JP2716103B2 - イムノアッセイにおける誤結果除去方法 - Google Patents
イムノアッセイにおける誤結果除去方法Info
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- JP2716103B2 JP2716103B2 JP5503596A JP50359692A JP2716103B2 JP 2716103 B2 JP2716103 B2 JP 2716103B2 JP 5503596 A JP5503596 A JP 5503596A JP 50359692 A JP50359692 A JP 50359692A JP 2716103 B2 JP2716103 B2 JP 2716103B2
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、イムノアッセイにおける誤結果除去方法、
そして特に、デテクター（detector）抗体としての免疫
反応性抗体断片接合体および未重合IgGを用いることに
より捕獲抗体および／またはデテクター抗体と相互作用
できる干渉抗体の存在による誤結果を除去することに関
する。
そして特に、デテクター（detector）抗体としての免疫
反応性抗体断片接合体および未重合IgGを用いることに
より捕獲抗体および／またはデテクター抗体と相互作用
できる干渉抗体の存在による誤結果を除去することに関
する。
発明の背景 イムノアッセイは、生物学的検体例えば血清、血漿、
血液などの中の抗原の有無をスクリーニングするための
診断ツールとして用いられている。典型的には、かかる
アッセイは、様々な方式で反応させることのできる異な
る抗原決定基に対する二以上の抗体の使用を伴う。例え
ば正（forward）サンドイッチアッセイ方式では、溶存
するかまたは固相に固定された第一抗体を抗原を含むと
思われる検体とインキュベートする。抗原が存在する場
合には、第一抗体−抗原複合体が生じ、次いでその生成
複合体をレポーターに接合された第二抗体と反応させて
第一抗体−抗原−第二抗体−レポーター複合体を生成さ
せ、そして次にそれを検出することができる。
血液などの中の抗原の有無をスクリーニングするための
診断ツールとして用いられている。典型的には、かかる
アッセイは、様々な方式で反応させることのできる異な
る抗原決定基に対する二以上の抗体の使用を伴う。例え
ば正（forward）サンドイッチアッセイ方式では、溶存
するかまたは固相に固定された第一抗体を抗原を含むと
思われる検体とインキュベートする。抗原が存在する場
合には、第一抗体−抗原複合体が生じ、次いでその生成
複合体をレポーターに接合された第二抗体と反応させて
第一抗体−抗原−第二抗体−レポーター複合体を生成さ
せ、そして次にそれを検出することができる。
残念なことに、イムノアッセイは誤作用して検体中に
抗原が存在しないのに誤結果を生じることがある。誤結
果は、例えば検体中に抗原が存在しないのに第二抗体−
レポーター接合体が第一抗体と反応してしまう場合な
ど、多くの方法で生じ得る。これは非特異的相互作用例
えば疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合、フ
ァンデアワールス力などのために生じ得る。
抗原が存在しないのに誤結果を生じることがある。誤結
果は、例えば検体中に抗原が存在しないのに第二抗体−
レポーター接合体が第一抗体と反応してしまう場合な
ど、多くの方法で生じ得る。これは非特異的相互作用例
えば疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素結合、フ
ァンデアワールス力などのために生じ得る。
非特異的相互作用に発生は、第一抗体および／または
第二抗体接合体の両者に結合する試験検体中に存在する
物質によることもあり得る。通常、かかる物質は、第一
および／または第二抗体の生産に用いられた生物種の免
疫グロブリンに既に晒された動物からの血清検体中に存
在する。これらの免疫グロブリンはその物質中で干渉抗
体の形成を生起する抗原として働く。
第二抗体接合体の両者に結合する試験検体中に存在する
物質によることもあり得る。通常、かかる物質は、第一
および／または第二抗体の生産に用いられた生物種の免
疫グロブリンに既に晒された動物からの血清検体中に存
在する。これらの免疫グロブリンはその物質中で干渉抗
体の形成を生起する抗原として働く。
誤結果防止方法には、例えば1990年４月３日にLenzら
に付与された米国特許第4,914,040号に記載されている
ように、特異免疫反応体の一つとしてIgGまたはそのFab
またはＦ（ab′）2の断片のホモポリマー、または同種
の動物に由来するIgG分子とFc不含IgG断片のヘテロポリ
マーを使用する方法がある。
に付与された米国特許第4,914,040号に記載されている
ように、特異免疫反応体の一つとしてIgGまたはそのFab
またはＦ（ab′）2の断片のホモポリマー、または同種
の動物に由来するIgG分子とFc不含IgG断片のヘテロポリ
マーを使用する方法がある。
1990年９月７日に公開されたPCT出願公開No.WO90/102
26は、抗原を検査する検体中の干渉抗体と共に、捕獲お
よびインジケーター抗体（酵素にカプリングした完全抗
体）の調製に用いた生物種由来の少量の干渉抗体複合体
化血清（IACS）を用いることにより、ELISAアッセイ方
法における偽陽性結果を防止することを記載している。
IACSポリクローナル抗体は干渉抗体と反応して干渉抗体
が捕獲抗体およびインジケーター抗体を連結しないよう
にする。
26は、抗原を検査する検体中の干渉抗体と共に、捕獲お
よびインジケーター抗体（酵素にカプリングした完全抗
体）の調製に用いた生物種由来の少量の干渉抗体複合体
化血清（IACS）を用いることにより、ELISAアッセイ方
法における偽陽性結果を防止することを記載している。
IACSポリクローナル抗体は干渉抗体と反応して干渉抗体
が捕獲抗体およびインジケーター抗体を連結しないよう
にする。
発明の概要 本発明は、デテクター抗体としての免疫反応性抗体断
片接合体および未重合IgGを被検体（analyte）の有無を
検査しようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させ
ることより成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイ
における誤結果を実質的に除去する方法に関する。
片接合体および未重合IgGを被検体（analyte）の有無を
検査しようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させ
ることより成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイ
における誤結果を実質的に除去する方法に関する。
図面の簡単な説明 図１は、完全抗体接合体を重合IgGの存在下または非
存在下にデテクター抗体として用いたイムノアッセイ方
式で得られたCKMB値を示す。それらの結果は、18検体中
のCKMB値が12ng/mlより大であり、また24μｇの重合IgG
によってそれ以上減少し得なかったことを示している。
存在下にデテクター抗体として用いたイムノアッセイ方
式で得られたCKMB値を示す。それらの結果は、18検体中
のCKMB値が12ng/mlより大であり、また24μｇの重合IgG
によってそれ以上減少し得なかったことを示している。
図２は、大きく上昇したCKMB値を有する前記図１に記
載の18検体中の３検体のCKMB値を、80μｇという多量の
重合IgGをアッセイ１回あたり用いても121ng/ml以下に
は減少し得なかったことを示している。
載の18検体中の３検体のCKMB値を、80μｇという多量の
重合IgGをアッセイ１回あたり用いても121ng/ml以下に
は減少し得なかったことを示している。
図３は、デテクター抗体が完全抗体接合体である場
合、未重合ポリクローナルIgGが非特異的結合を実質的
に減少し得なかったことを示している。
合、未重合ポリクローナルIgGが非特異的結合を実質的
に減少し得なかったことを示している。
図４は、デテクター抗体としてのＦ（ab′）2接合体
および未重合ポリクローナルIgGを用い、実質的にすべ
ての非特異的結合が除去されたことを示している。
および未重合ポリクローナルIgGを用い、実質的にすべ
ての非特異的結合が除去されたことを示している。
図５は、デテクター抗体としてのＦ（ab′）2接合体
を未重合ポリクローナルIgGの存在下または非存在下に
用いて実質的にすべての非特異的結合が除去されたこと
を示している。重合IgGおよび未重合IgGの非存在下およ
び存在下に完全抗体接合体をデテクター抗体として用い
た場合のCKMB値を、重合IgGおよび未重合IgGの非存在下
および存在下にＦ（ab′）2接合体を用いた場合に得ら
れた値と比較した。
を未重合ポリクローナルIgGの存在下または非存在下に
用いて実質的にすべての非特異的結合が除去されたこと
を示している。重合IgGおよび未重合IgGの非存在下およ
び存在下に完全抗体接合体をデテクター抗体として用い
た場合のCKMB値を、重合IgGおよび未重合IgGの非存在下
および存在下にＦ（ab′）2接合体を用いた場合に得ら
れた値と比較した。
図６は、未重合マウスIgGの存在下および非存在下に
三つの患者検体の各々について測定されたhCG測定値を
示している。
三つの患者検体の各々について測定されたhCG測定値を
示している。
発明の詳細な説明 ここで用いられる「捕獲抗体」という用語は、被検体
を結合できる抗体を意味し、ポリクローナル、モノクロ
ーナルまたはその免疫反応性断片のいずれでもよい。そ
れは不均一（固相）また均一（溶液相）アッセイのいず
れに用いることもできる。
を結合できる抗体を意味し、ポリクローナル、モノクロ
ーナルまたはその免疫反応性断片のいずれでもよい。そ
れは不均一（固相）また均一（溶液相）アッセイのいず
れに用いることもできる。
ここで用いられる「デテクター抗体」は捕獲抗体が結
合するものとは異なるエピトープで被検体を結合できる
レポーターに接合された抗体を意味し、そしてその抗体
はポリクローナル、モノクローナルまたはその免疫反応
性断片のいずれでもよい。
合するものとは異なるエピトープで被検体を結合できる
レポーターに接合された抗体を意味し、そしてその抗体
はポリクローナル、モノクローナルまたはその免疫反応
性断片のいずれでもよい。
ここで用いられる「免疫反応性抗体断片」という用語
は、抗体の結合領域を含む一断片または複数断片を意味
する。かかる断片はFc部分を欠く断片として定義される
Fab−型断片、例えばFab、Fab′、およびＦ（ab′）2断
片であってよい。
は、抗体の結合領域を含む一断片または複数断片を意味
する。かかる断片はFc部分を欠く断片として定義される
Fab−型断片、例えばFab、Fab′、およびＦ（ab′）2断
片であってよい。
ここで用いられる「干渉抗体」という用語は、捕獲抗
体および／またはデテクター抗体の免疫反応性断片と相
互作用できる検体中に存在する抗体を意味する。
体および／またはデテクター抗体の免疫反応性断片と相
互作用できる検体中に存在する抗体を意味する。
ここで用いられる「実質的に除去する」という用語
は、感知できないほどの量、すなわち誤結果を生じない
量の非特異的結合は生じてもよいことを意味する。
は、感知できないほどの量、すなわち誤結果を生じない
量の非特異的結合は生じてもよいことを意味する。
本発明により、デテクター抗体としての免疫反応性抗
体断片接合体および未重合IgGを被検体の有無を検査し
ようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させること
より成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイにおけ
る誤結果を実質的に除去する方法が提供される。
体断片接合体および未重合IgGを被検体の有無を検査し
ようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させること
より成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイにおけ
る誤結果を実質的に除去する方法が提供される。
免疫反応性抗体断片接合体および未重合IgGは、イム
ノアッセイ過程の様々な段階で生物学的検体中の干渉抗
体と反応させることができる。それらは検体に、それを
捕獲抗体とインキュベートした後で同時に添加すること
ができる。捕獲抗体、免疫反応性抗体断片接合体および
未重合IgGは、干渉抗体を含んでいると思われる検体と
同時に反応させることができる。免疫反応性抗体断片接
合体と未重合IgGとを検体と反応させてから捕獲抗体と
インキュベートすることもできる。もう一つのバリエー
ションとして、干渉抗体含有検体を未重合IgGと反応さ
せてから捕獲抗体および免疫反応性抗体断片接合体とイ
ンキュベートすることができる。好ましくは、免疫反応
性抗体断片接合体および未重合IgGを被検体含有検体お
よび捕獲抗体と同時に反応させる。
ノアッセイ過程の様々な段階で生物学的検体中の干渉抗
体と反応させることができる。それらは検体に、それを
捕獲抗体とインキュベートした後で同時に添加すること
ができる。捕獲抗体、免疫反応性抗体断片接合体および
未重合IgGは、干渉抗体を含んでいると思われる検体と
同時に反応させることができる。免疫反応性抗体断片接
合体と未重合IgGとを検体と反応させてから捕獲抗体と
インキュベートすることもできる。もう一つのバリエー
ションとして、干渉抗体含有検体を未重合IgGと反応さ
せてから捕獲抗体および免疫反応性抗体断片接合体とイ
ンキュベートすることができる。好ましくは、免疫反応
性抗体断片接合体および未重合IgGを被検体含有検体お
よび捕獲抗体と同時に反応させる。
未重合IgGの使用量は、検体中に存在する実質的にす
べての干渉抗体を複合体化するのに十分な量とすべきで
ある。その量は、検体のサイズ、いつ試薬を添加する
か、などに依存して変化することになる。
べての干渉抗体を複合体化するのに十分な量とすべきで
ある。その量は、検体のサイズ、いつ試薬を添加する
か、などに依存して変化することになる。
本発明の方法は、固相方式であろうと、溶液方式であ
ろうと実際上任意のイムノアッセイ方式に用いることが
できる。かかるアッセイには米国特許第4,098,876号
（その開示を引用により本明細書の記載に含める）に記
載されているような逆サンドイッチアッセイ、競合アッ
セイ、正サンドイッチアッセイ、および米国特許第4,24
4,940号（その開示を引用により本明細書の記載に含め
る）に記載されているような同時的アッセイが包含され
るが、それらに限定されるものではない。モノクローナ
ル抗体を用いた免疫測定アッセイは米国特許第4,376,11
0号および4,486,530号に記載されているところ、それら
の開示を引用により本明細書の記載に含める。
ろうと実際上任意のイムノアッセイ方式に用いることが
できる。かかるアッセイには米国特許第4,098,876号
（その開示を引用により本明細書の記載に含める）に記
載されているような逆サンドイッチアッセイ、競合アッ
セイ、正サンドイッチアッセイ、および米国特許第4,24
4,940号（その開示を引用により本明細書の記載に含め
る）に記載されているような同時的アッセイが包含され
るが、それらに限定されるものではない。モノクローナ
ル抗体を用いた免疫測定アッセイは米国特許第4,376,11
0号および4,486,530号に記載されているところ、それら
の開示を引用により本明細書の記載に含める。
固相イムノアッセイを用いる場合、広範にわたる様々
な支持体のいずれを用いてもよい。例えば、合成ポリマ
ー支持体例えばポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポ
リスチレン、例えばアミノ化またはカルボキシル化ポリ
スチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリビニ
ルクロリドなど：ガラスビーズ、アガロースなどを挙げ
ることができる。好ましくは、固相は1987年４月28日に
Lauらに付与された米国特許第4,661,408号（その開示を
引用により本明細書の記載に含める）に記載されている
ような被覆二酸化クロム粒子である。これらの二酸化ク
ロムは加水分解的に十分安定であり、不均一イムノアッ
セイおよびバイオアフィニティー分離における固体支持
体として有用である。粒子の芯部は、５〜100m2/gの表
面積、100〜750エルステッドの保持力、５〜45emu/gの
残留磁気および８〜85emu/gの飽和磁気を有する針状、
ルチル二酸化クロムである。これらの粒子は表面安定化
され、そしてSiO2のコーティングで更に安定化される。
そのシリカ被覆二酸化クロムは次いで更にシランで被覆
することによってその粒子を更に安定化させると共にタ
ンパク質に対する結合部位を与える。
な支持体のいずれを用いてもよい。例えば、合成ポリマ
ー支持体例えばポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポ
リスチレン、例えばアミノ化またはカルボキシル化ポリ
スチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリビニ
ルクロリドなど：ガラスビーズ、アガロースなどを挙げ
ることができる。好ましくは、固相は1987年４月28日に
Lauらに付与された米国特許第4,661,408号（その開示を
引用により本明細書の記載に含める）に記載されている
ような被覆二酸化クロム粒子である。これらの二酸化ク
ロムは加水分解的に十分安定であり、不均一イムノアッ
セイおよびバイオアフィニティー分離における固体支持
体として有用である。粒子の芯部は、５〜100m2/gの表
面積、100〜750エルステッドの保持力、５〜45emu/gの
残留磁気および８〜85emu/gの飽和磁気を有する針状、
ルチル二酸化クロムである。これらの粒子は表面安定化
され、そしてSiO2のコーティングで更に安定化される。
そのシリカ被覆二酸化クロムは次いで更にシランで被覆
することによってその粒子を更に安定化させると共にタ
ンパク質に対する結合部位を与える。
捕獲抗体は前述の如く、ポリクローナル、モノクロー
ナルまたはその免疫反応性断片であってもよく、また当
業者に知られた技法を用いて調製することができる。
ナルまたはその免疫反応性断片であってもよく、また当
業者に知られた技法を用いて調製することができる。
捕獲抗体、免疫反応性抗体断片および未重合IgGは、
抗体を産生できる実際上任意の生物種、例えばマウス、
ラット、ウサギ、ヤギまたはウマなどから調製すること
ができる。本発明の好ましい態様として、抗体および免
疫反応性断片はマウス細胞から調製される。
抗体を産生できる実際上任意の生物種、例えばマウス、
ラット、ウサギ、ヤギまたはウマなどから調製すること
ができる。本発明の好ましい態様として、抗体および免
疫反応性断片はマウス細胞から調製される。
未重合IgGは、モノクローナルであろうとポリクロー
ナルであろうと、抗体製造の標準的方法を用いて調製す
ることができる。本発明の実施にあたっては、使用未重
合IgGを非免疫供給源由来とするのが好ましい。未重合I
gGを捕獲抗体および接合体と同じ種からのものとするの
が好ましい。
ナルであろうと、抗体製造の標準的方法を用いて調製す
ることができる。本発明の実施にあたっては、使用未重
合IgGを非免疫供給源由来とするのが好ましい。未重合I
gGを捕獲抗体および接合体と同じ種からのものとするの
が好ましい。
免疫反応性抗体断片接合体は、慣用のカプリングおよ
び標準方法を用いてレポーターにカプリングされた免疫
反応性抗体断片である。免疫反応性抗体断片へのカプリ
ングには広い範囲の様々なレポーターを利用することが
できる。レポーターは放射性同位元素例えば125I、酵
素、蛍光原物質、化学発光物質または電気化学的物質で
あってよい。
び標準方法を用いてレポーターにカプリングされた免疫
反応性抗体断片である。免疫反応性抗体断片へのカプリ
ングには広い範囲の様々なレポーターを利用することが
できる。レポーターは放射性同位元素例えば125I、酵
素、蛍光原物質、化学発光物質または電気化学的物質で
あってよい。
本発明の実施に用いることのできるレポーター酵素例
には、ヒドロラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクター
ゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼ
などが包含される。特定例には、アルカリ性ホスファタ
ーゼ、ベーターガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペル
オキシダーゼが包含される。その他の例がIshikawa et
al.,Clin.Chem.Acta,194:51〜74（1990）に見られると
ころ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。
には、ヒドロラーゼ、リアーゼ、オキシドレダクター
ゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼ
などが包含される。特定例には、アルカリ性ホスファタ
ーゼ、ベーターガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペル
オキシダーゼが包含される。その他の例がIshikawa et
al.,Clin.Chem.Acta,194:51〜74（1990）に見られると
ころ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。
本発明は実際上任意の被検体の測定に適している。例
えば、クレアチンキナーゼのMBイソ酵素（CKMB）、甲状
腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、濾
胞刺激ホルモン（FSH）、プロラクチン、フェリチン、
アルファーフェトプロティン（AFP）、ヒト絨毛膜ゴナ
ドトロピン（hCG）などが挙げられる。
えば、クレアチンキナーゼのMBイソ酵素（CKMB）、甲状
腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）、濾
胞刺激ホルモン（FSH）、プロラクチン、フェリチン、
アルファーフェトプロティン（AFP）、ヒト絨毛膜ゴナ
ドトロピン（hCG）などが挙げられる。
以下の実施例は本発明の実施を例説するためのもので
あって、いささかも限定としてとらえられてはならな
い。
あって、いささかも限定としてとらえられてはならな
い。
実施例 下記のすべての実施例はaca ディスクリート（discr
ete）臨床アナライザー（E.I.du Pont de Nemours and
Company,ウィルミントン，デラウエア州19898）を用い
た。aca の一例は米国特許第4,066,412号に記載されて
いるところ、その開示を引用により本明細書の記載に含
める。更に、前述の如く、本発明の方法は、イムノアッ
セイ方式に用いるのに適した任意の抗体および／または
それらの免疫反応性断片を用いて実施することができ
る。
ete）臨床アナライザー（E.I.du Pont de Nemours and
Company,ウィルミントン，デラウエア州19898）を用い
た。aca の一例は米国特許第4,066,412号に記載されて
いるところ、その開示を引用により本明細書の記載に含
める。更に、前述の如く、本発明の方法は、イムノアッ
セイ方式に用いるのに適した任意の抗体および／または
それらの免疫反応性断片を用いて実施することができ
る。
以下の試薬およびプロトコール後述の実施例に用い
た。
た。
ａ）CKMBイムノアッセイに用いられた細胞系統 用いられたモノクローナル抗体を産生する細胞系統
は、米国特許第4,912,033号およびVaidya et al.,Clin.
