JP2669859B2 - Protein reactivation method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、還元変性状態のシステイン含有タンパク質
を再活性化する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for reactivating a cysteine-containing protein in a reductive denatured state.

従来の技術 タンパク質はある特定の高次構造（以下天然型と呼
ぶ）を形成することによってその特異的な機能を発揮す
る生体高分子である。システイン残基間のジスルフィド
結合もその高次構造の一部であり、タンパク質の機能あ
るいは安定性などにおいて重要な役割を果たしている。
最近、遺伝子組換え技術の進展により、タンパク質の生
産量は高まり、特に大腸菌を利用した発現系では、菌内
に生産されるタンパク質が顆粒として形成される例もあ
り〔エフ・エイ・オー・マーストン（F.A.O.Marston）
ら、バイオテクノロジー（BIO/TECNOLOGY）２,800（198
4）、ディー・エヌ・ブレムス（D.N.Brrms）ら、バイオ
ケミストリー（Biochemistry）24,7662（1985）〕、こ
の顆粒からのタンパク質の採取法が重要な課題となって
きた。このタンパク質の顆粒を溶解させるためには一度
変性させなければならない。特にシステイン含有タンパ
ク質を溶解させる場合は還元状態で変性させなければな
らないため、このタンパク質を再活性化するためには、
還元変性状態のタンパク質を効率よく、天然型のタンパ
ク質のジスルフィド結合に相当する位置にジスルフィド
結合を形成させなければならない。従来の技術では、こ
の変性剤存在下での変性状態と天然型の間の構造変化は
二状態転移〔タンパク質分子 99−127頁 岩波書店（1
985年）〕であることが多いことを利用して、変性剤を
含まない溶液に一段階、または多段階に分けて希釈した
り、透析したりすることによって再活性化していた〔ジ
ェイ・エイ・ギル（J.A.Gill）ら、バイオテクノロジー
（BIO/TECHNOLOGY）３,643（1985）、エイチ・ジェイ・
ジョージ（H.J.George）ら、ディー・エヌ・エー（DN
A）４,273（1985）、特開昭61−257931〕。この方法で
は、二次構造と三次構造の形成を一度に行うことにな
り、天然型においてはタンパク質分子内に包みこまれて
いる疎水部位が相互に作用したり、分子内、分子間で天
然型とは異なる位置にジスルフィド結合が形成されるな
どの反応が起こり、タンパク質が天然型とならずに会合
体や変性体となる場合が多かった。特に疎水性の相互作
用による会合体や変性体を形成する傾向が強いタンパク
質の場合は、天然型と同じ位置でのジスルフィド結合の
形成が抑制され、１％前後しか天然型とならない場合も
ある。BACKGROUND ART Protein is a biopolymer that exerts its specific function by forming a specific higher-order structure (hereinafter referred to as a natural type). The disulfide bond between cysteine residues is also a part of its higher-order structure, and plays an important role in protein function or stability.
Recently, the amount of protein produced has increased due to the development of genetic recombination technology. In particular, in an expression system using Escherichia coli, there are cases where proteins produced in the bacteria are formed as granules [F.A. Marston (FAOMarston)
Et al., Biotechnology (BIO / TECNOLOGY) 2, 800 (198
4), DNBrrms et al., Biochemistry 24 , 7662 (1985)], and the method of collecting proteins from these granules has become an important issue. The protein granules must be denatured once to dissolve. In particular, when a cysteine-containing protein is dissolved, it must be denatured in a reducing state, so in order to reactivate this protein,
A protein in a reductive denatured state must efficiently form a disulfide bond at a position corresponding to the disulfide bond of a native protein. In the conventional technique, the structural change between the denaturing state and the natural type in the presence of this denaturing agent is a two-state transition [protein molecule, page 99-127, Iwanami Shoten (1
985)], it was reactivated by diluting or dialysis in a solution containing no denaturant in one step or in multiple steps [J.A. Gill (JAGill), et al., biotechnology (BIO / tECHNOLOGY) 3, 643 (1985), H. Jay
HJGeorge et al., DN
A) 4, 273 (1985) , JP-A-61-257931]. In this method, the secondary structure and the tertiary structure are formed at the same time, and in the native type, the hydrophobic sites encapsulated in the protein molecule interact with each other, or the natural type is intramolecularly or intermolecularly bound. In many cases, a reaction such as the formation of a disulfide bond occurs at a position different from that of the protein, and the protein does not become a natural type but becomes an aggregate or a denatured form. Particularly, in the case of a protein which has a strong tendency to form an aggregate or a denatured product due to hydrophobic interaction, formation of a disulfide bond at the same position as that of the natural type is suppressed, and only about 1% of the natural type may be obtained.

従って従来の再活性化方法においては、疎水性の相互
作用による会合体や変性体を形成する傾向が強いシステ
イン含有タンパク質は還元変性状態から、効率よく再活
性化することが困難であった。Therefore, in the conventional reactivation method, it was difficult to efficiently reactivate a cysteine-containing protein from a reductively denatured state, which has a strong tendency to form an aggregate or a denatured body due to a hydrophobic interaction.

最近、ケー・イー・ラングレー（K.E.Langley）ら
は、変性状態でジスルフィド結合を形成させることによ
って、高頻度で天然型のジスルフィド結合に相当する位
置にジスルフィド結合を形成させるならば、疎水性の相
互作用による会合体や変性体の形成により天然型のジス
ルフィド結合に相当する位置でのジスルフィド結合を阻
害される場合より、再活性化されるタンパク質の収率が
向上することを報告した〔ヨーロッピアン・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）163,31
3−321（1987）〕。この方法は牛成長ホルモンの再活性
化法に関し、具体的には大腸菌内に顆粒として産生され
た牛成長ホルモンを洗浄後、6M塩酸グアニジンで可溶化
し、室温で20時間以上放置してジスルフィド結合を形成
させ、6M塩酸グアニジン存在下ゲル過クロマトグラフ
ィーを行ってモノマー画分を分取し、2M塩酸グアニジン
まで希釈後、透析するという方法である。しかし、この
方法は可溶化する際に還元モノマーの収率が低く、この
ために残余する会合体や目的タンパク質のSH基をブロッ
クする顆粒由来の物質が天然型のジスルフィド結合に相
当する位置でのジスルフィド結合の形成を阻害する。ま
た、この方法は酸化時、室温で20時間以上も放置してい
るため、こうした条件下ではアスパラギン残基、グルタ
ミン残基がデアミデーションを受けることが知られてい
る〔バイオキミカ・バイオフィジィカ・アクタ（Biochi
mica et Biophysica Acta）214,498−508（1970）〕。
また、これを避けるために５℃前後の低温で行えば、酸
化工程は長時間にわたる。Recently, KELangley and co-workers have shown that hydrophobic interactions can occur if they frequently form disulfide bonds at positions corresponding to natural disulfide bonds by forming disulfide bonds in a denatured state. It was reported that the yield of the reactivated protein is improved compared to the case where the formation of aggregates or denatured bodies by the method inhibits the disulfide bond at the position corresponding to the natural type disulfide bond [European Journal. of Biochemistry (Eur.J.Biochem.) 163, 31
3-321 (1987)]. This method relates to the reactivation method of bovine growth hormone. Specifically, after washing bovine growth hormone produced as granules in E. coli, it is solubilized with 6M guanidine hydrochloride and left at room temperature for 20 hours or more to form disulfide bond. Is formed, the gel fractionation is performed in the presence of 6M guanidine hydrochloride, the monomer fraction is separated, diluted to 2M guanidine hydrochloride, and then dialyzed. However, in this method, the yield of the reducing monomer is low when solubilized, and therefore the residual aggregates and the substance derived from the granules that block the SH group of the target protein are at a position corresponding to the natural disulfide bond. Inhibits disulfide bond formation. In addition, since this method is left for 20 hours or more at room temperature during oxidation, it is known that asparagine residues and glutamine residues undergo deamidation under these conditions (Bio-Kimika Biophysica. Actor (Biochi
mica et Biophysica Acta) 214 , 498-508 (1970)].
If the oxidation is performed at a low temperature of about 5 ° C. in order to avoid this, the oxidation process takes a long time.

