JP2706461B2 - Release of suppression of oxygen production - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はコリスメートムターゼ（chorismate mutas
e）及び／又はプレフェネートデヒドラターゼ（prephen
ate dehydratase）活性を持つ酵素、およびフェニルア
ラニンのような所望の化合物の製造における該酵素の使
用に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to chorismate mutas
e) and / or prephenate dehydratase (prephen)
ate dehydratase) activity and the use of said enzymes in the production of desired compounds such as phenylalanine.

（従来の技術） 微生物におけるフェニルアラニンの合成経路は、コリ
スメートムターゼ及びプレフェネートデヒドラターゼ
（CMPD）活性を有する２機能単一酵素または２種類の酵
素により触媒される反応が含まれていることが知られて
いる。一般的に、この活性はフェニルアラニンによるフ
ィードバック阻害を受けている。大腸菌（Escherichia
coli）は、pheAと命名されたCMPD活性をコードする染色
体遺伝子を持っている。(Prior Art) It is known that the synthesis pathway of phenylalanine in microorganisms includes a reaction catalyzed by a bifunctional single enzyme or two kinds of enzymes having chorismate mutase and prephenate dehydratase (CMPD) activities. Have been. Generally, this activity is subject to feedback inhibition by phenylalanine. Escherichia coli
coli) has a chromosomal gene encoding CMPD activity, designated pheA.

トライブ（Tribe）は、オーストラリアの出願公開第7
2727/81号でNST37と命名された大腸菌の突然変異株がフ
ェニルアラニンによる阻害を実質的に受けないコリスメ
ートムターゼプロフェネートデヒドラターゼを生産する
ことを述べている。Tribe is an Australian Application Publication No. 7
No. 2727/81 states that a mutant strain of E. coli designated NST37 produces chorismate mutase profenate dehydratase that is substantially unaffected by phenylalanine.

ハドソン（Hadoson）とデビットソン（Davidoson）
は、J.Mol.Biol.180巻、1023−1051頁（1984）に、大腸
菌のpheAの核酸配列を発表している。Hudson and Davidson
Has published the nucleic acid sequence of E. coli pheA in J. Mol. Biol. 180, 1023-1051 (1984).

バルトウィン（Baldwin）らは、Arch.Biochem.Biophy
s.211巻、66−85頁（1981）にフェニルアラニンの濃度
の増加が２量体のCMPDを不活性な４量体および８量体に
変換させることを発表している。Baldwin et al., Arch.Biochem.Biophy
s. 211, pp. 66-85 (1981), discloses that increasing the concentration of phenylalanine converts dimeric CMPD into inactive tetramers and octamers.

ゲッシイング（Gething）とデビットソン（Davidso
n）は、Eur.J.Biochem.86巻、159−164頁（1978）に、C
MPD凝集状態での変化は二次構造の大きな変化を含んで
おらず、また、CMPDがフェニルアラニンにさらされたと
き、トリプトファン残基が疎水性の強い環境に移動する
ことを発表している。Geshing and Davidson
n) is described in Eur. J. Biochem. 86, pp. 159-164 (1978)
The changes in the MPD aggregation state do not include major changes in secondary structure, and also show that tryptophan residues move to a more hydrophobic environment when CMPD is exposed to phenylalanine.

ゲッシイング（Gething）とデビットソン（Davidso
n）は、Eur.J.Biochem.86巻、165−174頁（1978）に、C
MPDのシステイン残基を5,5−ジチオビス［ニトロベンゾ
エート］で修飾するとことでCMPDがフェニルアラニンに
よるフィードバック阻害を受けなくなることを発表して
いる。Geshing and Davidson
n) is described in Eur. J. Biochem. 86, pp. 165-174 (1978).
Modification of the cysteine residue of MPD with 5,5-dithiobis [nitrobenzoate] prevents CMPD from being inhibited by phenylalanine.

ゲッシイング（Gething）とデビットソン（Davidso
n）は、Eur.J.Biochem.78巻、111−117頁（1977）に、C
MPDの２個のトリプトファン残基をジメチル［２−ヒド
ロキシ−５−ニトロベンジルスルホニウムブロマイド］
で修飾すると一部分の活性がフィードバック阻害に耐性
の酵素ができることを発表している。Geshing and Davidson
n) is described in Eur. J. Biochem. 78, 111-117 (1977).
Two tryptophan residues of MPD were replaced with dimethyl [2-hydroxy-5-nitrobenzylsulfonium bromide]
It has been reported that modification with a peptide results in an enzyme whose partial activity is resistant to feedback inhibition.

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、実質的にフェニルアラニンによるフィード
バック阻害に対して感受性のないCMPD活性を有する一群
のタンパクをを提供することを目的とする。(Problems to be Solved by the Invention) An object of the present invention is to provide a group of proteins having CMPD activity that is substantially insensitive to feedback inhibition by phenylalanine.

（課題を解決するための手段） 本発明のタンパクは、構造式： ΓCO−Δ （式中、Γは、CMPD活性を有するアミノ酸配列であり、
大腸菌のCMPDのＮ末端から337個のアミノ酸配列に実質
的に一致しており;COは、ΓのＣ末端アミノ酸基のカル
ボニル基であり；及びΔは、−OH、−O^-、ΓのＣ末端基
にペプチド結合により結合しているトリプトファン以外
のアミノ酸残基又はΓのＣ末端基にペプチド結合により
結合しているトリプトファン以外のＮ末端残基を有する
アミノ酸配列である）で表される。(Means for Solving the Problems) The protein of the present invention has a structural formula: ΓCO-Δ (where Γ is an amino acid sequence having CMPD activity,
Substantially matches the 337 amino acid sequence from the N-terminus of E. coli CMPD; CO is the carbonyl group of the C-terminal amino acid group of Γ; and Δ is —OH, —O ⁻ , C of Γ. An amino acid residue other than tryptophan bonded to the terminal group by a peptide bond or an N-terminal residue other than tryptophan bonded to the C-terminal group of Γ by a peptide bond).

“実質的に一致”とは、CMPDと実質的に同じ活性を残
存させるのに十分な同一性を有することを意味してい
る。例えば、大腸菌に類縁の細菌のpheA遺伝子の配列は
そのような同一部分を含んでいる。実質的な活性を残存
している構造中の少しの変化（例えば、限られた数の残
基の付加、脱離もしくは非保存性置換、または多くの残
基の保存性置換）はこの用語の意味に含まれている。By "substantially identical" is meant having sufficient identity to retain substantially the same activity as CMPD. For example, the sequence of the pheA gene of a bacterium analogous to E. coli contains such an identical part. Small changes in the structure that retain substantial activity (eg, the addition of a limited number of residues, elimination or non-conservative substitutions, or conservative substitutions of many residues) Included in meaning.

