JP2670130B2 - Method for culturing Rhodococcus bacteria and method for producing 2-ketobutyric acid using the microorganism - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌の培
養方法及び該微生物を用いた２−ケト酪酸の製造方法に
関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application] The present invention relates to a method for culturing a bacterium of the genus Rhodococcus and a method for producing 2-ketobutyric acid using the microorganism.

本発明の方法によれば高収率で安価に２−ケト酪酸を
製造することができる。According to the method of the present invention, 2-ketobutyric acid can be produced at high yield and at low cost.

２−ケト酪酸は必須アミノ酸の１つであるＬ−イソロ
イシンの製造原料として最も期待される前駆物質であ
る。2-ketobutyric acid is the most promising precursor as a raw material for the production of L-isoleucine, which is one of the essential amino acids.

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） ２−ケト酪酸はＬ−イソロイシンの原料として最も有
望な前駆物質であるが、化学合成法による製造ではプロ
セスが複雑なため安価に製造することができず、Ｌ−イ
ソロイシンの原料としての工業的利用は困難な状況であ
った。(Prior Art and Problems to be Solved by the Invention) 2-Ketobutyric acid is the most promising precursor as a raw material for L-isoleucine, but the production by the chemical synthesis method is complicated and the process is inexpensive. However, it was difficult to industrially use L-isoleucine as a raw material.

本発明者らはロドコッカス（Rhodococcus）属に属す
る微生物を培養するに際し、培地中に1,2−プロパンジ
オール及び／又は1,2−ブタンジオールを添加して培養
した培養物又は該培養物から回収した菌体もしくはその
処理物の存在下、1,2−ブタンジオールを水性溶媒中で
酵素反応させると２−ケト酪酸が顕量生成するという全
く新規な知見を見出し、本発明を完成するに至った。The present inventors, when culturing a microorganism belonging to the genus Rhodococcus, collect the culture obtained by adding 1,2-propanediol and / or 1,2-butanediol to the medium, or recovering from the culture. The present invention has been completed based on the finding that a novel amount of 2-ketobutyric acid is produced when an enzyme reaction of 1,2-butanediol in an aqueous solvent is carried out in the presence of the treated cells or a treated product thereof. It was

［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用） 本発明は、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属し、
1,2−ブタンジオールから２−ケト酪酸を生成する能力
を有する微生物を培養するに際し、培地中に1,2−プロ
パンジオール及び／又は1,2−ブタンジオールを添加す
ることを特徴とするロドコッカス（Rhodococcus）属に
属する微生物の培養方法であり、更に、上記培養物又は
該培養物から回収した菌体もしくはその処理物の存在
下、1,2−ブタンジオールから２−ケト酪酸を製造する
方法をも提供するものである。[Structure of the Invention] (Means and Actions for Solving the Problems) The present invention belongs to the genus Rhodococcus,
When culturing a microorganism having the ability to produce 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol, Rhodococcus characterized in that 1,2-propanediol and / or 1,2-butanediol are added to the medium (Rhodococcus), a method for culturing a microorganism belonging to the genus, further comprising the step of producing 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol in the presence of the above-mentioned culture, the cells recovered from the culture or a treated product thereof. Is also provided.

本発明に用いる微生物としては、ロドコッカス（Rhod
ococcus）属に属し、1,2−ブタンジオールから２−ケト
酪酸を生成する能力を有するものであれば特に制限はな
く、例えば、ロドコッカス・エキュイ（Rhodococcus eq
ui）IFO 3730が挙げられる。The microorganism used in the present invention includes Rhodococcus
ococcus) and is capable of producing 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol, and is not particularly limited. For example, Rhodococcus eq (Rhodococcus eq.
ui) IFO 3730 can be mentioned.

1,2−プロパンジオール及び／又は1,2−ブタンジオー
ルの培地への添加量は、培地に対して、通常0.1〜10重
量％、好ましくは0.2〜４重量％である。1,2−プロパン
ジオール又は1,2−ブタンジオールの培地への添加時期
は特に制限されず、培養開始前であってもよく、また培
養途中であってもよい。更に、一括して添加してもよ
く、培養途中に逐次添加してもよい。The amount of 1,2-propanediol and / or 1,2-butanediol added to the medium is usually 0.1 to 10% by weight, preferably 0.2 to 4% by weight, based on the medium. The timing of adding 1,2-propanediol or 1,2-butanediol to the medium is not particularly limited, and may be before the start of the culture or during the culture. Furthermore, they may be added all at once or may be added sequentially during the culture.

