイオンの存在下
でおこり、因子VIIの構造変化に起因すると信じられて
いる。例：ネマーソンら（1982）の“止血の進歩及び血
栓症（Progress in Hemostasis and Thrombosis）"Spae
t,T.H.編,Grune ＆ Stratton,ニューヨーク,6巻,237-26
1ページ；カールソン（Carson）,Prog,Clin.Pathol.9
巻,1−14ページ参照。因子VIIチモーゲンから因子VIIa
活性酵素への変換は、チモーゲンのarg-ileペプチド結
合を切断し、Gla部分を含む軽鎖と酵素活性部位を含む
重鎖とを有する因子VIIaを生成することによって実現す
る。
チモーゲン，因子VIIが凝固促進活性をもつならば、
凝固開始は単純に、通常は因子VIIを組織因子から分離
している物理的障壁の破壊に続いておこるはずである。
こうして、止血がおこるためには、血液凝固を開始する
負傷そのもので十分である。チモーゲンがその誘導酵素
に比較して少量の活性をもつことを決定するには困難を
伴う。というのは、活性チモーゲンは、痕跡量の酵素が
混入した不活性チモーゲンと同じ活性をもつからであ
る。たいていの場合、この問題のアプローチは、単に向
活性部位（active site-divected）酵素阻害剤、例えば
ジイソプロピルフルオロ燐酸（DFP）、或いは適当なク
ロロメチルケトンでチモーゲンを処理し、それにより混
入酵素を阻害するということである。普通チモーゲンは
ほとんど不活性であるから、これは測定可能の活性の完
全な喪失をおこす。しかしながら因子VIIチモーゲンは
それ自体DFPによって容易に阻害され、こうしてこの単
純なアプローチをうまく回避する。実際、因子VIIのDFP
に対する反応性は非常に大きく、このこと自体、因子VI
Iチモーゲンの非常に大きい活性を示唆している。
凝固開始は単純に、通常は因子VIIを組織因子から分離
している物理的障壁の破壊に続いておこるはずである。
こうして、止血がおこるためには、血液凝固を開始する
負傷そのもので十分である。チモーゲンがその誘導酵素
に比較して少量の活性をもつことを決定するには困難を
伴う。というのは、活性チモーゲンは、痕跡量の酵素が
混入した不活性チモーゲンと同じ活性をもつからであ
る。たいていの場合、この問題のアプローチは、単に向
活性部位（active site-divected）酵素阻害剤、例えば
ジイソプロピルフルオロ燐酸（DFP）、或いは適当なク
ロロメチルケトンでチモーゲンを処理し、それにより混
入酵素を阻害するということである。普通チモーゲンは
ほとんど不活性であるから、これは測定可能の活性の完
全な喪失をおこす。しかしながら因子VIIチモーゲンは
それ自体DFPによって容易に阻害され、こうしてこの単
純なアプローチをうまく回避する。実際、因子VIIのDFP
に対する反応性は非常に大きく、このこと自体、因子VI
Iチモーゲンの非常に大きい活性を示唆している。
ウシ因子VII及びVIIaを用いるDFP阻害研究は、因子VI
Iチモーゲンは因子VIIa活性の１％よりわづかに小さい
活性を含むだけとはいえ、因子VIIが定性的には因子VII
aと同じ酵素活性をもつことを示した。DFPはヒト因子VI
Iも阻害することがわかり、その速度は因子VIIaの阻害
速度の３分の１であった。これはウシ蛋白質を用いたと
きに認められた割合とほぼ同じである。例：ネマーソン
の“血液（Blood）"71巻,1−８ページ,1988及びツール
（Zur）ら、J.Biol.clem257巻,5623-5631ページ,1982参
照。
Iチモーゲンは因子VIIa活性の１％よりわづかに小さい
活性を含むだけとはいえ、因子VIIが定性的には因子VII
aと同じ酵素活性をもつことを示した。DFPはヒト因子VI
Iも阻害することがわかり、その速度は因子VIIaの阻害
速度の３分の１であった。これはウシ蛋白質を用いたと
きに認められた割合とほぼ同じである。例：ネマーソン
の“血液（Blood）"71巻,1−８ページ,1988及びツール
（Zur）ら、J.Biol.clem257巻,5623-5631ページ,1982参
照。
実験は、組織因子と因子VIIとの物理的錯体化によっ
て凝固が簡単に開始するという意見を支持している。こ
の考え方を支持するその他の証拠は、ウシ因子VII及びV
IIaはほとんど同じ解離常数をもって組織因子に結合す
るという考察に由来する。ヒト組織因子のソースとして
単球を用いた場合、同じ現象がヒト因子VII及びVIIaで
認められた。従って、蛋白質分解的凝固開始を仮定する
必要はなく、これによって蛋白質分解的事象の無限の退
行の問題は回避される。チモーゲンのこの活性度は概し
て異常で、凝固系において特異であるように見える。因
子VIIの又は実際、因子VIIaの活性は、静かな（quiesce
nt）凝固系と矛盾しない。なぜならば組織因子は存在し
ないときにはそれは凝固の引き金をひくことができない
からである。
て凝固が簡単に開始するという意見を支持している。こ
の考え方を支持するその他の証拠は、ウシ因子VII及びV
IIaはほとんど同じ解離常数をもって組織因子に結合す
るという考察に由来する。ヒト組織因子のソースとして
単球を用いた場合、同じ現象がヒト因子VII及びVIIaで
認められた。従って、蛋白質分解的凝固開始を仮定する
必要はなく、これによって蛋白質分解的事象の無限の退
行の問題は回避される。チモーゲンのこの活性度は概し
て異常で、凝固系において特異であるように見える。因
子VIIの又は実際、因子VIIaの活性は、静かな（quiesce
nt）凝固系と矛盾しない。なぜならば組織因子は存在し
ないときにはそれは凝固の引き金をひくことができない
からである。
固有の反応性をもつため、因子VIIは他のすべての既
知の凝固チモーゲンと区別される。このように因子VII
チモーゲンは酵素活性をもっているから、チモーゲン及
び活性酵素を区別せずに、一緒に言う場合には因子VII
（ａ）という表現を用いる。
知の凝固チモーゲンと区別される。このように因子VII
チモーゲンは酵素活性をもっているから、チモーゲン及
び活性酵素を区別せずに、一緒に言う場合には因子VII
（ａ）という表現を用いる。
組織因子も補因子の中では独特である。というのは凝
固因子Ｖ及びVII並びに凝固連続段階におけるその他の
補因子とは異なり、成熟組織因子の蛋白質は活性をあら
わすためにはそれ以上の処理を必要としないからであ
る。これらの考察をまとめると、血液凝固の開始のため
に組織因子にとって必要なことは、それが因子VIIと物
理的に錯体化することだけであることがし示唆される。
固因子Ｖ及びVII並びに凝固連続段階におけるその他の
補因子とは異なり、成熟組織因子の蛋白質は活性をあら
わすためにはそれ以上の処理を必要としないからであ
る。これらの考察をまとめると、血液凝固の開始のため
に組織因子にとって必要なことは、それが因子VIIと物
理的に錯体化することだけであることがし示唆される。
組織因子は、燐脂質と結合した膜結合−糖蛋白質であ
り通常は循環中に存在しない。血管が破壊されると血漿
凝固因子である因子VIIが組織因子と錯体化することが
でき、それによって触媒的活性種（Apecies）が形成さ
れ、それは固有の径路の成分である因子IX（血漿トロン