Chem.32（４）:657〜663（1986）に記載された手順を用
いて取得したところ、その開示を引用により本明細書の
記載に含める。
は、米国特許第4,912,033号およびVaidya et al.,Clin.
Chem.32（４）:657〜663（1986）に記載された手順を用
いて取得したところ、その開示を引用により本明細書の
記載に含める。
脱水生産完了後、そのようにして得られたモノクロー
ナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿透析、アフィ
ニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィーなど任意の数の標準的技法を用いて精製すること
ができる。モノクローナル抗体の単離および精製のため
のこれらのおよびその他の方法は一般的に、Goding,Mon
oclonal Antibodies;Principles and Practice,Academi
c press,ロンドンおよびニューヨーク,1983および米国
特許第4,533,496号に記載されているところ、その開示
を引用により本明細書の記載に含める。
ナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿透析、アフィ
ニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィーなど任意の数の標準的技法を用いて精製すること
ができる。モノクローナル抗体の単離および精製のため
のこれらのおよびその他の方法は一般的に、Goding,Mon
oclonal Antibodies;Principles and Practice,Academi
c press,ロンドンおよびニューヨーク,1983および米国
特許第4,533,496号に記載されているところ、その開示
を引用により本明細書の記載に含める。
精製および単離のための好ましい方法はプロテインＡ
セファロース（Pharmacia Fine Chemicals,ウプサラ，
スェーデン）でのアフィニティークロマトグラフィーで
あった。プロティンＡは免疫グロブリンを抗原結合部位
と相互作用することなく結合する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）から単離されたポリペプチド（分
子量42,000）である。
セファロース（Pharmacia Fine Chemicals,ウプサラ，
スェーデン）でのアフィニティークロマトグラフィーで
あった。プロティンＡは免疫グロブリンを抗原結合部位
と相互作用することなく結合する黄色ブドウ球菌（Stap
hylococcus aureus）から単離されたポリペプチド（分
子量42,000）である。
後述の如く二酸化クロム粒子上に固定された捕獲試薬
として用いられた抗−CKBモノクローナル抗体は前述の
如く取得した。クローン番号は2581 BH 1.1であり、そ
してモノクローナル抗体はIgG1サブクラスのものであっ
た。前述の如く、本発明は特定の抗体および／または免
疫反応性断片の使用に限定されない。例えばイムノアッ
セイに有用な任意のCKMB抗体を使用することができる。
として用いられた抗−CKBモノクローナル抗体は前述の
如く取得した。クローン番号は2581 BH 1.1であり、そ
してモノクローナル抗体はIgG1サブクラスのものであっ
た。前述の如く、本発明は特定の抗体および／または免
疫反応性断片の使用に限定されない。例えばイムノアッ
セイに有用な任意のCKMB抗体を使用することができる。
後述の免疫反応性断片の生産に用いられた抗−CKMBモ
ノクローナル抗体は前述の如く取得した。クローン番号
は2580 CC 4.2であり、そしてモノクローナル抗体はIgG
2bサブクラスであった。
ノクローナル抗体は前述の如く取得した。クローン番号
は2580 CC 4.2であり、そしてモノクローナル抗体はIgG
2bサブクラスであった。
プロティンＡ精製抗体は４℃で一夜アセテート緩衝液
（100mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH3.
5）に対して透析した。透析した抗体を透析緩衝液を用
いて5mg/mlの濃度まで希釈した。抗体溶液を37℃の水浴
に５〜10分置いた。
（100mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH3.
5）に対して透析した。透析した抗体を透析緩衝液を用
いて5mg/mlの濃度まで希釈した。抗体溶液を37℃の水浴
に５〜10分置いた。
ペプシン（Sigma Chemical Co.,セントルイス，ミズ
ーリ州）の10mg/ml溶液をアセテート緩衝液中で調製し
た。50:1の抗体：ペプシン重量比を与えるのに必要なペ
プシン量を計算した。ペプシンを添加しながら抗体溶液
を攪拌した。その混合物を10〜15分間インキュベートし
た。3.5M Tris塩基を溶液のpHが7.0〜8.0の範囲となる
まで徐々に滴加することにより反応を止めた。Ｆ（a
b′）2調製物を2.2×25cmカラム中、４〜4.5ml/時の流
速で、15〜20mlのプロティンＡ−セファロースを通し
た。タンパク質ピークを画分の吸光度を280nmで記録す
ることによりモニターした。タンパク質ピークを集め、
そして62mm PM30膜フィルターを嵌装したAmicon攪拌セ
ルを用いて約30mg/mlまで濃縮した。滅菌したＦ（a
b′）2濃縮液を濾過しそして−20℃で貯蔵した。
ーリ州）の10mg/ml溶液をアセテート緩衝液中で調製し
た。50:1の抗体：ペプシン重量比を与えるのに必要なペ
プシン量を計算した。ペプシンを添加しながら抗体溶液
を攪拌した。その混合物を10〜15分間インキュベートし
た。3.5M Tris塩基を溶液のpHが7.0〜8.0の範囲となる
まで徐々に滴加することにより反応を止めた。Ｆ（a
b′）2調製物を2.2×25cmカラム中、４〜4.5ml/時の流
速で、15〜20mlのプロティンＡ−セファロースを通し
た。タンパク質ピークを画分の吸光度を280nmで記録す
ることによりモニターした。タンパク質ピークを集め、
そして62mm PM30膜フィルターを嵌装したAmicon攪拌セ
ルを用いて約30mg/mlまで濃縮した。滅菌したＦ（a
b′）2濃縮液を濾過しそして−20℃で貯蔵した。
ｂ）Ｆ（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体の製造 前述の如き抗−CKMB抗体断片を、“Enzyme Immunoass
ays",Ishikawa et al.,Eds.,pp.81〜90（1981）中のKit
agawa et al.,Enzyme labeling with N−hydroxysuccin
imidyl ester of maleimideに記載された手順を用いて
β−ガラクトシダーゼにカプリングしたところ、その開
示を引用により本発明の記載に含める。接合体は次のよ
うにして製造した： 抗−CKMBモノクローナル抗体Ｆ（ab′）2断片を抗体
透析緩衝液（20mMホスフェート緩衝液、300mM NaCl、pH
7.0）に対して透析した。１モルのＦ（ab′）2を30モル
のSMCC〔Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート〕と混合
しそして室温で35分間絶えず攪拌しながらインキュベー
トした。その混合物をUV検出器（280nmでの吸光度）を
設けたSephadex G−25カラム（2.2×13cm）にかけた。
活性化Ｆ（ab′）2断片を抗体透析緩衝液を用いて溶出
した。タンパク質ピークを集めた。体積を記録しそして
タンパク質濃度を推定した。Boehringer Mannheimから
購入した１モルの大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダー
ゼ〔SMCC活性化Ｆ（ab′）2と当量〕を抗体透析緩衝液
に溶解した。活性化Ｆ（ab′）2をβ−ガラクトシダー
ゼと混合しそして少くとも25分間25℃で絶えず攪拌しな
がらインキュベートした。接合体の合成は、100μｌル
ープGF450分析カラムを備えたLKB HPLCを用いてモニタ
ーした。主ピークがクロマトグラム上で第二ピークを超
えたところで、接合体反応混合物1mlあたり10μｌの0.1
M N−エチルマレイミド溶液を添加することにより反応
を急止した。その混合物をAmicon攪拌セルおよびYM100
フィルター（いずれもAmicon社製）を用いて4.0mlまで
濃縮した。その接合体濃縮液を0.2μシリンジフィルタ
ーを通して濾過し、そして1mlループGF450カラム、UVモ
ニター、フラクションコレクターおよびチャートレコー
ダーを備えたLKB HPLCを用いて精製した。適切な画分を
集め、プールしそして280nm波長で吸光度を測定したタ
ンパク質濃度を推定した。生成濃縮液を濾過し、滅菌し
そして４℃で貯蔵した。接合体濃縮液は、CKMBアッセイ
のために必要に応じてβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈
緩衝液（脱イオン水１あたり、33.5gPIPES〔ピペラジ
ン−N,N′−ビス〔２−エタンスルホン酸〕〕）0.2g MG
Cl2、29.2g NaCl、100g牛血清アルブミン、および0.167
gマウスIgG、pH7.0）で希釈した。
ays",Ishikawa et al.,Eds.,pp.81〜90（1981）中のKit
agawa et al.,Enzyme labeling with N−hydroxysuccin
imidyl ester of maleimideに記載された手順を用いて
β−ガラクトシダーゼにカプリングしたところ、その開
示を引用により本発明の記載に含める。接合体は次のよ
うにして製造した： 抗−CKMBモノクローナル抗体Ｆ（ab′）2断片を抗体
透析緩衝液（20mMホスフェート緩衝液、300mM NaCl、pH
7.0）に対して透析した。１モルのＦ（ab′）2を30モル
のSMCC〔Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート〕と混合
しそして室温で35分間絶えず攪拌しながらインキュベー
トした。その混合物をUV検出器（280nmでの吸光度）を
設けたSephadex G−25カラム（2.2×13cm）にかけた。
