JP2670326B2 - 培養液採取装置，採取方法及び培養システム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物の細胞を培養する培養槽内より培養液
を採取する方法及び装置に係り、特に培養状況のモニタ
リング、コントロールのために必要な少量の試料を微生
物汚染を招くことなく採取するのに好適な採取方法及び
採取装置及びそれを含む培養システムに関する。

〔従来の技術〕

従来の培養槽内の培養液を採取するための装置として
は、種々の工夫がなされており、雑菌汚染を防止しつつ
試料を採取することが広く実施されている。第３図に通
常用いられる公知の試料採取機構の概念の一例を示す。
いずれも試料採取後に採取用配管内をスチームライン殺
菌を行うことにより細菌の培養槽内への侵入を防止して
いる。

〔発明が解決しようとする課題〕

培養液を採取するにあたっては次の点に留意しなけれ
ばならない。すなわち、培養液中の細胞が試料採取管内
に沈降しない流速で培養液を引き抜かねばならない。さ
らに、前回の採取時に管内に留められ管壁に沈着した細
胞を再浮遊させるため強い乱流を与える線速度が必要で
ある。モニタリングには、管内に沈積していた細胞が除
去されたあとに採取した試料用いなければならない。

上記従来の方法では、配管内に直接スチームを通じ、
121℃以上の高温に一定時間保持することが必要であ
り、所要のスチーム流量により、配管径が決められるこ
とになる。したがって、試料採取配管の内径は、管路
長、断熱材の有無等によりかわるが一般には少なくとも
10mm程度になる。その結果、少なくとも100ml/回以上採
取しないと培養液のモニタリング試料として意味をなさ
なくなる。

近年、各種の計測技術が進歩し、グルコース、乳酸、
各種アミノ酸、各種生理活性物質の定量に使用する試料
量はわずかで済むようになりつつある。従来の方法で
は、数mlの試料を得るために、多量の培養液を採取し、
その大部分を捨ることになる。近年の培養技術の発達に
より、より小さな培養槽を用いてより高密度で目的細胞
を培養して目的物質の生産効率をより高める手法が用い
られることが多く、前記のようなモニタリングのために
培養液を多量に採取することは早急に改善することが望
まれていた。

本発明の目的は、少量の試料を連続的に採取する方法
及び装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、下記によって達成される。

すなわち、本発明は、内径の小なる培養液採取管の一
端をスチーム流通管の先端より突出せしめ、該培養液採
取管の他の一端を該採取管の外径より大であり、かつス
チーム滅菌に必要な温度まで昇温可能なスチーム流量を
通過せしめるのに十分な断面積を与える内径を有するス
チーム流通管内に収容してなる培養液採取装置にあり、
またスチーム流通管は培養槽に接続する機構を有する管
材ａ、及び該管材と共有する隔壁により接合されかつ隔
壁近傍において内径の大なる部分を有する管材ｂ、内径
の大なる部分で管材ｂと接続される管材ｃより構成さ
れ、培養液採取管が管材ａ及びｂ間の隔壁を貫通し管材
の内部にその一端が開口している培養液採取装置にあ
る。

また、本発明は、上記培養液採取装置を培養槽に装着
し、該培養液採取装置にスチームを流通せしめて該採取
装置の内部を滅菌せしめたのち、内径大なる管材に接続
している管材を取りはずし、次いで該内径大なる管材に
収容されている試料採取配管を通じて試料を採取する培
養液採取方法にある。

この場合、上記試料採取配管を自動診断装置、自動分
析装置等の測定装置に連結したフレキシブル配管に接続
することにより培養液を採取することもできる。

更に、本発明は、培養細胞に対するガスの供給手段と
培養液の供給手段及び老廃培養液の排出手段を具備した
培養槽、内径の小なる培養液採取管の一端をスチーム流
通管の先端より突出せしめ、該培養液採取管の他の一端
を該採取管の外径より大であり、かつスチーム滅菌に必
要な温度まで昇温可能なスチーム流量を通過せしめるの
に十分な断面積を与える内径を有するスチーム流通管内
に収容してなる培養液採取装置、前記培養液採取装置で
採取された培養液中の細胞の画像を拡大する手段と該画
像から生きている細胞及び死細胞を認識する画像認識装
置とを具備する細胞の数及び活性の連続自動診断装置、
前記培養液採取装置で採取された培養液中のグルコー
ス、乳酸、アンモニア等の溶解成分を分析する溶解成分
自動分析装置、前記連続自動診断装置及び前記溶解成分
自動分析装置からの情報をもとに培養槽を自動運転する
ための手段を有する培養システムにある。