好ましいΓは大腸菌のCMPDの１−337番のアミノ酸か
らなっている。その配列は、以下に述べるようにpKB912
もしくはpKB702から、又は先に引用したハドソンとデビ
ットソン（1984）に発表された次の配列： （式中、各アルファベット文字は下記の表に示されてい
る）により決定できる。Preferred Γ consists of amino acids 1-337 of E. coli CMPD. The sequence is pKB912 as described below.
Alternatively, the following sequences published from pKB702 or by Hudson and Davidson (1984) cited above: (Wherein each letter of the alphabet is shown in the table below).

Δは、−OHまた−O^-が好ましい。また、Δはアミノ酸
配列：Ψ−Ω（式中、Ψはトリプトファン以外のアミノ
酸残基またはＮ末端がトリプトファン残基以外のアミノ
酸配列であり；及びΩは配列EEMFYLDIQANLESAEMQKALKEL
GEITRSMKVLGCYPSENVVPVDPTもしくはCMPD活性以外の酵素
活性、好ましくはフェニルアラニン合成経路の酵素の活
性をコードしている配列である）で表されるものでも良
い。Ωに適した他の活性をコードする配列は、ヤニシュ
−ペロン（Yanisch−Perron）らがGene,33巻、103頁（1
985）に報告したlacZαをコードするpUC19の一部分より
生産できるlacZα、または配列RRIPGNSLAVVLQRRDWENPGV
TQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTORPSQQLRSLNGEWRLMRYFLLTHLCG
ISHRIWCTLSTICSDAAである。例えば、Ψは、arg−glyで
も良い。 Δ is, -OH also -O ^- are preferred. Δ is an amino acid sequence: Ψ-Ω (where Ψ is an amino acid residue other than tryptophan or an amino acid sequence whose N-terminus is not a tryptophan residue; and Ω is the sequence EEMFYLDIQANLESAEMQKALKEL
GEITRSMKVLGCYPSENVVPVDPT or a sequence encoding an enzyme activity other than CMPD activity, preferably an activity of an enzyme in the phenylalanine synthesis pathway). Sequences encoding other activities suitable for Ω are described by Yanisch-Perron et al. In Gene, 33, 103 (1).
LacZα which can be produced from a part of pUC19 encoding lacZα reported in 985), or the sequence RRIPGNSLAVVLQRRDWENPGV
TQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTORPSQQLRSLNGEWRLMRYFLLTHLCG
ISHRIWCTLSTICSDAA. For example, Ψ may be arg-gly.

本発明は、前記のタンパクをコードするDNAおよびそ
の発現を促すように配置された制御DNAから成る発現性
ビヒクル（vehicle）も提供する。例えば、タンパクを
コードするDNAは、大腸菌pheA構造遺伝子の最初の1011
塩基対と等しい約1011塩基対もしくは同じアミノ酸をコ
ードしているの核酸配列より成る。好ましくは、制御DN
Aは、フェニルアラニンによるフィードバック制御を受
けず及びタンパクをコードしているDNAとプロモターの
間に挿入されているアテニュエターを全く欠如している
プロモーター（例えば、lacP）から成っている。更に、
このプロモーターは、タンパクをコードしているDNA及
びCMPD以外のフェニルアラニン合成経路の酵素をコード
しているDNA、例えば,DAHPシンターゼをコードしている
DNAを含む合成オペロンの発現を制御できる。The present invention also provides an expression vehicle comprising a DNA encoding the above-described protein and control DNA arranged to promote its expression. For example, the DNA encoding the protein is the first 1011 of the E. coli pheA structural gene.
Consists of a nucleic acid sequence encoding about 1011 base pairs equal to base pairs or the same amino acid. Preferably, the control DN
A consists of a promoter that is not under feedback control by phenylalanine and lacks any attenuator inserted between the DNA encoding the protein and the promoter (eg, lacP). Furthermore,
This promoter encodes DNA encoding a protein and DNA encoding an enzyme of the phenylalanine synthesis pathway other than CMPD, such as DAHP synthase
The expression of synthetic operons including DNA can be controlled.

発現性ビヒクルで形質転換された微生物細胞を発酵培
地で培養し、そこからフェニルアラニンを回収する。The microbial cells transformed with the expression vehicle are cultured in a fermentation medium from which phenylalanine is recovered.

最後に、本発明は、大腸菌pheA遺伝子を含むDNAを単
離すること及び338番のトリプトファンに対応するTGGコ
ドンをTGA終止コドンに変換することによって、細胞を
フィードバック阻害非感受性のCMPDを生産できるように
遺伝子工学的に加工する方法を提供する。Finally, the present invention provides a method for producing CMPD that is insensitive to feedback inhibition by isolating DNA containing the E. coli pheA gene and converting the TGG codon corresponding to tryptophan at position 338 to a TGA stop codon. And a method for genetic engineering.

我々は、大腸菌CMPDの触媒機能の臨界段片がＮ末端か
ら337番目のアミノ酸までに存在すること、フェニルア
ラニンによるフィードバック感受性は唯一つのアミノ
酸、即ち、338番目のトリプトファン、に依存している
こと、及びCMPDのＣ末端から49個全部のアミノ酸を除去
しても触媒活性は破壊せず実質的にフィードバック感受
性のみを破壊することを発見した。同様に、338番目の
トリプトファンを他の１個もしくは２個以上のアミノ酸
で置換してもフィードバック非感受性酵素を生じる。生
成したCMPD活性フェニルアラニン非感受性酵素は、最後
から２番目までの２つの合成段階（コリスメート→プレ
フェネート→ヒェニルピルベート）を生成物のフェニル
アラニンの存在下でも進行させ、高い生成物収率を可能
にし、かつ、その他は変化していないので、特に生体内
でのフェニルアラニ合成において有益である。We show that the critical step of the catalytic function of E. coli CMPD is present from the N-terminus to the amino acid at position 337, that the feedback sensitivity by phenylalanine depends on only one amino acid, namely tryptophan at position 338, and It has been discovered that removal of all 49 amino acids from the C-terminus of CMPD does not destroy catalytic activity, but substantially only feedback sensitivity. Similarly, substitution of tryptophan at position 338 with one or more other amino acids also produces a feedback-insensitive enzyme. The resulting CMPD-active phenylalanine-insensitive enzyme allows the last two penultimate synthetic steps (chorismate → prephenate → phenylpyruvate) to proceed in the presence of the product phenylalanine, resulting in high product yields. And the others are unchanged, which is particularly beneficial for phenylalanine synthesis in vivo.