ボプラスチン成分）及び外因性、及び固有凝固径路どち
らにも含まれる因子Ｘ［スチュアート（Stuart）因子］
を活性化し、因子IXa及び因子Ｘaが生成する。組織因子
は、血液凝固をモニター且つ研究する診断薬として重要
な臨床的用途をも有する。
り通常は循環中に存在しない。血管が破壊されると血漿
凝固因子である因子VIIが組織因子と錯体化することが
でき、それによって触媒的活性種（Apecies）が形成さ
れ、それは固有の径路の成分である因子IX（血漿トロン
ボプラスチン成分）及び外因性、及び固有凝固径路どち
らにも含まれる因子Ｘ［スチュアート（Stuart）因子］
を活性化し、因子IXa及び因子Ｘaが生成する。組織因子
は、血液凝固をモニター且つ研究する診断薬として重要
な臨床的用途をも有する。
因子VIIは血漿中に痕跡量存在する（約10nM）。因子V
IIが著しく欠乏している人にひどい出血が見られること
は、この蛋白質の生理的重要性を示している。因子VII
欠乏は稀であるが、最近のデータは、欠乏患者の約16％
に普通は死に通づるような脳出血がおこることを示唆し
ている。ラグニ（Ragni）らの“因子VII欠乏（Factor V
II Deficiency）",Amer.J.Hematol.,10巻,79-88ページ
（1981）。他方、因子VIIを正常レベルの５％しかもた
ない患者でもほとんど、又は全く出血症状をおこなさい
ことがある。しかしながら或る一定の因子VIIレベルで
もかなりの臨床的変動性がある。
IIが著しく欠乏している人にひどい出血が見られること
は、この蛋白質の生理的重要性を示している。因子VII
欠乏は稀であるが、最近のデータは、欠乏患者の約16％
に普通は死に通づるような脳出血がおこることを示唆し
ている。ラグニ（Ragni）らの“因子VII欠乏（Factor V
II Deficiency）",Amer.J.Hematol.,10巻,79-88ページ
（1981）。他方、因子VIIを正常レベルの５％しかもた
ない患者でもほとんど、又は全く出血症状をおこなさい
ことがある。しかしながら或る一定の因子VIIレベルで
もかなりの臨床的変動性がある。
種々の病気、例えば癌及び心臓血管病は血管中の凝血
形成の増加と関係がある。心臓血管病の主な治療の中に
は抗凝固剤、例えばワルファリン及び関連薬剤の使用も
含まれる。それらはビタミンＫ−依存性凝血因子（例：
因子II,VII,IX,X）の合成を阻害する。この治療が種々
の血栓塞栓症，肺動脈塞栓症，心筋梗塞（心臓発作）の
発生率を低下させることを示す研究が多数である。しか
しながらワルファリン治療は、時には致命的な出血をか
なり高い発生率でおこす。
形成の増加と関係がある。心臓血管病の主な治療の中に
は抗凝固剤、例えばワルファリン及び関連薬剤の使用も
含まれる。それらはビタミンＫ−依存性凝血因子（例：
因子II,VII,IX,X）の合成を阻害する。この治療が種々
の血栓塞栓症，肺動脈塞栓症，心筋梗塞（心臓発作）の
発生率を低下させることを示す研究が多数である。しか
しながらワルファリン治療は、時には致命的な出血をか
なり高い発生率でおこす。
ワルファリン型抗凝固剤の投与量をモニターする標準
的方法は、クィックone-stageプロトロンビン時間を用
いるこ方法である。静止的条件下で行われるこの試験で
は、患者血漿の試料を37℃にあたためる。それから組織
トロンボプラスチン（粗組織因子）の懸濁液をカルシウ
ムイオンと共に血漿試料に加え、凝固時間を測定する。
正常な凝固時間は12＋／−0.5秒である。この抗凝固剤
の治療的範囲は、凝固時間を正常値の1.2乃至1.5倍の範
囲にする薬剤血中濃度である。このように狭い範囲のた
め、臨床検査では正確さが必要であるが、この正確さに
は達しないことが多い。これらの不正確さの原因は抗凝
固剤のいくつかの出血性副作用にあると考えられてい
る。
的方法は、クィックone-stageプロトロンビン時間を用
いるこ方法である。静止的条件下で行われるこの試験で
は、患者血漿の試料を37℃にあたためる。それから組織
トロンボプラスチン（粗組織因子）の懸濁液をカルシウ
ムイオンと共に血漿試料に加え、凝固時間を測定する。
正常な凝固時間は12＋／−0.5秒である。この抗凝固剤
の治療的範囲は、凝固時間を正常値の1.2乃至1.5倍の範
囲にする薬剤血中濃度である。このように狭い範囲のた
め、臨床検査では正確さが必要であるが、この正確さに
は達しないことが多い。これらの不正確さの原因は抗凝
固剤のいくつかの出血性副作用にあると考えられてい
る。
因子VIIは同様な方法で測ることができる。
患者血漿の希釈液を正常血漿に加え、one-stageプロ
トロンビン時間試験を行う。試験試料中の因子VIIの量
は試験試料の凝固時間を正常血漿の希釈液で得られるそ
れと比較することによって推定される。実際、現在では
凝固系のすべての試験が種々の血漿の凝固時間の測定
（常に静止条件下の試験管中）に基づいている。しかし
ながらin vivoにおける血液凝固は動いている流れの中
でおこるのが常であるから、静止系においては流れが酵
素反応に与える影響を正しく評価することはできない。
トロンビン時間試験を行う。試験試料中の因子VIIの量
は試験試料の凝固時間を正常血漿の希釈液で得られるそ
れと比較することによって推定される。実際、現在では
凝固系のすべての試験が種々の血漿の凝固時間の測定
（常に静止条件下の試験管中）に基づいている。しかし
ながらin vivoにおける血液凝固は動いている流れの中
でおこるのが常であるから、静止系においては流れが酵
素反応に与える影響を正しく評価することはできない。
今では、種々の血液凝固チモーゲンをカルシウムイオ
ンと共に、内面を平らな燐脂質の二重層膜で被覆した管
状ハウジング部分を一定の流速で通すことによって、特
異的血液凝固酵素反応が動的方法でより特異的に行われ
得ることが判明した。任意に、そしてより好ましくは、
その平らな膜が精製組織因子を含んでいる。ハウジング
を通過する試薬は、因子VII又は因子VIIaのどちらか
（それは組織因子と結合して酵素的活性種を形成する）
を、組織因子−因子VII錯化合物の基質となる因子IX又
は因子Ｘと共に含む。因子IXa又は因子Ｘaの産生速度
は、これらの因子のために適した試験法によって容易に
分析される。動的反応は、現在の静的方法によるより
も、活性因子の産生をより特異的に分析することができ
る。
ンと共に、内面を平らな燐脂質の二重層膜で被覆した管
状ハウジング部分を一定の流速で通すことによって、特
異的血液凝固酵素反応が動的方法でより特異的に行われ
得ることが判明した。任意に、そしてより好ましくは、
その平らな膜が精製組織因子を含んでいる。ハウジング
を通過する試薬は、因子VII又は因子VIIaのどちらか
（それは組織因子と結合して酵素的活性種を形成する）
を、組織因子−因子VII錯化合物の基質となる因子IX又
は因子Ｘと共に含む。因子IXa又は因子Ｘaの産生速度
は、これらの因子のために適した試験法によって容易に
分析される。動的反応は、現在の静的方法によるより
も、活性因子の産生をより特異的に分析することができ
る。
更に、例えば患者からの血漿試料をこのような燐脂質
膜被覆デバイスを一定流速で且つ本発明のその他の条件
下で通過させることにより、血漿試料と組織因子含有−
