JP2749135B2 - アンモニアの定量方法およびそれに用いるキット - Google Patents
アンモニアの定量方法およびそれに用いるキットInfo
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、体液または他の試料中のアンモニアの定量
方法、および該方法を行うのに使用する試薬含有キット
に関する。
方法、および該方法を行うのに使用する試薬含有キット
に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 血中アンモニアレベルの決定は、数多くの病的状態の
臨床診断において重要である。血中アンモニアレベルが
上昇していることは、肝臓疾患、肝性昏睡、ライエ症候
群、心不全および胎児赤芽球症と関連している。アンモ
ニアレベルをモニターすることはまた、肝臓移植を受け
た患者および過栄養の患者の臨床管理において有用であ
る。
臨床診断において重要である。血中アンモニアレベルが
上昇していることは、肝臓疾患、肝性昏睡、ライエ症候
群、心不全および胎児赤芽球症と関連している。アンモ
ニアレベルをモニターすることはまた、肝臓移植を受け
た患者および過栄養の患者の臨床管理において有用であ
る。
試料中のアンモニアレベルを決定することはまた、化
学工業から食品産業に至る種々の産業分野で行なわれて
いる。化学品、肥料のような原料物質、パン製品やフル
ーツジュースのような食糧品などの試料が定期的に分析
されている。
学工業から食品産業に至る種々の産業分野で行なわれて
いる。化学品、肥料のような原料物質、パン製品やフル
ーツジュースのような食糧品などの試料が定期的に分析
されている。
アンモニアの臨床決定のための従来法では、一般に、
アンモニウムイオンから揮発形のアンモニアへの変換を
もとにしたアンモニアの滴定分析または分光分析が行な
われていた。しかしながら、系中にアンモニア以外の揮
発成分が含まれている場合には困難が伴った。加えて、
アンモニアを決定するときのアッセイ条件はアミド分解
反応および脱アミノ化反応を促進するためアッセイ結果
が不正確なものとなっていた。たとえば、ベルテロット
反応によるアンモニアの分光的決定では、分析に先立っ
て除タンパク質する必要がある。除タンパク質は酸性pH
で行なわれる工程であり、正常部位にアンモニアが生成
され、間違った高いアンモニア値が得られる。
アンモニウムイオンから揮発形のアンモニアへの変換を
もとにしたアンモニアの滴定分析または分光分析が行な
われていた。しかしながら、系中にアンモニア以外の揮
発成分が含まれている場合には困難が伴った。加えて、
アンモニアを決定するときのアッセイ条件はアミド分解
反応および脱アミノ化反応を促進するためアッセイ結果
が不正確なものとなっていた。たとえば、ベルテロット
反応によるアンモニアの分光的決定では、分析に先立っ
て除タンパク質する必要がある。除タンパク質は酸性pH
で行なわれる工程であり、正常部位にアンモニアが生成
され、間違った高いアンモニア値が得られる。
アンモニアの決定のために酵素法を導入することによ
り、上記の不都合がなくなった［スカンド（Scand）の
J.Clin.Lab.Invest.,16（1964）443参照］。そのような
酵素系においては、過剰のα−ケトグルタレート、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、およびＬ
−グルタミン酸脱水素酵素（GLDH）が用いられていた。
そのような酵素系では、アンモニアをα−ケトグルタレ
ートと接触させてグルタメートを生成させ、それと同時
にNADHをNADに酸化していた。NADHの減少は試料中のア
ンモニアの濃度に正比例しており、340nmにおけるNADH
の吸光度の減少を決定することにより都合よく測定する
ことができる。
り、上記の不都合がなくなった［スカンド（Scand）の
J.Clin.Lab.Invest.,16（1964）443参照］。そのような
酵素系においては、過剰のα−ケトグルタレート、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）、およびＬ
−グルタミン酸脱水素酵素（GLDH）が用いられていた。
そのような酵素系では、アンモニアをα−ケトグルタレ
ートと接触させてグルタメートを生成させ、それと同時
にNADHをNADに酸化していた。NADHの減少は試料中のア
ンモニアの濃度に正比例しており、340nmにおけるNADH
の吸光度の減少を決定することにより都合よく測定する
ことができる。
臨床化学の実験室では、初期の酵素法で試料として酸
により除タンパク質した全血を用いた。上述したよう
に、そのような除タンパク質は間違った高いアンモニア
値を与えるので、測定の正確さに影響が出る。モンドザ
ック（Mondzac）ら［J.Lad.Clin.Med.66（1965）526参
照］は、除タンパク質した試料の代わりにヘパリン化し
た血漿を用いた改良GLDH法を記載している。この方法の
不利な点は、他の血漿成分（酵素など）がNADHと反応す
るため真の終点が存在しないように思われることであ
る。このことを回避するために、前インキュベーション
時間を15〜20分間と長くし、これらの交差反応物質を前
以て反応させておくことが行なわれた。しかしながら、
そのような前インキュベーションも、これらの交差反応
を完全に除くことはできなかった。
により除タンパク質した全血を用いた。上述したよう
に、そのような除タンパク質は間違った高いアンモニア
値を与えるので、測定の正確さに影響が出る。モンドザ
ック（Mondzac）ら［J.Lad.Clin.Med.66（1965）526参
照］は、除タンパク質した試料の代わりにヘパリン化し
た血漿を用いた改良GLDH法を記載している。この方法の
不利な点は、他の血漿成分（酵素など）がNADHと反応す
るため真の終点が存在しないように思われることであ
る。このことを回避するために、前インキュベーション
時間を15〜20分間と長くし、これらの交差反応物質を前
以て反応させておくことが行なわれた。しかしながら、