本発明のその他の特徴及び長所は、その好ましい実施
例の記載及び特許請求の範囲より明らかになるであろ
う。Other features and advantages of the invention will be apparent from the description of the preferred embodiments, and from the claims.

遺伝的構造 第１図において、水平な線はコリスメート−ムーター
ゼ−プレフェネートデヒドララーゼ（pheA）をコードす
るDNAおよびその周辺区域の大腸菌の染色体DNAを表して
いる。同図中の箱の部分はpheAの翻訳される領域を表し
ている。338番の位置のアミノ酸残基トリプトファン
（タンパクのカルボキシ末端から49個のアミノ酸は除去
されている）が示されており、また、Nco Iは、制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂部位であり、その部位はトリプト
ファン残基のコドンを含む配列である。“P"は、pheAの
プロモーターを表し、及び“A"はpheAの制限領域の５′
末端内の転写アテニュエターを表す。ハドソンとデビッ
トソン（1984）により発表されたpheA及びCMPDの核酸及
びアミノ酸配列も参考のため含まれている。Genetic Structure In FIG. 1, the horizontal lines represent the DNA encoding chorismate-mutase-prephenate dehydralase (pheA) and the chromosomal DNA of E. coli in the surrounding area. The boxes in the figure represent the pheA translated regions. The amino acid residue tryptophan at position 338 is shown (49 amino acids have been removed from the carboxy terminus of the protein), and NcoI is a restriction endonuclease cleavage site, which is a tryptophan residue. Sequence containing the codons of the group. “P” represents the promoter of pheA and “A” is 5 ′ of the restriction region of pheA.
Represents a transcription attenuator in the end. The nucleic acid and amino acid sequences of pheA and CMPD published by Hudson and Davidson (1984) are also included for reference.

発現性ベクターは、「分子クローニーング、実験マニ
ュアル」コールドスプリングハーバー（1982）（Molecu
lar Cloning,A Loboratory Manual Cold Spring Harbo
r）にマニアチス（Maniatis）らによって述べられてい
るような手法を用いることにより入手可能な一般的なも
のより組み立てることができる。例えば、pheA遺伝子
は、pKB45（ズラウスキー（Zurawski）ら、Proc.Nat'l.
Acad.Sci.75:4271−4274（1978））、またはpKB663（大
腸菌YMC9に挿入されてATCC39462として寄託されてい
る、そしてバックマンによる1984年９月24日付米国出願
SN653193（これにより参考文献とする）、に述べられて
いる）のようなプラスミドから調製できる。pheA遺伝子
は、下記に述べるようにして切り出しもしくは変更し
て、フェニルアラニン非感受性CMPDをコードする遺伝子
pheA′得ることができる。そして、pheA′遺伝子を適当
なプロモーター及び他の制御DNAに接続する。例えば、p
heA′をpKB663（上記参照）またはpKB430（下記参照）
から調製されるlacPと繋げる。Expression vectors are described in “Molecular Cloning, Experimental Manual”, Cold Spring Harbor (1982) (Molecu
lar Cloning, A Loboratory Manual Cold Spring Harbo
r) can be assembled from the generic ones available by using the procedure as described by Maniatis et al. For example, the pheA gene is derived from pKB45 (Zurawski et al., Proc. Nat'l.
Acad. Sci. 75: 4271-4274 (1978)), or pKB663 (inserted into E. coli YMC9 and deposited as ATCC 39462) and filed by Bachmann on September 24, 1984, US application.
SN653193 (hereby incorporated by reference)). The pheA gene was excised or modified as described below to encode a gene encoding phenylalanine-insensitive CMPD.
pheA 'can be obtained. The pheA 'gene is then connected to an appropriate promoter and other control DNA. For example, p
heA 'is replaced with pKB663 (see above) or pKB430 (see below)
And lacP prepared from

新規のオペロンは、他のフェニルアラニン合成経路酵
素（例えば、aroF）をコードしている遺伝子を用いるこ
とにより、SN653193（前記参照）で一般的に述べたよう
に構築することができる。例えば、aroFは、pKB45（前
記参照）、またはpKB712（ATCC39856）もしくはpKB750
（ATCC39857）の適当な分解から調製できる（各々は前
記引用のSN653193に記載されている）。Novel operons can be constructed as described generally in SN653193 (see above) by using genes encoding other phenylalanine synthesis pathway enzymes (eg, aroF). For example, aroF is pKB45 (see above), or pKB712 (ATCC39856) or pKB750.
(ATCC39857) (each described in SN653193, cited above).

詳しくは、Ｃ末端から49個のアミノ酸を欠いている活
性CMPD酵素をコードする、切り出されたpheA遺伝子（ph
eA′と命名された）は、pheA遺伝子（第１図）のNco I
部位から遺伝子の末端までのDNAを欠落させることによ
って調製することができる。この変化した遺伝子は天然
に存在するトリプトファンコドン（TGG）の代わりに終
止コドン（TGA）を持っている。この欠落は、Nco Iによ
り開裂し、DNAポリメラーゼによって粘着性末端を相補
性塩基で修復し、そしてＡ（アデニン）で始まるDNA末
端（例えば、修復されたEcoR I末端）と接続することに
よって、任意のクローン化pheA遺伝子から再現性良く調
整できる。Specifically, the excised pheA gene (ph) encoding an active CMPD enzyme lacking 49 amino acids from the C-terminus
eA ') is the Nco I of the pheA gene (Figure 1).
It can be prepared by deleting the DNA from the site to the end of the gene. This altered gene has a stop codon (TGA) instead of the naturally occurring tryptophan codon (TGG). This deletion is optionally achieved by cleavage with NcoI, repairing the sticky ends with complementary bases by DNA polymerase, and connecting to a DNA end that begins with A (adenine) (eg, a repaired EcoR I end). Can be adjusted with good reproducibility from the cloned pheA gene.