燐脂質膜との接触によって生成する特異的酵素生成物の
測定が可能となり、特異的凝固因子欠乏に関する貴重な
情報が得られ、先行方法によるよりも鋭敏に患者の正し
い抗凝固パラメーターをモニターすることができる。
膜被覆デバイスを一定流速で且つ本発明のその他の条件
下で通過させることにより、血漿試料と組織因子含有−
燐脂質膜との接触によって生成する特異的酵素生成物の
測定が可能となり、特異的凝固因子欠乏に関する貴重な
情報が得られ、先行方法によるよりも鋭敏に患者の正し
い抗凝固パラメーターをモニターすることができる。
発明の酵素リアクターは、血液凝固反応以外の燐脂質
依存性酵素反応を行い、分析するためにも用いられる。
このような反応は、試薬溶液中の種々の不活性の酵素反
応成分が燐脂質二重層膜−被覆−管状ハウジングを通過
して流れることを含む。試薬溶液中の不活性酵素成分は
ハウジングの内面の燐脂質膜と相互作用して酵素的活性
になり、反応産物を溶出液中で分析することができる。
依存性酵素反応を行い、分析するためにも用いられる。
このような反応は、試薬溶液中の種々の不活性の酵素反
応成分が燐脂質二重層膜−被覆−管状ハウジングを通過
して流れることを含む。試薬溶液中の不活性酵素成分は
ハウジングの内面の燐脂質膜と相互作用して酵素的活性
になり、反応産物を溶出液中で分析することができる。
発明の概要 本発明によると、体内に見出されるものと非常に近い
環境において血液凝固反応速度及びその他の燐脂質依存
性酵素反応の速度をin vitroで測定できる動的連続流酵
素リアクターが提供される。本発明によると、種々の凝
固因子の活性化速度、特に因子Ｘから因子Ｘaへの活性
化及び因子IXから因子IXaへの活性化（両方共因子VII又
は因子VIIaを介する）の速度を測定する方法、並びにト
ロンビン産生速度の測定法も提供される。
環境において血液凝固反応速度及びその他の燐脂質依存
性酵素反応の速度をin vitroで測定できる動的連続流酵
素リアクターが提供される。本発明によると、種々の凝
固因子の活性化速度、特に因子Ｘから因子Ｘaへの活性
化及び因子IXから因子IXaへの活性化（両方共因子VII又
は因子VIIaを介する）の速度を測定する方法、並びにト
ロンビン産生速度の測定法も提供される。
図面の簡単な説明 第１図は本発明の一実施態様に従う、因子VIIa及び組
織因子による因子Ｘの活性化を示す。
織因子による因子Ｘの活性化を示す。
第２図は本発明の連続流酵素リアクターの線図であ
る。
る。
第３図は本発明の連続流酵素リアクターの長さ方向の
図である。
図である。
第４図は試薬をリアクターに送り込む手段及び反応溶
出液中のトロンビン及び因子Ｘaを分析する手段に連結
した本発明の連続流酵素反応の線図である。
出液中のトロンビン及び因子Ｘaを分析する手段に連結
した本発明の連続流酵素反応の線図である。
発明の詳細な説明 本発明は、平らな燐脂質の二重層から成り、任意に、
且つより好ましくは酵素又は酵素補因子を含む脂質膜で
内面を被覆した管状ハウジングから成る動的連続流酵素
リアクターに関するものである。管状ハウジングは、特
異的液体試薬をその中に供給する手段に連結可能の一端
をもち、第二の開口はそこからの溶出液を集め分析する
手段に連結可能である。管状ハウジングは、両端が開い
ている、又は開放可能の毛細管であることが好ましい。
且つより好ましくは酵素又は酵素補因子を含む脂質膜で
内面を被覆した管状ハウジングから成る動的連続流酵素
リアクターに関するものである。管状ハウジングは、特
異的液体試薬をその中に供給する手段に連結可能の一端
をもち、第二の開口はそこからの溶出液を集め分析する
手段に連結可能である。管状ハウジングは、両端が開い
ている、又は開放可能の毛細管であることが好ましい。
種々の精製凝固因子又はチモーゲン、又はそれらに代
る血漿をカルシウムと共にポンプで酵素リアクターを通
過させ、燐脂質膜中の酵素又は補因子と反応させる。こ
れらの因子がリアクターに入る時の流速を調節し、リア
クターを出る溶出液中の生成物濃度を測定することによ
って、一連の血漿凝固段階の種々のチモーゲンから活性
生成物への活性化率（速度）を推定し、生成物形成に対
する流れの影響を測定することができる。その上、活性
化種が定常的産生レベルに達するまでの時間も計算でき
る。
る血漿をカルシウムと共にポンプで酵素リアクターを通
過させ、燐脂質膜中の酵素又は補因子と反応させる。こ
れらの因子がリアクターに入る時の流速を調節し、リア
クターを出る溶出液中の生成物濃度を測定することによ
って、一連の血漿凝固段階の種々のチモーゲンから活性
生成物への活性化率（速度）を推定し、生成物形成に対
する流れの影響を測定することができる。その上、活性
化種が定常的産生レベルに達するまでの時間も計算でき
る。
発明の好ましい実施態様によると、燐脂質二重層は、
血液凝固因子の活性化を開始する酵素補因子である精製
組織因子を含む。リアクターを通過する凝固因子は因子
VII又は因子VIIa、並びに因子IX又は因子Ｘである。凝
固因子はカルシウムイオンと共に燐脂質膜−被覆−毛細
管を通過し、管の内面の組織因子含有−燐脂質二重層膜
上を流れる。膜中の組織因子が流動物質中の因子VII又
は因子VIIaに接触するとき毛細管の内側に酵素的活性な
コンプレクスが形成される。この酵素的活性なコンプレ
クスは、これはこれで流動物質中の因子IXを因子IX
aに、又は因子Ｘを因子Ｘaに活性化する。リアクター入
口における因子IX又は因子Ｘ及び因子VII又は因子VIIa
の流速及び濃度を調節し、リアクターからの溶出液中の
因子IXa又は因子Ｘaの濃度をモニターすることによっ
て、因子IXが因子IXaに又は因子Ｘが因子Ｘaに活性化さ
れる速度が計算され、それに対する流れの影響が測定で
きる。その上因子VII又はVIIaの種々の濃度の場合、因
子IXa又は因子Ｘaの定常的産生に達するまでの時間も計
算できる。
血液凝固因子の活性化を開始する酵素補因子である精製
組織因子を含む。リアクターを通過する凝固因子は因子
VII又は因子VIIa、並びに因子IX又は因子Ｘである。凝
固因子はカルシウムイオンと共に燐脂質膜−被覆−毛細
管を通過し、管の内面の組織因子含有−燐脂質二重層膜
上を流れる。膜中の組織因子が流動物質中の因子VII又
は因子VIIaに接触するとき毛細管の内側に酵素的活性な
コンプレクスが形成される。この酵素的活性なコンプレ
クスは、これはこれで流動物質中の因子IXを因子IX
aに、又は因子Ｘを因子Ｘaに活性化する。リアクター入
口における因子IX又は因子Ｘ及び因子VII又は因子VIIa
の流速及び濃度を調節し、リアクターからの溶出液中の
因子IXa又は因子Ｘaの濃度をモニターすることによっ
て、因子IXが因子IXaに又は因子Ｘが因子Ｘaに活性化さ
れる速度が計算され、それに対する流れの影響が測定で
きる。その上因子VII又はVIIaの種々の濃度の場合、因
子IXa又は因子Ｘaの定常的産生に達するまでの時間も計
算できる。
因子VIIは因子VIIaに置き代えることができ、その反
対も可能である。なぜならば既述のように、チモーゲン
の活性は活性酵素の約１％に過ぎないとはいえ、チモー
ゲン因子VIIは定性的にはその活性酵素誘導体である因
子VIIaと同じ血液凝固促進活性を有するからである。ヅ
