JP2714143B2 - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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- JP2714143B2 JP2714143B2 JP1150743A JP15074389A JP2714143B2 JP 2714143 B2 JP2714143 B2 JP 2714143B2 JP 1150743 A JP1150743 A JP 1150743A JP 15074389 A JP15074389 A JP 15074389A JP 2714143 B2 JP2714143 B2 JP 2714143B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新しいB/F分離方法を用いて抗原又は抗体
を特異的に測定するようにした免疫学的測定方法に関す
る。
を特異的に測定するようにした免疫学的測定方法に関す
る。
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法としてEIA法が
近年急激に行われるようになった。EIA法においては、
通常ビーズ、プレート、磁性粒子、シリコン、ガラス、
ディスク、濾紙等の不溶性担体に固定化した抗原又は抗
体を用いて検体中の微量成分、例えば、CEA、インシュ
リン、HBs抗原、HBs抗体を正確に測定できるようになっ
た。このようなビーズ等の不溶性担体を用いた測定法
は、抗原抗体反応によって結合した物質（Bound）と結
合していない物質（Free）の分離（B/F分離）の操作を
行った後に、試料中の微量成分を測定する。よく使われ
ている２ステップサンドイッチ法では、これはあらかじ
め抗原又は第一抗体を固定化した不溶性担体に試料中の
抗体又は抗原を反応させ、洗浄後、酵素標識第二抗体を
加え反応させる。この不溶性担体を十分に洗浄すること
によってB/F分離を行い、基質を加え酵素活性測定する
ことによって試料中の抗原又は抗体を測定することがで
きる。
近年急激に行われるようになった。EIA法においては、
通常ビーズ、プレート、磁性粒子、シリコン、ガラス、
ディスク、濾紙等の不溶性担体に固定化した抗原又は抗
体を用いて検体中の微量成分、例えば、CEA、インシュ
リン、HBs抗原、HBs抗体を正確に測定できるようになっ
た。このようなビーズ等の不溶性担体を用いた測定法
は、抗原抗体反応によって結合した物質（Bound）と結
合していない物質（Free）の分離（B/F分離）の操作を
行った後に、試料中の微量成分を測定する。よく使われ
ている２ステップサンドイッチ法では、これはあらかじ
め抗原又は第一抗体を固定化した不溶性担体に試料中の
抗体又は抗原を反応させ、洗浄後、酵素標識第二抗体を
加え反応させる。この不溶性担体を十分に洗浄すること
によってB/F分離を行い、基質を加え酵素活性測定する
ことによって試料中の抗原又は抗体を測定することがで
きる。
また、第一抗体、第二抗体ともにモノクロナール抗体
を用いれば、同時に第一抗体を固定化した不溶性担体に
検体と酵素標識第二抗体を同時に加えることができ、抗
原抗体反応を一段階で済ませることができるので、操作
時間が２ステップサンドイッチより短くて済み、手間も
省ける。
を用いれば、同時に第一抗体を固定化した不溶性担体に
検体と酵素標識第二抗体を同時に加えることができ、抗
原抗体反応を一段階で済ませることができるので、操作
時間が２ステップサンドイッチより短くて済み、手間も
省ける。
最近、酸化鉄等の磁性粒子を用いて磁石によってB/F
分離を迅速に行う方法がEIA自動分析装置に応用される
ようになった。
分離を迅速に行う方法がEIA自動分析装置に応用される
ようになった。
本発明は、従来のように抗原抗体反応を固相上で行わ
せるのではなく、液相での反応を用いかつB/F分離を容
易に行うことによって、操作性、時間短縮をはかり、さ
らには自動化を容易に行う目的で発明されたものであ
る。
せるのではなく、液相での反応を用いかつB/F分離を容
易に行うことによって、操作性、時間短縮をはかり、さ
らには自動化を容易に行う目的で発明されたものであ
る。
本発明は、吸着体、例えば澱粉のアミラーゼに対する特
異的な結合性に着目しB/F分離を容易かつ迅速に行うこ
とが可能となることを見出し完成されたものである。
異的な結合性に着目しB/F分離を容易かつ迅速に行うこ
とが可能となることを見出し完成されたものである。
本発明は、抗原抗体反応時において液層での反応が可
能であることにより反応時間で短縮でき、試料中の微量
成分と抗原抗体反応によって生じたアミラーゼ標識抗体
−抗原−非アミラーゼ標識抗体の抗原抗体反応複合物を
アミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してB/F分離
を容易かつ迅速に行い、当該微量成分を極めて効率的に
測定できるようにし、また自動化を容易に行うための免
疫学的測定方法を提供することを目的とする。
能であることにより反応時間で短縮でき、試料中の微量
成分と抗原抗体反応によって生じたアミラーゼ標識抗体
−抗原−非アミラーゼ標識抗体の抗原抗体反応複合物を
アミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してB/F分離
を容易かつ迅速に行い、当該微量成分を極めて効率的に
測定できるようにし、また自動化を容易に行うための免
疫学的測定方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の免疫学的測定方法
の第１の態様においては、試料中の抗原に特異的な非ア
ミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗体を反応させた
後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分離を
行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標識活