活性化Ｆ（ab′）2断片を抗体透析緩衝液を用いて溶出
した。タンパク質ピークを集めた。体積を記録しそして
タンパク質濃度を推定した。Boehringer Mannheimから
購入した１モルの大腸菌（E.coli）β−ガラクトシダー
ゼ〔SMCC活性化Ｆ（ab′）2と当量〕を抗体透析緩衝液
に溶解した。活性化Ｆ（ab′）2をβ−ガラクトシダー
ゼと混合しそして少くとも25分間25℃で絶えず攪拌しな
がらインキュベートした。接合体の合成は、100μｌル
ープGF450分析カラムを備えたLKB HPLCを用いてモニタ
ーした。主ピークがクロマトグラム上で第二ピークを超
えたところで、接合体反応混合物1mlあたり10μｌの0.1
M N−エチルマレイミド溶液を添加することにより反応
を急止した。その混合物をAmicon攪拌セルおよびYM100
フィルター（いずれもAmicon社製）を用いて4.0mlまで
濃縮した。その接合体濃縮液を0.2μシリンジフィルタ
ーを通して濾過し、そして1mlループGF450カラム、UVモ
ニター、フラクションコレクターおよびチャートレコー
ダーを備えたLKB HPLCを用いて精製した。適切な画分を
集め、プールしそして280nm波長で吸光度を測定したタ
ンパク質濃度を推定した。生成濃縮液を濾過し、滅菌し
そして４℃で貯蔵した。接合体濃縮液は、CKMBアッセイ
のために必要に応じてβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈
緩衝液（脱イオン水１あたり、33.5gPIPES〔ピペラジ
ン−N,N′−ビス〔２−エタンスルホン酸〕〕）0.2g MG
Cl2、29.2g NaCl、100g牛血清アルブミン、および0.167
gマウスIgG、pH7.0）で希釈した。
ｃ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−CKB捕獲
抗体 抗−CKB抗体を、Birkmeyer et al.（Birkmeyer,et a
l.Application of novel chromium dioxide magnetic p
articles to immunoassay development,Clin.Chem.,33:
1543〜1547,1987）により実質的に記載された手順に従
って二酸化クロム粒子上に固定したところ、その開示を
引用により本明細書の記載に含める。
抗体 抗−CKB抗体を、Birkmeyer et al.（Birkmeyer,et a
l.Application of novel chromium dioxide magnetic p
articles to immunoassay development,Clin.Chem.,33:
1543〜1547,1987）により実質的に記載された手順に従
って二酸化クロム粒子上に固定したところ、その開示を
引用により本明細書の記載に含める。
4lのカプリング緩衝液を、196mlの10mM KH2PO4（−塩
基性）および204mlの10mM K2HPO4（二塩基性）を混合
し、そしてその容量を脱イオン水を用いて4lまで増加さ
せることにより調製した。pHは7.0に調節した。抗−CKB
モノクローナル抗体（2581BH1.1）を変えられたカプリ
ング緩衝液に対し一夜透析し、そして透析を更に４時間
続けた。透析した抗体の容量を測定し、そしてタンパク
質濃度を推定した。抗体溶液をカプリング緩衝液を用い
て2mg/mlまで希釈した。希釈抗体（2mg/ml）およびグル
タルアルデヒド活性化二酸化クロム粒子の５％懸濁液を
等容ずつ組織培養フラスコ中で混合した（この実験で
は、最終反応容量は200mlとした）。混合物を４℃で一
夜放置混合した。その組織培養フラスコを室温で磁気プ
レート上に置くことにより、粒子を60分間放置分離し
た。上清を除去し、そして粒子に結合した抗体量を測定
するためにアリコートを貯蔵した。これらの条件下では
98％以上の抗体が粒子に結合した。200mlのクエンチ溶
液（2.0Mグリシン緩衝液）を用いて反応をクエンチし、
そして室温で１時間揺動させた。粒子を磁気プレート上
で30分間分離した。上清を除去し、次いで組織培養フラ
スコ中150mlの洗浄緩衝液（10mMリン酸カリウム緩衝
液、0.1％牛血清アルブミン、pH7.4）で10回洗浄した。
最終洗浄からの上清を捨てた。200mlの貯蔵緩衝液（10m
Mリン酸カリウム緩衝液、0.1％牛血清アルブミン、0.01
％チメロサール、pH7.4）を粒子懸濁液に添加しそして
４℃で貯蔵した。10μｌの粒子懸濁液は10μｇの抗−CK
B抗体と250μｇの二酸化クロムを含有した。
基性）および204mlの10mM K2HPO4（二塩基性）を混合
し、そしてその容量を脱イオン水を用いて4lまで増加さ
せることにより調製した。pHは7.0に調節した。抗−CKB
モノクローナル抗体（2581BH1.1）を変えられたカプリ
ング緩衝液に対し一夜透析し、そして透析を更に４時間
続けた。透析した抗体の容量を測定し、そしてタンパク
質濃度を推定した。抗体溶液をカプリング緩衝液を用い
て2mg/mlまで希釈した。希釈抗体（2mg/ml）およびグル
タルアルデヒド活性化二酸化クロム粒子の５％懸濁液を
等容ずつ組織培養フラスコ中で混合した（この実験で
は、最終反応容量は200mlとした）。混合物を４℃で一
夜放置混合した。その組織培養フラスコを室温で磁気プ
レート上に置くことにより、粒子を60分間放置分離し
た。上清を除去し、そして粒子に結合した抗体量を測定
するためにアリコートを貯蔵した。これらの条件下では
98％以上の抗体が粒子に結合した。200mlのクエンチ溶
液（2.0Mグリシン緩衝液）を用いて反応をクエンチし、
そして室温で１時間揺動させた。粒子を磁気プレート上
で30分間分離した。上清を除去し、次いで組織培養フラ
スコ中150mlの洗浄緩衝液（10mMリン酸カリウム緩衝
液、0.1％牛血清アルブミン、pH7.4）で10回洗浄した。
最終洗浄からの上清を捨てた。200mlの貯蔵緩衝液（10m
Mリン酸カリウム緩衝液、0.1％牛血清アルブミン、0.01
％チメロサール、pH7.4）を粒子懸濁液に添加しそして
４℃で貯蔵した。10μｌの粒子懸濁液は10μｇの抗−CK
B抗体と250μｇの二酸化クロムを含有した。
ｄ）CKMBに対する終点（endpoint）法によるβ−ガラク
トシダーゼ活性測定用波長の選択 自動化ノムノアッセイについてここに記載するCKMBの
イムノアッセイは、レポーター酵素、すなわち検出自在
標識、としてβ−ガラクトシダーゼを用いた。クロロフ
ェノールレッドガラクトシド（CPRG）を基質として用い
てβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するところ、その際
酵素はCPRGと反応してクロロフェノールレッド（CPR）
を生成する。アッセイ１回あたり約3mgのCPRGを用い
た。CPRGの吸収極大は414nmで生じた。
トシダーゼ活性測定用波長の選択 自動化ノムノアッセイについてここに記載するCKMBの
イムノアッセイは、レポーター酵素、すなわち検出自在
標識、としてβ−ガラクトシダーゼを用いた。クロロフ
ェノールレッドガラクトシド（CPRG）を基質として用い
てβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するところ、その際
酵素はCPRGと反応してクロロフェノールレッド（CPR）
を生成する。アッセイ１回あたり約3mgのCPRGを用い
た。CPRGの吸収極大は414nmで生じた。
他方、CPRは577nmに吸収極大を有した。酵素により形
成されたCPR量はCPRGの１％以下である。図１は、緩衝
液中の二酸化クロム粒子の吸収スペクトルのほか、二酸
化クロム粒子の存在下におけるCPRGおよびCPRの吸収ス
ペクトルを示す。
成されたCPR量はCPRGの１％以下である。図１は、緩衝
液中の二酸化クロム粒子の吸収スペクトルのほか、二酸
化クロム粒子の存在下におけるCPRGおよびCPRの吸収ス
ペクトルを示す。
二色法終点測定が良好で再現性ある測定値を与えるこ
とを見出した。このアプローチを用いる場合、その終点
測定にはシグナルを２波長で測定することも必要である
ということに留意しなければならない。選択された第一
波長は577nmであったがこれはCPRの吸収がその波長で最
大となるからである。600nm波長をブランクとして用い
ると満足できる性能が得られた。この検出系で最良結果
を得るには620nmフィルターが必要であると分析され
た。それより低い例えば510や540nmといった波長を用い
ることもできるが、それらはCPRGピークの下向き勾配に
あたり、従ってCPRG濃度の変動に対し敏感である可能性
がある。
とを見出した。このアプローチを用いる場合、その終点
測定にはシグナルを２波長で測定することも必要である
ということに留意しなければならない。選択された第一
波長は577nmであったがこれはCPRの吸収がその波長で最
大となるからである。600nm波長をブランクとして用い
ると満足できる性能が得られた。この検出系で最良結果
を得るには620nmフィルターが必要であると分析され
た。それより低い例えば510や540nmといった波長を用い
ることもできるが、それらはCPRGピークの下向き勾配に
あたり、従ってCPRG濃度の変動に対し敏感である可能性
がある。
従って、好ましい測定系は、β−ガラクトシダーゼ活
性を有する生成物を577nmの第一波長、および600nmまた
はそれ以上の第二波長で測定すべきである。第一波長か
ら得られた読みから第二波長からえられた読みを差し引
くことにより酵素活性の正確な測定が可能となった。
性を有する生成物を577nmの第一波長、および600nmまた
はそれ以上の第二波長で測定すべきである。第一波長か
ら得られた読みから第二波長からえられた読みを差し引
くことにより酵素活性の正確な測定が可能となった。
ｅ）試薬 1.CKMBキャリブレーター:1mlあたり０、13.8、32、64お
よび128ngのヒトCKMB。精製ヒトCKMB（Aalto Scientifi
c Ltd.,ビスタ（Vista），カリホルニア州）をCKMB不含
ヒト血清プールに添加した。
よび128ngのヒトCKMB。精製ヒトCKMB（Aalto Scientifi
c Ltd.,ビスタ（Vista），カリホルニア州）をCKMB不含
ヒト血清プールに添加した。
2.抗−CKB二酸化クロム粒子を前述の如く調製した。