ールら、J.Biol.Clem.257巻,5623-5631ページ（198
2）；ネマーソン、血液71巻,1−８ページ（1988）。こ
うして因子VIIは前処理して因子VIIaにすることなく、
原材料としてこの酵素リアクターに用いられる。
対も可能である。なぜならば既述のように、チモーゲン
の活性は活性酵素の約１％に過ぎないとはいえ、チモー
ゲン因子VIIは定性的にはその活性酵素誘導体である因
子VIIaと同じ血液凝固促進活性を有するからである。ヅ
ールら、J.Biol.Clem.257巻,5623-5631ページ（198
2）；ネマーソン、血液71巻,1−８ページ（1988）。こ
うして因子VIIは前処理して因子VIIaにすることなく、
原材料としてこの酵素リアクターに用いられる。
本発明のその他の実施態様によると、精製因子VII又
は因子VIIaと、精製凝固因子である因子V,因子VIII,因
子IX及び因子Ｘとの混合物を、プロトロンビンと共に膜
被覆−毛細管に導入する。それからトロンビン産生−，
因子IXa産生−，又は因子Ｘa産生速度を測定し、種々濃
度の各凝固因子のトロンビン−，因子IXa−，又は因子
Ｘa産生に対する影響をモニターすることができる。
は因子VIIaと、精製凝固因子である因子V,因子VIII,因
子IX及び因子Ｘとの混合物を、プロトロンビンと共に膜
被覆−毛細管に導入する。それからトロンビン産生−，
因子IXa産生−，又は因子Ｘa産生速度を測定し、種々濃
度の各凝固因子のトロンビン−，因子IXa−，又は因子
Ｘa産生に対する影響をモニターすることができる。
本発明のもう一つの実施態様によると、血漿を一定の
流速で燐脂質膜−被覆酵素リアクターに導入し、リン脂
質膜中の組織因子との相互作用によって凝固因子の活性
化を開始する。それから選択した因子、例えばIXa,Xa又
はプロトロンビンなどの産生を測定することができる。
この実施態様は、プロトロンビン時間の静的測定によっ
て得られるよりも特異的に凝固形成を評価することがで
き、血液凝固不全患者又は抗凝固剤治療を受けている人
の評価に適用できる。
流速で燐脂質膜−被覆酵素リアクターに導入し、リン脂
質膜中の組織因子との相互作用によって凝固因子の活性
化を開始する。それから選択した因子、例えばIXa,Xa又
はプロトロンビンなどの産生を測定することができる。
この実施態様は、プロトロンビン時間の静的測定によっ
て得られるよりも特異的に凝固形成を評価することがで
き、血液凝固不全患者又は抗凝固剤治療を受けている人
の評価に適用できる。
連続流酵素リアクターの毛細管の大きさは様々で、内
径は約0.10乃至1.10mm,長さは約１乃至15cmである。低
い壁剪断速度（約20sec-1）では生成物の形成は、等式
（L/Q）2/3により、毛細管の大きさに比例する。この式
においてＬは管の長さ、Ｑはリアクターを通る流速で、
この式は拡散調節反応を示している。高剪断速度（100s
ec-1以上）では、拡散はあまり重要でなく、酵素動力学
が主になると考えられる。
径は約0.10乃至1.10mm,長さは約１乃至15cmである。低
い壁剪断速度（約20sec-1）では生成物の形成は、等式
（L/Q）2/3により、毛細管の大きさに比例する。この式
においてＬは管の長さ、Ｑはリアクターを通る流速で、
この式は拡散調節反応を示している。高剪断速度（100s
ec-1以上）では、拡散はあまり重要でなく、酵素動力学
が主になると考えられる。
毛細管は、先ずそれを沸騰洗剤溶液、例えばスパーク
リーンTM（SparkleenTM）に浸し、その後それを超音波
洛中で蒸溜脱イオン水ですすぐことによって準備され
る。それから120℃で乾かし、組織因子を含む脂質小胞
の懸濁液を満たす。それから毛細管に0.14M NaClと1mg/
mlウシ血清アルブミン（BSA）を含む0.01MN−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルフォン酸
（HEPES）緩衝溶液（HClでPHを7.5に調節）をどっと流
す。充填毛細管は最後は緩衝液中に室温で保存し、部材
が空気にさらされないようにする。
リーンTM（SparkleenTM）に浸し、その後それを超音波
洛中で蒸溜脱イオン水ですすぐことによって準備され
る。それから120℃で乾かし、組織因子を含む脂質小胞
の懸濁液を満たす。それから毛細管に0.14M NaClと1mg/
mlウシ血清アルブミン（BSA）を含む0.01MN−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルフォン酸
（HEPES）緩衝溶液（HClでPHを7.5に調節）をどっと流
す。充填毛細管は最後は緩衝液中に室温で保存し、部材
が空気にさらされないようにする。
精製組織因子を含む脂質小胞懸濁液は、好ましくはバ
ッチ（Bach）らの“再構成された燐脂質小胞中の組織因
子に結合する因子VII:ホスファチジルセリンによる協同
性の誘発（Factor VII Binding to Tissue Factor in R
econstituted Phospholipid Vesicles:Induction of Co
operativity by Phosphatidylserine）"Bioclemistry25
巻,4007ページ（1986）に記載の方法によってつくられ
る。この方法は、透析可能の非イオン性洗剤オクチルグ
ルコシッドの大過剰の存在下で組織因子を燐脂質小胞に
挿入する段階を含む。透析により洗剤を除去すると、大
きい燐脂質小胞内に精製組織因子が自然に挿入される。
小胞はホスファチジルセリン又はその他の酸性燐脂質
と、ホスファチジルコリンとの混合物からつくられる。
０乃至40％ホスファチジルセリン（PS）と60乃至100％
ホスファチジルコリン（PC）との混合物を約１乃至10mo
l組織因子対100,000mol燐脂質の比で組織因子と結合さ
せるのが好ましい。
ッチ（Bach）らの“再構成された燐脂質小胞中の組織因
子に結合する因子VII:ホスファチジルセリンによる協同
性の誘発（Factor VII Binding to Tissue Factor in R
econstituted Phospholipid Vesicles:Induction of Co
operativity by Phosphatidylserine）"Bioclemistry25
巻,4007ページ（1986）に記載の方法によってつくられ
る。この方法は、透析可能の非イオン性洗剤オクチルグ
ルコシッドの大過剰の存在下で組織因子を燐脂質小胞に
挿入する段階を含む。透析により洗剤を除去すると、大
きい燐脂質小胞内に精製組織因子が自然に挿入される。
小胞はホスファチジルセリン又はその他の酸性燐脂質
と、ホスファチジルコリンとの混合物からつくられる。
０乃至40％ホスファチジルセリン（PS）と60乃至100％
ホスファチジルコリン（PC）との混合物を約１乃至10mo
l組織因子対100,000mol燐脂質の比で組織因子と結合さ
せるのが好ましい。
精製組織因子は既知の方法でウシ脳又はヒト脳又は胎
盤からつくられ（例えばスパイサー（Spicer）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.84巻,5148-5152ページ，（1987）或い