こうして調製された変化した酵素（欠失CMPD）がフィ
ードバック耐性であることの検定は、野生型CMPDをフィ
ードバック阻害するのに十分なフェニルアラニン存在下
で、コリスメートムターゼもしくはプレフェネートデヒ
ドラターゼのどちらかを測定すること（ゲシング（Eur.
J.Biochem.71:417−325）らの方法を用いる）によって
行うことができる。欠失CMPDのどちらの活性も、少なく
とも1.2mMの濃度のフェニルアラニンの存在下でも変化
しなかった。更に、欠失CMPDがlacZアルファペプチドの
ような他のペプチドもしくはタンパクとの融合体として
発現する場合にも、CMPD活性及びフェニルアラニン非感
受性は残存される。結局、野生型CMPDに対する１個のア
ミノ酸置換が338番のtrpに起こった場合には、CMPD活性
及びフェニルアラニン非感受性は残存される。Assaying that the altered enzyme thus prepared (deleted CMPD) is resistant to feedback requires that either chorismate mutase or prephenate dehydratase be present in the presence of sufficient phenylalanine to feedback inhibit wild-type CMPD. Measuring (Gessing (Eur.
J. Biochem. 71: 417-325). Neither activity of the deleted CMPD was altered in the presence of phenylalanine at a concentration of at least 1.2 mM. Furthermore, when the deleted CMPD is expressed as a fusion with another peptide or protein, such as the lacZ alpha peptide, CMPD activity and phenylalanine insensitivity remain. Ultimately, if a single amino acid substitution to wild-type CMPD occurs at trp 338, CMPD activity and phenylalanine insensitivity remain.

以下に示す実施例は例示であり、本発明を限定する意
図のものではない。The following examples are illustrative and are not intended to limit the invention.

実施例１（pheA′、pKB631） 第２図において、pKB45（前記参照）をPst Iによって
開裂し、そしてPst Iで切断されたpBR322（ATCC37017）
と連結してpKB629を得た。次に、このプラスミドをNco
I及びEcoR Iにより開裂し；各粘着末端にDNAポリメラー
ゼで相補塩基を付けてそして結合させ、pKB631を得た。
pKB631は、我々がpheA′と命名した切り出された形のph
eAの５′部分を含んでいる。Example 1 (pheA ', pKB631) In FIG. 2, pKB45 (see above) was cleaved with PstI and pBR322 cut with PstI (ATCC37017).
And pKB629 was obtained. Next, this plasmid was
Cleavage with I and EcoR I; each cohesive end was ligated with a complementary base with DNA polymerase and ligated to give pKB631.
pKB631 is a phage form of the excised form we named pheA '
Contains the 5 'portion of eA.

実施例２（lacP−pheA′、pKB823） 第３図において、pKB663（大腸菌ATCC39462株内に存
在する）の派生体pheA′を、pKB663のNco I−EcoR Iの
断片を取り除くこと及びプラスミドを再連結することに
よって調製して、pKB823を得た。そのプラスミドにおい
ては、pheA′遺伝子はlacプロモーターの制御下にあ
る。以下に説明するように、この構造はlacPとpheAの間
に弱いアテニュエーター配列を含んでいる。Example 2 (lacP-pheA ', pKB823) In FIG. 3, a derivative pheA' of pKB663 (present in E. coli ATCC39462) was removed by removing the NcoI-EcoRI fragment of pKB663 and religating the plasmid. To obtain pKB823. In that plasmid, the pheA 'gene is under the control of the lac promoter. As described below, this structure contains a weak attenuator sequence between lacP and pheA.

実施例３及び４（pheA′−aroF融合体pKB684及びpKB68
9） 第５図において、pKB631（第２図参照）及びpKB668
（前記に引用されたS.N.653193参照）を、EcoR I及びPv
u IIで開裂し、pKB684を生じるように適当なフラグメン
トをつなぎ合わせることによって、pheA′をaroFに融合
するのに使用した。この構造においては、pheA′遺伝子
はpheAプロモーターから転写される。次に、pKB684のSt
u I部位を、Stu Iで切断し、その部位にHind IIIリンカ
ーを挿入することによってHind III部位に変換してpKB6
89を調製する。この工程は、必要に応じて異種のプロモ
ーターが容易に挿入できるように、pheAのオペロンとそ
のプロモーターの間にリンカーを配置するものである。Examples 3 and 4 (pheA'-aroF fusions pKB684 and pKB68
9) In Fig. 5, pKB631 (see Fig. 2) and pKB668
(See SN653193 cited above), EcoRI and Pv
pheA 'was used to fuse to aroF by cleaving with uII and joining the appropriate fragments together to yield pKB684. In this structure, the pheA 'gene is transcribed from the pheA promoter. Next, St of pKB684
The uI site is cut with StuI and converted to a HindIII site by inserting a HindIII linker at that site to convert pKB6
Prepare 89. In this step, a linker is placed between the pheA operon and the promoter so that a heterologous promoter can be easily inserted as necessary.

実施例５、６及び７（pheA′−aroF融合体、lacP,pKB69
4、pKB697及びpKB702） 第４図に示されるように、pKB663（前記参照）のlacP
DNAの近くのTth111I部位をHind IIIリンカーを用いて
より便利なHind III部位に変換してpKB692を得た。次
に、第６図に示されるように、pKB689及びpKB692（第４
図）をHind III及びHpa Iで処理し、適当なフラグメン
トとつなぐことによりpKB694プラスミドを、調製した。
このプラスミドは、pheAプロモーターがlacプロモータ
ーで補強されていることを除いて実施例３及び４のphe
A′−aroFオペロンの変形である。そのpKB694上のTth11
1I部位を、Hind IIIリンカーを用いてHind III部位に変
換してpKB697（第６図）を作った。この工程は、得られ
たpKB697からテトラサイクリン耐性であるプラスミドを
誘導するために、第８図に示されるように、Hind IIIで
切断されたpBR322とHind IIIで切断された該pKB697を融
合してpKB702（ATCC67068株内に寄託されている）を調
製することができるようにするために行われた。この耐
性因子はプラスミドの操作及び分離を容易にする。Examples 5, 6 and 7 (pheA'-aroF fusion, lacP, pKB69
4, pKB697 and pKB702) As shown in FIG. 4, lacP of pKB663 (see above).
The Tth111I site near the DNA was converted to a more convenient HindIII site using a HindIII linker to yield pKB692. Next, as shown in FIG. 6, pKB689 and pKB692 (fourth
Figure) was treated with HindIII and HpaI, and the pKB694 plasmid was prepared by ligation with the appropriate fragments.
This plasmid was constructed as described in Examples 3 and 4 except that the pheA promoter was reinforced with the lac promoter.
A variant of the A'-aroF operon. Tth11 on that pKB694
The 1I site was converted to a HindIII site using a HindIII linker to create pKB697 (FIG. 6). In this step, in order to induce a tetracycline-resistant plasmid from the obtained pKB697, as shown in FIG. 8, HindIII-cut pBR322 and HindIII-cut pKB697 were fused to form (Deposited in ATCC 67068 strain). This resistance factor facilitates manipulation and isolation of the plasmid.