そのような前インキュベーションも、これらの交差反応
を完全に除くことはできなかった。
米国特許第3,929,581号明細書には、モンドザックの
改良法であり、初期の方法の不都合がなくなったとされ
ている酵素法が記載されている。この米国特許は、試料
として除タンパク質しない血漿を使用することを教示し
ている。試料を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（NADPH）およびGLDHと接触させる。加え
て、GLDHを安定化し酵素反応を促進するためにアデノシ
ン二リン酸（ADP）が含まれている。特許権者は、アッ
セイを行うのに約５分間かかると報告しており、これは
前インキュベーション期間を必要としないという事実に
一部よっている。上記アッセイ成分を組み合わせると、
本質的に交差反応がなく、それゆえアンモニアに特異的
なアッセイが得られる。
改良法であり、初期の方法の不都合がなくなったとされ
ている酵素法が記載されている。この米国特許は、試料
として除タンパク質しない血漿を使用することを教示し
ている。試料を還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドリン酸（NADPH）およびGLDHと接触させる。加え
て、GLDHを安定化し酵素反応を促進するためにアデノシ
ン二リン酸（ADP）が含まれている。特許権者は、アッ
セイを行うのに約５分間かかると報告しており、これは
前インキュベーション期間を必要としないという事実に
一部よっている。上記アッセイ成分を組み合わせると、
本質的に交差反応がなく、それゆえアンモニアに特異的
なアッセイが得られる。
上記特許権者は、NADHの代わりにNADPHを使用するこ
とは１つのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合
物を他のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合物
で自明に置き換えたものではないと議論した。NADHの使
用で交差反応の問題が見られたので、同じ問題がNADPH
でも起こることが予想された。さらに、GLDHは、NADPH
に比べてNADHと遥かに速やかに反応するため、NADPHで
は望ましくない一層遅い反応となることが教示された。
しかしながら、米国特許第3,929,581号の方法では、こ
れらの問題もいずれも生じなかった。
とは１つのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合
物を他のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合物
で自明に置き換えたものではないと議論した。NADHの使
用で交差反応の問題が見られたので、同じ問題がNADPH
でも起こることが予想された。さらに、GLDHは、NADPH
に比べてNADHと遥かに速やかに反応するため、NADPHで
は望ましくない一層遅い反応となることが教示された。
しかしながら、米国特許第3,929,581号の方法では、こ
れらの問題もいずれも生じなかった。
（課題を解決するための手段） 本発明の目的は、除タンパク質する必要なく、またNA
DHを使用することなく血中アンモニアレベルを試験する
別の方法を提供することにある。本発明の他の目的は、
自動化診断システムでも使用可能なほど充分速く行うこ
とのできる血中アンモニアアッセイ法を開発することに
ある。とりわけ、本発明の他の目的は、血中アンモニア
を試験するための自動化診断システムに使用することの
できる試薬試験キットを提供することにある。
DHを使用することなく血中アンモニアレベルを試験する
別の方法を提供することにある。本発明の他の目的は、
自動化診断システムでも使用可能なほど充分速く行うこ
とのできる血中アンモニアアッセイ法を開発することに
ある。とりわけ、本発明の他の目的は、血中アンモニア
を試験するための自動化診断システムに使用することの
できる試薬試験キットを提供することにある。
すなわち、本発明は、試料中のアンモニアの定量方法
であって、 （ａ）試料を、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
タレートおよび還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドリン酸と、存在するアンモニアを使い尽く
すのに充分な時間接触させ、 （ｂ）分光光度計または他の手段により吸光度の変化を
測定することにより試料中に存在するアンモニアの量を
決定する、ことを特徴とする方法； 試料中のアンモニアの定量方法であって、 （ａ）試料を、α−ケトグルタレートおよび還元型ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸と接触
させ、 （ｂ）最初の吸光度を測定し、 （ｃ）実質的にすべてのアンモニアを使い尽くすまで充
分な時間グルタミン酸脱水素酵素を加え、ついで （ｄ）最終の吸光度を測定し、最初と最終の間の吸光度
の変化を計算することにより試料中のアンモニアの量を
決定する、ことを特徴とする方法； （ａ）バッファー中のグルタミン酸脱水素酵素およびα
−ケトグルタレート； （ｂ）還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレド
オチドリン酸；および （ｃ）希釈バッファー からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット； （ａ）約0.01〜約0.25Mのリン酸バッファー、pH7〜7.4;
約1mM〜約1Mのα−ケトグルタレート；約100〜約10,000
U/mlのグルタミン酸脱水素酵素；およびグルセロール （ｂ）約0.5〜約10mMのニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドリン酸水溶液（pH約10）、および安定化