上記の微生物を培養するための培地としては、炭素源
としてエタノール、グリセロール、酢酸又はその塩、コ
ハク酸又はその塩等を、窒素源として塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムのような無機
アンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸のような有機窒素源等を、無機物
としてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム等を、また必
要に応じて各種ビタミン等の栄養素を含有した培地が好
適に使用される。なお、培地に添加する1,2−プロパン
ジオール又は1,2−ブタンジオールは、２−ケト酪酸生
成酵素の生成促進物質として作用する以外に、微生物の
生育のための炭素源としても作用するので、培養開始前
に1,2−プロパンジオール又は1,2−ブタンジオールを培
地中に添加しておく場合は、炭素源として前記のような
エタノール、グリセロール等を使用することは必ずしも
必要ではない。The medium for culturing the above microorganisms, ethanol, glycerol, acetic acid or a salt thereof as a carbon source, succinic acid or a salt thereof, etc., ammonium chloride as a nitrogen source, ammonium sulfate, inorganic ammonium salts such as ammonium nitrate, peptone, A medium containing meat extract, corn steep liquor, an organic nitrogen source such as casamino acid, potassium phosphate, magnesium sulfate and the like as an inorganic substance, and, if necessary, various nutrients such as vitamins is preferably used. In addition, 1,2-propanediol or 1,2-butanediol added to the medium acts as a carbon source for the growth of microorganisms, in addition to acting as a production promoting substance for 2-ketobutyric acid synthase. When 1,2-propanediol or 1,2-butanediol is added to the medium before the start of culture, it is not always necessary to use ethanol, glycerol or the like as the carbon source.

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は通常20〜40℃、好ましくは25〜35℃である。培養
途中のpHは通常５〜10、好ましくは６〜８付近であり、
培養中のpHの調整には酸、アルカリを添加して行うこと
ができる。The culture is carried out under aerobic conditions such as aeration and stirring, and the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C. The pH during the culturing is usually 5 to 10, preferably around 6 to 8,
Adjustment of the pH during the culture can be performed by adding an acid or an alkali.

なお、培養期間は通常１〜７日間、好ましくは２〜５
日間である。The culture period is usually 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days.
Days.

培養後、得られた培養物、該培養物から過又は遠心
分離により集めた菌体、該菌体の超音波等による破砕物
又は菌体もしくはその破砕物の固定化等の処理物を酵素
剤として使用する。After culturing, the obtained culture, bacterial cells collected from the culture by hyperfiltration or centrifugation, disrupted products of the bacterial cells by ultrasonic waves, or treated products such as immobilized bacterial cells or their disrupted products are enzymatic agents. To use as.

菌体又は菌体破砕物の固定化手段は、特に制限される
ものではなく、例えばポリアクリルアミド、アルギン
酸、κ−カラギーナン等による包括法等が好適に用いら
れる。The means for immobilizing the cells or the disrupted cells is not particularly limited, and for example, an entrapment method using polyacrylamide, alginic acid, κ-carrageenan, or the like is suitably used.

上述の本発明に用いる各微生物は、各酵素活性を向上
させた変異、遺伝子組み換え、細胞融合などの手法によ
り得られた微生物であってもよい。Each of the microorganisms used in the present invention described above may be a microorganism obtained by a technique such as mutation, gene recombination, cell fusion or the like in which each enzyme activity is improved.

この酵素反応系には、少なくとも1,2−ブタンジオー
ルが含まれていればよく、その濃度は例えば反応の開始
時に通常0.01〜20重量％、好ましくは0.05〜10重量％程
度である。This enzyme reaction system may contain at least 1,2-butanediol, and its concentration is, for example, usually 0.01 to 20% by weight, preferably about 0.05 to 10% by weight at the start of the reaction.

1,2−ブタンジオールを原料として２−ケト酪酸を生
成する微生物の培養物又は該培養物から回収した菌体も
しくはその処理物の使用量は特に限定されるものではな
いが、通常0.1〜50重量％、好ましくは１〜30重量％程
度である。The amount of the culture of the microorganism that produces 2-ketobutyric acid using 1,2-butanediol as a raw material, or the amount of the bacterial cells or treated product thereof recovered from the culture is not particularly limited, but is usually 0.1 to 50. %, Preferably about 1 to 30% by weight.

この反応は、pHが通常５〜10、好ましくは６〜９で行
われ、反応温度は通常約10〜60℃、好ましくは約20〜45
℃である。反応は通常約10〜72時間行う。This reaction is carried out at a pH of usually 5 to 10, preferably 6 to 9, and the reaction temperature is usually about 10 to 60 ° C, preferably about 20 to 45 ° C.
° C. The reaction is usually performed for about 10 to 72 hours.