実施例８（アテニュエーターを欠落するpheA′−aroF融
合体、pKB693） 野生型pheAは、リーダーペプチドを形成するのに十分
なフェニルアラニンの存在下で転写を抑制する働きをす
るアテニュエーター配列を含んでいる。lacプロモータ
ーのような外来プロモーターから発現する前述のpheA−
aroF融合体のあるものにおいては、少なくともアテニュ
エーター配列の一部がプロモーターとpheAもしくはphe
A′の間に残存し、そしてある抑制的影響を転写に及ぼ
しているらしく、そのようにしてpheAまたはpheA′の発
現程度を減少させていることが分かった。アテニュエー
ター配列を完全に取り除くことが望ましい。特に、アテ
ニュエーター配列を欠いているpKB689は、少なくともア
テニュエーター配列の一部を持っているpKB693から調製
（以下に説明され、第６図及び第７図に示されるよう
に）された。Example 8 (pheA'-aroF fusion lacking attenuator, pKB693) Wild-type pheA contains an attenuator sequence that acts to repress transcription in the presence of sufficient phenylalanine to form a leader peptide. Contains. The pheA- described above expressed from a foreign promoter such as the lac promoter.
In some aroF fusions, at least a portion of the attenuator sequence has a promoter and pheA or pheA
It was found to remain during A 'and to have some repressive effect on transcription, thus reducing the expression of pheA or pheA'. It is desirable to completely remove the attenuator sequence. In particular, pKB689 lacking the attenuator sequence was prepared from pKB693 carrying at least a portion of the attenuator sequence (as described below and shown in FIGS. 6 and 7).

第７図において、pKB45及びpBR322（上記参照）をPst
Iによって連結し、環状にしてpKB628を作った。pKB628
をStu I部位で開裂し、エキソヌクレアーゼで末端を除
去してKpn Iリンカーで再結合させ、pKB638を得た。pKB
632をKpn I部位で開裂し、エキソヌクレアーゼで末端を
除去し、そしてKpn Iリンカーで再結合させてpKB638を
得た。pKB638のKpn I部位をリンカーを用いてHind III
部位に変換してpKB688を得た。In FIG. 7, pKB45 and pBR322 (see above) were converted to Pst
Linked by I and circularized to make pKB628. pKB628
Was cleaved at the StuI site, truncated with exonuclease and religated with a KpnI linker to yield pKB638. pKB
632 was cleaved at the KpnI site, truncated with exonuclease, and religated with a KpnI linker to yield pKB638. The Kpn I site of pKB638 was linked to Hind III using a linker.
Conversion to a site yielded pKB688.

第６図において、pKB693は、pKB689（第５図）及びpK
B688（第７図）をHind III及びHpa Iで処理すること並
びに（アガロースゲル上で大きさにより選択された）フ
ラグメントと連結させることにより調製される。In FIG. 6, pKB693 corresponds to pKB689 (FIG. 5) and pK69.
Prepared by treating B688 (FIG. 7) with Hind III and Hpa I and ligating with fragments (selected on size on agarose gels).

実施例９ アテニュエーターを欠くlacP−pheA′（pKB9
12） 前記のアテニュエーターDNAを欠落するその他のphe
A′は第９図及び第10図に示されるように調製されるpKB
912（ATCC67067として寄託）である。第９図において、
pKB750（ATCC39857,米国出願SN653193参照）のKpn I−E
coR Iフラグメントは、アテニュエーターDNAを含まずに
pheA遺伝子を有している。そのフラグメントをpKB444に
クローニングしてpKB909を得た。次に、第10図に示され
るように、pKB909のNco I−EcoR Iフラグメントを除去
し、pKB912のlacP−pheA′融合体（ATCC67067として寄
託）を得た。第９図に示されるように、pKB444は、リン
カーを用いてpKB430（SN653193で述べられたpBR322の派
生体）のPvu II部位をまずHpa Iに、次に、Kpn Iに変換
することにより作られた。Example 9 lacP-pheA 'lacking an attenuator (pKB9
12) Other phes lacking the attenuator DNA
A 'is the pKB prepared as shown in FIGS. 9 and 10.
912 (deposited as ATCC67067). In FIG.
Kpn I-E of pKB750 (see ATCC 39857, U.S. Application SN653193)
The coRI fragment contains no attenuator DNA
It has the pheA gene. The fragment was cloned into pKB444 to obtain pKB909. Next, as shown in FIG. 10, the NcoI-EcoRI fragment of pKB909 was removed to obtain a lacP-pheA 'fusion of pKB912 (deposited as ATCC67067). As shown in FIG. 9, pKB444 was created by converting the PvuII site of pKB430 (a derivative of pBR322 described in SN653193) first to HpaI and then to KpnI using a linker. Was.

実施例10 アテニュエーターを欠くlacP−pheA′−aroF
（pKB951） 新しいlacP−pheA′融合体及びaroFも持っているプラ
スミドを調製した。このプラスミドpKB951（第10図）
は、pKB712（SN653193）の類似体であり、それは以前に
フェニルアラニンの合成に使用されている。pKB951は、
pKB912のTth111I部位をCla Iリンカーを用いてCla I部
位に変更し、Cla I−Hpa Iフラグメントを除去して、そ
こにpKB702（第８図）の適当なCla I−Hpa Iフラグメン
トを連結することによってpKB912から調製される。Example 10 lacP-pheA'-aroF lacking an attenuator
(PKB951) A plasmid was also prepared that also contained the new lacP-pheA 'fusion and aroF. This plasmid pKB951 (Figure 10)
Is an analog of pKB712 (SN653193), which has previously been used for the synthesis of phenylalanine. pKB951 is
Changing the Tth111I site of pKB912 to a ClaI site using a ClaI linker, removing the ClaI-HpaI fragment, and ligating therewith the appropriate ClaI-HpaI fragment of pKB702 (FIG. 8). Prepared from pKB912.

実施例11 pheA（pKB894）の338番trpの置換 pheAにおける僅かな変化（野生型酵素の338番トリプ
トファン残基をアルギニン−グリシンのジペプチドへ置
換すること）がフィードバック阻害感受性を実質的に除
去する。Example 11 Substitution of trp 338 in pheA (pKB894) A slight change in pheA (replacement of the tryptophan residue at position 338 of the wild-type enzyme with a dipeptide of arginine-glycine) substantially eliminates feedback inhibition sensitivity.