3.抗−CKMB F（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体濃
縮液を前述の如く調製した。
縮液を前述の如く調製した。
4.接合体希釈緩衝液は、脱イオン水１あたり、100gの
牛血清アルブミン、33.5gのナトリウムPIPES、29.2gの
塩化ナトリウムおよび0.2gの塩化マグネシウムを有した
（pH7.0）。
牛血清アルブミン、33.5gのナトリウムPIPES、29.2gの
塩化ナトリウムおよび0.2gの塩化マグネシウムを有した
（pH7.0）。
5.洗浄緩衝液は250mM Tris、50mMホウ酸ナトリウムより
構成した（pH7.85）。
構成した（pH7.85）。
6.再懸濁緩衝液は0.03M HEPES、0.02MナトリウムHEPE
S、0.01M酢酸マグネシウムおよび0.005％Tween20より構
成した（pH7.6）。
S、0.01M酢酸マグネシウムおよび0.005％Tween20より構
成した（pH7.6）。
7.3mgのクロロフェノールレッドガラクトシド、8.75mg
のトリハロース、30mgのマンニトールおよび3.15mgのカ
ーボワックス（20μｍ）を含むCPRG錠剤は、1976年１月
20日にBriggsらに付与された米国特許第3,932,943号に
実質的に開示された方法を用いて調製されたところ、そ
の開示を引用により本明細書の記載に含める。
のトリハロース、30mgのマンニトールおよび3.15mgのカ
ーボワックス（20μｍ）を含むCPRG錠剤は、1976年１月
20日にBriggsらに付与された米国特許第3,932,943号に
実質的に開示された方法を用いて調製されたところ、そ
の開示を引用により本明細書の記載に含める。
8.40.4mgのナトリウムHEPES、22.8mgのHEPES、7.0mgの
ソルビトール、1.15mgの酢酸マグネシウムおよび4.0mg
のカーボワックス（20μｍ）を含有するHEPES（（ｎ−
〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−エ
タンスルホン酸））錠剤は1976年１月20日にBriggsらに
付与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示され
た方法を用いて調製されたところ、その開示を引用によ
り本明細書の記載に含める。
ソルビトール、1.15mgの酢酸マグネシウムおよび4.0mg
のカーボワックス（20μｍ）を含有するHEPES（（ｎ−
〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ′−〔２−エ
タンスルホン酸））錠剤は1976年１月20日にBriggsらに
付与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示され
た方法を用いて調製されたところ、その開示を引用によ
り本明細書の記載に含める。
ｆ）プロトコール 前述の如く二酸化クロム粒子上に被覆された抗−CKB
抗体10μｇを300μｌの適宜に希釈された接合体と共に
反応管に分注した。300μｌの検体またはキャリブレー
ターをその反応管に分注し、次いでその反応管内に渦流
生成させ（vortexed）そして15分間37℃の水浴に入れそ
して２分間ごとに混合した。そのインキュベーション時
間経過後、それら反応管をCorning磁気試験管立てに置
くことにより粒子を分離した。上清を吸引した後、500
μｌの洗浄緩衝液を添加しそして粒子を再懸濁した。こ
の段階を３回繰り返した。最終洗浄段階の後で75μｌの
再懸濁緩衝液を添加しそして粒子を再び再経過した。60
μｌの粒子懸濁液をパックに分注した。
抗体10μｇを300μｌの適宜に希釈された接合体と共に
反応管に分注した。300μｌの検体またはキャリブレー
ターをその反応管に分注し、次いでその反応管内に渦流
生成させ（vortexed）そして15分間37℃の水浴に入れそ
して２分間ごとに混合した。そのインキュベーション時
間経過後、それら反応管をCorning磁気試験管立てに置
くことにより粒子を分離した。上清を吸引した後、500
μｌの洗浄緩衝液を添加しそして粒子を再懸濁した。こ
の段階を３回繰り返した。最終洗浄段階の後で75μｌの
再懸濁緩衝液を添加しそして粒子を再び再経過した。60
μｌの粒子懸濁液をパックに分注した。
粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性をaca
（E.I.du Pont de Nemours and Company,ウィルミン
トン，デラウエア州19898）で測定した。aca ディスク
リート臨床アナライザーと共に用いるためのaca CPRG
パック（デラウエア州ウイルミントンのE.I.du Pont de
Nemours and Company社から入手可能な標準的aca デ
ィスクリート臨床アナライザーパック）は、ディンプル
（くぼみ）２にHEPES錠剤をそしてディンプル３にはCPR
G錠剤を含む。ここでディンプル２および３としては標
準的aca ディスクリート臨床アナライザーパック内の
錠剤貯蔵区域のことであり、CPRG錠剤は3mgのクロロフ
ェノールレッドガラクトシド、8.75mgのトレハロース、
30mgのマンニトールおよび3.15mgのカーボワックス〔20
μｍ〕を含有し（これは1976年１月20日にBriggsらに付
与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示された
方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により
本明細書の記載に含める）、またHEPES錠剤は40.4mgの
ナトリウムHEPES、22.8mgのHEPES、7.0mgのソルビトー
ル、1.15mgの酢酸マグネシウムおよび4.0mgのカーボワ
ックス〔20μｍ〕を含有する（これは当該技術分野に知
られた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。
（E.I.du Pont de Nemours and Company,ウィルミン
トン，デラウエア州19898）で測定した。aca ディスク
リート臨床アナライザーと共に用いるためのaca CPRG
パック（デラウエア州ウイルミントンのE.I.du Pont de
Nemours and Company社から入手可能な標準的aca デ
ィスクリート臨床アナライザーパック）は、ディンプル
（くぼみ）２にHEPES錠剤をそしてディンプル３にはCPR
G錠剤を含む。ここでディンプル２および３としては標
準的aca ディスクリート臨床アナライザーパック内の
錠剤貯蔵区域のことであり、CPRG錠剤は3mgのクロロフ
ェノールレッドガラクトシド、8.75mgのトレハロース、
30mgのマンニトールおよび3.15mgのカーボワックス〔20
μｍ〕を含有し（これは1976年１月20日にBriggsらに付
与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示された
方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により
本明細書の記載に含める）、またHEPES錠剤は40.4mgの
ナトリウムHEPES、22.8mgのHEPES、7.0mgのソルビトー
ル、1.15mgの酢酸マグネシウムおよび4.0mgのカーボワ
ックス〔20μｍ〕を含有する（これは当該技術分野に知
られた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。
次にそれらパックをセロファンテープでシールしそし
て粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を次のよう
にしてaca ディスクリート臨床アナライザーを用いて
測定した。パックをaca にかけたところで、2mlのホス
フェート緩衝液（pH7.8）および3mlの水をパックに分注
した。ブレーカーミキサー１（錠剤試薬を破砕しそして
試薬の混合を助長するaca ディスクリート臨床アナラ
イザーの一成分）を用いてHEPESおよびCPRG錠剤を溶解
しそして粒子を懸濁させる。結合した酵素はCPRGと反応
して37℃でCPRを形成した。4.2分後、形成されたCPRを5
77および600nm波長で測定した。577nmはCPRが吸収極大
を有する第一波長であり、そして600nmはブランク用波
長であった。600nmでの読みを577nmでの読みから差し引
いて、懸濁された粒子による干渉を除去した。aca で
の終点読みと呼ばれる577nm読み−600nm読みをCKMBキャ
リブレーターのボトル値に対してプロットして標準曲線
を作成した。
て粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を次のよう
にしてaca ディスクリート臨床アナライザーを用いて
測定した。パックをaca にかけたところで、2mlのホス
フェート緩衝液（pH7.8）および3mlの水をパックに分注
した。ブレーカーミキサー１（錠剤試薬を破砕しそして
試薬の混合を助長するaca ディスクリート臨床アナラ
イザーの一成分）を用いてHEPESおよびCPRG錠剤を溶解
しそして粒子を懸濁させる。結合した酵素はCPRGと反応
して37℃でCPRを形成した。4.2分後、形成されたCPRを5
77および600nm波長で測定した。577nmはCPRが吸収極大
を有する第一波長であり、そして600nmはブランク用波
長であった。600nmでの読みを577nmでの読みから差し引
いて、懸濁された粒子による干渉を除去した。aca で
の終点読みと呼ばれる577nm読み−600nm読みをCKMBキャ
リブレーターのボトル値に対してプロットして標準曲線
を作成した。
実施例１ 干渉抗体の存在に起因する非特異的結合のためにCKMB
イムノアッセイにおいて偽陽性結果を与える疑いのある
81血清検体を前記プロトコールを用いて、CKMB値につい
て分析した。このアッセイは、重合IgGの非存在下およ
び存在下に完全抗−CKMB抗体接合体をデテクター抗体と
して用いて行った。
イムノアッセイにおいて偽陽性結果を与える疑いのある
81血清検体を前記プロトコールを用いて、CKMB値につい
て分析した。このアッセイは、重合IgGの非存在下およ
び存在下に完全抗−CKMB抗体接合体をデテクター抗体と
して用いて行った。
詳細には、抗−スルホニル尿素除草剤（Glean ,E.I.