酵素反応に用いられる反応溶媒としては、水又はリン
酸もしくはトリス塩酸等の緩衝液が好ましい。The reaction solvent used in the enzymatic reaction is preferably water or a buffer solution such as phosphoric acid or Tris-hydrochloric acid.

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
These examples do not limit the scope of the invention in any way.

以下の実施例において、２−ケト酪酸の定性は、ペー
パークロマトグラフのRf値により、定量は高速液体クロ
マトグラフィー（島津LC−5A）により行った。また、％
と表したのは重量％を意味する。In the following examples, the qualitativeness of 2-ketobutyric acid was determined by the Rf value of a paper chromatograph, and the quantification was performed by high performance liquid chromatography (Shimadzu LC-5A). Also,%
Is expressed as% by weight.

反応終了液からの２−ケト酪酸の分離・精製は、通
常、エーテル抽出法、イオン交換樹脂処理法等により行
うことができる。Separation and purification of 2-ketobutyric acid from the reaction-terminated liquid can be usually performed by an ether extraction method, an ion exchange resin treatment method, or the like.

実施例１ 下記培地組成の培地100mlを500ml容三角フラスコに分
注して120℃、15分間滅菌処理したものに、ロドコッカ
ス・エキュイ（Rodococcus equi）IFO 3730を一白金耳
量接種し、30℃にて２時間振盪培養（前培養とする）
後、上記と同じ培地組成ａの培地1000mlを５容三角フ
ラスコに分注して120℃、15分間滅菌処理したものに上
記前培養物20mlを接種したものを更に30℃にて２日間振
盪培養した。Example 1 A 100 ml medium having the following medium composition was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. Shaking culture for 2 hours (preculture)
Then, 1000 ml of the same medium composition a as described above was dispensed into a 5-volume Erlenmeyer flask and sterilized at 120 ° C for 15 minutes, inoculated with 20 ml of the above preculture, and further shake-cultured at 30 ° C for 2 days. did.

培養終了液1000mlを遠心分離（10,000rpm、10分、４
℃）し菌体を集め、該集菌体を1/15Mリン酸緩衝液（pH
7.0）50mlに懸濁後、再び遠心分離（10,000rpm、10分、
４℃）して得た菌体を２−ケト酪酸生成酵素源とした。1000 ml of the culture termination solution is centrifuged (10,000 rpm, 10 minutes, 4 minutes)
° C), collect the cells, and collect the cells with a 1/15 M phosphate buffer (pH
7.0) After suspending in 50 ml, centrifuge again (10,000 rpm, 10 minutes,
The cells obtained at 4 ° C.) were used as a source of 2-ketobutyric acid-forming enzyme.

反応液（1,2−ブタンジオール ２％、1/15Mリン酸緩
衝液、pH7.0）100mlに上記で調製した２−ケト酪酸生成
酵素源5g（湿菌体）を加え、30℃にて24時間反応を行
い、該反応物から遠心分離（10,000rpm、10分、４℃）
にて除菌した上清液を回収し、該上清液中に生成した２
−ケト酪酸量を定量した。また、上清液50mlを塩酸酸性
（pH2.0）に調整後、該溶液にエーテル200mlを添加して
抽出を行った。該エーテル相を分離後、恒温水槽（50
℃）にてエーテルを蒸発除去し２−ケト酪酸の粗精製成
製物を得た。以上の結果を第１表に示した。To 100 ml of the reaction liquid (1,2-butanediol 2%, 1 / 15M phosphate buffer, pH 7.0), 5 g of 2-ketobutyric acid-producing enzyme source (wet cells) prepared above was added, and the mixture was heated at 30 ° C. Perform reaction for 24 hours and centrifuge from the reaction product (10,000 rpm, 10 minutes, 4 ° C)
The supernatant liquid that had been sterilized by
-The amount of ketobutyric acid was determined. Further, 50 ml of the supernatant was adjusted to hydrochloric acid (pH 2.0), and 200 ml of ether was added to the solution for extraction. After separating the ether phase, a constant temperature water bath (50
(° C) to remove the ether by evaporation to obtain a crude purified product of 2-ketobutyric acid. The results are shown in Table 1.