は1987年６月12日提出のマネーソンらの米国特許出願第
062,166号に提供される組換えDNAクローニング法によっ
てつくられる。
盤からつくられ（例えばスパイサー（Spicer）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.84巻,5148-5152ページ，（1987）或い
は1987年６月12日提出のマネーソンらの米国特許出願第
062,166号に提供される組換えDNAクローニング法によっ
てつくられる。
第２図及び第４図に関しては、酵素リアクターを用い
る場合、毛細管（１）を貯蔵用緩衝液から取出し、カル
シウムイオン溶液と、因子VII又は因子VIIaと、因子V,
因子VIII,因子IX,因子Ｘ及びプロトロンビンから成る精
製凝固因子の中の一つ以上とを含む注射器（３）に連結
する。これらの精製因子は公知の蛋白質分離法によって
得るか、組換えDNAクローニング法によってつくられ
る。ポンプ（４）を用いて溶液を一定速度で毛細管
（１）を通し、種々の凝固因子を組織因子含有−平面燐
脂質膜と反応させる。活性化された酵素生成物を含む溶
出物質を毛細管（１）の出口でコレクタ中に集め分析す
る。
る場合、毛細管（１）を貯蔵用緩衝液から取出し、カル
シウムイオン溶液と、因子VII又は因子VIIaと、因子V,
因子VIII,因子IX,因子Ｘ及びプロトロンビンから成る精
製凝固因子の中の一つ以上とを含む注射器（３）に連結
する。これらの精製因子は公知の蛋白質分離法によって
得るか、組換えDNAクローニング法によってつくられ
る。ポンプ（４）を用いて溶液を一定速度で毛細管
（１）を通し、種々の凝固因子を組織因子含有−平面燐
脂質膜と反応させる。活性化された酵素生成物を含む溶
出物質を毛細管（１）の出口でコレクタ中に集め分析す
る。
それから選択した酵素の産生速度を測定する。因子IX
a又は因子Ｘaの産生速度を測定する一つの方法は、出発
材料としてトリチウム標識化因子IX又は因子Ｘを用い、
その後毛細管溶出液中に生成した酸性溶性トリチウムの
量を測定することである。その他に標準ラジオアッセー
又は蛍光（蛍光発生）アッセー法を用いて本発明のリア
クター中にあらわれる酵素反応の生成物を分析すること
ができる。蛍光アッセーを用いる場合、種々の化学的成
分の相互反応の後に、毛細管溶出液の蛍光を時間の関数
として測定する。
a又は因子Ｘaの産生速度を測定する一つの方法は、出発
材料としてトリチウム標識化因子IX又は因子Ｘを用い、
その後毛細管溶出液中に生成した酸性溶性トリチウムの
量を測定することである。その他に標準ラジオアッセー
又は蛍光（蛍光発生）アッセー法を用いて本発明のリア
クター中にあらわれる酵素反応の生成物を分析すること
ができる。蛍光アッセーを用いる場合、種々の化学的成
分の相互反応の後に、毛細管溶出液の蛍光を時間の関数
として測定する。
所与の酵素の産生速度を測定するもう一つの方法は、
酵素生成物に特異的な色素原基質を酵素リアクターの溶
出液に加え、それからその流れを連続流光度計を通過さ
せるというものである。例えば第４図に示されるように
因子Ｘaの産生速度を測定しようとする場合、色素原基
質S2222 （６）（ロッテンバーグ（Lottenberg）ら、M
eth.Enzymol.80巻,341-361ページ,1981）を溶出液に加
えてから光度計を通過させる。酵素リアクター中で生成
する因子Ｘaの濃度は405nmにおける吸光度の変化によっ
て測定される。或いは、例えばトロンビン産生速度を測
定しようとする場合は、酵素リアクター溶出液が光度計
に入る前に色素原基質S2238 （７）（ロッテンバーグ
ら、Meth.Enzymol.80巻,341-361ページ,1981）をそれに
加える。１種類以上の酵素産生速度を同時に測定しよう
とする場合、酵素リアクターの出口の流れを分け、各流
れに異なる色素原基質を加え別々に吸光度を測定する。
比例ポンプ（８）を用いて流れを混合段階（９）にまで
送り、その後別々の流れは分光光度計（10）及び（11）
に送られる。
酵素生成物に特異的な色素原基質を酵素リアクターの溶
出液に加え、それからその流れを連続流光度計を通過さ
せるというものである。例えば第４図に示されるように
因子Ｘaの産生速度を測定しようとする場合、色素原基
質S2222 （６）（ロッテンバーグ（Lottenberg）ら、M
eth.Enzymol.80巻,341-361ページ,1981）を溶出液に加
えてから光度計を通過させる。酵素リアクター中で生成
する因子Ｘaの濃度は405nmにおける吸光度の変化によっ
て測定される。或いは、例えばトロンビン産生速度を測
定しようとする場合は、酵素リアクター溶出液が光度計
に入る前に色素原基質S2238 （７）（ロッテンバーグ
ら、Meth.Enzymol.80巻,341-361ページ,1981）をそれに
加える。１種類以上の酵素産生速度を同時に測定しよう
とする場合、酵素リアクターの出口の流れを分け、各流
れに異なる色素原基質を加え別々に吸光度を測定する。
比例ポンプ（８）を用いて流れを混合段階（９）にまで
送り、その後別々の流れは分光光度計（10）及び（11）
に送られる。
１種類以上の酵素生成物について測定した濃度レベル
を用いて、これら生成物の各々で定常的産生レベルに達
するまでの時間を計算することができる。分析の目的
で、所与の生成物の定常的産生レベルの1/2に達する時
間（Ｔ1/2）を測定してもよい。これはデータの比較を
より容易にする。今や本発明の連続流酵素リアクターを
用いて得られるこの新しいパラメーター、即ち定常状態
の産生に達するまでの時間は、血液凝固メカニズムの分
析を高める。これに対し、従来の静的凝固アッセイは定
常状態的条件に関する情報を与えることができず、定常
状態に達するための時間に与える流速の影響を評価する
こともできない。
を用いて、これら生成物の各々で定常的産生レベルに達
するまでの時間を計算することができる。分析の目的
で、所与の生成物の定常的産生レベルの1/2に達する時
間（Ｔ1/2）を測定してもよい。これはデータの比較を
より容易にする。今や本発明の連続流酵素リアクターを
用いて得られるこの新しいパラメーター、即ち定常状態
の産生に達するまでの時間は、血液凝固メカニズムの分
析を高める。これに対し、従来の静的凝固アッセイは定
常状態的条件に関する情報を与えることができず、定常
状態に達するための時間に与える流速の影響を評価する
こともできない。
本発明の酵素リアクターは、最低3000sec-1の壁体剪
断速度まで安定である。これは人体の血管系の最大平均
壁体剪断速度、即ち約2000sec-1乃至5000sec-1に匹敵す
る。
断速度まで安定である。これは人体の血管系の最大平均
壁体剪断速度、即ち約2000sec-1乃至5000sec-1に匹敵す
る。
以下の非制限的実施例は本発明をより詳しく説明する
ためのものである。
ためのものである。
実施例１ 米国特許出願第062,166号に記載の組換えDNAクローニ
ング法によってつくられるか或いはスパイサーらがPro
c.Natl.Acad.Sci.84巻,5184-5152,1987に記載したよう
にウシ脳又はヒト脳又は胎盤粉末から公知の蛋白質分離