剤；および （ｃ）約0.01〜約0.25Mのトリス−（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンバッファー（pH約8.2〜約8.6） からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット； （ａ）約16mg/mlのα−ケトグルタレート、約572U/mlの
グルタミン酸脱水素酵素、約0.05Mのリン酸バッファー
（pH約7.0〜7.4）、約33％（v/v）のグリセロール、約
0.05mg/mlのウシガンマグロブリン、および約0.5mg/ml
のアジ化ナトリウム； （ｂ）約4mg/mlのニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、約50％のプロピレングリコール、約1m
g/mlのアジ化ナトリウム、約3.1mg/mlのホウ酸、約16mg
/mlのビシンバッファー、pH約10.2;および （ｃ）約0.01Mのトリスバッファー、約5mg/mlのポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、約0.2mg/mlの分子量約
500,000の硫酸デキストラン、pH約8.2 からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット；および 有効量のグルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタレー
ト、還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドリン酸の粉末とバッファーとを１パッケージ中に納め
たことを特徴とする、試料中のアンモニアレベル測定用
キットを提供するものである。
であって、 （ａ）試料を、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
タレートおよび還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドリン酸と、存在するアンモニアを使い尽く
すのに充分な時間接触させ、 （ｂ）分光光度計または他の手段により吸光度の変化を
測定することにより試料中に存在するアンモニアの量を
決定する、ことを特徴とする方法； 試料中のアンモニアの定量方法であって、 （ａ）試料を、α−ケトグルタレートおよび還元型ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸と接触
させ、 （ｂ）最初の吸光度を測定し、 （ｃ）実質的にすべてのアンモニアを使い尽くすまで充
分な時間グルタミン酸脱水素酵素を加え、ついで （ｄ）最終の吸光度を測定し、最初と最終の間の吸光度
の変化を計算することにより試料中のアンモニアの量を
決定する、ことを特徴とする方法； （ａ）バッファー中のグルタミン酸脱水素酵素およびα
−ケトグルタレート； （ｂ）還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレド
オチドリン酸；および （ｃ）希釈バッファー からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット； （ａ）約0.01〜約0.25Mのリン酸バッファー、pH7〜7.4;
約1mM〜約1Mのα−ケトグルタレート；約100〜約10,000
U/mlのグルタミン酸脱水素酵素；およびグルセロール （ｂ）約0.5〜約10mMのニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドリン酸水溶液（pH約10）、および安定化
剤；および （ｃ）約0.01〜約0.25Mのトリス−（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンバッファー（pH約8.2〜約8.6） からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット； （ａ）約16mg/mlのα−ケトグルタレート、約572U/mlの
グルタミン酸脱水素酵素、約0.05Mのリン酸バッファー
（pH約7.0〜7.4）、約33％（v/v）のグリセロール、約
0.05mg/mlのウシガンマグロブリン、および約0.5mg/ml
のアジ化ナトリウム； （ｂ）約4mg/mlのニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、約50％のプロピレングリコール、約1m
g/mlのアジ化ナトリウム、約3.1mg/mlのホウ酸、約16mg
/mlのビシンバッファー、pH約10.2;および （ｃ）約0.01Mのトリスバッファー、約5mg/mlのポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、約0.2mg/mlの分子量約
500,000の硫酸デキストラン、pH約8.2 からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット；および 有効量のグルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタレー
ト、還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドリン酸の粉末とバッファーとを１パッケージ中に納め
たことを特徴とする、試料中のアンモニアレベル測定用
キットを提供するものである。
本発明は、試料中のアンモニアの量を決定するのに用
いる方法およびキットに関するものである。本発明の方
法は、試料を、GLDH、α−ケトグルタレート、および還
元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン
酸（NHxDPH）と接触させ、ついでそれから試料中に存在
するアンモニアの量を決定することを含む。
いる方法およびキットに関するものである。本発明の方
法は、試料を、GLDH、α−ケトグルタレート、および還
元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン
酸（NHxDPH）と接触させ、ついでそれから試料中に存在
