JP2749387B2 - High-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer - Google Patents
High-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometerInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物発光又は化学発光による可視領域から
赤外に至る極微弱な自然発光のスペクトル分析を顕微鏡
による像サイズで行うことができる明るい小型の操作性
に優れた高感度多波長顕微分光装置に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention provides a bright image that can be used to perform microscopic image analysis of a very weak spontaneous luminescence ranging from a visible region to an infrared region due to bioluminescence or chemiluminescence using a microscope. The present invention relates to a small-sized high-sensitivity multi-wavelength microspectroscope with excellent operability.
顕微多波長分光装置は、従来より、顕微鏡的な大きさ
の試料の吸収分光特性等を測定し、それによりその試料
中に含まれる吸収物質等を量的あるいは質的に調べる装
置として使用されており、最近は、生物発光、化学発
光、励起光による極微弱蛍光等を呈する微小物体からの
極微弱発光の分光特性を測定する装置としても開発され
てきている。これらのなかで、励起光の試料による吸収
分光特性や反射分光特性を求めるものとして、回折格子
を用いた分光器を利用した顕微分光測光法やフーリエ変
換分光器を利用した顕微測定用フーリエ変換分光法が実
用化されている。これらは、励起光の各波長当り強度の
数桁下の強度を検出できれば分光特性が求められ、たと
え測定困難な試料でも励起光を強くしたり、試料濃度を
希釈すれば測定可能であるため、極微弱光を超高感度で
検出できる最高感度の測定系を必要としない。2. Description of the Related Art Micro-wavelength spectroscopy has been used as a device for measuring absorption spectroscopic characteristics of a sample having a microscopic size, and thereby quantitatively or qualitatively examining an absorption substance contained in the sample. Recently, it has been developed as a device for measuring the spectral characteristics of extremely weak luminescence from a minute object exhibiting very weak fluorescence due to bioluminescence, chemiluminescence, excitation light or the like. Among them, microspectrophotometry using a spectroscope using a diffraction grating and Fourier transform spectroscopy for microscopic measurements using a Fourier transform spectrometer are used to determine the absorption spectral characteristics and reflection spectral characteristics of the excitation light by the sample. The law has been put to practical use. These require spectral characteristics if the intensity can be detected several orders of magnitude lower than the intensity per wavelength of the excitation light, and even if the sample is difficult to measure, it can be measured by increasing the excitation light or diluting the sample concentration. There is no need for a measurement system with the highest sensitivity that can detect extremely weak light with ultra-high sensitivity.
一方、励起光による試料からの顕微鏡下での蛍光やラ
マン散乱の測定は、細胞内カルシウムの濃度測定用とし
ての顕微蛍光法や、干渉計を採用したフーリエ変換分光
法による顕微蛍光分光法、さらに顕微鏡下でのマイクロ
ラマン分光法として実用化されている。しかしながら、
蛍光やラマン散乱は、試料の吸収分光特性を求めるため
透過光を測定するのに比較してはるかに弱い光を検出す
るため、できる限り明るい顕微分光が要求される。On the other hand, the measurement of fluorescence and Raman scattering under a microscope from a sample by excitation light is performed by a microfluorescence method for measuring the concentration of intracellular calcium, a microfluorescence spectroscopy using a Fourier transform spectroscopy employing an interferometer, and Practical as micro-Raman spectroscopy under a microscope. However,
Fluorescence and Raman scattering require much brighter microspectroscopy to detect light that is much weaker than measuring transmitted light to determine the absorption spectral characteristics of a sample.
さらに、生物からの極微弱な発光の生物フォトンや化
学発光のような励起光のない発光の分光もできる限り明
るい顕微分光が要求される。すなわち、顕微蛍光分光や
顕微ラマン分光、顕微発光分光は、いずれも微小部分の
発光を顕微鏡で拡大して分光を行うため、拡大に逆比例
して光量は少なくなる。したがって、拡大率を大きくす
るにつれてますます顕微分光は困難となる。そこで、高
感度な顕微分光装置が要求される。Furthermore, the spectroscopy of light without excitation light, such as biological photons or chemiluminescence, which emit extremely weak light from living organisms, is required to be as bright as possible. In other words, microscopic fluorescence spectroscopy, microscopic Raman spectroscopy, and microscopic emission spectroscopy all perform microscopic spectroscopy by enlarging the light emission of a microscopic portion, so that the amount of light decreases in inverse proportion to the magnification. Therefore, microspectroscopy becomes more and more difficult as the magnification is increased. Therefore, a highly sensitive microspectroscope is required.
しかし、このような極微弱光の分光を顕微鏡下で行う
ためには、できるだけ光の損失を少なくして測定するこ
とが望ましい。そのためには、光束利用率（スループッ
ト）を大きくするために出射立体角を大きくとれる光学
系にして、一度に多数の波長の光を測定する同時測光の
優位性を有する検出系がよい。すなわち、コリメーター
系、集光系とも明るい光学系を採用するとともに、波長
走査を行わないで同時に多波長のスペクトル分析ができ
るポリクロメーターの設計思想をとり入れた高感度多波
長分光装置が必要である。しかしながら、従来の分光装
置にあってはこの要求を満足するものはなかった。However, in order to perform such ultra-slight light spectroscopy under a microscope, it is desirable to perform measurement with as small a light loss as possible. To this end, an optical system capable of increasing the solid angle of emission in order to increase the light flux utilization rate (throughput) is preferable, and a detection system having the advantage of simultaneous photometry for measuring light of many wavelengths at a time is preferable. In other words, there is a need for a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer that employs a bright optical system for both the collimator system and the condensing system and incorporates the design concept of a polychromator that can simultaneously perform multi-wavelength spectrum analysis without performing wavelength scanning. . However, none of the conventional spectrometers satisfy this requirement.