〔作用〕

試料採取管は通常内径5mm以下好ましくは３〜1mmのも
のが用いられ、その先端は培養槽内に挿入される。試料
採取管の培養槽外に位置する部分は、試料採取管外径よ
り大であるスチーム流通管内に収容されている。試料採
取管先端側のスチーム流通管末端は培養槽本体にネジ込
み又は他の方法により接続可能な構造を有している。ス
チーム流通管の他の一端はその内部に試料採取管後端を
収容し、かつ試料採取管に接続するフレキシブル管を収
容するに十分な容積を有している。培養を開始するにあ
たり、まず、培養槽の殺菌を行う際に、培養槽に接続さ
れた上記スチーム流通管にスチームを通じて内部の温度
を121℃以上とし、約20〜30分間保持する。この間に、
試料採取管及びこれに接続したフレキシブル配管の殺菌
が行われる。殺菌終了後、スチーム流通管内部により、
上記フレキシブル配管を無菌的雰囲気下で引き出し、別
途殺菌してある各種測定装置等に接続されたフレキシブ
ル配管とを接続する。試料の採取は、上記フレキシブル
配管の途中にペリスタリックポンプを設備し、ペリスタ
リックポンプを作動させて培養液を採取する。採取する
方法としては特に上記に限定されるものでなく、培養槽
本体を加圧することにより圧力差で押し出す方法等も用
いることができる。

前記培養液採取装置において、スチーム流通管が、培
養槽に接続するための機構を具備した部材ａ、及び部材
ａと共有する隔壁により接合されており、かつ隔壁近傍
において内径の大なる部分を有する管材ｂ、内径の大き
な部分で管材ｂと接続される管材ｃとから構成されてお
り、培養液採取管の先端を管材ａより突出させ、かつ後
端を管材ｃ内部に位置させた構造をなしている。殺菌終
了後、管材ｃをとり外し、内部より培養液採取管に接続
されたフレキシブル配管をとり出して、別途殺菌した各
種計測機器に接続するためのフレキシブル配管に接続す
る。

この培養液採取装置による培養液の採取法は次の通り
行われる。まず、培養槽に培養液採取装置を装着する。
この培養液採取装置のスチーム流通管にスチームを通じ
て内部の温度を121℃以上とし、約20〜30分間保持す
る。この間に、試料採取管及びこれに接続したフレキシ
ブル配管の殺菌が行われる。殺菌終了後、スチーム流通
管内部より、上記フレキシブル配管を無菌的雰囲気下で
引き出し、別途殺菌してある各種計測器等に接続された
フレキシブル配管とを接続する。上記フレキシブル配管
の途中にペリスタリックポンプを設置し、ペリスタリッ
クポンプを作動させて培養液を採取する。この培養液採
取法により、培養槽を汚染することなく無菌的に少量の
培養液を連続的に確実に採取することができる。

この培養液採取装置は培養槽、細胞の数及び活性の連
続的自動診断装置、培養液中の溶解成分自動分析装置、
前記連続自動診断装置及び前記溶解成分自動分析装置か
らの情報をもとに培養槽を自動運転するためのコンピュ
ーターから成る培養システムに組み込まれ、雑菌汚染等
のリスクがなくかつ制御精度の高い培養システムが構築
できる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、
本発明は、この実施例に限定されるものでない。

実施例１ 本発明の一実施例を第１図、第２図により説明する。
なお、第１図は培養液採取装置の斜視図、第２図はその
断面図である。

試料採取管１は、通常内径5mm以下好ましくは３〜1mm
のものが用いられ、その一端は培養槽10内に挿入され
る。該試料採取管の培養槽外に位置する部分は、該試料
採取用配管外径より大であり、かつスチームライン滅菌
に十分な断面積を有するスチーム流通管2a,2b,2c内に収
容される。スチーム流通管2a,2bは共有する隔壁３によ
り接続されている。