発明が解決しようとする課題 本発明は、還元変性状態のシステイン含有タンパク質
を効率よく、再活性化する方法を提供する。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention The present invention provides a method for efficiently reactivating a cysteine-containing protein in a reductive denatured state.

課題を解決するための手段 本発明者らは、変性剤を加えて可溶化する際に同時に
還元剤を加えることによりシステイン含有タンパク質の
還元モノマーを増加させ、会合体を減少又は消失させる
ことができることを見出した。Means for Solving the Problems The present inventors can increase the reducing monomer of a cysteine-containing protein by adding a reducing agent at the same time as adding a denaturing agent to solubilize it, and reduce or eliminate aggregates. Was found.

さらに目的タンパク質が微生物の菌体内に顆粒として
蓄積される場合は変性剤を加えて顆粒を可溶化する際に
同時に還元剤を加えることにより、目的タンパク質のSH
基をブロックする顆粒由来の物質を目的タンパク質から
遊離させ、還元剤を除去する際に、該物質を還元剤と共
に除去することができ、その結果、変性状態でジスルフ
ィド結合を形成させた場合、天然型のジスルフィド結合
に相当する位置にジスルフィド結合を有する再活性化さ
れたシステイン含有タンパク質の収率を向上させること
ができることを見い出し、本発明を完成するに至った。Furthermore, if the target protein accumulates in the cells of the microorganism as granules, the SH of the target protein can be reduced by adding a reducing agent at the same time as solubilizing the granules by adding a denaturing agent.
When the substance derived from the granules that block the group is released from the target protein and the reducing agent is removed, the substance can be removed together with the reducing agent. As a result, when a disulfide bond is formed in a denatured state, the natural It was found that the yield of a reactivated cysteine-containing protein having a disulfide bond at a position corresponding to the type disulfide bond can be improved, and the present invention has been completed.

本発明の方法は、システイン含有タンパク質に変性
剤および還元剤を加えて還元変性状態にして可溶化し、
還元剤を除去し、変性状態のまま酸化させて天然型
のタンパク質のジスルフィド結合に相当する位置にジス
ルフィド結合を形成させ、変性剤を除去することによ
って再活性化されたタンパク質を分離精製することから
なっている。本発明は、特にシロザケ成長ホルモンＩ
（SGH−Ｉ）、ウナギ成長ホルモンＩなど変性剤濃度を
下げて再活性化する場合、会合体または変性体を形成す
る傾向が強い難溶性のシステイン含有タンパク質であ
り、かつジスルフィド結合の数が少なく、分子間にはジ
スルフィド結合がないタンパク質の再活性化に好適であ
る。The method of the present invention comprises adding a denaturant and a reducing agent to a cysteine-containing protein to solubilize it in a reductive denatured state,
Removal of the reducing agent, oxidation in the denatured state to form a disulfide bond at a position corresponding to the disulfide bond of the native protein, and separation and purification of the reactivated protein by removing the denaturing agent Has become. The present invention is particularly directed to chum salmon growth hormone I.
(SGH-I), eel growth hormone I, etc. It is a poorly soluble cysteine-containing protein that has a strong tendency to form aggregates or denatured substances when it is reactivated by lowering the concentration of denaturants, and has a small number of disulfide bonds. It is suitable for reactivating a protein having no disulfide bond between molecules.

蛋白質が菌体内に顆粒として蓄積される場合、顆粒の
分離・精製法は、特開昭60−244259に記載されている以
下に示す工程に従って行う。When the protein is accumulated in the cells as granules, the method for separating and purifying the granules is carried out according to the following steps described in JP-A-60-244259.

次に各工程について詳述する。 Next, each step will be described in detail.

＜工程１＞ 蛋白質の顆粒を菌体内に蓄積している微生物菌体を破
砕後、遠心分離して沈殿画分（沈殿画分Ａとする）をと
る。<Step 1> Microbial cells accumulating protein granules in the cells are crushed and centrifuged to obtain a precipitate fraction (hereinafter referred to as precipitate fraction A).

菌体破砕は中性付近の緩衝液（例えばpH7のリン酸緩
衝液）に菌体を懸濁し、ついで常法により超音波処理、
リゾチーム処理、ホモゲナイザー処理、機械的圧力によ
ることができる。特に機械的圧力による破砕が好まし
く、例えばフレンチ・プレス，マントン−ガウリンホモ
ゲナイザー等によって破砕が行われる。破砕条件は各機
器の適切な使用範囲で十分である。For cell disruption, suspend the cells in a buffer solution near neutrality (eg phosphate buffer at pH 7), and then sonicate by a conventional method.
Lysozyme treatment, homogenizer treatment, mechanical pressure can be used. In particular, crushing by mechanical pressure is preferable, and for example, crushing is performed by a French press, Manton-Gaulin homogenizer or the like. Crushing conditions are sufficient in the appropriate use range of each device.

次に破砕液を遠心分離して沈殿画分Ａを得るが、この
沈殿画分には蛋白質顆粒及び菌体残渣が含まれる。遠心
分離は通常の遠心分離機によって行えばよいが、連続遠
心、シャープレスによってもよい。通常の遠心分離機を
使用する場合の遠心条件は通常2000〜15000rpm,10〜120
分とするが、特に4000〜12000rpm,30〜90分が好まし
い。Next, the disrupted liquid is centrifuged to obtain a precipitate fraction A, which contains protein granules and cell residue. Centrifugation may be performed by an ordinary centrifuge, but continuous centrifugation or sharp press may be used. The centrifugation conditions when using a normal centrifuge are usually 2000-15000 rpm, 10-120
Minutes, but 4000 to 12000 rpm and 30 to 90 minutes are particularly preferable.

＜工程２＞ 沈殿画分Ａをアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属
の鉱酸塩、ペントース、ヘキソース、２糖類、３糖類、
デオキシ糖、糖アルコール、デキストランもしくはデキ
ストリン又はフィコールの水溶液、又はパーコールの水
懸濁液に懸濁して遠心分離して沈殿画分（沈殿画分Ｂと
する）をとる。この遠心分離によって細胞残渣は上清と
して除去され、蛋白質顆粒を含む沈殿が得られる。<Step 2> The precipitated fraction A is converted to an alkali metal or alkaline earth metal mineral salt, pentose, hexose, disaccharide, trisaccharide,
The precipitate is suspended in an aqueous solution of deoxy sugar, sugar alcohol, dextran or dextrin or ficoll, or in an aqueous suspension of Percoll, and centrifuged to obtain a precipitate fraction (precipitated fraction B). By this centrifugation, cell debris is removed as a supernatant, and a precipitate containing protein granules is obtained.