するアンモニアの量を決定することを含む。
本発明の方法に用いる試薬は、キットの形に組合わ
せ、キットの成分、すなわちグルタミン酸脱水素酵素／
α−ケトグルタレート、NHxDPHおよびバッファーを別々
にパッケージングし、本発明方法において試薬システム
として容易に組合わせて用いることができる。特に、本
発明の試薬はまた自動診断システムに容易に適用するこ
とができ、それにより試験の再現性と正確さが保証され
る。
せ、キットの成分、すなわちグルタミン酸脱水素酵素／
α−ケトグルタレート、NHxDPHおよびバッファーを別々
にパッケージングし、本発明方法において試薬システム
として容易に組合わせて用いることができる。特に、本
発明の試薬はまた自動診断システムに容易に適用するこ
とができ、それにより試験の再現性と正確さが保証され
る。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明は、試料中に存在するアンモニアの量を決定す
るための方法およびキットに関する。本発明の方法は、
試料を、GLDH、α−ケトグルタレートおよびNHxDPHと、
存在するアンモニアを使い尽しNHxDPHをNHxDPに酸化す
るのに充分な時間接触させ、吸光度の変化を分光光度計
または他の手段により測定し、ついでそれから試料中に
存在するアンモニアの量を決定することからなる。反応
は詳しく記載すると次のようになる。
るための方法およびキットに関する。本発明の方法は、
試料を、GLDH、α−ケトグルタレートおよびNHxDPHと、
存在するアンモニアを使い尽しNHxDPHをNHxDPに酸化す
るのに充分な時間接触させ、吸光度の変化を分光光度計
または他の手段により測定し、ついでそれから試料中に
存在するアンモニアの量を決定することからなる。反応
は詳しく記載すると次のようになる。
NADPHを含有する試薬システムに比べて、NHxDPHで調
製した試薬は終点に達するのが速く、そのため一層効率
的な反応システムが得られる。第１図に示すように、ア
ンモニア濃度が10μg/ml（w/v）の標準水溶液を用いて
本発明の方法を行った。同じ方法を用い、NHxDPHの代わ
りにNADPHを用いた一連の比較試験も行った。NADPH反応
では、約175秒すなわち約３分間で平衡および安定な終
点に達した。NHxDPHを含有する方法では、約125秒すな
わち約２分間またはそれより速く平衡に達した。
製した試薬は終点に達するのが速く、そのため一層効率
的な反応システムが得られる。第１図に示すように、ア
ンモニア濃度が10μg/ml（w/v）の標準水溶液を用いて
本発明の方法を行った。同じ方法を用い、NHxDPHの代わ
りにNADPHを用いた一連の比較試験も行った。NADPH反応
では、約175秒すなわち約３分間で平衡および安定な終
点に達した。NHxDPHを含有する方法では、約125秒すな
わち約２分間またはそれより速く平衡に達した。
この反応速度の上昇は、本発明の方法を自動診断シス
テムに用いる場合にはとりわけ重要である。たとえば、
アボットスペクトラムハイパーフォーマンスダイアグノ
スティックシステム（Abbott Spectrum High Performan
ce Diagnostic System）（アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ）は、種々の診断アッセイを
行い、その効率が予定している試験の全反応時間に依存
するランダムアクセス分析システムである。反応時間の
短縮により試料の処理量が劇的に増加する。
テムに用いる場合にはとりわけ重要である。たとえば、
アボットスペクトラムハイパーフォーマンスダイアグノ
スティックシステム（Abbott Spectrum High Performan
ce Diagnostic System）（アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ）は、種々の診断アッセイを
行い、その効率が予定している試験の全反応時間に依存
するランダムアクセス分析システムである。反応時間の
短縮により試料の処理量が劇的に増加する。
このようなNADPHの代わりにNHxDPHを用いることによ
る反応速度の増加は、ただ単にこれら２つのジヌクレオ
チドリン酸化合物の構造上の類似性に着眼すれば予期さ
れなかったものであり、とりわけ、ある場合には反対の
結果さえ観察されたので予期されなかったものであっ
た。たとえば、ストーン（Stone）ら［Biochem.23（198
4）4340参照］は、ジヒドロ葉酸リダクターゼの場合に
はNHxDPHはNADPHよりも反応が遅かったと報告してい
る。
る反応速度の増加は、ただ単にこれら２つのジヌクレオ
チドリン酸化合物の構造上の類似性に着眼すれば予期さ
れなかったものであり、とりわけ、ある場合には反対の
結果さえ観察されたので予期されなかったものであっ
た。たとえば、ストーン（Stone）ら［Biochem.23（198
4）4340参照］は、ジヒドロ葉酸リダクターゼの場合に
はNHxDPHはNADPHよりも反応が遅かったと報告してい
る。
試料としては、血漿、血清、尿または他の体液から選
ばれたものを用いることができる。本発明の方法は生物
学的試料に特に適しているものであるけれども、化学プ
ロセスのための原料物質、化学製品および食糧品のよう
な産業上または商業上の使用から得られた試料に使用す
ることができるか、もしくは使用すべき適合することが
できるということも予期される。
ばれたものを用いることができる。本発明の方法は生物
学的試料に特に適しているものであるけれども、化学プ
ロセスのための原料物質、化学製品および食糧品のよう
な産業上または商業上の使用から得られた試料に使用す
ることができるか、もしくは使用すべき適合することが
できるということも予期される。
本発明の方法は中性からややアルカリ性のpHで行う
が、これはGLDHの活性がこのpH範囲で最適であるからで
ある。このpH範囲は、約６から約9.5、好ましくは約８
から９である。本発明のアッセイ法は、約8.3から約8.5
のややアルカリ性の範囲、とりわけpH8.4で行うのが特