試料採取用配管の培養槽内に挿入される末端側を収納
しているスチーム流通管2aは培養槽本体にネジ込み又は
他の方法によって接続される。スチーム流通管2bは隔壁
の近傍においてその内径が部分的に拡大され、かつ拡大
部分においてスチーム流通管2cと接続される。両者は通
常ネジ込み又は他の接続方法により接続されている。前
述の試料採取管はスチーム流通管の2a,2b間の隔壁を貫
通しスチーム流通管2dの拡大部分に開口している。さら
にその末端には、シリコンゴム管、ポリテトラフルオロ
エチレン製の管等のスチーム殺菌に耐えるフレキシブル
管６を接続し、該フレキシブル管を拡大部分に収納す
る。また、フレキシブル管の内径は試料採取管の内径と
できるだけ同一であることが望ましい。

次に、この培養液採取装置の使用方法を第５図により
説明する。

培養液採取装置の殺菌は以下の手順により行う。ま
ず、スチーム流通管2a及びスチーム流通管2bの各一端の
間をフレキシブル管８で接続する。またスチーム流通管
2cの一端にフレキシブル管９を接続する。フレキシブル
管９の末端にはスチーム流量を調節するための弁を設け
る（図示していない）。培養槽10のスチーム殺菌時にお
いて、フレキシブル管９に設けた弁を開き、スチーム流
通管2a、フレキシブル配管８、スチーム流通管2b及びス
チーム排出管2c内部にスチームを通じる。内部の温度が
121℃以上になるよう弁の開度を調節する。121℃で約20
〜30分間保持する（第５図（ａ））。この操作により試
料採取管１及びフレキシブル管６の殺菌も同時に行われ
る。殺菌終了後、フレキシブル管９に設けた弁を閉じ、
さらに、フレキシブル配管８についてもその中間でピン
チコック等の手段により閉鎖する。冷却後、スチーム流
通管2cをとり外す（第５図（ｂ））。スチーム流通管2b
内部に収納されたフレキシブル配管６をとり出し、末端
をクリンベンチ等の無菌的雰囲気下で測定計測手段に
（図示せず）連絡するためのフレキシブル配管27に接続
する（第５図（ｃ）及び（ｄ））。なお、フレキシブル
配管27の先端には、フレキシブル配管６との接続を容易
ならしめるために、ごう性を有する接続用管材26を接続
することが好ましい。フレキシブル管27及び接続管材26
についてはあらかじめ、オートクレーブ等の殺菌手段に
より無菌化処理が不可欠であることはいうまでもない。

培養液を採取するにあたっては、培養槽内部が外部に
比べ加圧状態である場合には、圧力差で流出せしめる方
法も用いられるが、一般的にはフレキシブル管６又は27
にペリスタリックポンプを装着して、引き抜く方法が用
いられる。

実施例２ 第３図（ａ），（ｂ）は本発明の他の実施例を示して
おり、（ａ）は斜視図、（ｂ）はその断面図を示してい
る。

試料採取管への先端は培養槽内に挿入され、後端は、
該試料採取管外径より大なる径を有するスチーム流通管
2a、2c内に収容される。試料採取管１の先端側を収容す
るスチーム流通管2aは、培養槽壁にネジ込み又は他の方
法により接続される。流通管2aの後端はその内径が部分
的に拡大され、かつ拡大部分において、スチーム流通管
2cと接続される。試料採取管の後端はスチーム流通管2c
の拡大部分に開口している。さらにその末端にはシリコ
ンゴム管、ポリテトラフルオロエチレン製官等のフレキ
シブル管６を接続し、該フレキシブル管を拡大部分に収
納する。

本実施例の使用方法については、前述の実施例１とほ
ぼ同様である。

実施例３ 第４図（ａ），（ｂ）は他の実施例を示したものであ
り、（ａ）はその斜視図を、（ｂ）はその断面図を示し
ている。

試料採取管１の先端は培養槽内に挿入され、後端は、
該試料採取管外径より大なる径を有するスチーム流通管
2c、2b内に収容される。スチーム流通管2bには、培養槽
に接続するためのネジ込み、又は他の手段による接続手
段が付加されており、前記試料採取管は、該接続手段を
貫通し、その先端が培養槽内に挿入される。スチーム流
通管2c、2bはネジ込み等の接続手段により接続されてお
り、必要に応じて両者を分離することができる。前記試
料採取管の後端はスチーム流通管2b、2cで構成される空
間内に開口し、さらにその末端にシリコンゴム管、ポリ
テトラフルオロエチレン製の管等のフレキシブル管６が
接続され、該空間内に収容されている。