従来、密度の異なる細胞内成分の分離には、しばしば
ショ糖密度勾配超遠心法、ショ糖密度勾配平衡超遠心法
などが用いられている。又、ラット肝臓をショ糖溶液を
用いてホモゲナイズした後、遠心分離して沈殿部に細胞
核を含む画分を得る分画遠心法などが知られている〔大
岳 望ら著、「物理の単離と精製」、東大出版会発行、
145−155ページ（昭和51年発行）〕。Conventionally, sucrose density gradient ultracentrifugation method, sucrose density gradient equilibrium ultracentrifugation method, etc. are often used to separate intracellular components having different densities. Also known is a fractional centrifugation method in which rat liver is homogenized with a sucrose solution and then centrifuged to obtain a fraction containing cell nuclei in the sedimentation section (Nozomi Ohtake et al., `` Physical Isolation And refining ”, published by the University of Tokyo Press,
Pp. 145-155 (issued in 1976)].

上記において、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金
属の鉱酸塩としてはナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、セシウム等の塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩等があ
げられる。具体的には塩化セシウム、硫酸カルシウム、
塩化ナトリウム、臭化ナトリウム等があげられる。In the above, examples of the alkali metal or alkaline earth metal mineral salts include hydrochlorides such as sodium, potassium, calcium and cesium, sulfates, hydrobromides and the like. Specifically, cesium chloride, calcium sulfate,
Examples include sodium chloride and sodium bromide.

ペントースとしてはＬ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−リボース等、ヘキソースとしてはＤ−グリコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクト
ース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−ソルボース等、２糖類、
３糖類としてはショ糖、マルトース、ラクトース、トレ
ハロース、セロビオース、ラフィノース等、デオキシ糖
としてはＬ−ラムノース、２−デオキシ−Ｄ−リボース
等、糖アルコールとしてはグリセロール、エリトリッ
ト、アラビット、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニット等
があげられる。Pentose is L-arabinose, D-xylose, D-ribose and the like, and hexose is D-glycose, D-mannose, D-galactose, L-galactose, D-fructose, L-sorbose and the like, disaccharides,
Trisaccharides include sucrose, maltose, lactose, trehalose, cellobiose, raffinose and the like, deoxy sugars such as L-rhamnose and 2-deoxy-D-ribose, and sugar alcohols such as glycerol, erythritol, arabite, D-sorbitol and D. -Mannitol and the like can be mentioned.

フィコール（Ficoll）、パーコール（Percoll）はフ
ァルマシア社製の商品の商品名であり、フィコールはシ
ョ糖とエピクロルヒドリンとからなる水に易溶の合成高
分子であり、パーコールはシリカのビーズを合成樹脂で
コーティングし粒をそろえたものである。Ficoll and Percoll are trade names of products manufactured by Pharmacia. Ficoll is a water-soluble synthetic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin. Percoll is a synthetic resin made of silica beads. It is coated and the grains are prepared.

水溶液、水懸濁液は中性付近の緩衝液であることが好
ましい。The aqueous solution and the aqueous suspension are preferably near neutral buffer solutions.

水溶液中の固形成分の濃度としては、アルカリ金属も
しくはアルカリ土類金属の鉱酸塩の場合は５〜50％（w/
w）、グリセリンの場合は10〜80％（w/w）、デキストラ
ン、デキストリンの場合は５〜50％（w/w）、ショ糖を
はじめその他の糖類の場合は0.25〜4M、特に0.5〜2Mが
適当である。The concentration of solid components in the aqueous solution is 5 to 50% (w / w in the case of an alkali metal or alkaline earth metal mineral acid salt).
w), 10-80% (w / w) for glycerin, 5-50% (w / w) for dextran and dextrin, 0.25-4M for sucrose and other sugars, especially 0.5- 2M is appropriate.

上記水溶液、水懸濁液の沈殿画分Ａに対する使用割合
としては工程１に入る前の発酵ブロスの容量に対して1/
20〜20倍量（v/v）が適当である。The ratio of the above-mentioned aqueous solution or water suspension to the precipitation fraction A is 1 / the volume of the fermentation broth before the step 1.
A 20-20 volume (v / v) is appropriate.

上記条件で調製した沈殿画分Ａの懸濁液は直ちに遠心
分離することにより沈殿画分Ｂを得てもよいが、沈殿Ｂ
の分離効率を高めるために懸濁液は十分撹拌したのち遠
心分離することが好ましい。The suspension of the precipitation fraction A prepared under the above conditions may be immediately centrifuged to obtain the precipitation fraction B.
In order to enhance the separation efficiency of (1), it is preferable to centrifuge the suspension after sufficiently stirring it.

遠心分離は通常の遠心分離機によって行えばよいが連
続遠心、シャープレスによってもよい。通常の遠心分離
機による場合通常2000〜15000rpm,10〜120分、好ましく
は4000〜12000rpm,30〜90分の条件で行う。Centrifugation may be performed by a usual centrifugal separator, but may be performed by continuous centrifugation or a sharp press. In the case of using an ordinary centrifuge, the conditions are usually 2000 to 15000 rpm, 10 to 120 minutes, and preferably 4000 to 12000 rpm, 30 to 90 minutes.

＜工程３＞ 沈殿画分Ｂをノニオン系界面活性剤又はコール酸類も
しくはそのアルカリ金属塩の水溶液と混合し、ついで固
液分離する。この操作により沈殿画分Ｂに混在する微生
物の膜成分の蛋白質、脂質、リポ多糖類等が溶解除去さ
れ、顆粒が精製される。<Step 3> The precipitated fraction B is mixed with a nonionic surfactant or an aqueous solution of cholic acid or its alkali metal salt, and then solid-liquid separated. By this operation, proteins, lipids, lipopolysaccharides, etc. of the membrane components of the microorganisms mixed in the precipitate fraction B are dissolved and removed, and the granules are purified.

なお、リポ多糖類はパイロジェンとして知られ、顆粒
画分からリポ多糖類を除去しておくことは医薬品製造上
必須である。In addition, lipopolysaccharide is known as a pyrogen, and it is essential for pharmaceutical production to remove lipopolysaccharide from the granular fraction.

上記方法に関する従来技術としては、トリトンＸ−10
0、EDTA（エチレンジアミン四酢酸）等での処理により
大腸菌の膜から蛋白質、脂質、リポ多糖類が除去される
ことをシュナイトマン（Schnaitman）が報告している。Prior art related to the above method includes Triton X-10.
Schnaitman reported that proteins, lipids and lipopolysaccharides were removed from Escherichia coli membranes by treatment with 0, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or the like.

〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriolo
gy）,108,553（1971）〕。[Journal of Bacteriology (J. Bacteriolo
gy), 108, 553 (1971)].