培地組成 基本培地 酵母エキス 0.01％ ポリペプトン 0.5 ％ （NH₄）₂HPO₄ 0.65％ KH₂PO₄ 0.35％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ FeSO₄・7H₂O 45 ppm MnSO₄・4H₂O ５ ppm ZnSO₄・7H₂O 30 ppm CuSO₄・5H₂O 2.5 ppm NaCl 50 ppm CaCO₃ 0.5 ％ 蒸留水 1000 ml （pH7.0） A:基本培地にエタノール１容量％添加、pH7.0 B:基本培地にエタノール１容量％と1,2−ブタンジオー
ル１％添加、pH7.0 C:基本培地にグリセロール１％添加、pH7.0 D:基本培地にクリセロール１％と1,2−ブタンジオール
１％添加、pH7.0 E:基本培地にコハク酸アンモニウム１％添加、pH7.0 F:基本培地にコハク酸アンモニウム１％と1,2−ブタン
ジオール１％添加、pH7.0 G:基本培地にエタノール１容量％と1,2−プロパンジオ
ール１％添加、pH7.0 H:基本培地にグリセロール１％と1,2−プロパンジオー
ル１％添加、pH7.0 I:基本培地に1,2−ブタンジオール１％添加、pH7.0 J:基本培地に1,2−プロパンジオール１％添加、pH7.0 K:基本培地に1,2−プロパンジオール１％と1,2−ブタン
ジオール１％添加、pH7.0 上記第１表から、培地に1,2−ブタンジオール又は1,2
−プロパンジオールを添加することにより２−ケト酪酸
生成量が顕著に増大することがわかる。0.01% medium composition basal medium yeast extract polypeptone _{0.5% (NH 4) 2 HPO} 4 0.65% KH 2 PO 4 0.35% MgSO 4 · 7H 2 O 0.04% FeSO 4 · 7H 2 O 45 ppm MnSO 4 · 4H 2 O 5 ppm _{ZnSO 4 · 7H 2 O 30 ppm} CuSO 4 · 5H 2 O 2.5 ppm NaCl 50 ppm CaCO 3 0.5% distilled water 1000 ml (pH7.0) a: ethanol 1% by volume added to the basal medium, pH 7.0 B: basal medium Ethanol 1% by volume and 1,2-butanediol 1%, pH 7.0 C: basic medium 1% glycerol, pH 7.0 D: basic medium 1% chrycerol and 1,2-butanediol 1% , PH7.0 E: ammonium succinate 1% added to the basic medium, pH7.0 F: ammonium succinate 1% and 1,2-butanediol 1% added to the basic medium, pH7.0 G: ethanol 1 added to the basic medium Volume% and 1,2-propanediol 1% added, pH 7.0 H: Glycerol 1% and 1,2-propanediol 1% added to basic medium, pH 7.0 I: 1,2-butanediene added to basic medium All 1% added, pH 7.0 J: 1,2-propanediol 1% added to the basic medium, pH 7.0 K: 1,2-propanediol 1% and 1,2-butanediol 1% added to the basic medium, pH 7.0 From Table 1 above, 1,2-butanediol or 1,2 was added to the medium.
It can be seen that the addition of -propanediol significantly increases the amount of 2-ketobutyric acid produced.

［発明の効果］ 本発明の方法によれば、安価な1,2−ブタンジオール
から好効率で安価に２−ケト酪酸を製造することができ
る。[Effects of the Invention] According to the method of the present invention, 2-ketobutyric acid can be produced from inexpensive 1,2-butanediol with good efficiency and at low cost.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical indication C12R 1:01)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】ロドコッカス（Rhodococcus）属に属し、
1,2−ブタンジオールから２−ケト酪酸を生成する能力
を有する微生物を培養するに際し、培地中に1,2−プロ
パンジオール及び／又は1,2−ブタンジオールを添加す
ることを特徴とするロドコッカス属に属し、1,2−ブタ
ンジオールから２−ケト酪酸を生成する能力を有する微
生物の培養方法。1. A member of the genus Rhodococcus,
When culturing a microorganism having the ability to produce 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol, Rhodococcus characterized in that 1,2-propanediol and / or 1,2-butanediol are added to the medium A method for culturing a microorganism belonging to the genus and having the ability to produce 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol. 【請求項２】ロドコッカス（Rhodococcus）属に属し、
1,2−ブタンジオールから２−ケト酪酸を生成する能力
を有する微生物の培養物又は該培養物から回収した菌体
もしくはその処理物の存在下、1,2−ブタンジオールを
水性溶媒中で反応させて２−ケト酪酸を生成させた後、
該反応液から２−ケト酪酸を採取することを特徴とする
２−ケト酪酸の製造方法。2. A member of the genus Rhodococcus,
Reaction of 1,2-butanediol in an aqueous solvent in the presence of a culture of a microorganism having the ability to produce 2-ketobutyric acid from 1,2-butanediol, or cells recovered from the culture or a treated product thereof. After generating 2-ketobutyric acid,
A method for producing 2-ketobutyric acid, which comprises collecting 2-ketobutyric acid from the reaction solution.