本実施例を使用するにあたっては、まず、スチーム流
通管2b、2cのそれぞれの末端部５及び７にスチーム供給
配管及びスチームドレン配管を接続し、スチーム流通管
2b、2c内にスチームを通じ、内部の温度が121℃以上に
なるように流量調節する。121℃にて20〜30分間保持
し、試料採取管及びフレキシブル管６の殺菌を行う。殺
菌終了後、スチームの流通を停止し、冷却したのち、前
述した実施例と同様の手法により使用する。

実施例４ 第７図は本発明になる培養液採取装置を用いた培養シ
ステムの例を示したものである。

内部が熱殺菌可能なステンレススチール製の培養槽10
において動物細胞や微生物などを培養する。本実施例は
動物細胞の例を示すが、微生物の場合も同様である。培
養槽10には動物細胞を含む懸濁液11が入っている。動物
細胞とは動物（例えばラット）の器官（例えば肝臓）か
ら採取した細胞である。培養によって動物細胞が産生す
る有用物質を回収する。基質はエネルギー源としてのグ
ルコースを初めアミノ酸類や血清を含む。動物細胞は適
切な環境が維持されれば酸素と基質とを摂取して細胞分
裂により増殖する。培養槽10内の懸濁液11は攪拌用モー
タ12と攪拌翼13とにより、細胞が損傷を受けない程度を
緩やかに攪拌され同時にコンプレッサ14と気泡発生装置
15とにより酸素含有ガスを吹き込む。攪拌用モータ12の
回転数やコンプレッサ14、酸素１、炭酸ガス２のガス供
給量はコンピュータ100で制御されて適切に操作され
る。また、基質と動物細胞を含む懸濁液11の物理化学的
性質は各種のセンサで計測される。すなわち、温度セン
サ16、pHセンサ17、DOセンサ18及びＤCO₂センサ19で懸
濁液の温度、pH,DO（溶存酸素濃度）及びＤCO₂（溶存炭
素ガス濃度）が各々計測される。これらの計測信号は推
論機構95に送信される。

培養液は採取装置20により培養槽より採取される。す
なわち、サンプリングポンプ22がコンピュータ100の指
令を受けて駆動して混合器23に懸濁液11を輸送する。混
合器23の液はフローセル41に輸送される。染色液供給ポ
ンプ32はコンピュータ100の指令を受けて駆動して染色
液31が混合器23に輸送されて、懸濁液11と染色液31とが
混合される。輸送ポンプ35はコンピュータ100の指令を
受けて懸濁液11と染色液31とが混合された液をフローセ
ル41に輸送する。また、フローセル41を定期的に洗浄す
るために洗浄液供給ポンプ34がコンピュータ100の指令
に応じて駆動し洗浄液33がフローセル41の直前に注入さ
れる。洗浄操作の頻度は低いのでマニュアルで実行して
も良い。

フローセル41では液中の細胞の画像が顕微鏡などの画
像拡大装置42で拡大される。画像拡大装置42で得る画像
は１画面だけでは正確な細胞状態を把握できないので、
撮像画像を次々に更新する。このために画像更新装置で
あるXYステージ43はコンピュータ100の指令を受けて駆
動し、フローセル41をＸ方向とＹ方向に移動させる。こ
のようにフローセル41の移動により画像拡大装置42では
フローセル41の異なった部分の画像が次々に得られる。
この画像はテレビカメラ44によって撮像されて、撮像画
像の信号がA/D変換器51に送信される。

A/D変換器51では、画像のアナログ信号をディジタル
信号に変換する。A/D変換された画像信号は、画像メモ
リ51Mに格納される。画像メモリ51Mに格納された多値画
像は、生細胞画像認識装置60と死細胞画像認識装置70と
に送信される。生細胞画像認識装置60では生死にかかわ
らず細胞を全て認識し、個数、大きさ、形状及び細胞の
輝度などを計算する。死細胞画像認識装置70は、死んだ
状態も含めて活性の低い状態の細胞を全て認識し、同様
に個数、大きさ、形状及び細胞の輝度などを計算する。
各々の計算結果は活性診断装置80に送信される。活性診
断装置80はこれらの計算結果を受けて生細胞及び死細胞
の個数、大きさ、形状及び細胞の輝度などを計算すると
同時にこれらの計算結果から細胞群の活性状態を総合的
に診断する。

流路切換えバルブ24に試料懸濁液を自動分析装置55に
移送する。自動分析装置55ではグルコース、乳酸、アン
モニア等の液中に溶解した成分を自動的に計測する。得
られた計測信号は推論機構95に送信される。