du Pont de Nemours and Company,ウィルミントン，デ
ラウエア州）マウスモノクローナルIgG46/67.1.2,E.I.d
u Pont de Nemours and Co.,Inc.,ウィルミントン，デ
ラウエア州）を常法を用いて作り、そして前述の如くプ
ロティンＡアフィニティークロマトグラフィーにより精
製した。
du Pont de Nemours and Company,ウィルミントン，デ
ラウエア州）マウスモノクローナルIgG46/67.1.2,E.I.d
u Pont de Nemours and Co.,Inc.,ウィルミントン，デ
ラウエア州）を常法を用いて作り、そして前述の如くプ
ロティンＡアフィニティークロマトグラフィーにより精
製した。
その抗体（46/67.1.2）溶液を10mMリン酸ナトリウ
ム、300mM塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを
含有するホスフェート緩衝液（pH7.0）に対して透析し
た。すべての試薬はミズーリ州セントルイスのSigma Ch
emical Co.社から購入した。次にその抗体溶液を、XM50
膜を備えたAmicon標準セル型式8050を用いて4.8〜5.2mg
/mlに濃縮した。
ム、300mM塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを
含有するホスフェート緩衝液（pH7.0）に対して透析し
た。すべての試薬はミズーリ州セントルイスのSigma Ch
emical Co.社から購入した。次にその抗体溶液を、XM50
膜を備えたAmicon標準セル型式8050を用いて4.8〜5.2mg
/mlに濃縮した。
5mg/mlのモノクローナル抗体溶液をグルタルアルデヒ
ド（Sigma Chemical Co.社）の0.02％溶液と22℃で16〜
24時間と反応した。次にグリシン溶液をグリシン（Sigm
a Chemical Co.社）の最終濃度が0.01Mとなるように添
加した。これによって残留反応をすべて急止した。グル
タルアルデヒドおよびグリシンなどの過剰試薬をホスフ
ェート緩衝食塩水（Sigma Chemical Co.社）に対して４
〜８℃で一夜透析することにより除去した。その透析し
た重合IgGを15分間12000rpmで遠心分離（デラウエア
州）ウイルミントンのE.I.du Pont de Nemours and Co.
社のSorvall、型式RC5B）して大集塊を除去した。その
上清をXM50膜を備えたAmicon標準セル型式8050を用いて
濃縮し、そしてアジ化ナトリウムを0.1％濃度となるよ
うに添加した。最後に、その重合IgG溶液を0.2ミクロン
フィルターを有するNalgene使い捨てフィルターウェア
を用いてフィルター滅菌し、そして４℃で貯蔵した。
ド（Sigma Chemical Co.社）の0.02％溶液と22℃で16〜
24時間と反応した。次にグリシン溶液をグリシン（Sigm
a Chemical Co.社）の最終濃度が0.01Mとなるように添
加した。これによって残留反応をすべて急止した。グル
タルアルデヒドおよびグリシンなどの過剰試薬をホスフ
ェート緩衝食塩水（Sigma Chemical Co.社）に対して４
〜８℃で一夜透析することにより除去した。その透析し
た重合IgGを15分間12000rpmで遠心分離（デラウエア
州）ウイルミントンのE.I.du Pont de Nemours and Co.
社のSorvall、型式RC5B）して大集塊を除去した。その
上清をXM50膜を備えたAmicon標準セル型式8050を用いて
濃縮し、そしてアジ化ナトリウムを0.1％濃度となるよ
うに添加した。最後に、その重合IgG溶液を0.2ミクロン
フィルターを有するNalgene使い捨てフィルターウェア
を用いてフィルター滅菌し、そして４℃で貯蔵した。
図１に示された結果は81検体のうち18検体に12ng/ml
を超えるCKMB値が認められたことを示している。これら
の値は、24μｇの重合IgGを用いた場合正常の上限であ
る12ng/mlより減少し得なかった。これらの18検体のCKM
B値はHybritech社の「Tandem −E CKMB免疫酵素測定
（immunoenzymetric）」アッセイを用いた場合は10ng/m
lより低かった。
を超えるCKMB値が認められたことを示している。これら
の値は、24μｇの重合IgGを用いた場合正常の上限であ
る12ng/mlより減少し得なかった。これらの18検体のCKM
B値はHybritech社の「Tandem −E CKMB免疫酵素測定
（immunoenzymetric）」アッセイを用いた場合は10ng/m
lより低かった。
実施例２ 重合IgG量を高めることにより、最高CKMB値を与えた
前記18検体のうちの３検体についてCKMB値を減少させる
試みを行った。完全抗−CKMB抗体接合体をデテクター抗
体として用いた。
前記18検体のうちの３検体についてCKMB値を減少させる
試みを行った。完全抗−CKMB抗体接合体をデテクター抗
体として用いた。
図２は、アッセイ１回あたり80μｇという多量の重合
IgGを用いてもこれら３検体の見掛けCKMB値を12ng/mlよ
り下には減少できなかったことを示している。それらの
結果は、完全抗体接合体をイムノアッセイのデテクター
抗体として用いた場合には重合IgGが非特異的結合を効
果的に低下させないことを示唆している。
IgGを用いてもこれら３検体の見掛けCKMB値を12ng/mlよ
り下には減少できなかったことを示している。それらの
結果は、完全抗体接合体をイムノアッセイのデテクター
抗体として用いた場合には重合IgGが非特異的結合を効
果的に低下させないことを示唆している。
実施例３ 偽陽性結果を示した前記実施例２で評価された３検体
のうちの２検体（＃8623および＃6609）を様々な量の未
重合ポリクローナルマウスIgGおよび完全抗体接合体を
用いることにより評価した。
のうちの２検体（＃8623および＃6609）を様々な量の未
重合ポリクローナルマウスIgGおよび完全抗体接合体を
用いることにより評価した。
図３は、これら検体のうちの１検体（検体＃6609）で
得られた偽陽性結果を、1ng/ml以下の未重合ポリクロー
ナルマウスIgGを用いて12ng/mlより低いCKMB値に低下さ
せ得たことを示している。しかしながらかかる結果は他
方の検体（検体＃8623）については得られなかった、す
なわち偽陽性結果を除去し得なかった。これらの結果
は、完全抗体接合体をイムノアッセイのデテクター試薬
として用いた場合には、未重合ポリクローナルマウスIg
Gは一部の患者検体中の干渉検体の存在による非特異的
結合を完全には除去しないことを示唆している。
得られた偽陽性結果を、1ng/ml以下の未重合ポリクロー
ナルマウスIgGを用いて12ng/mlより低いCKMB値に低下さ
せ得たことを示している。しかしながらかかる結果は他
方の検体（検体＃8623）については得られなかった、す
なわち偽陽性結果を除去し得なかった。これらの結果
は、完全抗体接合体をイムノアッセイのデテクター試薬
として用いた場合には、未重合ポリクローナルマウスIg
Gは一部の患者検体中の干渉検体の存在による非特異的
結合を完全には除去しないことを示唆している。
実施例４ 検体＃6609を次に、未重合ポリクローナルマウスIgG
の存在下または非存在下に免疫反応性抗−CKMB抗体断片
接合体をデテクター抗体として用いて評価した。具体的
には、β−ガラクトシダーゼにカプリングされたＦ（a
b′）2をデテクター抗体として用いた。未重合ポリクロ
ーナルマウスIgGの量を最適化した。
の存在下または非存在下に免疫反応性抗−CKMB抗体断片
接合体をデテクター抗体として用いて評価した。具体的
には、β−ガラクトシダーゼにカプリングされたＦ（a
b′）2をデテクター抗体として用いた。未重合ポリクロ
ーナルマウスIgGの量を最適化した。
図４はＦ（ab′）2接合体それだけでは検体中の偽陽
性結果の除去に効果的でなかったことを示す。しかしな
がら、Ｆ（ab′）2接合体を１回のアッセイあたり50μ
ｇという少量の未重合ポリクローナルマウスIgGと共に
用いると、検体中の干渉抗体の存在による非特異的結合
が完全に除去された。
性結果の除去に効果的でなかったことを示す。しかしな
がら、Ｆ（ab′）2接合体を１回のアッセイあたり50μ
ｇという少量の未重合ポリクローナルマウスIgGと共に
用いると、検体中の干渉抗体の存在による非特異的結合
が完全に除去された。
実施例５ 前記実施例１に記載されているように偽陽性結果を与
えた18検体すべてを、重合IgGおよびポリクローナルマ
ウスIgG（Scantibodies Laboratory,サンティー（Sante
e），カルホルニア州）の非存在下および存在下にＦ（a
b′）2接合体をデテクター抗体を用いて再分析した。
えた18検体すべてを、重合IgGおよびポリクローナルマ
ウスIgG（Scantibodies Laboratory,サンティー（Sante
e），カルホルニア州）の非存在下および存在下にＦ（a
b′）2接合体をデテクター抗体を用いて再分析した。
図５は、Ｆ（ab′）2接合体および未重合ポリクロー
ナルIgGの使用が試験されたすべての患者検体中の非特
異的結合による問題を実質的に除去したことを示してい
る。
ナルIgGの使用が試験されたすべての患者検体中の非特
異的結合による問題を実質的に除去したことを示してい
る。
実施例６ hCGのイムノアッセイにおける非特異的結合に対するポ
リクローナルマウスIgGの効果 ａ）Ｆ（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体試薬の製
造 デテクター抗体断片接合体の製造に用いられた抗−hC