上記でノニオン系界面活性剤としてはポリオキシエチ
レンアルキルエーテル系、例えばポリオキシエチレンオ
レイルエーテルC₁₈H₃₅O（CH₂CH₂O）nH〔商品名：ブリジ
（Brij）96（ｎ＝10），ブリジ98（ｎ＝20）など〕、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル系、例えばポリオキシ
エチレンステアリン酸エステル〔商品名：ニッサンノニ
オンＳ〕、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル系、例えばポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェ
ニルエーテル 〔商品名：トリトンＸ−100（ｎ＝9,10）など〕、ソル
ビタン脂肪酸エステル系、例えばモノステアリン酸ソル
ビタン（商品名：スパン60など）、ポリオキシエチレン
ソルビタン脂肪酸エステル系、例えばポリオキシエチレ
ンモノラウリン酸ソルビタン〔商品名：ツイーン20（オ
キシエチレン単位のくり返し＝20）など〕などが用いら
れる。In the above, the nonionic surfactant is a polyoxyethylene alkyl ether type, for example, polyoxyethylene oleyl ether C ₁₈ H ₃₅ O (CH ₂ CH ₂ O) nH [trade name: Brij 96 (n = 10), Briji 98 (n = 20) etc.], polyoxyethylene fatty acid ester type, for example, polyoxyethylene stearic acid ester [trade name: Nissan Nonion S], polyoxyethylene alkylphenyl ether type, for example, polyoxyethylene pt-octyl Phenyl ether [Brand name: Triton X-100 (n = 9,10), etc.], sorbitan fatty acid ester type, for example, sorbitan monostearate (Brand name: Span 60 etc.), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester type, for example polyoxyethylene monolaurin Sorbitan acid [trade name: Tween 20 (repeat of oxyethylene units = 20), etc.] is used.

コール酸類もしくはそのアルカリ金属塩としてはコー
ル酸、デオキシコール酸、それらのナトリウム塩等があ
げられる。Cholic acids or alkali metal salts thereof include cholic acid, deoxycholic acid and their sodium salts.

これらの界面活性剤（コール酸類及びそのアルカリ金
属塩も界面活性剤である）の水溶液は中性付近の緩衝液
とすることが好ましい。An aqueous solution of these surfactants (cholic acid and its alkali metal salts are also surfactants) is preferably a buffer solution near neutral.

水溶液中における界面活性剤の濃度は0.2〜10％（w/
v）、好ましくは0.5〜４％である。The concentration of the surfactant in the aqueous solution is 0.2 to 10% (w /
v), preferably 0.5-4%.

上記条件で調製した沈殿画分Ｂの混合液は直ちに固液
分離してもよいが、分離効率を高めるべく十分撹拌した
のち固液分離するのが好ましい。The mixed solution of the precipitation fraction B prepared under the above conditions may be subjected to solid-liquid separation immediately, but it is preferable to carry out solid-liquid separation after sufficiently stirring to enhance the separation efficiency.

固液分離は遠心分離、過等により行うことができ
る。遠心分離は固液分離を可能にする方法・条件であれ
ばいずれの方法・条件であってもよい。例えば、工程
１、工程２に述べた方法・条件によればよい。Solid-liquid separation can be performed by centrifugation, filtration, or the like. Centrifugation may be any method and condition as long as solid-liquid separation is possible. For example, the method and conditions described in steps 1 and 2 may be used.

上記界面活性剤処理に際し、金属キレート剤を併用す
ることにより精製効率を高めることができる。金属キレ
ート剤としてはEDTA、EGTA〔エチレングリコールビス
（２−アミノエチルエーテル）四酢酸〕、NTA（ニトリ
ロ三酢酸）、HEDTA（２−ヒドロキシエチルエチレンジ
アミン三酢酸）、DTPA（ジエチレントリアミン五酢
酸）、DCAT（1,2−ジアミノシクロヘキサン四酢酸）な
どがあげられる。金属キレート剤の濃度は２〜50mM、好
ましくは５〜20mMである。その他の条件は界面活性剤単
独使用の場合と同様でよい。Purification efficiency can be improved by using a metal chelating agent in combination with the above-mentioned surfactant treatment. As a metal chelating agent, EDTA, EGTA [ethylene glycol bis (2-aminoethyl ether) tetraacetic acid], NTA (nitrilotriacetic acid), HEDTA (2-hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), DCAT ( 1,2-diaminocyclohexanetetraacetic acid) and the like. The concentration of the metal chelating agent is 2 to 50 mM, preferably 5 to 20 mM. Other conditions may be the same as the case of using the surfactant alone.

本発明において変性剤は、SDS（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）、尿素または塩酸グアニジン、酸またはアルカリ
を、単独あるいは複合して用いる。変性剤の種類と濃度
は可溶化されるタンパク質をなるべく均一な状態にする
ようなものを選択する。還元剤は、β−メルカプトエタ
ノール、システイン、グルタチオンなどの一価のチオー
ル化合物またはジチオスライトール（DTT）などいずれ
でもよく、変性剤を含む水溶液に添加して用いるが、タ
ンパク質のシステイン残基とジスルフィド結合を形成す
る傾向の少ないDTTがより好ましい。In the present invention, as the denaturant, SDS (sodium dodecyl sulfate), urea or guanidine hydrochloride, acid or alkali is used alone or in combination. The type and concentration of the denaturing agent are selected so that the solubilized protein is made as uniform as possible. The reducing agent may be a monovalent thiol compound such as β-mercaptoethanol, cysteine, glutathione, or dithiothreitol (DTT), and is used by adding it to an aqueous solution containing a denaturing agent. DTT with less tendency to form bonds is more preferred.

変性剤を加えてタンパク質を可溶化する際に同時に還
元剤を加えることにより、タンパク質の還元モノマーを
増加させ、会合体を減少又は消失させることができる。
目的タンパク質が微生物の菌体内に顆粒として蓄積され
る場合は、変性剤を加えて顆粒を可溶化する際に同時に
還元剤を加えることにより、目的タンパク質のSH基をブ
ロックする顆粒由来の物質を目的タンパク質から遊離さ
せることができる。By adding a reducing agent at the same time that the denaturing agent is added to solubilize the protein, the reducing monomer of the protein can be increased and the aggregates can be reduced or eliminated.
When the target protein accumulates as granules in the microbial cells, a denaturing agent is added to solubilize the granules, and at the same time, a reducing agent is added. It can be released from the protein.

還元剤を除去する手段は、変性剤存在下、非酸化条件
下での希釈、透析（限外過を含む）、ゲル過、吸脱
着を含むクロマトグラフィーおよびバッチ操作などがあ
り特に限定されないが、ゲル過が望ましい。Means for removing the reducing agent include, but are not particularly limited to, dilution under non-oxidizing conditions in the presence of a denaturing agent, dialysis (including ultrafiltration), gel filtration, chromatography including adsorption and desorption, and batch operation, but Gel run is preferred.

また、微生物菌体内に顆粒として蓄積するタンパク質
を再活性化する場合は、還元剤が除去されるとともに該
タンパク質のSH基をブロックする顆粒由来の物質も除去
することができる。In the case of reactivating a protein that accumulates as granules in the microbial cells, the reducing agent can be removed and the substance derived from the granules that block the SH group of the protein can be removed.