上記の変更は、第11図に示すようにpKB685からpKB894
への変換において（第３図に示されるようにpKB663から
Ban I−BanH Iフラグメントを除去することによって得
られる）、pheAをNco Iによって開裂し、ヤエナリ豆の
ヌクレアーゼで線状のDNAを処理し、そしてXho Iリンカ
ーを加えてDNAの再閉鎖をする。この方法は通常上記に
述べたような特異的変化を引き起こすとは予期されない
けれども、配列分析の結果は余分な核酸が幸運にも除去
される（おそらくヤエナリ豆のヌクレアーゼ処理によ
る）ことを示し、上記のような結果を得た。当業者は、
この構造を得ることのできる他の方法があること（例え
ば、適当なDNAを合成すること）を容易に考えつくであ
ろう。The above changes were made from pKB685 to pKB894 as shown in Figure 11.
In conversion to (from pKB663 as shown in Figure 3)
Obtained by removing the BanI-BanHI fragment), pheA is cleaved with NcoI, the linear DNA is treated with Mung bean nuclease, and the XhoI linker is added to reclose the DNA. Although this method is not usually expected to cause the specific changes described above, the results of sequence analysis indicate that excess nucleic acid is fortunately removed (possibly due to nuclease treatment of the green beans). The result was as follows. Those skilled in the art
It will be readily apparent that there are other ways in which this structure can be obtained (eg, synthesizing appropriate DNA).

実施例12 pheA′−lacZ融合体 pheA′はlacZ遺伝子の一部と融合して、pheA′−lacZ
アルファペプチド融合体を生じる（第11図）。生じた融
合体はCMPD活性を持っている。その融合体は、pKB894か
らのlacP−theA′遺伝子フラグメントをpUC9（一般に市
販されており、前記に引用したヤニッシュらの発表で引
用されている）中のlacZにクローニングすることによっ
て作られる。融合体のlacZ部分は配列:RRIPGNSLAVVLQRR
DWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTORPSQQLRSLNGEWRLMRYF
LLTHLCGISHRIWCTLSTICSDAAを有している。pKB894をTth1
11Iで切断し、DNAポリメラーゼＩで末端をプルント（bl
unt）にしてXho Iで切断する。pUC9をHind IIIで切断
し、DNAポリメラーゼＩで末端をブルントにしてSal Iで
切断する。そのブルントな末端であるXho IおよびSal I
末端を、結合させてpKB906を得た。Example 12 pheA'-lacZ fusion pheA 'is fused with a part of the lacZ gene to form pheA'-lacZ
This produces an alpha peptide fusion (FIG. 11). The resulting fusion has CMPD activity. The fusion is made by cloning the lacP-theA 'gene fragment from pKB894 into lacZ in pUC9 (commercially available and cited in the Janish et al. Publication cited above). The lacZ part of the fusion has the sequence: RRIPGNSLAVVLQRR
DWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTORPSQQLRSLNGEWRLMRYF
Have LLTHLCGISHRIWCTLSTICSDAA. pKB894 to Tth1
Cleavage with 11I and pruning the end with DNA polymerase I (bl
unt) and cut with XhoI. pUC9 is cut with HindIII, blunt-ended with DNA polymerase I and cut with SalI. Xho I and Sal I at their brunet ends
The ends were ligated to give pKB906.

大腸菌K12株MM294内のプラスミドpKB912およびpKB702
は、ATCCに寄託され各々第67067号及び第67068号の番号
が与えられている。出願の譲受人である、バイオテクニ
カ・インターナショナル（BioThechnica Internationa
l）およびH.J.ハインツカンパニー（H.J.Heinz Compan
y）は、これらの株がこの特許の期間満了、株の最後の
分譲請求後５年、若しくは寄託から30年の内最も長い期
間の終わる前に死滅した場合には新しい株を補充する責
任があること、及びそのような特許の発効（その時に、
寄託物は公に利用できるようになる）を通知する責任が
あることを認識している。その時までは、寄託物は、CF
R第１−14条の37項及びUSC第112条第35項の下に特許庁
長官にのみ利用される。Plasmids pKB912 and pKB702 in E. coli K12 strain MM294
Have been deposited with the ATCC and are assigned the numbers 67067 and 67068, respectively. The assignee of the application, BioThechnica International
l) and HJ Heinz Company
y) is responsible for replenishing new strains if these strains expire before the expiration of this patent, five years after the last sale of the strains, or before the end of the longest of 30 years from the deposit. And the entry into force of such a patent (at that time,
(Deposits will be made publicly available). Until then, the deposit is CF
Used only by the Commissioner of the Patent Office under Articles 1-14-37 R and USC 112-35.

フェニルアラニンの生産 フェニルアラニンを生産するために、前記の発現性ベ
クターの一つを、フェニルアラニン非感受性CMPDが微生
物内で生産されるように適当な微生物に一般的方法によ
り形質転換する。一般的に、本発明のベクターは宿主生
物内でのフェニルアラニン生産を増加させることができ
る。当業者は適当な微生物を選択し、必要に応じて用い
られる宿主に応じてベクターを適当に修飾することがで
きるであろう。一般的に、大腸菌は、前記のベクターpK
B702及びpKB912に適した生物である。当業者には、所望
の生産物の生産を増強する遺伝子工学的な加工によって
他の所望の特徴が宿主生物に取り込まれるかもしれない
ことは明白であろう。Production of Phenylalanine To produce phenylalanine, one of the above-described expression vectors is transformed by a general method into a suitable microorganism such that phenylalanine-insensitive CMPD is produced in the microorganism. Generally, the vectors of the present invention are capable of increasing phenylalanine production in a host organism. Those skilled in the art will be able to select an appropriate microorganism and modify the vector as needed depending on the host used. Generally, E. coli is transformed with the vector pK described above.
Organism suitable for B702 and pKB912. It will be apparent to one skilled in the art that other desired characteristics may be incorporated into the host organism by genetic engineering to enhance the production of the desired product.