Gモノクローナル抗体（Hybritech 514）をHybritech In
c.社（P.O.Box 269006,サンジェゴ，カリホルニア州921
26）から購入した。この抗体は約３×10-10Ｍのアフィ
ニティーを有するβ鎖特異的モノクローナル抗体であっ
た。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十
分なアフィニティーを有する任意の抗−hCGモノクロー
ナル抗体を用いることができ、またかかる抗体は当業者
に知られた技法、例えばKohlerおよびMilstein,Nature,
256:495〜497（1975年８月７日）に記載の方法を用いて
製造することができる。Ｆ（ab′）2断片およびＦ（a
b′）2β−ガラクトシダーゼ接合体は前記ａ）および
ｂ）と同様に製造した。
リクローナルマウスIgGの効果 ａ）Ｆ（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体試薬の製
造 デテクター抗体断片接合体の製造に用いられた抗−hC
Gモノクローナル抗体（Hybritech 514）をHybritech In
c.社（P.O.Box 269006,サンジェゴ，カリホルニア州921
26）から購入した。この抗体は約３×10-10Ｍのアフィ
ニティーを有するβ鎖特異的モノクローナル抗体であっ
た。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十
分なアフィニティーを有する任意の抗−hCGモノクロー
ナル抗体を用いることができ、またかかる抗体は当業者
に知られた技法、例えばKohlerおよびMilstein,Nature,
256:495〜497（1975年８月７日）に記載の方法を用いて
製造することができる。Ｆ（ab′）2断片およびＦ（a
b′）2β−ガラクトシダーゼ接合体は前記ａ）および
ｂ）と同様に製造した。
前記実施例１と同様にして製造された濃縮接合体の溶
液をある量のβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈緩衝液
（100mM PIPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％（w/v）
牛血清アルブミン、および167μg/mlのプロティン−Ａ
精製マウスIgGを含有する。pH7.0）で希釈して４×10-9
M β−ガラクトシダーゼの最終濃度とする。
液をある量のβ−ガラクトシダーゼ接合体希釈緩衝液
（100mM PIPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％（w/v）
牛血清アルブミン、および167μg/mlのプロティン−Ａ
精製マウスIgGを含有する。pH7.0）で希釈して４×10-9
M β−ガラクトシダーゼの最終濃度とする。
ｂ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−hCG捕獲
抗体 二酸化クロム粒子は、1987年４月28日にLauらに付与
された米国特許第4,661,408号に実質的に記載されてい
るように製造したところ、その開示を引用により本明細
書の記載に含める。捕獲抗体として用いられらた抗−hC
G抗体（Du Pont細胞系統34/25）は、全分子hCGを免疫原
として用い、そしてモノクローナル抗体の生産について
当該技術分野において知られる常法を用いて製造され
た。使用した抗体は約３×10-10のアフィニティーを有
するα−鎖特異的抗−hCGモノクローナル抗体であっ
た。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十
分なアフィニティーを有する任意の抗−hCGモノクロー
ナル抗体を用いることができ、そしてかかる抗体は、モ
ノクローナル抗体の生産について当該技術分野において
知られる技法例えば前述のKohlerおよびMilsteinの方法
を用いて製造することができる。
抗体 二酸化クロム粒子は、1987年４月28日にLauらに付与
された米国特許第4,661,408号に実質的に記載されてい
るように製造したところ、その開示を引用により本明細
書の記載に含める。捕獲抗体として用いられらた抗−hC
G抗体（Du Pont細胞系統34/25）は、全分子hCGを免疫原
として用い、そしてモノクローナル抗体の生産について
当該技術分野において知られる常法を用いて製造され
た。使用した抗体は約３×10-10のアフィニティーを有
するα−鎖特異的抗−hCGモノクローナル抗体であっ
た。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十
分なアフィニティーを有する任意の抗−hCGモノクロー
ナル抗体を用いることができ、そしてかかる抗体は、モ
ノクローナル抗体の生産について当該技術分野において
知られる技法例えば前述のKohlerおよびMilsteinの方法
を用いて製造することができる。
捕獲抗−hCG抗体は、前記ｃ）に記載されているよう
に二酸化クロム粒子にカプリングした。抗−hCG捕獲抗
体を0.75mg/mlの最終濃度となるように25mg/mlの固体を
含有する二酸化クロム粒子のスラリーに添加した。この
ようにして得られた抗−hCG捕獲抗体被覆二酸化クロム
粒子スラリーを、不活性物質として添加された9.83mgの
トレハロース、0.98mgのカーボワックスおよび0.03mgの
チメロソルと共に、１錠あたり3.0mgの抗体被覆二酸化
クロム粒子を含有する錠剤にした。それら錠剤は、1976
年１月20日にBriggsらに付与された米国特許第3,932,94
3号に実質的に開示されたような方法を用いて製造され
たところ、その開示を引用により本発明の記載に含め
る。
に二酸化クロム粒子にカプリングした。抗−hCG捕獲抗
体を0.75mg/mlの最終濃度となるように25mg/mlの固体を
含有する二酸化クロム粒子のスラリーに添加した。この
ようにして得られた抗−hCG捕獲抗体被覆二酸化クロム
粒子スラリーを、不活性物質として添加された9.83mgの
トレハロース、0.98mgのカーボワックスおよび0.03mgの
チメロソルと共に、１錠あたり3.0mgの抗体被覆二酸化
クロム粒子を含有する錠剤にした。それら錠剤は、1976
年１月20日にBriggsらに付与された米国特許第3,932,94
3号に実質的に開示されたような方法を用いて製造され
たところ、その開示を引用により本発明の記載に含め
る。
ｃ）hCGのイムノアッセイにおける非特異的結合に対す
るポリクローナルIgGの効果 抗−hCG捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子を含む５個の
錠剤を3mlの水に溶解しそしてそれら試験管を室温で15
分間インキュベートした。250μｇの二酸化クロム粒子
固体を22本の12mm×75mmポリエチレン試験管に分注し
た。一連のhCGキャリブレーター（０、25、100、300お
よび500m IU/mlのヒトhCG/ml;hCGは妊婦尿から精製しそ
して世界保健機関（WHO）のファースト・インターナシ
ョナル・レファレンス・プレパレーション（1stInterna
tional Reference Preparation;略してFirst IRP）に従
って標準化した）の各々の10μｌを一連の試験管に添加
し（各キャリブレーター濃度について重複実験用試験管
を用意した）、次にその内容物を渦流生成により混合し
そして37℃加熱ブロックに２分間置いた。同様に、三つ
の患者検体の各々の10μｌを12本の試験管（各患者検体
について２セツトの重複実験用試験管を用意した）に添
加し、それらの内容物を次に渦流生成により混合し、そ
して37℃加熱ブロックに２分間置いた。400μｌの適切
に希釈されたＦ（ab′）2−β−ガラクトシダーゼ接合
体試薬（100mM PIPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％
（w/v）牛血清アルブミンおよび167μg/mlプロティン−
Ａ精製マウスIgGを含む接合体希釈緩衝液（pH7.0）で希
釈された４×10-9Ｍβ−ガラクトシダーゼ標識抗体接合
体）をキャリブレーターを含有する10本の試験管の各々
に、および患者検体を含有する６本の試験管（各患者検
体について２本の試験管）に添加し、そして各管の内容
物を渦流生成により混合し、次いで37℃で15分間インキ
ュベートした。同様にして400μｌの適切に希釈された
Ｆ（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体試薬（100mM P
IPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％（w/v）牛血清アル
ブミンを含むがポリクローナルマウスIgGは含まない接
合体希釈緩衝液で希釈されたβ−ガラクトシダーゼ標識
抗体接合体）を残る患者検体含有試験管６本（各患者検
体について試験管２本）の各々に添加し、そして各管の
内容物を渦流生成により混合し、次いで37℃で15分間イ
ンキュベートした。15分後に、管を磁気試験管立てに粒
子が試験管の側壁に磁気的に保持されるように置くこと
によりすべての管に含まれる粒子を分離した。各管の上
清を吸引により除去し、500μｌの洗浄緩衝液（250mM T
ris、50mMホウ酸ナトリウム、pH7.85）を各管に添加
し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。その洗浄
手順をさらに２回繰り返した。最終洗浄の後、75μｌの
再懸濁緩衝液（0.03M HEPES、0.02MナトリウムHEPES、
0.01M酢酸マグネシウム、および0.005％Tween20、pH7.