法によって得られる精製組織因子を含む燐脂質小胞は次
の方法で作成される。CHCl3中でPS及びPCを0:100（PS:P
C）から40:60（PS:PC）までのモル比で一つにし、Ｎ2気
流下、次いで真空中で２時間乾燥し、硼珪素ガラス管壁
に薄いフィルムを形成する。それから0.1M NaCl及び0.0
5Mトリス、PH7.5（TBS）中に溶かした15倍過剰モルのオ
クチルグルコシッド（200mM）を加え、混合物を時々攪
拌しながら完全に透明になるまで室温でインキュベート
した。
ング法によってつくられるか或いはスパイサーらがPro
c.Natl.Acad.Sci.84巻,5184-5152,1987に記載したよう
にウシ脳又はヒト脳又は胎盤粉末から公知の蛋白質分離
法によって得られる精製組織因子を含む燐脂質小胞は次
の方法で作成される。CHCl3中でPS及びPCを0:100（PS:P
C）から40:60（PS:PC）までのモル比で一つにし、Ｎ2気
流下、次いで真空中で２時間乾燥し、硼珪素ガラス管壁
に薄いフィルムを形成する。それから0.1M NaCl及び0.0
5Mトリス、PH7.5（TBS）中に溶かした15倍過剰モルのオ
クチルグルコシッド（200mM）を加え、混合物を時々攪
拌しながら完全に透明になるまで室温でインキュベート
した。
0.1％トライトン ×−100を含むTBS中の精製組織因
子を燐脂質−オクチルグルコシッド標本に加え、トライ
トン ×−100濃度が＜0.02％，組織因子：燐脂質：オ
クチルグルコシッドのモル比が１乃至10:100,000:1,50
0,000,である最終溶液を形成した。
子を燐脂質−オクチルグルコシッド標本に加え、トライ
トン ×−100濃度が＜0.02％，組織因子：燐脂質：オ
クチルグルコシッドのモル比が１乃至10:100,000:1,50
0,000,である最終溶液を形成した。
最終物質中の蛋白質及び燐脂質を正確に定量するため
に、痕跡量の［14Ｃ］PC及び3Ｈ−組織因子を加えた。3
Ｈ組カウント対14Ｃカウントの比は約10乃至100対１で
あった（組織因子濃度に依って）。液体シンチレーショ
ン計算法のために一部をとり、残りを室温で３×１リッ
トルのTBSに対して72乃至96時間透析した。その後その
物質をセファロース CL-2Bカラム（1.5×55cm）でTBS
中で室温でゲル濾過した。3Ｈ−組織因子及び14Ｃ−燐
脂質の回収を液体シンチレーショ計数法で測定した。生
成懸濁液は2mMPS/PC脂質小胞と20乃至200nM組織因子と
から成っていた。
に、痕跡量の［14Ｃ］PC及び3Ｈ−組織因子を加えた。3
Ｈ組カウント対14Ｃカウントの比は約10乃至100対１で
あった（組織因子濃度に依って）。液体シンチレーショ
ン計算法のために一部をとり、残りを室温で３×１リッ
トルのTBSに対して72乃至96時間透析した。その後その
物質をセファロース CL-2Bカラム（1.5×55cm）でTBS
中で室温でゲル濾過した。3Ｈ−組織因子及び14Ｃ−燐
脂質の回収を液体シンチレーショ計数法で測定した。生
成懸濁液は2mMPS/PC脂質小胞と20乃至200nM組織因子と
から成っていた。
標準ガラス毛細管を準備するたに、先ずそれらを1gス
パークリーンTM/500ml蒸溜，脱イオン水の沸騰洗剤溶液
に30分間浸し、それらを超音波溶中で蒸溜，脱イオン水
で５分間づつ３回、合計15分間すすいだ。それから毛細
管を120℃で30分間乾かし、組織因子を含むPS/PC脂質小
胞の調製懸濁液を充填した。10分後管にHEPES/アルブミ
ン緩衝液（0.01MHEPES,0.14NaCl,1mg/mlBSA,HClを用い
てPHを7.5に調節する）を流し込み、その緩衝液に浸し
て保存し、脂質膜と空気との接触を阻止する。
パークリーンTM/500ml蒸溜，脱イオン水の沸騰洗剤溶液
に30分間浸し、それらを超音波溶中で蒸溜，脱イオン水
で５分間づつ３回、合計15分間すすいだ。それから毛細
管を120℃で30分間乾かし、組織因子を含むPS/PC脂質小
胞の調製懸濁液を充填した。10分後管にHEPES/アルブミ
ン緩衝液（0.01MHEPES,0.14NaCl,1mg/mlBSA,HClを用い
てPHを7.5に調節する）を流し込み、その緩衝液に浸し
て保存し、脂質膜と空気との接触を阻止する。
実施例２ 実施例１に期した方法によって作成し、被覆した毛細
管（I.D.＝0.56mm,L＝75mm）を因子VIIaの種々の溶液、
100nMトリチウム標識因子Ｘ及び5nM CaCl2を含む注射器
に連結した。精密ポンプを用いて、溶液を27.1μl/min
の一定の流速で毛細管を通す。管を出る流れについて生
成した酸溶出トリチウムの量を測定することによって、
因子Ｘaの産生及び濃度を分析した。定常状態における
結果を１表に示す。
管（I.D.＝0.56mm,L＝75mm）を因子VIIaの種々の溶液、
100nMトリチウム標識因子Ｘ及び5nM CaCl2を含む注射器
に連結した。精密ポンプを用いて、溶液を27.1μl/min
の一定の流速で毛細管を通す。管を出る流れについて生
成した酸溶出トリチウムの量を測定することによって、
因子Ｘaの産生及び濃度を分析した。定常状態における
結果を１表に示す。
表からわかるように、生成した因子Ｘaの濃度は定常
状態では因子VIIa濃度に無関係である。しかしながら第
１図は、上記四濃度の因子VIIaに対して、時間の経過と
共に生成する因子Ｘaの量を説明している。因子Ｘaが定
常状態に達するまでの時間は因子VIIaの濃度とは逆関係
に変化することが判った。その他に、因子VIIを同じ条
件下で用いても同様な結果を与えた。即ち、因子VIIの
濃度が減少するにつれて、定常状態に達するまでの時間
は増加した。因子VIIの濃度0.1nMでは、因子Ｘaの定常
状態濃度は10.6nMであった。
状態では因子VIIa濃度に無関係である。しかしながら第
１図は、上記四濃度の因子VIIaに対して、時間の経過と
共に生成する因子Ｘaの量を説明している。因子Ｘaが定
常状態に達するまでの時間は因子VIIaの濃度とは逆関係
に変化することが判った。その他に、因子VIIを同じ条
件下で用いても同様な結果を与えた。即ち、因子VIIの
濃度が減少するにつれて、定常状態に達するまでの時間
は増加した。因子VIIの濃度0.1nMでは、因子Ｘaの定常
状態濃度は10.6nMであった。
因子Ｘaの産生が定常状態に行く過程は除々であった
から、因子ＸaのＴ1/2を計算した。第１図では、Ｔ1/2
は因子VIIa0.5-10nM濃度から得られ、約４分であること
がわかる。これらの因子VIIa濃度は人体の正常な因子VI
I濃度の５乃至100％に相当する一方、体内の因子VII濃
度が５％以下の場合はひどい出血がおこるのが普通であ
る。第１図に示されるように、因子VIIa濃度が0.1nM
（正常の１％）及び0.075nM（正常の0.75％）に低下す
るにつれて、Ｔ1/2は著しく増加する。この実施例で発
生した壁体剪断速度はヒト静脈系のそれ、例えば約20乃
至40sec1-に近かった。
から、因子ＸaのＴ1/2を計算した。第１図では、Ｔ1/2
は因子VIIa0.5-10nM濃度から得られ、約４分であること
がわかる。これらの因子VIIa濃度は人体の正常な因子VI
I濃度の５乃至100％に相当する一方、体内の因子VII濃