酸化の手段は特に限定されないが、自然酸化による方
法以外に、溶存酸素による酸化を酸素又は空気を該水溶
液に通気することによって促進する方法、溶存酸素によ
る酸化を該水溶液に二価の銅イオンを添加することによ
って促進する方法、該水溶液にｏ−ヨードソ安息香酸、
酸化型グルタチオン、酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの混合物、シスチンまたはシスチンとシステイ
ンの混合物などの弱い酸化剤を添加することによって酸
化する方法がある。pHによって、酸化速度を制御するこ
とも可能である。また、酸化時のタンパク質濃度は低い
方が望ましく、タンパク質によって異なるが、通常0.1
〜2000μg/mlである。反応時間および反応温度は特に限
定されないが、５分〜10時間で、凍結しない範囲で10℃
以下が望ましい。この酸化反応により、高頻度で天然型
のジスルフィド結合に相当する位置にジスルフィド結合
を持つタンパク質が形成される。Means for oxidation is not particularly limited, in addition to the method by natural oxidation, a method of promoting the oxidation by dissolved oxygen by aerating oxygen or air into the aqueous solution, the oxidation by dissolved oxygen by adding divalent copper ions to the aqueous solution. A method of accelerating by adding, o-iodosobenzoic acid to the aqueous solution,
There is a method of oxidizing by adding a weak oxidizing agent such as oxidized glutathione, a mixture of oxidized glutathione and reduced glutathione, cystine or a mixture of cystine and cysteine. The oxidation rate can be controlled by the pH. In addition, it is desirable that the protein concentration during oxidation is low, and it depends on the protein, but usually 0.1
~ 2000 μg / ml. The reaction time and the reaction temperature are not particularly limited.
The following is desirable. By this oxidation reaction, a protein having a disulfide bond at a position corresponding to a natural disulfide bond is frequently formed.

変性剤を除去する手段は希釈、透析（限外過を含
む）、ゲル過、等電点沈殿、吸脱着を含むクロマトグ
ラフィーおよびバッチ操作などがあり、変性剤が除去さ
れるとともに会合体や変性体となった天然型とは異なる
位置にジスルフィド結合を持つタンパク質や不純物も、
分子量、電荷、疎水性などの差異により除去され、天然
型のジスルフィド結合に相当する位置にジスルフィド結
合を持つタンパク質が分離される。具体的には、ａ）透
析−遠心分離 ｂ）希釈−濃縮−等電点沈殿−遠心分離
ｃ）イオン交換クロマトグラフィー−透析−遠心分離
ｄ）ゲル過−イオン交換クロマトグラフィーなどの
方法がある。Means for removing the denaturant include dilution, dialysis (including ultrafiltration), gel filtration, isoelectric focusing, chromatography including adsorption / desorption, and batch operation. Proteins and impurities with disulfide bonds at positions different from the natural type that became the body,
It is removed due to differences in molecular weight, charge, hydrophobicity, etc., and the protein having a disulfide bond at the position corresponding to the natural disulfide bond is separated. Specifically, there are methods such as a) dialysis-centrifugation b) dilution-concentration-isoelectric focusing-centrifugation c) ion exchange chromatography-dialysis-centrifugation d) gel per-ion exchange chromatography.

本発明の各工程において、反応温度は特に限定されな
いが、凍結しない範囲で10℃以下が望ましい。タンパク
質を含有する溶液のpHはタンパク質によって異なり、特
に限定されないが、pH2〜７が望ましい。In each step of the present invention, the reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 10 ° C. or lower as long as it does not freeze. The pH of the solution containing the protein varies depending on the protein and is not particularly limited, but pH 2 to 7 is desirable.

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する
が、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するもので
はない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples do not limit the scope of the present invention.

実施例1. 大腸菌によって生産されたSGH−Ｉの顆粒か
らの再活性化法（Ｉ） 組換え型SGH−Ｉは特開昭61−93197に示された培養方
法に従って得た組換え型SGH−Ｉ顆粒含有菌体から、特
開昭60−244259に示された方法に従い、純度約90％まで
に単離、精製された。この顆粒5mgを7M尿素、5mM EDT
A、1mM DTTを含む100mMトリス〔トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン〕緩衝液（pH8.0）に溶解し、2.5ml
とした。４℃、２時間撹拌後、遠心分離（12,000rpm、
５分間）し、上清から、7M尿素を含む100mMトリス緩衝
液（pH7.0）で平衡化したゲル過カラムPD−10（ファ
ルマシア・ファインケミカル社製）を用いてDTTを除去
した。タンパク質溶出画分3.5mlに等量の7M尿素、およ
び1mM CuSO₄を含む100mMトリス緩衝液（pH9.0）を混合
し、４℃にて２時間静置することによって酸化を進行さ
せた。次にこの溶液7mlを２の100mMトリス緩衝液（pH
7.0）に４℃で一晩透析した。透析内液を遠心分離（12,
000rpm、５分間）すると、上清にほぼ純粋な組換え型SG
H−Ｉが回収された。関根らの方法〔プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc.Natl.Acad.Sci.）82 4306（1985）〕により、
得られた組換え型SGH−Ｉの活性を測定したところ天然
のSGH−Ｉ〔エイチ・カワウチ（H.Kawauchi）ら、アチ
ーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフ
ィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysic
s）244 542（1986）〕と同等の活性を示した。第１表
に工程の物質収支を示した。Example 1. Method for reactivating SGH-I produced by Escherichia coli from granules (I) Recombinant SGH-I was obtained according to the culture method described in JP-A-61-93197. The cells containing I granules were isolated and purified to a purity of about 90% according to the method disclosed in JP-A-60-244259. 5 mg of this granule was added to 7 M urea and 5 mM EDT.
A, dissolved in 100 mM Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane] buffer (pH 8.0) containing 1 mM DTT, 2.5 ml
And After stirring at 4 ° C for 2 hours, centrifuge (12,000 rpm,
After 5 minutes), DTT was removed from the supernatant using a gel per column PD-10 (Pharmacia Fine Chemical Co.) equilibrated with 100 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 7 M urea. 3.5 ml of the protein eluate fraction was mixed with an equal amount of 7 M urea and 100 mM Tris buffer (pH 9.0) containing 1 mM CuSO ₄ , and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours to promote oxidation. Next, 7 ml of this solution was added to 2 100 mM Tris buffer (pH
7.0) at 4 ° C overnight. Centrifuge the dialysate (12,
000 rpm, 5 minutes), the supernatant was almost pure recombinant SG
HI was recovered. According to the method of Sekine et al. [Proceeding of the National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.) 82 4306 (1985)],
When the activity of the obtained recombinant SGH-I was measured, natural SGH-I [H. Kawauchi et al., Archives of Biochemistry and Biophysic
s) 244 542 (1986)]. Table 1 shows the material balance of the process.