に好ましい。pHをこのアルカリ性の範囲に保持するため
に、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンバッ
ファーを用いるが、他の適当なバッファーまたはバッフ
ァー系、たとえばリン酸バッファーやトリエタノールア
ミンバッファーを用いることもできる。
が、これはGLDHの活性がこのpH範囲で最適であるからで
ある。このpH範囲は、約６から約9.5、好ましくは約８
から９である。本発明のアッセイ法は、約8.3から約8.5
のややアルカリ性の範囲、とりわけpH8.4で行うのが特
に好ましい。pHをこのアルカリ性の範囲に保持するため
に、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンバッ
ファーを用いるが、他の適当なバッファーまたはバッフ
ァー系、たとえばリン酸バッファーやトリエタノールア
ミンバッファーを用いることもできる。
試薬調製物中のGLDHの濃度は、少なくともIU/ml（活
性単位/mg）であり、反応混合物中のα−ケトグルタレ
ートの濃度は少なくとも1mMである。NHxDPHの濃度は、
約0.05〜約0.05mMの範囲である。
性単位/mg）であり、反応混合物中のα−ケトグルタレ
ートの濃度は少なくとも1mMである。NHxDPHの濃度は、
約0.05〜約0.05mMの範囲である。
体液試料、特に血液、血漿、および血清マトリックス
成分を安定化させるために、安定化剤を任意に用いるこ
とができる。安定化剤は、界面活性剤と硫酸デキスラン
の混合物であり、好ましくは、ポリエチレンラウリルエ
ーテルとエチレンオキシドおよび分子量が約500,000の
硫酸デキスラン23モルとの混合物である。
成分を安定化させるために、安定化剤を任意に用いるこ
とができる。安定化剤は、界面活性剤と硫酸デキスラン
の混合物であり、好ましくは、ポリエチレンラウリルエ
ーテルとエチレンオキシドおよび分子量が約500,000の
硫酸デキスラン23モルとの混合物である。
つぎに実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。なお本
発明の方法は、少なくとも２つの異なるやり方で行うこ
とができる。実施例１は、１工程アンモニア試験法であ
り、アンモニア標準試料を試験した。実施例２は、本発
明の方法の他の態様を示すものである。実施例３は、本
発明方法と公知方法との相関関係を決定したものであ
る。
るが、本発明はこれらに限られるものではない。なお本
発明の方法は、少なくとも２つの異なるやり方で行うこ
とができる。実施例１は、１工程アンモニア試験法であ
り、アンモニア標準試料を試験した。実施例２は、本発
明の方法の他の態様を示すものである。実施例３は、本
発明方法と公知方法との相関関係を決定したものであ
る。
実施例１ 下記成分１、２および３を調製した。
［成分１］ NHxDPH（4mg/ml） 50％プロピレングリコール アジ化ナトリウム（1mg/ml（w/v）） ホウ酸（3.1mg/ml（w/v）） ビシンバッファー（16mg/ml（w/v）） pH10.2 ［成分２］ α−ケトグルタレート（16mg/ml（w/v）） グルタミン酸脱水素酵素（572U/ml） リン酸バッファー（0.05M、pH7.0〜7.4 33％（v/v）グリセロール ウシガンマグロブリン（0.05mg/ml（w/v）） アジ化ナトリウム（0.5mg/ml（w/v）） ［成分３］ α−ケトグルタレート（2.6mM） トリスバッファー（0.01M） Brij−35（ICIアメリカ（ICI Americas Inc.,）製、ポ
リオキシエチレン（23）ラウリルエーテル）（5mg/ml
（w/v）） 硫酸デキストラン（平均分子量500,000）（0.2mg/ml（w
/v）） pH8.2 上記成分１、２および３を試薬系として1:1:20（v/
v）の比で混合した。ついで、本発明のアッセイを自動
２色診断用アナライザー上で行った。上記試薬系の250
μアリコートを、30℃に保持したキュベット中に分配
した。アンモニアを０、１、２、４、６、８、10、12、
14、16および18μg/ml（w/v）含有する各アンモニア標
準液の試料（25μ）を、試薬系を含む個々のキュベッ
ト中に直ちに分配した。5.6秒後に340/560nmでの分光光
度計での最初の読み取りを行った。最初の読み取りの３
分後に２回目の分光光度計での読み取りを行い、２つの
値の間の吸光度の違いを得、各試料中のアンモニアレベ
ルを計算するのに用いた。
リオキシエチレン（23）ラウリルエーテル）（5mg/ml
（w/v）） 硫酸デキストラン（平均分子量500,000）（0.2mg/ml（w
/v）） pH8.2 上記成分１、２および３を試薬系として1:1:20（v/
v）の比で混合した。ついで、本発明のアッセイを自動
２色診断用アナライザー上で行った。上記試薬系の250
μアリコートを、30℃に保持したキュベット中に分配
した。アンモニアを０、１、２、４、６、８、10、12、
14、16および18μg/ml（w/v）含有する各アンモニア標
準液の試料（25μ）を、試薬系を含む個々のキュベッ
ト中に直ちに分配した。5.6秒後に340/560nmでの分光光
度計での最初の読み取りを行った。最初の読み取りの３
分後に２回目の分光光度計での読み取りを行い、２つの
値の間の吸光度の違いを得、各試料中のアンモニアレベ
ルを計算するのに用いた。
このアッセイの結果を第２図に示す。第２図は、アッ
セイで実際に得られたアンモニア値と予測されたアンモ
ニア値との間の相関係数が1.00であることを示してい
る。第２図の直線の傾きは0.993であり、切片は0.001で
ある。
セイで実際に得られたアンモニア値と予測されたアンモ
ニア値との間の相関係数が1.00であることを示してい
る。第２図の直線の傾きは0.993であり、切片は0.001で
ある。
上記成分１、２および３では、記載した濃度のものを
用いたが、実質的に同様の結果を得るために当業者はこ
れらの濃度を変えることができる。
用いたが、実質的に同様の結果を得るために当業者はこ
れらの濃度を変えることができる。
実施例２ 成分１、２および３は、実施例１と同じである。成分