度が５％以下の場合はひどい出血がおこるのが普通であ
る。第１図に示されるように、因子VIIa濃度が0.1nM
（正常の１％）及び0.075nM（正常の0.75％）に低下す
るにつれて、Ｔ1/2は著しく増加する。この実施例で発
生した壁体剪断速度はヒト静脈系のそれ、例えば約20乃
至40sec1-に近かった。
実施例３ 毛細管の大きさ及び流速が異なる以外は、実施例２と
同じ実験条件を実施した。毛細血管の内径0.33mm及び長
さ125mmの場合の結果を２表に示す。
同じ実験条件を実施した。毛細血管の内径0.33mm及び長
さ125mmの場合の結果を２表に示す。
低い流速（200μl/min）では、壁体剪断速度計算値は
856sec-1であった。これは小動脈で得られる平均壁体剪
断速度と、微小循環で得られるそれとの中間である。40
0μl/minでは、得られた壁体剪断速度は1712sec-1であ
り、微小循環の速度に近い。このように、酵素リアクタ
ーは生理的範囲に匹敵する剪断速度に対して明らかに安
定的であった。よって、凝固系の種々の異常の影響を、
静脈系から微小循環までに互る流れ条件下で評価するこ
とができる。
856sec-1であった。これは小動脈で得られる平均壁体剪
断速度と、微小循環で得られるそれとの中間である。40
0μl/minでは、得られた壁体剪断速度は1712sec-1であ
り、微小循環の速度に近い。このように、酵素リアクタ
ーは生理的範囲に匹敵する剪断速度に対して明らかに安
定的であった。よって、凝固系の種々の異常の影響を、
静脈系から微小循環までに互る流れ条件下で評価するこ
とができる。
内径約0.10mm乃至1.10mm、長さ約1.0乃至15cmの範囲
の毛細管が容認されることがわかった。管直径の変化は
産生する生成物の量を変えるが発明の基礎的メカニズム
を変えることはないことがわかった。
の毛細管が容認されることがわかった。管直径の変化は
産生する生成物の量を変えるが発明の基礎的メカニズム
を変えることはないことがわかった。
上の実施例は、本発明の連続流酵素リアクターを用い
て得ることができるデータの型を示す。これは公知の静
的方法を用いては得られないデータの型である。上記は
発明の範囲を制限するものではない。なぜならばここに
請求する酵素リアクターを用いてトロンビン生成速度、
全血漿中の凝固因子の産生及びその他種々の燐脂質依存
性酵素反応を測定することができる。
て得ることができるデータの型を示す。これは公知の静
的方法を用いては得られないデータの型である。上記は
発明の範囲を制限するものではない。なぜならばここに
請求する酵素リアクターを用いてトロンビン生成速度、
全血漿中の凝固因子の産生及びその他種々の燐脂質依存
性酵素反応を測定することができる。
Claims (24)
- 【請求項１】燐脂質依存性酵素反応を行い、分析するた
めの動的連続流酵素リアクターであって、内面を平らな
燐脂質二重層膜で被覆した管状部材から成り、そのハウ
ジングは第一の開口が液体流試薬をそこに供給するため
の手段と連結可能で、第二の開口がそこからの溶出液を
集め、分析するための手段と連結可能である動的連続流
酵素リアクター。 - 【請求項２】ハウジングが毛細管である請求の範囲１記
載の酵素リアクター。 - 【請求項３】ハウジングが、内径約0.1乃至1.1mm、長さ
約1.0乃至15cmを有する請求の範囲１記載の酵素リアク
ター。 - 【請求項４】燐脂質膜が、酵素と酵素補因子とから成る
群から選択される最低１つの付加的成分を含んで成る請
求の範囲１記載の酵素リアクター。 - 【請求項５】補因子が組織因子である請求の範囲４記載
の酵素リアクター。 - 【請求項６】燐脂質膜が中性及び酸性燐脂質を含んで成
る請求の範囲１記載の酵素リアクター。 - 【請求項７】燐脂質膜がホスファチジルコリン及びホス
ファチジルセリンを含んで成る請求の範囲１記載の酵素
リアクター。 - 【請求項８】燐脂質膜が60乃至100％ホスファチジルコ
リンと０乃至40％ホスファチジルセリンとの混合物から
成る請求の範囲１記載の酵素リアクター。 - 【請求項９】燐脂質膜が70％ホスファチジルコリンと30
％ホスファチジルセリンとの混合物から成る請求の範囲
１記載の酵素リアクター。 - 【請求項１０】燐脂質膜が組織因子を、100,000mole燐
脂質に対し約１乃至10mole組織因子の割合で含む請求の
範囲５記載の酵素リアクター。 - 【請求項１１】（ａ） 酵素反応を行うための試薬を定
められた流速で、内面を平らな燐脂質二重層膜で被覆し
た管状部材から成る動的連続的酵素流リアクターの入口
に供給し、試薬及び膜成分は、別々では酵素反応の遂行
に対して不活性であるが一緒になると酵素的活性系を形
成し、 （ｂ） 試薬を定められた一定流速で酵素リアクターに
送り込み、試薬と燐脂質膜との接触によって媒介される
酵素反応が酵素リアクター中でおこり、 （ｃ） 溶出液中の酵素反応産物を酵素リアクターの出
口から集め、 （ｄ） 酵素反応中に生成する生成物の量を適当な試験
法によって測定する、 諸段階から成る動的酵素反応を連続的に行い測定する方
法。 - 【請求項１２】燐脂質膜がその他に、酵素と酵素補因子
から成る群から選択される最低一つの付加的成分を含ん
で成る請求の範囲11記載の方法。 - 【請求項１３】補因子が組織因子である請求の範囲12記
載の方法。 - 【請求項１４】試薬が血液凝固因子とカルシウムイオン
を含んで成る請求の範囲13記載の方法。 - 【請求項１５】血液凝固因子が、因子VII及び因子VIIa
から成る群から選択される血液凝固因子を、因子IX,因
子X,因子V,因子VIII,プロトロンビン及び全血から成る
群から選択される最低一つの因子と共に含んで成る請求
の範囲14記載の方法。 - 【請求項１６】血液凝固因子が因子VII及び因子IXであ
る請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項１７】血液凝固因子が因子VIIa及び因子IXであ
る請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項１８】血液凝固因子が因子VII及び因子Ｘであ
る請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項１９】血液凝固因子が因子VIIa及び因子Ｘであ
る請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項２０】血液凝固因子が因子VII,因子X,因子Ｖ及
びプロトロンビンである請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項２１】血液凝固因子が因子VIIa，因子X,因子Ｖ
及びプロトロンビンである請求の範囲14記載の方法。 - 【請求項２２】生成物量を測定する試験法が、ラジオア
ッセイ，色素発生試験，蛍光発生試験から成る群から選
択される請求の範囲11記載の方法。 - 【請求項２３】更に、生成した産物量を測定する前に反
応産物に特異的な色素発生又は蛍光発生基質を溶出液に
加えることを含んで成る請求の範囲11記載の方法。 - 【請求項２４】更に、酵素リアクター中で生成する一つ
以上の生成物の量を測定できるように、酵素リアクター
からの生成物溶出液を分割することを含んで成る請求の