実施例2. 酸化工程後の天然型SGH−Ｉの精製方法
（Ｉ） 実施例１によって得られた酸化液の溶液を100mMトリ
ス緩衝液（pH8.0）で10倍に希釈し、４℃にて２時間放
置後、限外過膜（YM−10,アミコン社製）を用い、1/1
0に濃縮した。1N塩酸を用いて濃縮液のpHを6.0に調整し
等電点沈殿を起こした後、遠心分離（12,000rpm、５分
間）すると、上清にほぼ純粋な組換え型SGH−Ｉが回収
された。関根らの方法〔プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.）82 4306（1985）〕により、得られた組
換え型SGH−Ｉの活性を測定したところ、天然のSGH−Ｉ
〔エイチ・カワウチ（H.Kawauchi）ら、アチーブス・オ
ブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス
（Archives of Biochemistry and Biophysics）244 54
2（1986）〕と同等の活性を示した。第２表に工程の物
質収支を示した。 Example 2 Purification Method of Natural SGH-I after Oxidation Step (I) The solution of the oxidized solution obtained in Example 1 was diluted 10-fold with 100 mM Tris buffer (pH 8.0) and heated to 4 ° C. And left for 2 hours, using an ultra-membrane (YM-10, manufactured by Amicon),
Concentrated to zero. After adjusting the pH of the concentrated solution to 6.0 with 1N hydrochloric acid to cause isoelectric point precipitation, centrifugation (12,000 rpm, 5 minutes) was performed to recover almost pure recombinant SGH-I in the supernatant. . Sekine et al.'S method [Proceeding of the
National Academy of Science (Proc.Nat
l.Acad.Sci.) 82 4306 (1985)], the activity of the obtained recombinant SGH-I was measured.
[H. Kawauchi et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 244 54
2 (1986)]. Table 2 shows the material balance of the process.

実施例3. 酸化工程後の天然型SGH−Ｉの精製方法（I
I） 実施例１によって得られた酸化後の溶液を7M尿素を用
いて10倍に希釈し、pHを8.0に調整した後、7M尿素を含
む10mMトリス緩衝液（pH8.0）で平衡化したDEAEセファ
ロースCL−6B（ファルマシア ファインケミカル社製）
カラム（1.5×5.7cm）に通塔（10ml/時）した。続いて
同緩衝液50mlで洗浄（10ml/時）後、30mlの同緩衝液と7
M尿素、1M NaClを含む10mMトリス緩衝液（pH8.0）を用
いて濃度勾配法で溶出（5ml/時）を行った。溶出液は１
画分を5mlとして分画したところ、第３画分（5ml）にほ
ぼ純粋な組換え型SGH−Ｉを回収することができた。次
にこの溶液5mlを1.5の100mMトリス緩衝液（pH8.0）で
４℃、一晩透析を行った。透析内液を遠心分離（12,000
rpm、５分間）したところ、上清にジスルフィド結合の
位置を含め天然型SGH−Ｉと同じ立体構造を有する組換
え型SGH−Ｉが回収された。関根らの方法〔プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）82 4306（1985）〕
により、得られた組換え型SGH−Ｉの活性を測定したと
ころ、天然のSGH−Ｉ〔エイチ・カワウチ（H.Kawauch
i）ら、アチーブス・オブ・バイオケミストリー・アン
ド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry a
nd Biophysics）244 542（1986）〕と同等の活性を示
した。第３表に工程の物質収支を示した。 Example 3. Purification method of natural SGH-I after oxidation step (I
I) The solution after oxidation obtained in Example 1 was diluted 10-fold with 7 M urea, adjusted to pH 8.0, and then equilibrated with 10 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 7 M urea. DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals)
The solution was passed through a column (1.5 × 5.7 cm) (10 ml / hour). After washing with 50 ml of the same buffer (10 ml / hour), wash with 30 ml of the same buffer.
Elution (5 ml / hour) was performed by a concentration gradient method using 10 mM Tris buffer (pH 8.0) containing M urea and 1 M NaCl. The eluate is 1
When fractionation was performed with 5 ml, almost pure recombinant SGH-I could be recovered in the third fraction (5 ml). Next, 5 ml of this solution was dialyzed against 1.5 100 mM Tris buffer (pH 8.0) at 4 ° C. overnight. Centrifuge the dialysate (12,000
After 5 minutes (rpm), recombinant SGH-I having the same three-dimensional structure as natural SGH-I including the position of disulfide bond was recovered in the supernatant. Sekine et al.'S method [Proceding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci.) 82 4306 (1985)]
When the activity of the obtained recombinant SGH-I was measured by the method, the natural SGH-I [H. Kawauch (H. Kawauch
i) et al., Archives of Biochemistry a
nd Biophysics) 244 542 (1986)]. Table 3 shows the material balance of the process.

実施例4. 大腸菌によって生産されたウナギ成長ホルモ
ンＩの顆粒からの再活性化法 組換え型ウナギ成長ホルモンＩの顆粒は下記の方法に
より得た。まず、組換え体プラスミドpUPA1を含むエッ
シュリヒア・コリ（Escherichia coli）EUPA1（FERM B
P−825）を10mlのMCG培地〔0.6％ Na₂HPO₄,0.3％KH₂PO
₄,0.5％NaCl,0.1％NH₄Cl,0.5％グルコース,0.5％カザミ
ノ酸,1mM MgSO₄,4μg/mlビタミンB₁,pH7.2〕に接種
し、30℃で７時間培養した。得られた培養液を50mlのMC
G培地に接種し、30℃で18時間培養した。得られた培養
液を１のMCG培地に接種し、30℃で５時間培養後、42
℃で２時間培養し、さらに37℃で41時間培養した。得ら
れた培養液を8,000rpm、10分間遠心して菌体を回収し
た。得られた菌体を特開昭60−244259に示された方法に
従って単離、精製することにより、純度約90％のウナギ
成長ホルモンＩの顆粒を得た。この顆粒5mgを7M尿素、5
mM EDTA、1mM DTTを含む100mMトリス緩衝液（pH8.0）
に溶解し、2.5mlとした。４℃、２時間撹拌後、遠心分
離（12,000rpm、５分間）し、上清から、7M尿素を含む1
00mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したゲル過カラ
ムPD−10（ファルマシア・ファインケミカル社製）を用
いて還元剤を除去した。タンパク質溶出画分3.5mlと等
量の7M尿素、および1mM CuSO₄を含む100mMトリス緩衝
液（pH9.0）とを混合後、４℃にて２時間静置し、酸化
を進行させた。次にこの溶液7mlを２の100mMトリス緩
衝液（pH7.0）に４℃で一晩透析した。透析内液を遠心
分離（12,000rpm、５分間）したところ、上清にほぼ純
粋な組換え型ウナギ成長ホルモンＩが回収された。ラジ
オイムノアッセイ〔エム・キシダ（M.Kishida）ら、ジ
ェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリノロジ
ー（General and Comparative Endocrinology65 478
（1987）〕により抗体との結合活性を測定したところ天
然ウナギ成長ホルモンＩ〔エム・キシダ（M.Kishida）
ら、ジェネラル・アンド・コンパラティブ・エンドクリ
ノロジー（General and Comparative Endocrinology）6
5 478（1987）〕と同等であり天然型と同等の生物活性
を有することが示唆された。第４表に工程の物質収支を
示した。 Example 4. Reactivation method from eel growth hormone I granules produced by E. coli Recombinant eel growth hormone I granules were obtained by the following method. First, Escherichia coli EUPA1 (FERM B containing the recombinant plasmid pUPA1
P-825) in 10 ml of MCG medium [0.6% Na ₂ HPO ₄ , 0.3% KH ₂ PO
₄ , 0.5% NaCl, 0.1% NH ₄ Cl, 0.5% glucose, 0.5% casamino acid, 1 mM MgSO ₄ , 4 μg / ml vitamin B ₁ , pH 7.2] and inoculated at 30 ° C. for 7 hours. 50 ml of the obtained culture solution
G medium was inoculated and cultured at 30 ° C. for 18 hours. The resulting culture solution was inoculated into 1 MCG medium and cultured at 30 ° C. for 5 hours.
Culturing was carried out at ℃ for 2 hours and further at 37 ℃ for 41 hours. The obtained culture solution was centrifuged at 8,000 rpm for 10 minutes to collect bacterial cells. The resulting cells were isolated and purified according to the method disclosed in JP-A-60-244259 to obtain eel growth hormone I granules having a purity of about 90%. 5 mg of this granule is treated with 7 M urea, 5
100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing mM EDTA and 1 mM DTT
To 2.5 ml. After stirring at 4 ° C for 2 hours, centrifuge (12,000 rpm, 5 minutes) and add 7M urea from the supernatant.
The reducing agent was removed using a gel per column PD-10 (Pharmacia Fine Chemical Co.) equilibrated with 00 mM Tris buffer (pH 7.0). The protein elution fraction (3.5 ml) was mixed with an equal amount of 7 M urea and 100 mM Tris buffer (pH 9.0) containing 1 mM CuSO ₄ , and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours to promote oxidation. Next, 7 ml of this solution was dialyzed against 2 100 mM Tris buffer (pH 7.0) at 4 ° C. overnight. When the dialyzed solution was centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes), almost pure recombinant eel growth hormone I was recovered in the supernatant. Radioimmunoassay [M. Kishida et al., General and Comparative Endocrinology 65 478
(1987)] and the binding activity to the antibody was measured, the natural eel growth hormone I [M. Kishida]
Et al., General and Comparative Endocrinology 6
5 478 (1987)] and has the same biological activity as the natural type. Table 4 shows the material balance of the process.