すなわち、従来の回折格子を用いた分光器は、基本的
にモノクロメーターであるため、入射スリットと出射ス
リットが必須であり、そのため波長走査が必要となり、
そのとき出射スリット以外の光は捨ててしまっているた
め同時測光の優位性はない。また、出射面にスペクトル
分布を検出する１次元又は２次元光分布検出器を配する
構成となっていないため、単に出射スリットをはずして
検出器をつけただけでは、焦点面の問題、収差の問題が
ありうまくいかない。そして、コリメーター系、集光系
ともに反射鏡を軸外しで用いているため、収差によるス
ペクトル線像の曲がりが生じ、Ｆナンバーはあまり小さ
くできず、分光器の明るさには限界があり、Ｆ＝３以下
のものは実用化されていなかった。このような従来の分
光器の反射鏡として放物面鏡を用いて、Ｆ＝１の分光器
が最近開発された。しかしながら、集光鏡（放物面鏡）
を軸外しの状態で用いているため、スペクトル線像が曲
がってしまい、１次元又は２次元光分布検出器を配置し
て正確なスペクトル分布を求めることは困難であるとい
う大きな問題の他、高感度で検出器を用いるため検出面
を冷却する必要が生じ、そのため検出面の結露を防ぐた
めの手段として、１次元又は２次元光分布検出器の光電
面の前面に比較的厚さのある断熱用の真空チャンバーを
配置しなければならないことから生じる、集光用の放物
面鏡の焦点距離を長くしなければならないという問題が
ある。さらに、凹面回折格子を用い、検出器としてアレ
イ状の検出器を用いたポリクロメーターが最近販売され
たが、凹面回折格子の直径、曲率半径に限界があるた
め、明るさに限界があり不充分である。一方、極微弱発
光の分光分析のために、三画コモンパス干渉計、四角コ
モンパス干渉計、複屈折偏光干渉計等を用いた静止型干
渉分光法を利用することが提案されているが、その後の
検討の結果、発光試料面の面積がとれるので、分光器よ
り明るいとの指摘に疑問が出てきた。また、これらの干
渉計においては、従来の分光器より明るい光学系を採用
しているが、これは鏡の代わりにより明るいレンズを使
用していることによるものであり、干渉計の特性ではな
い。そして、回折格子の横幅より検出器アレイの横幅が
小さい現状では、これらの幅の大きさがそれぞれの分光
システムの分解能を決定するものであるところから、静
止型干渉分光法の分解能は分光器より悪く、また、エネ
ルギーの点からは、分光器の場合、入射スリットの幅を
広げると分解能は悪くなる代わりにエネルギーはかせげ
るが、静止型干渉分光法ではこのようなことはできな
い。That is, since a conventional spectroscope using a diffraction grating is basically a monochromator, an entrance slit and an exit slit are indispensable, so wavelength scanning is required,
At that time, light other than the exit slit is discarded, so there is no advantage in simultaneous photometry. Further, since a one-dimensional or two-dimensional light distribution detector for detecting a spectrum distribution is not arranged on the exit surface, simply removing the exit slit and attaching the detector will cause problems with the focal plane and aberration. There is a problem and it does not work. In addition, since both the collimator system and the condensing system use the reflecting mirror off-axis, the spectral line image is bent due to aberrations, the F-number cannot be reduced too much, and the brightness of the spectroscope is limited, Those with F = 3 or less have not been put to practical use. A spectroscope with F = 1 has recently been developed using a parabolic mirror as a reflecting mirror of such a conventional spectroscope. However, focusing mirrors (parabolic mirrors)
Is used off-axis, the spectral line image is bent, and it is difficult to obtain an accurate spectral distribution by arranging a one-dimensional or two-dimensional light distribution detector. The use of a detector with sensitivity requires the detection surface to be cooled, and as a means of preventing dew condensation on the detection surface, a relatively thick thermal insulation is provided in front of the photoelectric surface of the one-dimensional or two-dimensional light distribution detector. There is a problem that the focal length of the concentrating parabolic mirror must be increased, which arises from the necessity of disposing a vacuum chamber for focusing. Furthermore, a polychromator using a concave diffraction grating and an array of detectors as a detector has recently been sold, but the diameter and curvature radius of the concave diffraction grating are limited, so the brightness is limited and insufficient. It is. On the other hand, for spectroscopic analysis of extremely weak light emission, it has been proposed to use a static interferometer using a three-image common-pass interferometer, a square common-pass interferometer, a birefringent polarization interferometer, etc. As a result of the investigation, it was pointed out that it was brighter than a spectroscope because the area of the luminescent sample surface could be taken. Also, these interferometers employ optical systems that are brighter than conventional spectrometers, but this is due to the use of brighter lenses instead of mirrors, not the characteristics of interferometers. In the current situation where the width of the detector array is smaller than the width of the diffraction grating, since the size of these widths determines the resolution of each spectroscopic system, the resolution of static interferometry is higher than that of the spectrometer. In terms of energy, and in terms of energy, in the case of a spectroscope, increasing the width of the entrance slit increases the energy instead of deteriorating the resolution, but this is not possible with static interferometry.
そして、例えば、従来のレーザーラマン分光装置と顕
微鏡とを組み合わせ、１μｍ程度の局所領域のラマン分
光スペクトルを測定できるようにしたものとして、第11
図に示したブロック構成図を有する顕微ラマンシステム
が開発されているが、この顕微ラマンシステムは顕微鏡
部分とレーザーラマン分光装置部分との結合機構が複雑
になっている。Then, for example, a combination of a conventional laser Raman spectrometer and a microscope is used to measure a Raman spectrum of a local region of about 1 μm.
Although a micro-Raman system having the block diagram shown in the figure has been developed, the micro-Raman system has a complicated coupling mechanism between a microscope portion and a laser Raman spectroscopy device portion.
以上のとおりの現状であるため、従来の分光器ないし
分光法を用いて、生物発光又は化学発光を呈する微小物
体からの極微弱発光の分光分析、特に同時に多波長のス
ペクトル分布を求めることは困難であった。As described above, it is difficult to use a conventional spectroscope or spectroscopy to perform spectral analysis of extremely weak luminescence from a minute object exhibiting bioluminescence or chemiluminescence, and particularly to obtain a multi-wavelength spectral distribution at the same time. Met.
したがって、本発明の目的は、上記した従来の分光器
ないし分光法を用いた顕微分光装置の欠点を克服し、極
めて明るく、小型で、生物発光又は化学発光による極微
弱な自然発光のスペクトル分布を波長走査なしに同時に
求めることができるポリクロメーターの技術思想による
新規な高感度多波長分光装置を用いた高感度顕微多波長
分光装置を提供することである。Accordingly, an object of the present invention is to overcome the above-mentioned drawbacks of the conventional spectroscope or microspectroscope using spectroscopy, and to obtain an extremely bright, small, and extremely weak spontaneous emission spectrum due to bioluminescence or chemiluminescence. An object of the present invention is to provide a high-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer using a novel high-sensitivity multi-wavelength spectrometer based on the technical idea of a polychromator which can be obtained simultaneously without wavelength scanning.
本発明の高感度顕微多波長分光装置は、試料の拡大像
を形成する顕微鏡光学系と、試料の拡大像の微小領域又
はある程度の広がりのある領域からの光を点状ないし線
状に限定して射出する光学系、この限定して射出する光
学系の点状ないし線状の射出端を焦点としそこから出る
光をとり入力れて平行にする明るいコリメーターレン
ズ、コリメーターレンズによって平行にされた光であっ
て法線に対して角度をなして入射された光を回折して分
光する反射型回折格子、反射型回折格子によって分光さ
れた平行光を像面上にスペクトル像として結像する結像
レンズ、及び、結像レンズの像面上に配置された高感度
１次元又は２次元光検出器からなる高感度多波長分光装
置とから構成され、生物発光又は化学発光による極微弱
な自然発光の分光検出のために用いられ、前記反射型回
折格子としてブレーズド回折格子を用い、前記高感度多
波長分光装置の各構成要素を、反射型回折格子への入射
角の絶対値が反射型回折格子からの回折角の絶対値より
小さく、その入射角を正としたときにその回折角が負と
なるような配置であって、−１次の回折光をスペクトル
像としてとり出し可能な配置にしたことを特徴とするも
のである。The high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer of the present invention is a microscope optical system that forms an enlarged image of a sample, and restricts light from a microscopic region or a region having a certain extent of the enlarged image of the sample to a point-like or linear shape. The collimating lens is a collimator lens that focuses on the point-like or linear exit end of this limited-emission optical system, takes light emitted therefrom, and collimates it. Reflection grating that diffracts and splits light that is incident at an angle to the normal line, and forms parallel light that is split by the reflection grating as a spectral image on an image plane. An imaging lens, and a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer including a high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector arranged on the image plane of the imaging lens, and a very weak natural light due to bioluminescence or chemiluminescence. Emission spectral detection A blazed diffraction grating is used as the reflection type diffraction grating, and each component of the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer is used to determine the absolute value of the incident angle to the reflection type diffraction grating by the diffraction angle from the reflection type diffraction grating. Is smaller than the absolute value of the incident angle, and the diffraction angle is negative when the incident angle is positive, and the arrangement is such that the −1st-order diffracted light can be extracted as a spectral image. Is what you do.
この場合、高感度多波長分光装置において、試料の拡
大像の微小領域又はある程度の広がりのある領域からの
光を点状ないし線状に限定して射出する光学系として、
スリットないしピンホールを用いてもよいし、光コンセ
ントレイターを用いてもよい。In this case, in a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer, as an optical system that emits light from a small region or a region having a certain extent of an enlarged image of a sample in a point-like or linear manner,
A slit or a pinhole may be used, or an optical concentrator may be used.
さらに、上記のような高感度多波長分光装置の高感度
１次元又は２次元光検出器を除いた分光器を同種又は種
類を異ならして２以上多段に配置し、加分散又は差分散
の配列にすることにより、数回回折光を利用して、角分
散を制御することにより、より分解能を向上させた高感
度多波長分光装置にすることができる。Further, two or more spectrometers of the same type or different types except for the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector of the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer described above are arranged in two or more stages, and an arrangement of additive dispersion or differential dispersion. By controlling the angular dispersion by using the diffracted light several times, a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer with further improved resolution can be obtained.