範囲11記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/154,083 US4865984A (en) | 1988-02-08 | 1988-02-08 | Dynamic continuous flow enzyme reactor |
| US154,083 | 1988-02-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02503057A JPH02503057A (ja) | 1990-09-27 |
| JP2756606B2 true JP2756606B2 (ja) | 1998-05-25 |
Family
ID=22549933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1502293A Expired - Lifetime JP2756606B2 (ja) | 1988-02-08 | 1989-02-01 | 動的連続流酵素リアクター |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4865984A (ja) |
| EP (1) | EP0353291B1 (ja) |
| JP (1) | JP2756606B2 (ja) |
| AU (1) | AU607661B2 (ja) |
| CA (1) | CA1282361C (ja) |
| DK (1) | DK494989A (ja) |
| FI (1) | FI90254C (ja) |
| WO (1) | WO1989007133A2 (ja) |
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| GB9022938D0 (en) * | 1990-10-22 | 1990-12-05 | Biocompatibles Ltd | Non-thrombogenic surfaces |
| US6203816B1 (en) * | 1990-11-13 | 2001-03-20 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| US5314695A (en) † | 1990-11-13 | 1994-05-24 | Corvas International, Inc. | Tissue factor based prothrombin time reagent |
| DK0565665T3 (da) * | 1991-10-04 | 1998-09-28 | Dade Behring Inc | Fremstilling af prothrombin-tidsreagenser ud fra rekombinant human faktor og syntetiske phospholipider |
| US6114135A (en) * | 1991-11-08 | 2000-09-05 | Goldstein; Sheldon | Multiple coagulation test system and method of using a multiple coagulation test system |
| US5366869A (en) * | 1991-11-08 | 1994-11-22 | Sheldon Goldstein | Multiple coagulation test device and method |
| CA2165412A1 (en) * | 1994-04-28 | 1995-10-29 | Barry John Woodhams | Calibrator for prothrombin time (pt) assays |
| US5731212A (en) * | 1994-12-20 | 1998-03-24 | International Technidyne Corporation | Test apparatus and method for testing cuvette accommodated samples |
| US20030232075A1 (en) * | 2002-05-06 | 2003-12-18 | University Of Minnesota, A Minnesota Corporation | Compositions for producing factor Xa |
| WO2006088741A2 (en) * | 2005-02-16 | 2006-08-24 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Procoagulants based on metal-chelating lipids |
| CA2600907C (en) * | 2005-03-04 | 2016-06-28 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Coagulation and fibrinolytic cascades modulator |
| WO2009046194A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Fibrin sealant |
| US20100297257A1 (en) * | 2007-11-09 | 2010-11-25 | National Institutes Of Health (Nih), U.S. Dept. Of Health And Human Services (Dhhs) | Anticoagulant antagonist and hemophillia procoagulant |
| US8372343B2 (en) | 2007-12-07 | 2013-02-12 | Sheldon Goldstein | Multiple coagulation test cartridge and method of using same |
| CN101903807B (zh) | 2007-12-20 | 2013-01-09 | 诺瓦提斯公司 | 隐形眼镜的制造方法 |
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| US10429377B1 (en) | 2019-03-15 | 2019-10-01 | Coagulation Sciences Llc | Coagulation test device, system, and method of use |
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1988
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-
1989
- 1989-02-01 AU AU30604/89A patent/AU607661B2/en not_active Ceased
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