１（100μ）を成分３（1ml）と混合する。この混合物
（0.5ml）を厚さ1cmの２個のキュベットのそれぞれに分
配し、37℃に平衡化する。ついで、一方のキュベットに
は血漿（0.05ml）を加え、他方のキュベットには水（0.
05ml）を加えて試料ブランクとする。キュベットを混合
し、340nmでの吸光度の最初の読み取りを行う。つい
で、各キュベットに成分２（0.05ml）を加え、37℃で約
３分間反応させる。再び吸光度を測定し、２工程間での
吸光度の違いを得、各試料中でのアンモニアレベルを計
算するのに用いる。
１（100μ）を成分３（1ml）と混合する。この混合物
（0.5ml）を厚さ1cmの２個のキュベットのそれぞれに分
配し、37℃に平衡化する。ついで、一方のキュベットに
は血漿（0.05ml）を加え、他方のキュベットには水（0.
05ml）を加えて試料ブランクとする。キュベットを混合
し、340nmでの吸光度の最初の読み取りを行う。つい
で、各キュベットに成分２（0.05ml）を加え、37℃で約
３分間反応させる。再び吸光度を測定し、２工程間での
吸光度の違いを得、各試料中でのアンモニアレベルを計
算するのに用いる。
実施例３ 実施例１に記載した手順に従い、89の血漿試料につい
てアンモニアレベルを測定した。同時に同じ試料をデュ
ポンACAアンモニアアッセイ法を用いて分析した。デュ
ポン法は、非常に正確な方法として当業者に知られてい
るものである。第３図は、本発明の方法をデュポンACA
アンモニアアッセイ法と比較した場合に高い相関関係を
示す試験結果が得られることを示している。なお第３図
の直線の傾きは1.064であり、切片は−0.019であり、相
関係数は0.998である。
てアンモニアレベルを測定した。同時に同じ試料をデュ
ポンACAアンモニアアッセイ法を用いて分析した。デュ
ポン法は、非常に正確な方法として当業者に知られてい
るものである。第３図は、本発明の方法をデュポンACA
アンモニアアッセイ法と比較した場合に高い相関関係を
示す試験結果が得られることを示している。なお第３図
の直線の傾きは1.064であり、切片は−0.019であり、相
関係数は0.998である。
試験を行った全部で89の血漿試料のうち10の代表的な
試料についてのアンモニア測定の結果を下記第１表に示
す。
試料についてのアンモニア測定の結果を下記第１表に示
す。
試薬のキット中での配置は、数多くの異なるやり方で
行うことができる。すべての試薬を粉末とし、これらを
前以て測定した量で１つの容器中に入れ、ついで水また
はバッファーまたはバッファー系を加えて作動試薬とす
ることができる。別法として、キットを種々の粉末およ
び液体試薬の組合わせからなるようにし、これらを使用
者が混合するかまたはこのアッセイを使用する診断器具
システムにより混合するようにすることもできる。すべ
ての試薬は、いかなる形態であれ、適当な安定化剤また
は安定化システムを含んでいてよい。試薬をキット中に
パッケージングすることができ、その場合は、キットの
個々の成分を別々に貯蔵しておき使用前にそれらを組合
わせる。
行うことができる。すべての試薬を粉末とし、これらを
前以て測定した量で１つの容器中に入れ、ついで水また
はバッファーまたはバッファー系を加えて作動試薬とす
ることができる。別法として、キットを種々の粉末およ
び液体試薬の組合わせからなるようにし、これらを使用
者が混合するかまたはこのアッセイを使用する診断器具
システムにより混合するようにすることもできる。すべ
ての試薬は、いかなる形態であれ、適当な安定化剤また
は安定化システムを含んでいてよい。試薬をキット中に
パッケージングすることができ、その場合は、キットの
個々の成分を別々に貯蔵しておき使用前にそれらを組合
わせる。
キット中の試薬の組合わせの一例として３つの別々の
区画からなるものが挙げられ、各区画は次のいずれかを
含んでいる。
区画からなるものが挙げられ、各区画は次のいずれかを
含んでいる。
（ａ）バッファー中のGLDHおよびα−ケトグルタレート （ｂ）バッファー中のNHxDPH、および （ｃ）希釈バッファー キット中の試薬のパッケージングの他の方法は、GLD
H、α−ケトグルタレート、NHxDPHおよびバッファーま
たはバッファー系を粉末状とし、すべての成分を１つの
パッケージ中で前以て混合しておくものである。使用者
はまた、希釈バッファーを支給されるかまたは使用者自
身のバッファーまたは水を用いて試薬システムを使用に
適するように元に戻すことができる。前以て決められた
比率で組合わせると作動アンモニア試薬が得られ、実験
室員により最小の時間消費でアンモニアアッセイを行う
ことができる。キット中の各試薬に対して適用できる前
以て決められた比率の一例としては、各別々の区画中に
以下のものを含むものが挙げられる。
H、α−ケトグルタレート、NHxDPHおよびバッファーま
たはバッファー系を粉末状とし、すべての成分を１つの
パッケージ中で前以て混合しておくものである。使用者
はまた、希釈バッファーを支給されるかまたは使用者自
身のバッファーまたは水を用いて試薬システムを使用に
適するように元に戻すことができる。前以て決められた
比率で組合わせると作動アンモニア試薬が得られ、実験
室員により最小の時間消費でアンモニアアッセイを行う
ことができる。キット中の各試薬に対して適用できる前
以て決められた比率の一例としては、各別々の区画中に
以下のものを含むものが挙げられる。
（ａ）約0.01〜約0.25Mのリン酸バッファー、pH7〜7.4;
約1mM〜約1Mのα−ケトグルタレート；約100〜約10,000
U/mlのグルタミン酸脱水素酵素；およびグリセロール （ｂ）水溶液中の約0.5〜約10mMのNHxDPH（pH約10）、
および安定化剤；および （ｃ）約0.01〜約0.25Mのトリス−（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンバッファー（pH約8.2〜約8.6）
約1mM〜約1Mのα−ケトグルタレート；約100〜約10,000
U/mlのグルタミン酸脱水素酵素；およびグリセロール （ｂ）水溶液中の約0.5〜約10mMのNHxDPH（pH約10）、