6）を添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁し
た。そして60μｌの粒子を、ディンプル２にはHEPES錠
剤をそしてディンプル３にはCPRG錠剤を含んでいるaca
CPRGパック標準的aca ディスクリート臨床アナライ
ザーパック（aca ディスクリート臨床アナライザーと
共に用いるべく、デラウエア州ウイルミントンのE.I.du
Pont de Nemours and Companyから入手できる）のディ
ンプル１に分注した。ここでディンプル２および３とは
標準的aca ディスクリート臨床アナライザーパック内
の錠剤貯蔵区域のことであり、CPRG錠剤は3mgのクロロ
フェノールレッドガラクトシド、8.75mgのトレハロー
ス、30mgのマンニトールおよび3.15mgのカーボワックス
〔20μｍ〕を含有し（これは1976年１月20日にBriggsら
に付与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示さ
れた方法を用いて製造された）、またHEPES錠剤は40.4m
gのナトリウムHEPES、22.8mgのHEPES、7.0mgのソルビト
ール、1.15mgの酢酸マグネシウム、および4.0mgのカー
ボワックス〔20μｍ〕を含有する（これは当該技術分野
に知られらた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。
それらパックをセロファンテープでシールし、そして粒
子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性をaca で測定
した。aca での測定値は次のようにして得られた。パ
ックをaca にかけたところで2mlのホスフェート緩衝液
（pH7.8）および3mlの水をパックに分注した。ブレーカ
ーミキサー１（錠剤試薬を破砕し、そして試薬の混合を
助長するaca ディスクリート臨床アナライザーパック
の一成分である）を用いてHEPESおよびCPRG錠剤を溶解
しそして粒子を懸濁させた。結合したβ−ガラクトシダ
ーゼ酵素はCPRGと反応して37℃でクロロフェノールレッ
ド（CPR）を形成した。4.2分後、形成されたCPRを577お
よび600nm波長で測定した。577nmはCPRが吸収極大を有
する第一波長であり、そして600nmはブランク用波長で
ある。600nmでの読みを577nmでの読みから差し引いた。
aca での二色法終点読みと呼ばれる、577nmでの測定値
から600nmでの測定値を引いたものをhCGキャリブレータ
ーの濃度に対してプロットして標準曲線を作成した。結
果を図６に示す。図６は、未重合マウスIgGの存在下お
よび非存在下で三つの患者検体の各々について測定され
たhCG測定値を示す。それらの結果はhCGのイムノアッセ
イにおける偽陽性結果を減少させる上での未重合マウス
IgGの効果を示している。
るポリクローナルIgGの効果 抗−hCG捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子を含む５個の
錠剤を3mlの水に溶解しそしてそれら試験管を室温で15
分間インキュベートした。250μｇの二酸化クロム粒子
固体を22本の12mm×75mmポリエチレン試験管に分注し
た。一連のhCGキャリブレーター（０、25、100、300お
よび500m IU/mlのヒトhCG/ml;hCGは妊婦尿から精製しそ
して世界保健機関（WHO）のファースト・インターナシ
ョナル・レファレンス・プレパレーション（1stInterna
tional Reference Preparation;略してFirst IRP）に従
って標準化した）の各々の10μｌを一連の試験管に添加
し（各キャリブレーター濃度について重複実験用試験管
を用意した）、次にその内容物を渦流生成により混合し
そして37℃加熱ブロックに２分間置いた。同様に、三つ
の患者検体の各々の10μｌを12本の試験管（各患者検体
について２セツトの重複実験用試験管を用意した）に添
加し、それらの内容物を次に渦流生成により混合し、そ
して37℃加熱ブロックに２分間置いた。400μｌの適切
に希釈されたＦ（ab′）2−β−ガラクトシダーゼ接合
体試薬（100mM PIPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％
（w/v）牛血清アルブミンおよび167μg/mlプロティン−
Ａ精製マウスIgGを含む接合体希釈緩衝液（pH7.0）で希
釈された４×10-9Ｍβ−ガラクトシダーゼ標識抗体接合
体）をキャリブレーターを含有する10本の試験管の各々
に、および患者検体を含有する６本の試験管（各患者検
体について２本の試験管）に添加し、そして各管の内容
物を渦流生成により混合し、次いで37℃で15分間インキ
ュベートした。同様にして400μｌの適切に希釈された
Ｆ（ab′）2β−ガラクトシダーゼ接合体試薬（100mM P
IPES、1mM MgCl2、500mM NaCl、10％（w/v）牛血清アル
ブミンを含むがポリクローナルマウスIgGは含まない接
合体希釈緩衝液で希釈されたβ−ガラクトシダーゼ標識
抗体接合体）を残る患者検体含有試験管６本（各患者検
体について試験管２本）の各々に添加し、そして各管の
内容物を渦流生成により混合し、次いで37℃で15分間イ
ンキュベートした。15分後に、管を磁気試験管立てに粒
子が試験管の側壁に磁気的に保持されるように置くこと
によりすべての管に含まれる粒子を分離した。各管の上
清を吸引により除去し、500μｌの洗浄緩衝液（250mM T
ris、50mMホウ酸ナトリウム、pH7.85）を各管に添加
し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。その洗浄
手順をさらに２回繰り返した。最終洗浄の後、75μｌの
再懸濁緩衝液（0.03M HEPES、0.02MナトリウムHEPES、
0.01M酢酸マグネシウム、および0.005％Tween20、pH7.
6）を添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁し
た。そして60μｌの粒子を、ディンプル２にはHEPES錠
剤をそしてディンプル３にはCPRG錠剤を含んでいるaca
CPRGパック標準的aca ディスクリート臨床アナライ
ザーパック（aca ディスクリート臨床アナライザーと
共に用いるべく、デラウエア州ウイルミントンのE.I.du
Pont de Nemours and Companyから入手できる）のディ
ンプル１に分注した。ここでディンプル２および３とは
標準的aca ディスクリート臨床アナライザーパック内
の錠剤貯蔵区域のことであり、CPRG錠剤は3mgのクロロ
フェノールレッドガラクトシド、8.75mgのトレハロー
ス、30mgのマンニトールおよび3.15mgのカーボワックス
〔20μｍ〕を含有し（これは1976年１月20日にBriggsら
に付与された米国特許第3,932,943号に実質的に開示さ
れた方法を用いて製造された）、またHEPES錠剤は40.4m
gのナトリウムHEPES、22.8mgのHEPES、7.0mgのソルビト
ール、1.15mgの酢酸マグネシウム、および4.0mgのカー
ボワックス〔20μｍ〕を含有する（これは当該技術分野
に知られらた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。
それらパックをセロファンテープでシールし、そして粒
子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性をaca で測定
した。aca での測定値は次のようにして得られた。パ
ックをaca にかけたところで2mlのホスフェート緩衝液
（pH7.8）および3mlの水をパックに分注した。ブレーカ
ーミキサー１（錠剤試薬を破砕し、そして試薬の混合を
助長するaca ディスクリート臨床アナライザーパック
の一成分である）を用いてHEPESおよびCPRG錠剤を溶解
しそして粒子を懸濁させた。結合したβ−ガラクトシダ
ーゼ酵素はCPRGと反応して37℃でクロロフェノールレッ
ド（CPR）を形成した。4.2分後、形成されたCPRを577お
よび600nm波長で測定した。577nmはCPRが吸収極大を有
する第一波長であり、そして600nmはブランク用波長で
ある。600nmでの読みを577nmでの読みから差し引いた。
aca での二色法終点読みと呼ばれる、577nmでの測定値
から600nmでの測定値を引いたものをhCGキャリブレータ
ーの濃度に対してプロットして標準曲線を作成した。結
果を図６に示す。図６は、未重合マウスIgGの存在下お
よび非存在下で三つの患者検体の各々について測定され
たhCG測定値を示す。それらの結果はhCGのイムノアッセ
イにおける偽陽性結果を減少させる上での未重合マウス
IgGの効果を示している。
Claims (5)
- 【請求項１】デテクター抗体としての免疫反応性抗体断
片接合体および未重合IgGを被検体の有無を検査しよう
とする検体中に存在する干渉抗体と反応させることより
成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイにおける誤
結果を実質的に除去する方法。 - 【請求項２】免疫反応性断片がFab、Fab′またはＦ（a
b′）2より成る群より選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】生物種がマウス、ラット、ウサギ、ヤギま
たはウマより成る群より選択される請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】抗原がCKMB、TSHまたはhCGより成る群より
選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】未重合IgGが捕獲抗体および接合体と同種
に由来する請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US73615691A | 1991-07-26 | 1991-07-26 | |
| US736,156 | 1991-07-26 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06509420A JPH06509420A (ja) | 1994-10-20 |
| JP2716103B2 true JP2716103B2 (ja) | 1998-02-18 |
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ID=24958727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5503596A Expired - Lifetime JP2716103B2 (ja) | 1991-07-26 | 1992-07-23 | イムノアッセイにおける誤結果除去方法 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP2716103B2 (ja) |
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-
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