性により試料中の抗原を測定するものである。本発明の
免疫学的測定方法の第２の態様においては、試料中の抗
体に特異的な非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標識抗
原を反応させた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体に
よりB/F分離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標
識抗原の標識活性により試料中の抗体を測定するもので
ある。本発明の免疫学的測定方法の第３の態様において
は、試料中の抗原と競合する非アミラーゼ標識抗原とア
ミラーゼ標識抗体を反応させた後、アミラーゼに結合性
の強い吸着体によりB/F分離を行い該吸着体に吸着した
非アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗原を
測定するものである。本発明の免疫学的測定方法の第４
の態様においては、試料中の抗体と競合する非アミラー
ゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗原を反応させた後、アミ
ラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分離を行い該吸
着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標識活性により
試料中の抗体を測定するものである。
の第１の態様においては、試料中の抗原に特異的な非ア
ミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗体を反応させた
後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分離を
行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標識活
性により試料中の抗原を測定するものである。本発明の
免疫学的測定方法の第２の態様においては、試料中の抗
体に特異的な非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標識抗
原を反応させた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体に
よりB/F分離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標
識抗原の標識活性により試料中の抗体を測定するもので
ある。本発明の免疫学的測定方法の第３の態様において
は、試料中の抗原と競合する非アミラーゼ標識抗原とア
ミラーゼ標識抗体を反応させた後、アミラーゼに結合性
の強い吸着体によりB/F分離を行い該吸着体に吸着した
非アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗原を
測定するものである。本発明の免疫学的測定方法の第４
の態様においては、試料中の抗体と競合する非アミラー
ゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗原を反応させた後、アミ
ラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分離を行い該吸
着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標識活性により
試料中の抗体を測定するものである。
該アミラーゼに結合性の強い吸着体、即ち不溶性の担
体として、好ましいのは澱粉である。この吸着体の形態
としては、粉末、ディスク、濾紙、カラム等自由に成形
したものを用いることができる。
体として、好ましいのは澱粉である。この吸着体の形態
としては、粉末、ディスク、濾紙、カラム等自由に成形
したものを用いることができる。
本発明の非アミラーゼ標識抗体及びアミラーゼ標識抗
体に用いる抗体は、モノクロナール抗体、またはポリク
ロナール抗体を問わず使用できる。また、モノクロナー
ル抗体とポリクロナール抗体を組み合わせてもよい。好
ましくは、エピトープの異なる抗体を用いることが望ま
しい。
体に用いる抗体は、モノクロナール抗体、またはポリク
ロナール抗体を問わず使用できる。また、モノクロナー
ル抗体とポリクロナール抗体を組み合わせてもよい。好
ましくは、エピトープの異なる抗体を用いることが望ま
しい。
本発明のアミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼ等の各
種のアミラーゼを用いることができる。本発明におい
て、安定性や澱粉に対する吸着性のよい微生物由来のBa
cillus aubtilis （液化型）が好ましい。
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼ等の各
種のアミラーゼを用いることができる。本発明におい
て、安定性や澱粉に対する吸着性のよい微生物由来のBa
cillus aubtilis （液化型）が好ましい。
さらに、アミラーゼの吸着体に利用する澱粉にはトウ
モロコシ、小麦、米、ジャガイモ、サツマイモ等のもの
が使用できる。これら澱粉の吸着性は、加圧加熱法や加
熱法により増強させることができる。
モロコシ、小麦、米、ジャガイモ、サツマイモ等のもの
が使用できる。これら澱粉の吸着性は、加圧加熱法や加
熱法により増強させることができる。
非アミラーゼ標識抗体に用いる標識物質にはアミラー
ゼ以外の酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、補酵
素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、磁性物
質等の直接、間接的に測定可能な検知物質であれば使用
可能である。
ゼ以外の酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、補酵