本発明の高感度顕微多波長分光装置に用いられる高感
度多波長分光装置においては、特に、生物発光又は化学
発光による極微弱な自然発光の分光検出のために用いら
れる高感度多波長分光装置であり、試料の拡大像の微小
領域又はある程度の広がりのある領域からの光を点状な
いし線状に限定して射出する光学系が、顕微鏡光学系に
よって形成された試料の拡大像からの光を点状又は線状
光源としてコリメータレンズに入射させ、コリメータレ
ンズは試料の拡大像からの光を漏れなく平行度の高い平
行光線にして反射型回折格子の法線に対して角度をなし
て入射させる。したがって、反射型回折格子はその分解
能を十分に発揮するとともに生物発光又は化学発光によ
る極微弱光を分光するようになる。また、コリメータレ
ンズと結像レンズとは、反射型回折格子に極近接して配
置できるので、装置の小型化が実現できる。そして、コ
リメータレンズと結像レンズとして、Ｆナンバーが可能
な限り小さい明るいレンズを使用することができるの
で、両レンズの合成系となる高感度多波長分光装置全体
の明るさを十分に大きくすることができ、高感度１次元
又は２次元光検出器と組み合わせることにより、生物発
光又は化学発光による極微弱な自然発光の同時多波長分
析が可能になり、特に、生物発光、化学発光を利用した
生体、微量成分の研究手段として有効なものとなる。In the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used in the high-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer of the present invention, in particular, a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used for spectral detection of extremely weak spontaneous emission due to bioluminescence or chemiluminescence is used. There is an optical system that restricts and emits light from a small area or a certain spread area of an enlarged image of a sample to a point or a line, and emits light from an enlarged image of the sample formed by a microscope optical system. A collimator lens is incident on the collimator lens as a point-like or linear light source, and the collimator lens converts the light from the enlarged image of the sample into parallel rays with high parallelism without leakage and enters the collimator lens at an angle to the normal line of the reflection type diffraction grating. . Therefore, the reflection type diffraction grating sufficiently exhibits its resolution and separates extremely weak light due to bioluminescence or chemiluminescence. Further, since the collimator lens and the imaging lens can be arranged very close to the reflection type diffraction grating, the size of the apparatus can be reduced. Since a bright lens having an F-number as small as possible can be used as the collimator lens and the imaging lens, it is necessary to sufficiently increase the brightness of the entire high-sensitivity multi-wavelength spectroscopic device which is a combined system of the two lenses. In combination with a highly sensitive one-dimensional or two-dimensional photodetector, simultaneous multi-wavelength analysis of extremely weak spontaneous luminescence by bioluminescence or chemiluminescence becomes possible. It is effective as a research tool for trace components.
また、特に、高感度多波長分光装置の各構成要素を、
反射型回折格子への入射角の絶対値が反射型回折格子か
らの回折角の絶対値より小さく、その入射角を正とした
ときにその回折角が負となるような配置であって、−１
次の回折光をスペクトル像としてとり出し可能な配置に
したので、結像レンズが損失少なくより多くの回折光を
結像させるので、生物発光又は化学発光による極微弱な
自然発光の分光検出に適している。Also, in particular, each component of the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer is
An arrangement in which the absolute value of the angle of incidence on the reflection type diffraction grating is smaller than the absolute value of the diffraction angle from the reflection type diffraction grating, and the diffraction angle is negative when the incident angle is positive, 1
Since the next diffracted light is arranged to be able to be taken out as a spectral image, the imaging lens forms more diffracted light with less loss, so it is suitable for spectral detection of extremely weak spontaneous emission due to bioluminescence or chemiluminescence. ing.
本発明の高感度顕微多波長分光装置は、顕微鏡光学系
と多波長分光装置を組み合わせていて、その顕微鏡光学
系自体は、従来の顕微分光装置と同様に、対物レンズと
接眼レンズないし結像レンズからなる種々の態様の顕微
鏡光学系を使用することができる。しかしながら、従来
のものより明るく高感度な分光装置をしかも多波長同時
検出装置として用いている。The high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectroscope of the present invention combines a microscope optical system and a multi-wavelength spectroscope, and the microscope optical system itself includes an objective lens and an eyepiece lens or an imaging lens similarly to the conventional microspectroscope. Various types of microscope optics can be used. However, a spectroscope that is brighter and more sensitive than the conventional one is used as a multi-wavelength simultaneous detection device.
すなわち、多波長分光装置において、生物発光、化学
発光、励起光による極微弱蛍光等の極微弱光を分光分析
するためには、顕微鏡光学系によって拡大された試料の
発光点からの光を可能な限り多く分光系に入射させるよ
うに光学系を選択する必要がある。そのため、光学系が
極微弱光発光点を見込む立体角を可能な限り大きくする
必要がある。一方、分光系によって分光されたスペクト
ル線像は可能な限り直線状に結像されなければならな
い。このような要求を満足する光学系としては、現在の
ところ光学ガラスレンズの組み合わせからなるＦナンバ
ーの小さい光学レンズしかない。光学レンズにおいて
は、収差のないＦナンバーが１以下のものも容易に入手
できる。したがって、本発明に用いる高感度多波長分光
装置においては、このようなＦナンバーの小さい光学レ
ンズを用いる。そして、この光学レンズによって平行に
された光束を分光する分光系として反射型の回折格子を
用い、さらに、回折された光を結像して、スペクトル分
布像を与えるためにも明るい光学レンズを用い、その像
面にスペクトル強度分布像を電気的に検出する高感度１
次元又は２次元光検出器を配置して、各波長の光強度を
同時に検出する。That is, in a multi-wavelength spectrometer, in order to spectrally analyze weak light such as bioluminescence, chemiluminescence, and weak fluorescence due to excitation light, light from the emission point of the sample enlarged by the microscope optical system can be used. It is necessary to select an optical system so that the light enters the spectral system as much as possible. Therefore, it is necessary to make the solid angle at which the optical system looks at the very weak light emission point as large as possible. On the other hand, the spectral line image separated by the spectral system must be formed as linearly as possible. As an optical system that satisfies such a demand, at present, there is only an optical lens having a small F number which is a combination of optical glass lenses. Optical lenses having an aberration-free F number of 1 or less can be easily obtained. Therefore, in the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used in the present invention, such an optical lens having a small F-number is used. Then, a reflection type diffraction grating is used as a spectral system for dispersing the light beam collimated by this optical lens, and a bright optical lens is used to form an image of the diffracted light to give a spectrum distribution image. High sensitivity 1 for electrically detecting a spectrum intensity distribution image on its image plane
A two-dimensional or two-dimensional photodetector is arranged to simultaneously detect the light intensity of each wavelength.
第１図は、本発明の高感度顕微多波長分光装置の全体
の構成の１例を示したものである。この図面に示した高
感度顕微多波長分光装置は、試料Ｓの拡大像を形成する
顕微鏡光学系Ｉと、その拡大像の分光すべき部分からの
光を分光検出する分光検出光学系（高感度多波長分光装
置）IIとからなっており、その顕微鏡光学系Ｉは、試料
Ｓの照明光源（図示せず。試料自身が極微弱光を発生す
る場合には必要ない。）、試料載置台（図示せず）、像
側焦点F1を有する対物レンズ系１、及び、像側焦点F2を
有する接眼レンズ系２からなっている。この顕微鏡光学
系Ｉにおいては、試料Ｓの中間像Saが対物レンズ系１に
より、対物レンズ系の像側焦点F1から距離l1の位置に結
像し、さらに、その拡大像Sbが接眼レンズ系２により、
接眼レンズ系の像側焦点F2から距離l2の位置に形成され
るようになっている。FIG. 1 shows an example of the overall configuration of a high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer of the present invention. The high-sensitivity microscope and multi-wavelength spectroscope shown in this drawing includes a microscope optical system I for forming an enlarged image of a sample S and a spectral detection optical system (high-sensitivity) for spectrally detecting light from a portion of the enlarged image to be split. The microscope optical system I includes an illumination light source for the sample S (not shown; it is not necessary when the sample itself generates extremely weak light), and a sample mounting table ( not shown), an objective lens system 1 having an image-side focal point F 1, and consists of eyepiece system 2 having an image-side focal point F 2. In the microscope optical system I, the intermediate image Sa is the objective lens system 1 of the sample S, and imaged from the image side focal point F 1 of the objective lens system at a distance l 1, further enlarged image Sb eyepiece By system 2,
And it is formed from the image side focal point F 2 of the eyepiece system at a distance l 2.