および安定化剤；および （ｃ）約0.01〜約0.25Mのトリス−（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンバッファー（pH約8.2〜約8.6）
第１図は、アンモニア標準試料を用い、本発明により測
定した結果とNHxDPHの代わりにNADPHを用いた比較法に
より測定した結果とを比較して示すグラフ、第２図は、
実施例１のアッセイにおいて、アッセイで実際に得られ
たアンモニア値と予測されたアンモニア値との間の相関
係数が1.00であることを示すグラフ、第３図は、本発明
の方法とデュポンACAアンモニアアッセイとの間の相関
関係を示すグラフである。
定した結果とNHxDPHの代わりにNADPHを用いた比較法に
より測定した結果とを比較して示すグラフ、第２図は、
実施例１のアッセイにおいて、アッセイで実際に得られ
たアンモニア値と予測されたアンモニア値との間の相関
係数が1.00であることを示すグラフ、第３図は、本発明
の方法とデュポンACAアンモニアアッセイとの間の相関
関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オベイド・ヒッサミ アメリカ合衆国テキサス 76051、グレ ープ ヴァイン、サークルウッド・コー ト 3329番 (72)発明者 デヴィッド・アンソニー・ヨースト アメリカ合衆国イリノイ 60073、ラウ ンド・レイク・パーク、シーダー・ドラ イブ 96番 (56)参考文献 特開 昭60−180600（ＪＰ，Ａ) 特公 昭57−21995（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (8)
- 【請求項１】試料中のアンモニアの定量方法であって、 （ａ）試料を、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグル
タレートおよび還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドリン酸と、存在するアンモニアを使い尽く
すのに充分な時間接触させ、 （ｂ）分光光度計または他の手段により吸光度の変化を
測定することにより試料中に存在するアンモニアの量を
決定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】試料と、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケ
トグルタレートおよび還元型ニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチドリン酸との接触を、pH範囲で約６〜
約9.5に保持したバッファー溶液中で行う請求項（１）
記載の方法。 - 【請求項３】アンモニアの量の決定をpH約６〜約9.5の
範囲にあるバッファー溶液中で行う請求項（２）記載の
方法。 - 【請求項４】試料中のアンモニアの定量方法であって、 （ａ）試料を、α−ケトグルタレートおよび還元型ニコ
チンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸と接触
させ、 （ｂ）最初の吸光度を測定し、 （ｃ）実質的にすべてのアンモニアを使い尽くすまで充
分な時間グルタミン酸脱水素酵素を加え、ついで （ｄ）最終の吸光度を測定し、最初と最終の間の吸光度
の変化を計算することにより試料中のアンモニアの量を
決定する ことを特徴とする方法。 - 【請求項５】（ａ）バッファー中のグルタミン酸脱水素
酵素およびα−ケトグルタレート； （ｂ）還元型ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレド
オチドリン酸；および （ｃ）希釈バッファー からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット。 - 【請求項６】（ａ）約0.01〜約0.25Mのリン酸バッファ
ー、pH7〜7.4;約1mM〜約1Mのα−ケトグルタレート；約
100〜約10,000U/mlのグルタミン酸脱水素酵素；および
グリセロール （ｂ）約0.5〜約10mMのニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドリン酸水溶液（pH約10）、および安定化
剤；および （ｃ）約0.01〜約0.25Mのトリス−（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンバッファー（pH約8.2〜約8.6） からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット。 - 【請求項７】（ａ）約16mg/mlのα−ケトグルタレー
ト、約572U/mlのグルタミン酸脱水素酵素、約0.05Mのリ
ン酸バッファー（pH約7.0〜7.4）、約33％（v/v）のグ
リセロール、約0.05mg/mlのウシガンマグロブリン、お
よび約0.5mg/mlのアジ化ナトリウム； （ｂ）約4mg/mlのニコチンアミドヒポキサンチンジヌク
レオチドリン酸、約50％のプロピレングリコール、約1m
g/mlのアジ化ナトリウム、約3.1mg/mlのホウ酸、約16mg
/mlのビシンバッファー、pH約10.2;および （ｃ）約0.01Mのトリスバッファー、約5mg/mlのポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、約0.2mg/mlの分子量約
500,000の硫酸デキストラン、pH約8.2 からなり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）各成分を別々の
区画に収納してあることを特徴とする試料中のアンモニ
アレベル測定用キット。 - 【請求項８】有効量のグルタミン酸脱水素酵素、α−ケ
トグルタレート、還元型ニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドリン酸の粉末とバッファーとを１パッケ