実施例5. 大腸菌によって生産されたSGH−Ｉの顆粒か
らの再活性化法（II） 組換え型SGH−Ｉは特開昭61−93197に示された培養方
法に従って得た組換え型SGH−Ｉ顆粒含有菌体から、特
開昭60−244259に示された方法に従い、純度約90％まで
に単離、精製された。この顆粒5mgを7M尿素、5mM EDT
A、1mM DTTを含む100mMトリス緩衝液（pH8.0）に溶解
し、2.5mgとした。４℃、２時間撹拌後、遠心分離（12,
000rpm、５分間）し、上清から、7M尿素を含む100mMト
リス緩衝液（pH7.0）で平衡化したゲル過カラムPD−1
0（ファルマシア・ファインケミカル社製）を用いてDTT
を除去した。タンパク質溶出画分3.5mlに等量の7M尿
素、および0.2mM酸化型グルタチオンを含む100mMトリス
緩衝液（pH8.0）を混合し、４℃にて一晩静置すること
によって酸化を進行させた。次にこの溶液7mlを２の1
00mMトリス緩衝液（pH7.0）に４℃で一晩透析した。透
析内液を遠心分離（12,000rpm、５分間）すると、上清
にほぼ純粋な組換え型SGH−Ｉが回収された。関根らの
方法〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）82
4306（1985）〕により、得られた組換え型SGH−Ｉの
活性を測定したところ天然のSGH−Ｉ〔エイチ・カワウ
チ（H.Kawauchi）ら、アチーブス・オブ・バイオケミス
トリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Bi
ochemistry and Biophysisc）244,542（1986）〕と同等
の活性を示した。第５表に工程の物質収支をしめした。 Example 5. Reactivation method from granules of SGH-I produced by Escherichia coli (II) Recombinant SGH-I was a recombinant SGH-I obtained according to the culture method disclosed in JP-A-61-93197. The cells containing I granules were isolated and purified to a purity of about 90% according to the method disclosed in JP-A-60-244259. 5 mg of this granule was added to 7 M urea and 5 mM EDT.
A, 2.5 mM was dissolved in 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 1 mM DTT. After stirring at 4 ° C for 2 hours, centrifugation (12,
Gel per column PD-1 equilibrated with 100 mM Tris buffer (pH 7.0) containing 7 M urea from the supernatant after 5,000 rpm for 5 minutes)
0 (Pharmacia Fine Chemical Co., Ltd.)
Was removed. Oxidation was allowed to proceed by mixing 3.5 ml of the protein eluted fraction with an equal amount of 7 mM urea and 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 0.2 mM oxidized glutathione, and allowing it to stand at 4 ° C. overnight. . Then add 7 ml of this solution to 1 of 2
It was dialyzed against 00 mM Tris buffer (pH 7.0) at 4 ° C. overnight. When the dialyzed solution was centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes), almost pure recombinant SGH-I was recovered in the supernatant. Sekine et al. [Proceeding of the National Academy of Science (Proc.Natl.Acad.Sci.) 82]
4306 (1985)], the activity of the obtained recombinant SGH-I was measured, and natural SGH-I [H. Kawauchi et al., Achievements of Biochemistry and Biophysics ( Archives of Bi
ochemistry and Biophysisc) 244 , 542 (1986)]. Table 5 shows the material balance of the process.

参考例１ 従来の方法を用いたシロザケ成長ホルモンＩ
の再活性化法 実施例１と同様にして得られたSGH−Ｉの顆粒5mgを7M
尿素、5mM、EDTA、1mM DTTを含む100mMトリス緩衝液
（pH8.0）に溶解し、12.5mlとした。４℃、２時間撹拌
後、遠心分離（12,000rpm、５分間）し、上清を３の1
00mMリン酸緩衝液（pH7.0）に４℃で一晩透析した。透
析内液を遠心分離（12,000rpm、５分間）し、上清を得
た。第６表に工程の物質収支を示した。透析内液を遠心
分離した上清にほぼ純粋な組換え型SGH−Ｉが回収され
たが、収率は非常に低く、実用上有効でなかった。 Reference Example 1 Salmon growth hormone I using a conventional method
Reactivation method of SGH-I granules obtained in the same manner as in Example 1
It was dissolved in 100 mM Tris buffer (pH 8.0) containing urea, 5 mM, EDTA and 1 mM DTT to make 12.5 ml. After stirring at 4 ° C for 2 hours, the mixture was centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was diluted to 3: 1.
It was dialyzed against 00 mM phosphate buffer (pH 7.0) at 4 ° C. overnight. The dialyzed solution was centrifuged (12,000 rpm, 5 minutes) to obtain a supernatant. Table 6 shows the material balance of the process. Almost pure recombinant SGH-I was recovered in the supernatant obtained by centrifuging the dialysis solution, but the yield was very low and not practically effective.