第１図の顕微鏡光学系Ｉは発光試料又は吸収試料を分
析する際に用いるものであるが、第２図に示した本発明
の高感度顕微多波長分光装置のように、試料Ｓの励起用
光源Lsを備え、励起用光源Lsにより照射された試料Ｓの
蛍光、ラマン放射光等の拡大像を形成するようにしても
よい。これにより、局所領域の試料の蛍光分析、ラマン
分析等をすることが可能となる。この場合、励起用光源
Lsとしては、蛍光分析、ラマン分析等に使用する公知の
励起用光源を用いることができるが、特に、波長固定の
レーザーや波長選択可能なものが使用できる。The microscope optical system I shown in FIG. 1 is used for analyzing a light-emitting sample or an absorption sample. However, like the high-sensitivity micro-multiwavelength spectrometer of the present invention shown in FIG. A light source Ls may be provided to form an enlarged image of fluorescence, Raman emission light, and the like of the sample S irradiated by the excitation light source Ls. This makes it possible to perform a fluorescence analysis, a Raman analysis, and the like of the sample in the local region. In this case, the excitation light source
As Ls, a known excitation light source used for fluorescence analysis, Raman analysis, or the like can be used. In particular, a fixed wavelength laser or a wavelength selectable laser can be used.
分光検出光学系IIは、このような顕微鏡光学系Ｉによ
り形成された試料Ｓの拡大像Sbの微小領域又はある程度
の広がりのある領域からの光を点状ないし線状に限定し
て射出する光学系３、この点状ないし線状に限定された
位置を焦点とし、そこから出る光を可能な限り多くとり
入れて平行にするＦナンバーの小さいコリメーターレン
ズ４、コリメーターレンズ４によって平行にされた光を
回折して分光する反射型回折格子５、及び、反射型回折
格子５によって分光された平行光を像面Ｐ上にスペクト
ル像として結像する結像レンズ６からなる分光器と、ス
ペクトル像面上に配置された高感度１次元又は２次元光
検出器７とから構成されているものである。高感度１次
元又は２次元光検出器７の出力側にはコンピュータ８が
接続されていて、それからの出力に基づいてスペクトル
分析を行う。なお、反射型回折格子５は、検出スペクト
ル範囲を調整するために、点Ｃを中心として、図示した
矢印のように回転調節可能に構成されている。The spectral detection optical system II is an optical system that emits light from a small area or a somewhat wide area of the enlarged image Sb of the sample S formed by such a microscope optical system I in a point-like or linear manner. The system 3 is focused by this point or linearly limited position, and is collimated by a collimator lens 4 having a small F-number and a collimator lens 4 which takes in as much light as possible from the point and makes it parallel. A spectroscope including a reflection type diffraction grating 5 for diffracting and splitting light, and an imaging lens 6 for forming parallel light separated by the reflection type diffraction grating 5 on the image plane P as a spectrum image; And a high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7 arranged on the surface. A computer 8 is connected to the output side of the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7, and performs spectrum analysis based on the output from the computer. The reflection type diffraction grating 5 is configured to be rotatable about the point C as indicated by an arrow in order to adjust the detection spectrum range.
この場合、拡大像Sbの微小領域又はある程度の広がり
のある領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系
３としては、試料の拡大像Sbの微小領域又はある程度の
広がりのある領域からの光を点状あるいは線状にしてと
り出せるものであれば特に制限はない。例えば、第３図
に示した分光検出光学系IIのように、拡大像Sbの像面上
にピンホール又はスリット3aを配置し、拡大像Sbからの
光を絞るようにしてもよいし、あるいは、第４図に示し
た分光検出光学系IIのように、拡大像Sbからの光を集光
窓から集光し、点状又は線状の射出端に射出する光コン
セントレイター3bにより構成してもよい。In this case, as the optical system 3 that emits light by limiting the minute area of the enlarged image Sb or the area having a certain degree of spread to a point or a line, the optical system 3 may be formed from a small area of the enlarged image Sb of the sample or an area having a certain degree of spread. There is no particular limitation as long as the light can be extracted in the form of dots or lines. For example, as in the spectral detection optical system II shown in FIG. 3, a pinhole or a slit 3a may be arranged on the image plane of the enlarged image Sb, and the light from the enlarged image Sb may be reduced. As in the case of the spectral detection optical system II shown in FIG. 4, the light from the enlarged image Sb is condensed from a condensing window, and is constituted by an optical concentrator 3b which emits the light to a point-like or linear emission end. Is also good.
ただし、拡大像Sbの微小領域又はある程度の広がりの
ある領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系３
の大きさは、穴の大きさにより、例えば直径Ｄの丸穴と
したとき、λ/Dの回折角の広がった光束として分光器の
方に入射する。すなわち、拡大像Sbの空間分解能を高め
るため、穴の直径Ｄを小さくすると回折角は大きくな
り、広がった光束となって分光器に入射する。一方、穴
の直径Ｄを大きくすると、回折角は小さくなり、顕微鏡
のレンズ系で決まる広がり角の光束になるため、光束の
損失は少ないが、空間分解は悪くなる。空間分解と試料
の発光により、光学系３の直径を選択することが、感度
をよくする上で考慮する必要がある。However, an optical system 3 that limits the minute area of the enlarged image Sb or an area having a certain extent to a point or a line and emits it.
Depending on the size of the hole, for example, when a round hole having a diameter D is formed, the light is incident on the spectroscope as a light beam having a wide diffraction angle of λ / D. That is, when the diameter D of the hole is reduced in order to increase the spatial resolution of the enlarged image Sb, the diffraction angle increases, and the light flux becomes a spread light and enters the spectroscope. On the other hand, when the diameter D of the hole is increased, the diffraction angle becomes smaller, and the luminous flux has a divergent angle determined by the lens system of the microscope. Therefore, the loss of the luminous flux is small, but the spatial resolution is poor. It is necessary to consider the selection of the diameter of the optical system 3 based on the spatial resolution and the emission of the sample in order to improve the sensitivity.
このような、高感度多波長分光装置IIにあっては、回
折格子５の格子間隔をｄ、回折格子４への入射角をｉ、
回折格子５からの回折角をβ、波長をλ、回折次数をｍ
とすると、 sin i＋sinβ＝ｍλ/d の関係を満足するように、試料Ｓの拡大像Sbからの極微
弱な入射光が回折され、高感度１次元又は２次元光検出
器７上にスペクトル分光された像が結像されるので、高
感度１次元又は２次元光検出器７からの出力をコンピュ
ータ８によって分析し、その像の座標とその点の像強度
を求めることによって、生物発光、化学発光、励起光に
よる極微弱蛍光等を呈する微小物体からの極微弱発光の
分光特性を同時に測定することができる。ところで、上
記式において、ｍ＝−１の関係を満足させるように、結
像レンズ６及び高感度１次元又は２次元光検出器７を配
置する基本タイプ（−１次斜入射分光型）と、ｍ＝＋１
の関係を満足させるように、結像レンズ６及び高感度１
次元又は２次元光検出器７を配置する基本タイプ（＋１
次斜入射分光型）とがある。第５図（ａ）に−１次斜入
射分光型を、第５図（ｂ）に＋１次斜入射分光型を示
す。これらの場合、反射型回折格子４としてはブレーズ
ド回折格子を用い、図示のように配置する。In such a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer II, the grating interval of the diffraction grating 5 is d, the incident angle on the diffraction grating 4 is i,
The diffraction angle from the diffraction grating 5 is β, the wavelength is λ, and the diffraction order is m.