ージ中に納めたことを特徴とする、試料中のアンモニア
レベル測定用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US223056 | 1988-07-22 | ||
| US07/223,056 US5141853A (en) | 1988-07-22 | 1988-07-22 | Determination of ammonia levels in a sample |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02113898A JPH02113898A (ja) | 1990-04-26 |
| JP2749135B2 true JP2749135B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=22834833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0351774B1 (ja) |
| JP (1) | JP2749135B2 (ja) |
| KR (1) | KR910003378A (ja) |
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| CA (1) | CA1338430C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| CN104374906B (zh) * | 2014-11-28 | 2016-02-17 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种血清氨检测试剂 |
| WO2018196802A1 (zh) | 2017-04-28 | 2018-11-01 | 利多(香港)有限公司 | 一种检测装置和可直观读取检测结果的样本检测方法 |
| CN113396226A (zh) * | 2019-01-31 | 2021-09-14 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 氨检测测定中nadph或nadh的稳定化 |
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|---|---|---|---|---|
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| YU218175A (en) * | 1974-09-12 | 1984-04-30 | Schwartzhaupt Kg | Process for total or individual determination of lactate dehydrogenase isoenzyme |
| JPS57182169A (en) * | 1981-05-02 | 1982-11-09 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Measuring method for antigen-antibody reaction |
| JPS61124383A (ja) * | 1984-11-16 | 1986-06-12 | Unitika Ltd | 固定化線維素溶解活性酵素の安定化法 |
| US4914040A (en) * | 1988-03-03 | 1990-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
-
1988
- 1988-07-22 US US07/223,056 patent/US5141853A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-07-14 AU AU38158/89A patent/AU624393B2/en not_active Ceased
- 1989-07-14 JP JP1183530A patent/JP2749135B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-18 EP EP89113146A patent/EP0351774B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1989-07-18 AT AT89113146T patent/ATE112393T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-18 DE DE68918517T patent/DE68918517T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-20 CA CA000606186A patent/CA1338430C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-21 KR KR1019890010325A patent/KR910003378A/ko not_active Application Discontinuation
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| JPH02113898A (ja) | 1990-04-26 |
| CA1338430C (en) | 1996-07-02 |
| DE68918517T2 (de) | 1995-05-04 |
| AU3815889A (en) | 1990-01-25 |
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| KR910003378A (ko) | 1991-02-27 |
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| US5141853A (en) | 1992-08-25 |
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