形質転換された生物を適当な培地で培養し、そしてフ
ェニルアラニンを回収する。細菌を培養する当業者は、
どのような培養培地が本発明の実行に適しているかは知
っているであろう。例えば、 ミラー（Miller）「分子生物学における実験」（Experi
ments in Molecular Genetics）コールドスプリングハ
ーバー1972年（Cold Spring Harbor）により発表されて
いる培地や、以下に示す最小培地： 15g/ グルコース， 0.3g/ MgSO₄・7H₂O, 14.7mg/ CaCl₂・2H₂O, 0.5g/ NaCl 5g/ （NH₄）₂SO₄, 5mg/ ビタミンB₁, 1.5g/ KH₂PO₄, 7.5mg/ FeSO₄・7H₂O, 1g/ クエン酸ナトリウム、及び培地１当たりに10m
lの微量成分である。The transformed organism is cultured in a suitable medium, and phenylalanine is recovered. One skilled in the art of culturing bacteria,
You will know what culture medium is suitable for practicing the present invention. For example, Miller "Experiments in Molecular Biology" (Experi
ments in Molecular Genetics) Cold Spring Harbor, 1972 (Cold and media have been published by Spring Harbor), minimal medium is shown below: 15 g / _{glucose, 0.3g / MgSO 4 · 7H 2} O, 14.7mg / CaCl 2 · 2H _{2 O, 0.5g / NaCl 5g /} (NH 4) 2 SO 4, 5mg / vitamin _{B 1, 1.5g / KH 2 PO} 4, 7.5mg / FeSO 4 · 7H 2 O, 1g / sodium citrate, and the medium 1 10m per
It is a trace component of l.

微量成分は次の組成： 0.015g/ Na₂MoO₄・2H₂O, 0.25g/ H₃B0₃, 0.07g/ CoCl₂・6H₂O, 0.025g/ CuSO₄・5H₂O, 0.16g/ MnCl₂・4H₂O,及び 0.03g/ ZnSO₄・7H₂O である。Minor component had the following _{composition: 0.015g / Na 2 MoO 4 ·} 2H 2 O, 0.25g / H 3 B0 3, 0.07g / CoCl 2 · 6H 2 O, 0.025g / CuSO 4 · 5H 2 O, 0.16g / MnCl a ₂ · 4H ₂ O, and _{0.03g / ZnSO 4 · 7H 2 O} .

当業者には、CMPDを有する他の配列が作れることは明
らかであろう。例えば、pKB702またはpKB912で見られる
ようなpheA′配列を出発物として、標準的遺伝子工学的
な加工方法が他の配列を作るのに（例えば、pheA′配列
内の残基を切り出したり、置換すること、及び生成した
遺伝子工学的に加工された配列のCMPD活性を試験するこ
とによって）用いることができる。そのような変形され
たpheA′配列は337残基よりも長いことも短いこともあ
り、そしてそれらも本発明の範囲に含まれる。例えば、
338番のtrpのみが除去されている大腸菌のpheAをコード
する配列は、CMPD活性が残存し、及びフェニルアラニン
フィードバック阻害感受性を実質的に欠落しているはず
である。他の制御DNAを有する発現性ベクターを用いる
ことができ、及び他の発現系も用いることができる。It will be apparent to one skilled in the art that other sequences with CMPD can be made. For example, starting with the pheA 'sequence as found in pKB702 or pKB912, standard engineering techniques can be used to create other sequences (e.g., cut out or replace residues in the pheA' sequence). And testing the generated genetically engineered sequence for CMPD activity). Such modified pheA 'sequences may be longer or shorter than 337 residues, and are also within the scope of the invention. For example,
The sequence encoding E. coli pheA, in which only trp at position 338 has been removed, should retain CMPD activity and substantially lack susceptibility to phenylalanine feedback inhibition. Expression vectors with other control DNAs can be used, and other expression systems can be used.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、pheA遺伝子及びその周辺の区域を含む大腸菌
の染色体断片における、選択された制限酵素の開裂部位
を表す図であり； 第２図は、pheA′と命名された、その一部が切り取られ
た、pheAの構造を表す図であり； 第３図は、lacP及びpheA′の融合体の構造を表す図であ
り； 第４図は、pKB692の構造を表す図であり； 第５図は、pheA′及びaroFの融合体の構造を表す図であ
り； 第６図及び第７図は、pKB697及びpKB693の構造を表す図
であり； 第８図は、pKB702の構造を表す図であり； 第９図及び第10図は、lacP−pheA′の融合体を含むプラ
スミドの構造を表す図であり； 第11図は、pheA′−lacZの融合体及びpheA遺伝子内での
読み枠内in−frame）置換の構造を表す図である。FIG. 1 is a diagram showing cleavage sites of selected restriction enzymes in a chromosome fragment of Escherichia coli containing the pheA gene and the surrounding area; FIG. FIG. 3 is a diagram showing the structure of the fusion of lacP and pheA ′; FIG. 4 is a diagram showing the structure of pKB692; FIGS. 6 and 7 show the structures of pKB697 and pKB693; and FIG. 8 shows the structures of pKB702. 9 and 10 are diagrams showing the structure of a plasmid containing a lacP-pheA 'fusion; FIG. 11 is a drawing showing the in-frame reading in the pheA'-lacZ fusion and pheA gene; FIG. 9 is a diagram illustrating a structure of a −frame) substitution.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/22 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ラマスワミー・バラクリシュナン アメリカ合衆国マサチューセッツ州フレ イミンガム，シックス・ラヴァーデュア ー・サークル（番地なし)──────────────────────────────────────────────────の Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical display location C12P 13/22 9282-4B C12N 15/00 ZNAA // (C12N 1/21 C12R 1:19) ( C12N 15/09 ZNA C12R 1:19) (C12P 13/22 C12R 1:19) (72) Inventor Lamaswamy Barakrishnan Six Loverdur Circle, Framingham, Mass., USA (No address)