Then, the extremely weak incident light from the enlarged image Sb of the sample S is diffracted so as to satisfy the relationship of sin i + sin β = mλ / d, and is spectrally separated on the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7. The output from the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7 is analyzed by the computer 8, and the coordinates of the image and the image intensity at that point are obtained. In addition, it is possible to simultaneously measure the spectral characteristics of extremely weak light emission from a minute object exhibiting extremely weak fluorescence or the like due to excitation light. By the way, in the above formula, a basic type (−1st-order oblique incidence spectral type) in which the imaging lens 6 and the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7 are arranged so as to satisfy the relationship of m = −1, m = + 1
The imaging lens 6 and the high-sensitivity 1
Basic type (+1) in which a two-dimensional or two-dimensional photodetector 7 is arranged
(Next oblique incidence spectral type). FIG. 5A shows the -1st-order oblique incidence spectral type, and FIG. 5B shows the + 1st-order oblique incidence spectral type. In these cases, a blazed diffraction grating is used as the reflection type diffraction grating 4 and is arranged as shown.
第５図（ａ）の−１次斜入射分光型及び第５図（ｂ）
の＋１次斜入射分光型分光器におけるコリメーターレン
ズ４と結像レンズ６の口径の関係を考えてみる。第６図
（ａ）は−１次斜入射分光型について検討するための光
路図であるが、コリメーターレンズ４の直径をDi、回折
格子の幅をｌ、中心波長の回折角をβce、結像レンズ６
の直径をDoとすると、 Di＝lcosi Do＝lsin（2/π−βce）＝lcosβce ところで、このタイプの場合、光検出器７に有効に光
が達するためには、ｉ＜βceであるから、 Di＞Do の条件を満足するように結像レンズ６の口径を選ぶこと
が必要である。同じようにして、第６図（ｂ）の＋１次
斜入射分光型について検討すると、 Di＝lcosi Do＝lcosβce このタイプの場合、光検出器７に有効に光が達するた
めには、ｉ＞βceであるから、 Di＜Do の条件を満足するように結像レンズ６の口径を選ぶこと
が必要である。この検討に基づいて、分光すべき光の種
類に応じて何れのタイプを選択すべきかを検討する。−
１次斜入射分光型は、ブレーズド回折格子を第６図
（ａ）に示したように、短い回折面にも入射光が当たる
ように配置しなければならないため、この面から反射光
が生じて迷光となり、バックグラウンド光を増加させ
る。これに対して、＋１次斜入射分光型は、第６図
（ｂ）に示すように、ブレーズド回折格子の短い回折面
には光が当たらないように回折格子が配置されるため、
迷光は生じないが、上記したように結像レンズ６の口径
がコリメーターレンズ４のそれより大きい必要がある。
ところが、本発明に用いる高感度多波長分光装置におい
ては、コリメーターレンズ４の口径は可能な限り大きな
ものであるので、それ以上の口径のレンズを結像レンズ
として用いることは困難である。したがって、＋１次斜
入射分光型のものは、結像レンズ６としてコリメーター
レンズ４の口径程度のものを用いる場合、損失の大きい
ものということができる。以上のとおりであるから、生
物発光、化学発光のような極微弱な自然発光の分光検出
のためには、−１次斜入射分光型のものが適していると
言える。これに対して、迷光の影響が重大なラマン散
乱、蛍光等の励起光による極微弱発光の分光において
は、多少のロスはあっても、迷光が信号光を隠さない＋
１次斜入射分光型のものがより適していると言える。な
お、当然ながら、レンズの設計において、自由にコリメ
ーターレンズ、結像レンズの口径、Ｆナンバーが実現で
きるなら、生物発光、化学発光のような極微弱な自然発
光の分光検出のためにも、＋１次斜入射分光型のものが
より優れていると言うことができる。また、分解能をよ
くする必要があるときも、＋１次斜入射分光型のものが
よい。FIG. 5 (a) is a -1st-order oblique incidence spectral type and FIG. 5 (b)
Consider the relationship between the aperture of the collimator lens 4 and the diameter of the imaging lens 6 in the + 1st-order oblique incidence spectroscope. Figure 6 (a) is an optical path diagram for examine -1 Tsugihasu incident spectral type, diameter D i of the collimator lens 4, the width of the diffraction grating l, the diffraction angle of the center wavelength beta ce , Imaging lens 6
Let D o be the diameter of D i = D cos i D o = L sin (2 / π−β ce ) = L cos β ce In this type, light effectively reaches the photodetector 7. Since i <β ce , it is necessary to select the aperture of the imaging lens 6 so as to satisfy the condition of D i > D o . In the same manner, when examining the + 1st-order oblique-incidence spectroscopy type shown in FIG. 6 (b), in this type, light effectively reaches the photodetector 7 in the case of this type: D i = l cos i D o = l cos β ce Therefore, the since it is i> beta ce, it is necessary to choose the diameter of the imaging lens 6 so as to satisfy the condition D i <D o. Based on this study, it is examined which type should be selected according to the type of light to be split. −
In the first-order oblique incidence spectral type, as shown in FIG. 6 (a), the blazed diffraction grating must be arranged so that incident light also impinges on a short diffraction surface, and reflected light is generated from this surface. It becomes stray light and increases background light. On the other hand, in the + 1st-order oblique incidence spectral type, as shown in FIG. 6B, the diffraction grating is arranged so that light does not hit the short diffraction surface of the blazed diffraction grating.
Although no stray light is generated, the aperture of the imaging lens 6 needs to be larger than that of the collimator lens 4 as described above.
However, in the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used in the present invention, since the aperture of the collimator lens 4 is as large as possible, it is difficult to use a lens having a larger aperture as the imaging lens. Therefore, the + 1st-order oblique-incidence spectral type can be said to have a large loss when the imaging lens 6 having a diameter of about the collimator lens 4 is used. As described above, it can be said that the -1st-order oblique incidence spectral type is suitable for spectral detection of extremely weak spontaneous emission such as bioluminescence and chemiluminescence. On the other hand, in the spectroscopy of extremely weak light emission due to excitation light such as Raman scattering and fluorescence in which the influence of stray light is significant, the stray light does not hide the signal light even though there is some loss.
It can be said that the primary oblique incidence spectral type is more suitable. Naturally, if the aperture of the collimator lens and the imaging lens and the f-number can be freely realized in the lens design, the spectral detection of extremely weak spontaneous luminescence such as bioluminescence and chemiluminescence is also possible. It can be said that the + 1st-order oblique incidence type is superior. When it is necessary to improve the resolution, a + 1st-order oblique incidence spectral type is also preferable.
なお、コリメーターレンズ４、結像レンズ６として
は、球面レンズからなるＦナンバーの小さいレンズだけ
ではなく、非球面レンズ、フレネルレンズを用いてもよ
い。In addition, as the collimator lens 4 and the imaging lens 6, not only a lens having a small F number made of a spherical lens but also an aspherical lens or a Fresnel lens may be used.
このような高感度多波長分光装置IIにより試料の拡大
像Sbからの光を分光分析するに際しては、上記第１〜３
図に示したように、結像レンズ６から射出する回折光が
０次光以外に−１次光、＋１次光等の光を含むので、さ
きに述べたように適当な次数の回折光の中心波長が高感
度１次元又は２次元光検出器７の中心にくるように結像
レンズ６を配置するとともに、回折格子５の角度を調節
する。When the light from the enlarged image Sb of the sample is spectrally analyzed by such a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer II, the first to third light sources are used.
As shown in the figure, since the diffracted light emitted from the imaging lens 6 includes light such as -1 order light and +1 order light in addition to the 0 order light, as described above, the diffracted light of an appropriate order The imaging lens 6 is arranged so that the center wavelength is located at the center of the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7, and the angle of the diffraction grating 5 is adjusted.