知識ベース90は細胞の増殖と代謝に関する実験的ある
いは理論的に整理された知識が格納される。推論機構95
は前述の温度センサ16、pHセンサ17、DOセンサ18及びＤ
CO₂センサ19の計測値と、活性診断装置80の診断結果、
及び知識ベース90の知識（ルール）に基づいて細胞の状
態を推論して適切な制御方策を指示する。この指示結果
はコンピュータ100に送信される。コンピュータ100はこ
の指示結果に基づいて酸素供給、攪拌及び基質交換の制
御を行なう。

本システムにより培養の制御精度を大幅に向上でき
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、内径の小さな試料採取管を用いるこ
とができ、その結果、管内に沈積している細胞を再浮遊
させるのに十分な流速かつ、管内への細胞の沈積を起さ
ない流速で少量の培養液を採取することが可能となる。
したがって、培養液の試料採取回数を従来に比べて大幅
に増加でき、また連続的に採取することも可能となる。
その結果、グルコース濃度、乳酸濃度、細胞濃度、生産
物濃度等の指標をより細かく得ることができ、培養の制
御をより精度よく行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は培養液採取装置の一実施例を示す斜視図、第２
図は第１図に示した培養液採取装置を培養槽に装着した
状態を示す断面図、第３図（ａ），（ｂ）及び第４図
（ａ），（ｂ）は培養液採取装置の他の実施例を示す
図、第５図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）は培養液採
取装置の使用方法を示す図、第６図は従来の試料採取装
置を示す図である。第７図は本発明になる培養システム
のフローを示す図である。 １……試料採取管、2a,2b,2c……スチーム流通管、３…
…隔壁、6,8,9……フレキシブル管、10……培養槽。

フロントページの続き (72)発明者 石田 昌彦 茨城県日立市久慈町4026番地 株式会社 日立製作所日立研究所内 (72)発明者 松崎 晴美 茨城県日立市久慈町4026番地 株式会社 日立製作所日立研究所内

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】内径の小なる培養液採取管の一端をスチー
   ム流通管の先端より突出せしめ、該培養液採取管の他の
   一端を該採取管の外径より大であり、かつスチーム滅菌
   に必要な温度まで昇温可能なスチーム流量を通過せしめ
   るのに十分な断面積を与える内径を有するスチーム流通
   管内に収容してなることを特徴とする培養液採取装置。
2. 【請求項２】請求項１において、スチーム流通管は培養
   槽に接続する機構を有する管材ａ、及び該管材と共有す
   る隔壁により接合されかつ隔壁近傍において内径の大な
   る部分を有する管材ｂ、内径の大なる部分で管材ｂと接
   続される管材ｃより構成され、培養液採取管が管材ａ及
   びｂ間の隔壁を貫通し管材の内部にその一端が開口して
   いることを特徴とする培養液採取装置。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載の培養液採取装置を培
   養槽に装着し、該培養液採取装置にスチームを流通せし
   めて該採取装置の内部を殺菌せしめたのち、内径大なる
   管材に接続している管材を取りはずし、次いで該内径大
   なる管材中に収容されている試料採取配管を通じて試料
   を採取することを特徴とする培養液採取方法。
4. 【請求項４】試料採取配管を測定装置に連結した配管に
   接続することを特徴とする請求項３記載の培養液採取方
   法。
5. 【請求項５】培養細胞に対するガスの供給手段と培養液
   の供給手段及び老廃培養液の排出手段を具備した培養
   槽、内径の小なる培養液採取管の一端をスチーム流通管
   の先端より突出せしめ、該培養液採取管の他の一端を該
   採取管の外径より大であり、かつスチーム滅菌に必要な
   温度まで昇温可能なスチーム流量を通過せしめるのに十
   分な断面積を与える内径を有するスチーム流通管内に収
   容してなる培養液採取装置、前記培養液採取装置で採取
   された培養液中の細胞の画像を拡大する手段と該画像か
   ら生きている細胞及び死細胞を認識する画像認識装置と
   を具備する細胞の数及び活性の連続自動診断装置、前記
   培養液採取装置で採取された培養液中のグルコース、乳
   酸、アンモニア等の溶解成分を分析する溶解成分自動分
   析装置、前記連続自動診断装置及び前記溶解成分自動分
   析装置からの情報をもとに培養槽を自動運転するための
   手段とを有することを特徴とする培養システム。