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】構造式：ΓCOΔ で表される、フェニルアラニンによるフィードバック阻
害に対して実質的に非感受性であるコリスメートムター
ゼ／プレフェネートデヒドラターゼ（CMPD）活性を有す
ることを特徴とするタンパクであって、但し、式中、Γ
は大腸菌のCMPDのＮ末端から337個のアミノ酸配列に一
致しているかまたはCMPDの活性が保たれる範囲で一つま
たはそれ以上のアミノ酸が脱離、置換または付加されて
おり;COはΓのＣ末端アミノ酸残基のカルボニル基であ
り；そしてΔは−OH,−O^-、ペプチド結合によりＣ末端
基に結合しているトリプトファン以外のアミノ酸残基又
はトリプトファン以外のＮ末端残基を有するアミノ酸配
列であることを特徴とする、タンパク。1. A protein characterized by having chorismate mutase / prephenate dehydratase (CMPD) activity represented by the structural formula: ΓCOΔ, which is substantially insensitive to feedback inhibition by phenylalanine. Where, 式
Has one or more amino acids removed, substituted or added within the range that matches the 337 amino acid sequence from the N-terminus of CMPD of Escherichia coli or maintains the activity of CMPD; Is the carbonyl group of the C-terminal amino acid residue; and Δ is —OH, —O ⁻ , an amino acid sequence having an amino acid residue other than tryptophan or an N-terminal residue other than tryptophan linked to the C-terminal group by a peptide bond. A protein, characterized in that: 【請求項２】Γが以下の配列： からなる請求項１記載のタンパク。2. The method according to claim 1, wherein Γ is the following sequence: The protein according to claim 1, comprising: 【請求項３】Δが−OHまたは−O^-である請求項１又は２
記載のタンパク。Wherein Δ is -OH or -O ^- a is claim 1 or 2
The protein described. 【請求項４】Δがアミノ酸配列：Ψ−Ω （式中、Ψはトリプトファン以外のアミノ酸残基または
トリプトファン残基以外の２個のアミノ酸配列であり；
そしてΩは配列（ａ）EEMFYLDIQANLESAEMQKALKELGEITRS
MKVLGCYPSENVVPVDPTもしくは（ｂ）CMPD活性以外の酵素
活性をコードしている配列である） で表される、請求項１又は２記載のタンパク。(4) Δ is an amino acid sequence: Ψ-Ω (wherein Ψ is an amino acid residue other than tryptophan or two amino acid sequences other than tryptophan residue;
And Ω is an array (a) EEMFYLDIQANLESAEMQKALKELGEITRS
MKVLGCYPSENVVPVDPT or (b) a sequence encoding an enzyme activity other than the CMPD activity). 【請求項５】Ωがフェニルアラニン合成経路酵素活性も
しくはlacZαペプチド活性を有する、請求項４記載のタ
ンパク。5. The protein according to claim 4, wherein Ω has phenylalanine synthesis pathway enzyme activity or lacZα peptide activity. 【請求項６】Ψがarg−glyである、請求項４記載のタン
パク。6. The protein according to claim 4, wherein Ψ is arg-gly. 【請求項７】請求項１記載のタンパクをコードするDN
A、及び該タンパクをコードするDNAの発現を促進するよ
うに配置されて方向付けられた制御DNAを有する、遺伝
子工学により加工された発現性ビヒクル。7. A DNA encoding the protein according to claim 1.
A. A genetically engineered expression vehicle having A, and control DNA positioned and directed to promote expression of the DNA encoding the protein. 【請求項８】タンパクをコードするDNAが大腸菌のpheA
構造遺伝子の初めの1011組の塩基対と機能的に同一の約
1011組の塩基対の核酸配列を有する、請求項７記載の遺
伝子工学により加工された発現性ビヒクル。8. The DNA encoding the protein is E. coli pheA.
Approximately functionally identical to the first 1011 base pairs of the structural gene
The genetically engineered expression vehicle according to claim 7, which has a nucleic acid sequence of 1011 base pairs. 【請求項９】核酸配列の下流側に隣接するコドンがTGA
である、請求項７記載の遺伝子工学により加工された発
現性ビヒクル。9. The codon adjacent to the downstream side of the nucleic acid sequence is TGA
The expression vehicle processed by genetic engineering according to claim 7, which is: 【請求項１０】制御DNAがフェニルアラニンによる制御
を受けないプロモーターを有する、請求項７記載の遺伝
子工学により加工された発現性ビヒクル。10. The expression vehicle engineered by genetic engineering according to claim 7, wherein the control DNA has a promoter not controlled by phenylalanine. 【請求項１１】ビヒクルが野生株のpheAと関連しないプ
ロモーターを有し、そして該プロモーターとタンパクを
コードしているDNAの間にアテニュエーターを有さない
ことを特徴とする、請求項10記載の遺伝子工学により加
工された発現性ビヒクル。11. The vehicle according to claim 10, wherein the vehicle has a promoter not associated with wild-type pheA, and has no attenuator between the promoter and DNA encoding the protein. An expressible vehicle processed by genetic engineering. 【請求項１２】さらに、人工的オペロンを有するが、該
オペロンはタンパクをコードしているDNA及びCMPD以外
のフェニルアラニン合成経路の特定の段階を触媒する酵
素をコードするDNAからなり、且つ請求項10記載のプロ
モーターの制御下で発現される、請求項10記載の遺伝子
工学により加工された発現性ビヒクル。12. The method according to claim 10, further comprising an artificial operon, wherein the operon comprises a DNA encoding a protein and a DNA encoding an enzyme that catalyzes a specific step in the phenylalanine synthesis pathway other than CMPD. 11. The genetically engineered expression vehicle according to claim 10, which is expressed under the control of the promoter. 【請求項１３】プロモーターがlacプロモーターであ
る、請求項10、11または12記載の遺伝子工学により加工
された発現性ビヒクル。13. The gene-engineered expression vehicle according to claim 10, wherein the promoter is a lac promoter. 【請求項１４】ビヒクルが、pKB912（受託番号67067と
してATCCに寄託）及びpKB702（受託番号67068としてATC
Cに寄託）、もしくはそれらから誘導されたビヒクルか
ら選択される、請求項７記載の遺伝子工学により加工さ
れた発現性ビヒクル。14. A vehicle comprising pKB912 (deposited at the ATCC as accession number 67067) and pKB702 (ATC as accession number 67068).
C) or a vehicle derived therefrom. 【請求項１５】請求項７または14記載の発現性ビヒクル
を有する細胞。15. A cell having the expression vehicle according to claim 7 or 14. 【請求項１６】請求項15記載の細胞を発酵培地で培養す
ること及びその培養液からフェニルアラニンを回収する
ことからなる、フェニルアラニンの製造方法。16. A method for producing phenylalanine, comprising culturing the cell according to claim 15 in a fermentation medium and collecting phenylalanine from the culture. 【請求項１７】大腸菌のpheA遺伝子を準備すること、33
8番目のアミノ酸残基のコドンをTGGからTGAに変換する
ことによりpheA遺伝子を変化させること、そして変化し
たpheA遺伝子を発現性ビヒクル中に融合させることから
なる、請求項９記載の製造方法。17. Preparing the pheA gene of E. coli, 33.
The method according to claim 9, comprising changing the pheA gene by converting the codon of the eighth amino acid residue from TGG to TGA, and fusing the changed pheA gene into an expression vehicle.