ところで、高感度多波長分光装置IIについて、第１図
に示した基本タイプの変形として、コリメーターレンズ
と結像レンズとを１つのレンズによって兼用させる分光
装置が考えられる。第７図（ａ）に示すように、反射型
回折格子５の前面にＦナンバーの小さいコリメーター・
結像兼用レンズ９を平行に配置し、この兼用レンズ９の
焦点に入射スリット３を位置させ、回折格子５による回
折光の兼用レンズ９による像位置に高感度１次元又は２
次元光検出器７を配置して、試料からの光を垂直に入射
させるものである（垂直入射分光型）。入射スリット３
と高感度１次元又は２次元光検出器７との配置位置を交
換して、第７図（ｂ）のように試料からの光を斜め方向
から入射させるように配置してもよい（斜入射分光
型）。図の（ｂ）の斜入射分光型のものが、図の（ａ）
の垂直入射分光型のものより、回折光の角度分解能に優
れており、光束利用では、図の（ａ）の垂直入射分光型
のものが優れている。By the way, regarding the high-sensitivity multi-wavelength spectroscopic device II, as a modification of the basic type shown in FIG. 1, a spectroscopic device in which a collimator lens and an imaging lens are shared by one lens is considered. As shown in FIG. 7 (a), a collimator having a small F-number is provided in front of the reflection type diffraction grating 5.
An image forming / combining lens 9 is arranged in parallel, the entrance slit 3 is positioned at the focal point of the functioning lens 9, and a high sensitivity one-dimensional or 2
The two-dimensional photodetector 7 is arranged so that light from a sample is vertically incident (perpendicular incidence spectral type). Entrance slit 3
And the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7 may be exchanged so that the light from the sample is incident obliquely as shown in FIG. 7B (oblique incidence). Spectral type). The oblique-incidence spectral type shown in FIG.
Are superior in the angular resolution of the diffracted light than those of the vertical incidence spectral type, and the vertical incident spectral type shown in FIG.
また、高感度１次元又は２次元光検出器７としては、
第８図に示したように、２次元光子計数管と低残像ビジ
コンを組み合わせたもの（VIMS）、第９図のような光子
計数型画像計測装置（PIAS）、さらには、ダイオード光
検出器をアレー状に並べたアレー光検出器、CCD等が含
まれる。In addition, as the high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7,
As shown in FIG. 8, a combination of a two-dimensional photon counter and a low image persistence vidicon (VIMS), a photon counting type image measurement device (PIAS) as shown in FIG. 9, and a diode photodetector It includes an array photodetector, CCD, etc. arranged in an array.
この中のVIMSとPIASについて、簡単に説明すると、第
８図において、２次元光子計数管21の光電面22に入射し
た光子は光電子に変換され、この光電子はメッシュ23、
電子レンズ24を経て２段接続のマイクロチヤンネルプレ
ート（MCP）25に入射して増幅され、出射面の蛍光面26
に当って輝点を形成する。この輝点はレンズ27によって
低残像ビジコン28の光電面に結像し、ビジコン28の出力
から光子が対応する輝点の２次元の位置がパルス信号と
し求められるので、この輝点の分布を得ることによって
極微弱光スペクトル分布画像が求められる。Briefly explaining the VIMS and PIAS among them, in FIG. 8, the photons incident on the photocathode 22 of the two-dimensional photon counter 21 are converted into photoelectrons.
The light is incident on a two-stage connected microchannel plate (MCP) 25 through an electron lens 24 and is amplified.
To form a bright spot. These bright spots are imaged by the lens 27 on the photocathode of the low afterimage vidicon 28, and the two-dimensional position of the bright spot corresponding to the photon is determined as a pulse signal from the output of the vidicon 28, so that the distribution of the bright spots is obtained. Thus, a very weak light spectrum distribution image is obtained.
また、第９図のPIASにおいては、光電面22からMCP25
に至るまでの構成は第８図のものと同様であり（もっと
も、第９図のMCP25は３段接続である）、MCP25から出る
電子群はその後に配置されたシリコン半導***置検出器
（PSD）29に入射し、電子衝撃効果によってさらに増幅
され、パルス信号としてPSD29から出力される。PSD29は
その周辺に４個の信号出力電極30を持つ電荷分配型の位
置検出器であり、PSD29内部で発生した電荷は、表面の
抵抗層を経てこれら４個の電極30にその発生位置に応じ
て分配される。この結果、PSD29に入射する電子群の重
心位置すなわち、輝点位置に対応する信号が４個の電極
30から得られる。PSD29から得られるパルス信号はアン
プ32で増幅された後、位置演算装置31に導かれる。ここ
で、これらパルス信号を積分回路33で積分して各電極30
からの電荷量を求める。次に、これらの信号を加減算回
路34に導き、ウィンドゲート35を介して除算器36に導い
て位置信号に変換し、AD変換器37でAD変換して出力す
る。この出力信号を処理して輝点の分布を求め、極微弱
光スペクトル分布画像を得ることができる。なお、第８
図、第９図において、符号L0は入射光子（矢印）を光電
面22上に結像させる対物レンズを示している。In the PIAS shown in FIG. 9, the MCP 25
The configuration up to is the same as that of FIG. 8 (although the MCP25 in FIG. 9 is a three-stage connection), and the electron group exiting from the MCP25 is a silicon semiconductor position detector (PSD) disposed thereafter. It is incident on 29 and further amplified by the electron impact effect, and is output from PSD 29 as a pulse signal. The PSD 29 is a charge distribution type position detector having four signal output electrodes 30 around it, and the charges generated inside the PSD 29 pass through the surface resistive layer and are applied to these four electrodes 30 according to the positions where they are generated. Distributed. As a result, the signal corresponding to the position of the center of gravity of the electron group incident on the PSD 29, that is, the position of the bright spot, is output by four electrodes.
Obtained from 30. The pulse signal obtained from the PSD 29 is amplified by the amplifier 32 and then guided to the position calculation device 31. Here, these pulse signals are integrated by an integrating circuit 33 and each electrode 30
From the charge. Next, these signals are guided to an addition / subtraction circuit 34, and then to a divider 36 via a window gate 35, where they are converted into position signals, and AD-converted by an AD converter 37 to be output. By processing this output signal, the distribution of the bright spots is obtained, and a very weak light spectrum distribution image can be obtained. The eighth
In FIG. 9 and FIG. 9, reference numeral L 0 denotes an objective lens that forms an incident photon (arrow) on the photocathode 22.
ところで、高感度多波長分光装置IIとして、第１〜７
図に示したものに限らず、分光器を２以上多段に配置し
て、角分散を数回回折光を利用して加分散配列にするこ
とにより、全体の分解能を向上させたものを用いること
もできる。もちろん、差分散の配列もできる。このよう
な多重多波長分光装置の構成例を第10図に示す。図中
（ａ）は、第５図（ａ）の−１次斜入射分光型分光器A1
〜A4を４段直列に配列して、全体として方形に構成した
ものであり、同じく（ｂ）のものは、第５図（ｂ）の＋
１次斜入射分光型分光器A1〜A4を４段直列に配列して、
全体として方形に構成したものであり、（ｃ）のもの
は、＋１次斜入射分光型分光器A1〜A3を３段直列に配列
して構成したものである。なお、段数は上記に限られる
ものではない。By the way, as the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer II, the first to the seventh are as follows.
Not only the one shown in the figure, but also one in which the overall resolution is improved by arranging two or more spectrometers in multiple stages and making the angular dispersion several times using diffracted light to make an additive dispersion arrangement Can also. Of course, an array of difference variances is also possible. FIG. 10 shows a configuration example of such a multiplex multi-wavelength spectrometer. FIG. 5A shows the -1st-order oblique incidence spectrometer A 1 shown in FIG. 5A.
To A 4 by arranging the four stages in series, which is configured into a square as a whole, those also of (b), the fifth view of (b) +
Primary oblique incidence spectrometers A 1 to A 4 are arranged in four stages in series,
Overall are those configured in a square, which is constituted by arranging things, a + 1 Tsugihasu incidence spectroscope spectroscope A 1 to A 3 in three stages in series (c). The number of stages is not limited to the above.