参考例２ 従来の方法を用いたウナギ成長ホルモンＩの
再活性化法 実施例４と同様にして得られた組換え型ウナギ成長ホ
ルモンＩの顆粒5mgを7M尿素、5mM EDTA、1mM DTTを含
む100mMトリス緩衝液（pH8.0）に溶解し、12.5mlとし
た。４℃、２時間撹拌後、遠心分離（12,000rpm、５分
間）し、上清を３の100mMリン酸緩衝液（pH7.0）に４
℃で一晩透析し、透析内液を遠心分離（12,000rpm、５
分間）し、上清を得た。第７表に工程の物質収支を示し
た。透析内液を遠心分離した上清にほぼ純粋な組換え型
ウナギ成長ホルモンＩが回収されたが、収率は非常に低
く、実用上有効ではなかった。 Reference Example 2 Reactivation Method of Eel Growth Hormone I Using Conventional Method 5 mg of recombinant eel growth hormone I granules obtained in the same manner as in Example 4 was added to 100 mM containing 7 M urea, 5 mM EDTA and 1 mM DTT. It was dissolved in Tris buffer (pH 8.0) to make 12.5 ml. After stirring at 4 ° C for 2 hours, centrifugation (12,000 rpm, 5 minutes) was performed, and the supernatant was added to 3 of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0).
Dialyze at ℃ overnight, centrifuge the dialysate (12,000 rpm, 5
Then, a supernatant was obtained. Table 7 shows the material balance of the process. Almost pure recombinant eel growth hormone I was recovered in the supernatant obtained by centrifuging the dialyzed solution, but the yield was very low and not practically effective.

参考例３ ケー・イー・ラングレー（K.E.Langley）ら
の方法〔Eur.J.Biochem 163,313−321（1987）〕による
シロザケ成長ホルモンＩの再活性化法。 Reference Example 3 Method for reactivating chum salmon growth hormone I by the method of KELangley et al. [Eur. J. Biochem 163 , 313-321 (1987)].

実施例１と同様にして得られたSGH−Ｉの顆粒100mgを
6M塩酸グアニジン、50mMトリス緩衝液（pH8.0）に溶解
し、10mlとした。80時間放置後、上記緩衝液で平衡化し
たSephacryl Ｓ−200（ファルマシア・ファインケミカ
ル社製）カラム（2.6×94cm）に50ml/時で通塔した。続
いて、同緩衝液により溶出した。溶出液は5mlを１画分
として分画し、35mlの溶出画分を得た。この溶出画分に
0.25％（w/v）NaHCO₃、0.2％（w/v）α−ラクトース、
0.2％（w/v）マンニトール（pH8.5）を添加し、105mlと
した。続いて30の上記緩衝液に室温で24時間透析し
た。透析内液を遠心分離した上清を得た。第８表に工程
の物質収支を示した。透析内液を遠心分離した上清にほ
ぼ純粋な組換え型SGH−Ｉが回収されたが、収率は低
く、実用上有効ではなかった。100 mg of SGH-I granules obtained in the same manner as in Example 1
It was dissolved in 6 M guanidine hydrochloride and 50 mM Tris buffer (pH 8.0) to make 10 ml. After standing for 80 hours, the solution was passed through a Sephacryl S-200 (Pharmacia Fine Chemical Co.) column (2.6 × 94 cm) equilibrated with the above buffer at 50 ml / hour. Subsequently, it was eluted with the same buffer. The eluate was fractionated with 5 ml as one fraction to obtain an elution fraction of 35 ml. This eluted fraction
0.25% (w / v) NaHCO ₃ , 0.2% (w / v) α-lactose,
0.2% (w / v) mannitol (pH 8.5) was added to make 105 ml. It was subsequently dialyzed against 30 of the above buffers at room temperature for 24 hours. The supernatant obtained by centrifuging the dialysate was obtained. Table 8 shows the material balance of the process. Almost pure recombinant SGH-I was recovered in the supernatant obtained by centrifuging the dialyzed solution, but the yield was low and not practically effective.

発明の効果 本発明により還元変性状態のシステイン含有タンパク
質を効率よく再活性化することができる。 Effects of the Invention According to the present invention, a cysteine-containing protein in a reductive denatured state can be efficiently reactivated.

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】難溶性のシステイン含有タンパク質に変
性剤および還元剤を加えて還元変性状態で可溶化し、
還元剤を除去し、変性剤の濃度を希釈することなく変
性状態のまま酸化させて、天然型のタンパク質のジスル
フィド結合に相当する位置にジスルフィド結合を形成さ
せ、変性剤を除去することによって再活性化されたタ
ンパク質を分離精製することを特徴とするタンパク質の
再活性化法。1. A solubilizing agent in a reduced denaturing state by adding a denaturing agent and a reducing agent to a sparingly soluble cysteine-containing protein,
The reducing agent is removed, and the denaturing agent is oxidized in a denatured state without diluting to form a disulfide bond at a position corresponding to the disulfide bond of the native protein, and the denaturing agent is reactivated by removing the denaturing agent. A method for reactivating a protein, which comprises separating and purifying the activated protein. 【請求項２】該難溶性のシステイン含有タンパク質が微
生物の菌体内に顆粒として生産されるタンパク質である
請求項（１）記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the sparingly soluble cysteine-containing protein is a protein produced as granules in the cells of a microorganism. 【請求項３】変性剤がSDS、尿素、塩酸グアニジン、酸
またはアルカリである請求項（１）または（２）記載の
方法。3. The method according to claim 1, wherein the denaturing agent is SDS, urea, guanidine hydrochloride, acid or alkali. 【請求項４】還元剤を除去する手段が変性剤存在下、非
酸化条件下での希釈、透析、限外濾過、ゲル濾過、吸脱
着を含むクロマトグラフィーまたはバッチ操作である請
求項（１）または（２）記載の方法。4. The method for removing a reducing agent in the presence of a denaturing agent by chromatography under non-oxidizing conditions, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, adsorption / desorption, or batch operation. Alternatively, the method described in (2). 【請求項５】酸化の手段が通気による空気酸化法、金属
イオンを触媒に用いる空気酸化法、弱い酸化剤を用いる
酸化法のなかから選ばれる請求項（１）または（２）記
載の方法。5. The method according to claim 1 or 2, wherein the oxidizing means is selected from an air oxidizing method by aeration, an air oxidizing method using a metal ion as a catalyst, and an oxidizing method using a weak oxidizing agent. 【請求項６】弱い酸化剤がｏ−ヨードソ安息香酸、酸化
型グルタチオン、酸化型グルタチオンと還元型グルタチ
オンの混合物、シスチンまたはシスチンとシステインの
混合物である請求項（１）または（２）記載の方法。6. The method according to claim 1, wherein the weak oxidizing agent is o-iodosobenzoic acid, oxidized glutathione, a mixture of oxidized glutathione and reduced glutathione, cystine or a mixture of cystine and cysteine. . 【請求項７】酸化時のタンパク質濃度が0.1〜2000μg/m
lである請求項（１）または（２）記載の方法。7. The protein concentration during oxidation is 0.1 to 2000 μg / m.
The method according to claim 1 or 2, wherein l is l.