素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、磁性物
質等の直接、間接的に測定可能な検知物質であれば使用
可能である。
（作用） 抗原又は抗体の測定方法の態様について以下に述べ
る。
る。
抗原の測定 試料中の抗原に、特異的な非アミラーゼ標識抗体とア
ミラーゼ標識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗体を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応
を起こした非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定す
る。
ミラーゼ標識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗体を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応
を起こした非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定す
る。
試料中の抗原に非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標
識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
原を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応を起こした
非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定する。
識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
原を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応を起こした
非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定する。
抗体の測定 試料中の抗体に、特異的な非アミラーゼ標識抗原とア
ミラーゼ標識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗原を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応
を起こした非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定す
る。
ミラーゼ標識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗原を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応
を起こした非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定す
る。
試料中の抗体に非アミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標
識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
体を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応を起こした
非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定する。
識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
体を除去し、B/F分離を行い、抗原抗体反応を起こした
非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定する。
（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
試薬 抗原（CEA）の各種濃度の標準液（0,2.5,5,10,20,40,
80 ng/ml） アミラーゼ標識抗体 ペルオキシダーゼ標識抗体 トウモロコシ澱粉 基質液（50mMクエン酸緩衝液、5mM過酸化水素、10mM
オルトフェニレンジアミン、pH5） 停止液（4N硫酸） 操作方法 試験管に各種濃度の標準液又は検体100μｌとアミラ
ーゼ標識抗体及びペルオキシダーゼ標識抗体各200μｌ
づつ加え37℃10分間反応させる。
80 ng/ml） アミラーゼ標識抗体 ペルオキシダーゼ標識抗体 トウモロコシ澱粉 基質液（50mMクエン酸緩衝液、5mM過酸化水素、10mM
オルトフェニレンジアミン、pH5） 停止液（4N硫酸） 操作方法 試験管に各種濃度の標準液又は検体100μｌとアミラ
ーゼ標識抗体及びペルオキシダーゼ標識抗体各200μｌ
づつ加え37℃10分間反応させる。
反応液にトウモロコシ澱粉20mgを加え37℃10分間吸着
させる。
させる。
2000G以上で１分間遠心後上澄みを捨てる。
洗浄液（生理食塩水）1mlで３回洗浄する。
沈渣に基質液500μｌを加え、37℃30分間反応後停止
液200μｌを加える。
液200μｌを加える。
2000G以上で１分間遠心後上澄み200μｌをマイクロプ
レートに移し、マイクロプレートリーダーで波長492/63
0nmで吸光度を測定する。
レートに移し、マイクロプレートリーダーで波長492/63
0nmで吸光度を測定する。
結果 CEA濃度80ng/ml以下で良好な検量線が得られた（第１
図）。
図）。
実施例２ 実施例１と同様の試薬を用い、澱粉充填カラムによる
B/F分離を行った場合を説明する。
B/F分離を行った場合を説明する。
操作方法 試験管にCEA濃度０と80ng/mlの標準液100μｌとアミ
ラーゼ標識抗体及びペルオキシダーゼ標識抗体各200μ
ｌづつ加え37℃10分間反応させる。
ラーゼ標識抗体及びペルオキシダーゼ標識抗体各200μ
ｌづつ加え37℃10分間反応させる。
反応液をトウモロコシ澱粉20mg充填カラムに流し吸着
させる。
させる。
洗浄液（生理食塩水）5mlを流し洗浄する。
カラムの下方をコックで止める。