以上のように、本発明の高感度顕微鏡多波長分光装置
において、拡大像Sbの微小領域又はある程度の広がりの
ある領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系
３、Ｆナンバーの小さいコリメータレンズ４、反射型回
折格子５、結像レンズ６、高感度１次元又は２次元光検
出器７を有する高感度多波長分光装置IIは、生物発光、
化学発光、励起光による極微弱蛍光等を呈する微小物体
の拡大像Sbからの極微弱光の分光分析に際して、次のよ
うな優れた作用を実現する。すなわち、光学系３が拡大
像Sbからの光を点状又は線状光源としてコリメータレン
ズ４に入射させるので、コリメータレンズ４は拡大像Sb
からの光を漏れなく平行度の高い平行光線にして反射型
回折格子５に入射させる。したがって、反射型回折格子
５はその分解能を十分に発揮するとともに極微弱光を分
光するようになる。また、コリメータレンズ４と結像レ
ンズ６とは、反射型回折格子５に極近接して配置できる
ので、装置の小型化が実現できる。さらに、コリメータ
レンズ４と結像レンズ６にはＦナンバーの可能な限り小
さい明るいレンズを使用することができるので、両レン
ズの合成系となる装置全体の明るさを十分に大きくする
ことができ、高感度１次元又は２次元光検出器７と組み
合わせることにより、従来困難であった生物発光、化学
発光、励起光による極微弱蛍光等の極微弱光の多波長同
時分析が可能になる。As described above, in the high-sensitivity microscope multi-wavelength spectroscopic device of the present invention, the optical system 3 that emits a small area of the enlarged image Sb or an area having a certain degree of spread in a point-like or linear manner and a small F-number A high-sensitivity multi-wavelength spectrometer II having a collimator lens 4, a reflection type diffraction grating 5, an imaging lens 6, and a high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7 is a bioluminescence,
The following excellent operation is realized in the spectroscopic analysis of the extremely weak light from the enlarged image Sb of the minute object exhibiting the extremely weak fluorescence due to the chemiluminescence or the excitation light. That is, since the optical system 3 causes the light from the enlarged image Sb to enter the collimator lens 4 as a point-like or linear light source, the collimator lens 4
Is converted into a parallel light beam having a high degree of parallelism without leakage and is incident on the reflection type diffraction grating 5. Therefore, the reflection type diffraction grating 5 sufficiently exhibits its resolution and separates extremely weak light. Further, since the collimator lens 4 and the imaging lens 6 can be arranged very close to the reflection type diffraction grating 5, the size of the apparatus can be reduced. Further, since a bright lens having an F-number as small as possible can be used for the collimator lens 4 and the imaging lens 6, the brightness of the entire device which is a combined system of the two lenses can be sufficiently increased. By combining with a high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector 7, multi-wavelength simultaneous analysis of extremely weak light such as bioluminescence, chemiluminescence, and extremely weak fluorescence by excitation light, which has been conventionally difficult, becomes possible.
以上の説明から明らかなように、本発明の高感度顕微
多波長分光装置は、特に、生物発光又は化学発光による
極微弱な自然発光の分光検出のために用いられるもので
あり、試料の拡大像の微小領域又はある程度の広がりの
ある領域からの光を点状ないし線状に限定して射出する
光学系が、顕微鏡光学系によって形成された試料の拡大
像からの光を点状又は線状光源としてコリメータレンズ
に入射させ、コリメータレンズは試料の拡大像からの光
を漏れなく平行度の高い平行光線にして反射型回折格子
の法線に対して角度をなして入射させる。したがって、
反射型回折格子はその分解能を十分に発揮するとともに
生物発光又は化学発光による極微弱光を分光するように
なる。また、コリメータレンズと結像レンズとは、反射
型回折格子に極近接して配置できるので、装置の小型化
が実現できる。そして、コリメータレンズと結像レンズ
として、Ｆナンバーが可能な限り小さい明るいレンズを
使用することができるので、両レンズの合成系となる高
感度多波長分光装置全体の明るさを十分に大きくするこ
とができ、高感度１次元又は２次元光検出器と組み合わ
せることにより、生物発光又は化学発光による極微弱な
自然発光の同時多波長分析が可能になり、特に、生物発
光、化学発光を利用いた生体、微量成分の研究手段とし
て有効なものとなる。As is clear from the above description, the high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer of the present invention is used particularly for spectral detection of extremely weak spontaneous luminescence due to bioluminescence or chemiluminescence. An optical system that emits light from a minute region or a region having a certain degree of spread to a point or a line is limited to a point or line light source from an enlarged image of a sample formed by a microscope optical system. The collimator lens converts the light from the magnified image of the sample into parallel rays with high parallelism without leakage and enters the collimator lens at an angle with respect to the normal line of the reflective diffraction grating. Therefore,
The reflection type diffraction grating sufficiently exerts its resolution, and separates extremely weak light due to bioluminescence or chemiluminescence. Further, since the collimator lens and the imaging lens can be arranged very close to the reflection type diffraction grating, the size of the apparatus can be reduced. Since a bright lens having an F-number as small as possible can be used as the collimator lens and the imaging lens, it is necessary to sufficiently increase the brightness of the entire high-sensitivity multi-wavelength spectroscopic device which is a combined system of the two lenses. In combination with a highly sensitive one-dimensional or two-dimensional photodetector, simultaneous multi-wavelength analysis of extremely weak spontaneous luminescence by bioluminescence or chemiluminescence becomes possible. It is effective as a research tool for trace components.
また、特に、高感度多波長分光装置の各構成要素を、
反射型回折格子への入射角の絶対値が反射型回折格子か
らの回折角の絶対値より小さく、その入射角を正とした
ときにその回折角が負となるような配置であって、−１
次の回折光をスペクトル像としてとり出し可能な配置に
したので、結像レンズが損失少なくより多くの回折光を
結像させるので、生物発光又は化学発光による極微弱な
自然発光の分光検出に適している。Also, in particular, each component of the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer is
An arrangement in which the absolute value of the angle of incidence on the reflection type diffraction grating is smaller than the absolute value of the diffraction angle from the reflection type diffraction grating, and the diffraction angle is negative when the incident angle is positive, 1
Since the next diffracted light is arranged to be able to be taken out as a spectral image, the imaging lens forms more diffracted light with less loss, so it is suitable for spectral detection of extremely weak spontaneous emission due to bioluminescence or chemiluminescence. ing.
第１図は本発明の高感度顕微多波長分光装置の１実施例
の光学配置図、第２図は他の実施例の光学配置図、第３
図は本発明の高感度顕微多波長分光装置に用いる高感度
多波長分光装置の１実施例の光学配置図、第４図は高感
度多波長分光装置の他の実施例の光学配置図、第５図は
第３図の高感度多波長分光装置の２つの基本タイプの光
学配置図、第６図は第５図の基本タイプを検討するため
の光路図、第７図は本発明の高感度顕微多波長分光装置
に用いる高感度多波長分光装置の他の実施例の光学配置
図、第８図は本発明において用いる２次元光子計数管と
低残像ビジコンを組み合わせたものの断面図、第９図は
他の光子計数型画像計測装置の断面図、第10図は本発明
において用いる高感度多重多波長分光装置の光学配置
図、第11図は従来の顕微ラマンシステムのブロック構成
図である。 S:試料、I:顕微鏡光学系、II:高感度多波長分光装置、
1:対物レンズ系、2:接眼レンズ系、Sa:試料の中間像、S
b:拡大像、Ls:励起用光源、分光器A1〜A4：分光器、3:
試料の拡大像の微小領域又はある程度の広がりのある領
域からの光を点状ないし線状に限定して射出する光学
系、3a:入射スリット、3b:光コンセントレイター、4:コ
リメーターレンズ、5:反射型回折格子、6:結像レンズ、
7:高感度１次元又は２次元光検出器、8:コンピュータ、
9:コリメーター・結像兼用レンズ、21:2次元光子計数
管、22:光電面、23:メッシュ、24:電子レンズ、25:マイ
クロチヤンネルプレート（MCP）、26:蛍光面、27:レン
ズ、28:低残像ビジコン、29:シリコン半導***置検出器
（PSD）、30:信号出力電極、31:位置演算装置、32:アン
プ、33:積分回路、34:加減算回路、35:ウィンドゲー
ト、36:除算器、37:AD変換器、L0：対物レンズFIG. 1 is an optical layout diagram of one embodiment of the high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer of the present invention, FIG. 2 is an optical layout diagram of another embodiment, and FIG.
FIG. 4 is an optical layout diagram of one embodiment of a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used in the high-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer of the present invention. FIG. 4 is an optical layout diagram of another embodiment of the high-sensitivity multi-wavelength spectrometer. 5 is an optical layout diagram of two basic types of the high sensitivity multi-wavelength spectrometer of FIG. 3, FIG. 6 is an optical path diagram for examining the basic type of FIG. 5, and FIG. 7 is a high sensitivity of the present invention. FIG. 8 is an optical layout diagram of another embodiment of a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer used for a micro multi-wavelength spectrometer. FIG. 8 is a cross-sectional view of a combination of a two-dimensional photon counter and a low-image vidicon used in the present invention. Is a cross-sectional view of another photon counting type image measuring apparatus, FIG. 10 is an optical arrangement diagram of a high sensitivity multiplex multi-wavelength spectrometer used in the present invention, and FIG. 11 is a block configuration diagram of a conventional microscopic Raman system. S: sample, I: microscope optical system, II: high-sensitivity multi-wavelength spectrometer,
1: Objective lens system, 2: Eyepiece lens system, Sa: Intermediate image of sample, S
b: magnified image, Ls: excitation light source, spectrometer A 1 to A 4 : spectroscope, 3:
An optical system that restricts and emits light from a small area or a certain spread area of a magnified image of a sample to a point or a line, 3a: an entrance slit, 3b: an optical concentrator, 4: a collimator lens, 5 : Reflective diffraction grating, 6: imaging lens,
7: High sensitivity one-dimensional or two-dimensional photodetector, 8: Computer,
9: Collimator / imaging lens, 21: 2D photon counter, 22: Photocathode, 23: Mesh, 24: Electronic lens, 25: Microchannel plate (MCP), 26: Phosphor screen, 27: Lens, 28: Low image persistence vidicon, 29: Silicon semiconductor position detector (PSD), 30: Signal output electrode, 31: Position calculator, 32: Amplifier, 33: Integrator, 34: Adder / subtractor, 35: Wind gate, 36: Divider, 37: AD converter, L 0 : Objective lens
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 名越 利之 宮城県仙台市太白区八木山香澄町23―21 (72)発明者 稲場 文男 宮城県仙台市太白区八木山南１―13―１ (56)参考文献 特開 昭54−109890（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−37527（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−192632（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−115332（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−168519（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−243823（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／1640（ＷＯ，Ａ１) ────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (72) Inventor Toshiyuki Nagoshi 23-21 Kasumi-cho, Yagiyama, Taishiro-ku, Sendai, Miyagi Prefecture References JP-A-54-109890 (JP, A) JP-A-56-37527 (JP, A) JP-A-62-192632 (JP, A) JP-A-58-115332 (JP, A) JP-A-63 -168519 (JP, A) JP-A-63-243823 (JP, A) WO 89/1640 (WO, A1)
Claims (4)
試料の拡大像の微小領域又はある程度の広がりのある領
域からの光を点状ないし線状に限定して射出する光学
系、この限定して射出する光学系の点状ないし線状の射
出端を焦点としそこから出る光をとり入れて平行にする
明るいコリメーターレンズ、コリメーターレンズによっ
て平行にされた光であって法線に対して角度をなして入
射された光を回折して分光する反射型回折格子、反射型
回折格子によって分光された平行光を像面上にスペクト
ル像として結像する結像レンズ、及び、結像レンズの像
面上に配置された高感度１次元又は２次元光検出器から
なる高感度多波長分光装置とから構成され、生物発光又
は化学発光による極微弱な自然発光の分光検出のために
用いられ、前記反射型回折格子としてブレーズド回折格
子を用い、前記高感度多波長分光装置の各構成要素を、
反射型回折格子への入射角の絶対値が反射型回折格子か
らの回折角の絶対値より小さく、その入射角を正とした
ときにその回折角が負となるような配置であって、−１
次の回折光をスペクトル像としてとり出し可能な配置に
したことを特徴とする高感度顕微多波長分光装置。A microscope optical system for forming an enlarged image of a sample;
An optical system that restricts and emits light from a small region or a region having a certain extent of an enlarged image of a sample to a point or a line, and the point or linear exit end of the optical system that restricts and emits the light. A bright collimator lens that focuses and takes in light coming out of it and makes it parallel, a reflective type that diffracts and splits the light that is collimated by the collimator lens and enters at an angle to the normal. A diffraction grating, an imaging lens that forms parallel light separated by a reflection type diffraction grating on the image plane as a spectral image, and high-sensitivity one-dimensional or two-dimensional light detection disposed on the image plane of the imaging lens And a high-sensitivity multi-wavelength spectrometer comprising a vessel, used for spectral detection of extremely weak spontaneous luminescence by bioluminescence or chemiluminescence, and using a blazed diffraction grating as the reflection type diffraction grating, Each component of the multi-wavelength spectroscopic apparatus,
An arrangement in which the absolute value of the angle of incidence on the reflection type diffraction grating is smaller than the absolute value of the diffraction angle from the reflection type diffraction grating, and the diffraction angle is negative when the incident angle is positive, 1
A high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer characterized by being arranged so that the next diffracted light can be extracted as a spectrum image.
微小領域又はある程度の広がりのある領域からの光を点
状ないし線状に限定して射出する光学系として、スリッ
トないしピンホールを用いたことを特徴とする請求項１
記載の高感度顕微多波長分光装置。2. A high-sensitivity multi-wavelength spectrometer is provided as an optical system which emits light from a minute area of an enlarged image of a sample or an area having a certain degree of spread in a point-like or linear manner as a slit or a pinhole. 2. The method according to claim 1, wherein
The high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer described in the above.
微小領域又はある程度の広がりのある領域からの光を点
状ないし線状に限定して射出する光学系として、光コン
セントレイターを用いたことを特徴とする請求項１記載
の高感度顕微多波長分光装置。3. A high-sensitivity multi-wavelength spectrometer includes an optical concentrator as an optical system for emitting light from a minute area of an enlarged image of a sample or an area having a certain degree of spread in a point-like or linear manner. 2. The high-sensitivity microscopic multi-wavelength spectrometer according to claim 1, wherein the spectrometer is used.
いずれかに記載の、試料の拡大像の微小領域又はある程
度の広がりのある領域からの光を点状ないし線状に限定
して射出する光学系、コリメーターレンズ、反射型回折
格子、及び、結像レンズからなる分光器を、同種又は種
類を異ならして２以上多段に配置し、加分散又は差分散
の配列にすることにより、数回回折光を利用して角分散
を制御することを特徴とする高感度顕微多波長分光装
置。4. A high-sensitivity multi-wavelength spectroscopic device for limiting light from a minute region or a region having a certain extent of an enlarged image of a sample to a point or a line according to any one of claims 1 to 3. Spectroscopes composed of optical systems, collimator lenses, reflection type diffraction gratings, and imaging lenses, which are to be emitted at the same time, are arranged in two or more stages of the same type or different types, and are arranged in an additive dispersion or a differential dispersion. A high-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer characterized by controlling angular dispersion using diffracted light several times.
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|---|---|---|---|
| JP1208746A JP2749387B2 (en) | 1989-08-12 | 1989-08-12 | High-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1208746A JP2749387B2 (en) | 1989-08-12 | 1989-08-12 | High-sensitivity micro-multi-wavelength spectrometer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372238A JPH0372238A (en) | 1991-03-27 |
| JP2749387B2 true JP2749387B2 (en) | 1998-05-13 |
Family
ID=16561398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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Families Citing this family (1)
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| JPS63243823A (en) * | 1987-03-31 | 1988-10-11 | Shimadzu Corp | Spectrophotometer |
| EP0354927A4 (en) * | 1987-08-19 | 1990-09-26 | Integrated Solar Technologies Corporation | Macro-gradient optical density transmissive light concentrators, lenses and compound lenses of large geometry, and fabrication thereof |
-
1989
- 1989-08-12 JP JP1208746A patent/JP2749387B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| JPH0372238A (en) | 1991-03-27 |
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