カラムに基質液500μｌを加え反応させる。
発色の強さを目視判定する。
結果 CEA80ng/mlのものは強く黄色に発色しCEA濃度０と80n
g/mlとの間に有意な差があった。
g/mlとの間に有意な差があった。
以上のように、本発明によれば、抗原抗体反応時にお
いて被層での反応が可能であることにより反応時間が短
縮でき、試料中の微量成分と抗原抗体反応によって生じ
たアミラーゼ標識抗体−抗原−標識抗体の抗原抗体反応
複合物をアミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着して
B/F分離を容易かつ迅速に行い、当該微量成分を極めて
効率的に測定できるという効果が達成される。
いて被層での反応が可能であることにより反応時間が短
縮でき、試料中の微量成分と抗原抗体反応によって生じ
たアミラーゼ標識抗体−抗原−標識抗体の抗原抗体反応
複合物をアミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着して
B/F分離を容易かつ迅速に行い、当該微量成分を極めて
効率的に測定できるという効果が達成される。
第１図は実施例１によって得た検量線を示すグラフであ
る。
る。
Claims (6)
- 【請求項１】液相均一系において試料中の抗原に特異的
な非アミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗体を反応さ
せた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分
離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標
識活性により試料中の抗原を測定することを特徴とする
免疫学的測定方法。 - 【請求項２】液相均一系において試料中の抗体に特異的
な非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標識抗原を反応さ
せた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分
離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗原の標
識活性により試料中の抗体を測定することを特徴とする
免疫学的測定方法。 - 【請求項３】液相均一系において試料中の抗原と競合す
る非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標識抗体を反応さ
せた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分
離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗原の標
識活性により試料中の抗原を測定することを特徴とする
免疫学的測定方法。 - 【請求項４】液相均一系において試料中の抗体と競合す
る非アミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗原を反応さ
せた後、アミラーゼに結合性の強い吸着体によりB/F分
離を行い該吸着体に吸着した非アミラーゼ標識抗体の標
識活性により試料中の抗体を測定することを特徴とする
免疫学的測定方法。 - 【請求項５】前記アミラーゼに結合性の強い吸着体が澱
粉であることを特徴とする請求項（１）〜（４）のいず
れか１項記載の免疫学的測定方法。 - 【請求項６】非アミラーゼ標識抗原又は抗体を用いる
際、標識がアミラーゼ以外の酵素であることを特徴とす
る請求項（１）〜（５）のいずれか１項記載の免疫学的
測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1150743A JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1150743A JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0315759A JPH0315759A (ja) | 1991-01-24 |
| JP2714143B2 true JP2714143B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=15503448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1150743A Expired - Fee Related JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2714143B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5090100B2 (ja) | 2007-08-09 | 2012-12-05 | 豊田合成株式会社 | インフレーター |
| JP4332189B2 (ja) | 2007-08-09 | 2009-09-16 | トヨタ自動車株式会社 | インフレータ及びこれを用いた車両用エアバッグ装置 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8307156D0 (en) * | 1983-03-15 | 1983-04-20 | Celltech Ltd | Heterogeneous binding assays |
| JPS6339895A (ja) * | 1986-05-15 | 1988-02-20 | イ−・アイ・デユポン・ド・ネモア−ス・アンド・コンパニ− | 液体支持体を用いるバイオアフイニテイ−およびイオン交換分離 |
-
1989
- 1989-06-14 JP JP1150743A patent/JP2714143B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0315759A (ja) | 1991-01-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |