JP2651019B2 - Permselective membrane, electrode and enzyme electrode using it - Google Patents
Permselective membrane, electrode and enzyme electrode using itInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は選択透過膜、選択透過膜を設けた電極及びそ
の電極に固定化酵素層を設けて、電気化学的に検出可能
な物質の生成または消費を検出する酵素電極に関する。The present invention relates to a permselective membrane, an electrode provided with a permselective membrane, and an immobilized enzyme layer provided on the electrode to produce an electrochemically detectable substance. Or an enzyme electrode for detecting consumption.
「従来の技術」 微生物、動植物細胞、酵素等が触媒する生化学反応の
応用範囲は広いが、特に生化学反応を物質の検出手段に
応用するバイオセンシングは、測定不可能であった物質
や測定に多大の時間と労力を要した物質を簡単に測定で
きる有効な手法として注目を集めている。そしてこの手
法は、環境計測、食品分析、医療分析等の各分野におい
て実用化が進められている。"Conventional technology" The application range of biochemical reactions catalyzed by microorganisms, animal and plant cells, enzymes, etc. is wide. It has attracted attention as an effective method that can easily measure substances that require a lot of time and effort. This technique is being put to practical use in various fields such as environmental measurement, food analysis, and medical analysis.
一般に、酵素等の生体触媒は 反応の基質異性が高い。 Generally, biocatalysts such as enzymes have a high substrate isomerism in the reaction.
穏和な条件下での測定が可能である。 Measurement under mild conditions is possible.
高感度で微量成分の測定ができる。 It can measure trace components with high sensitivity.
などの利点がある。There are advantages such as.
しかし生体由来の物質であるため、 一般に高価である。 However, it is generally expensive because it is derived from living organisms.
温度、pH等の反応条件に制限がある。 There are restrictions on reaction conditions such as temperature and pH.
様々な要因によって生体触媒の触媒能が失われる
（いわゆる失活が起こる）という欠点をあわせもってい
る。It also has the disadvantage that the catalytic ability of the biocatalyst is lost due to various factors (so-called deactivation occurs).
このような問題点の解決のために、生体触媒を固定化
して用いることが広く行なわれており、特に酵素の固定
化に関しては多くの研究がなされている。In order to solve such problems, it is widely used to immobilize a biocatalyst, and many studies have been made particularly on immobilization of enzymes.
固定化酵素を物質の測定に応用する場合には、その酵
素により触媒される反応による物質の増減を検出できる
検出機構を組み合わせて装置を構成するが、検出機構に
は電気化学検出器、蛍光検出器、熱検出器等が応用され
ている。When the immobilized enzyme is applied to the measurement of a substance, the device is configured by combining a detection mechanism that can detect the increase or decrease of the substance due to a reaction catalyzed by the enzyme.The detection mechanism includes an electrochemical detector and fluorescence detection. Detectors, heat detectors and the like have been applied.
特に酸素電極や過酸化水素電極などの電気化学的な検
出機構は装置構成の簡単さ、検出感度の高さ、応答速度
の速さなどの利点を有し最も広く用いられている。In particular, an electrochemical detection mechanism such as an oxygen electrode or a hydrogen peroxide electrode has advantages such as simplicity of the device configuration, high detection sensitivity, and high response speed, and is most widely used.
酸素電極や過酸化水素電極などの電極を検出手段とし
て用いる場合には、電極として用いられる導電性基体の
近傍に被検出物質以外の物質の透過を制限する選択透過
膜と固定化酵素膜をなんらかの手段で配置するか、ある
いは導電性基体表面に選択透過膜と固定化酵素膜を形成
するものである（選択透過膜は、例えば過酸化水素電極
においては、アスコルビン酸等の測定妨害物質を透過さ
せず、選択的に過酸化水素を透過させる機能を有してい
る）。When an electrode such as an oxygen electrode or a hydrogen peroxide electrode is used as the detection means, a permselective membrane and an immobilized enzyme membrane that restrict the permeation of substances other than the substance to be detected are provided in the vicinity of the conductive substrate used as the electrode. Or by forming a permselective membrane and an immobilized enzyme membrane on the surface of the conductive substrate. (A permselective membrane, for example, in a hydrogen peroxide electrode, allows permeation of a measurement interfering substance such as ascorbic acid.) And has a function of selectively permeating hydrogen peroxide).
中でも過酸化水素を検出する方式は溶存酸素の変動に
よるベースラインの変化がなく、応答速度の点でも酸素
電極方式に比べて優れている。Above all, the method of detecting hydrogen peroxide has no change in the baseline due to the fluctuation of dissolved oxygen, and is superior to the oxygen electrode method in terms of response speed.
しかし固定化酵素電極（以下単に酵素電極という）に
おいては、導電性基体の近傍に（導電性基体表面に直接
形成する場合も含む）設ける固定化膜の物理的強度が酵
素電極の寿命を決定する要因となっており、物理的強度
を向上させることが大きな問題である。However, in the case of an immobilized enzyme electrode (hereinafter simply referred to as an enzyme electrode), the physical strength of an immobilized film provided near the conductive substrate (including the case where the electrode is directly formed on the surface of the conductive substrate) determines the life of the enzyme electrode. It is a major problem to improve the physical strength.
例えば、特開昭63−182559号にはタンパク質を用いて
選択透過膜を形成する方法が示されているが、タンパク
質と架橋剤だけを用いて形成した固定化タンパク質膜は
物理的強度が低く耐久性に問題があった。For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-182559 discloses a method of forming a permselective membrane using a protein, but an immobilized protein membrane formed using only a protein and a cross-linking agent has low physical strength and durability. There was a problem with sex.
一般に選択透過膜に限らず、酵素等を固定化したタン
パク質膜の強度を向上させる方法の一つとして強度に優
れた担体の上にタンパク質を固定化する方法が提案され
ている。例えば、特開昭62−32352号には酵素をポリエ
ステル布に固定化しタンパク質膜の強化をはかる方法が
開示されている。しかし、ポリエステル布がなどの固体
の補強材を用いる場合にはタンパク質膜の厚みがポリエ
ステル布などの補強材の厚みに依存してしまいタンパク
質を用いて選択透過膜を形成する場合には固定化生体触
媒電極の測定感度と測定速度に悪影響をおよぼしてしま
う。In general, not only a permselective membrane but also a method for immobilizing a protein on a carrier having excellent strength has been proposed as one of methods for improving the strength of a protein membrane on which an enzyme or the like is immobilized. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-32352 discloses a method for immobilizing an enzyme on a polyester cloth to strengthen a protein film. However, when a solid reinforcing material such as polyester cloth is used, the thickness of the protein membrane depends on the thickness of the reinforcing material such as polyester cloth. It adversely affects the measurement sensitivity and measurement speed of the catalyst electrode.
また、固定化酵素膜においては、タンパク質以外の物
質を混入してその膜強度を向上させる方法が提案されて
いる。例えば特公昭58−49821号にはアミノ及びイミノ
系高分子と共に酵素を固定化し膜強度を向上させる方法
が提案されている。しかし、この場合タンパク質膜を補
強しているものの、このような膜は選択透過膜の機能を
有するものではない。For the immobilized enzyme membrane, a method has been proposed in which a substance other than protein is mixed to improve the membrane strength. For example, Japanese Patent Publication No. 58-49821 proposes a method of immobilizing an enzyme together with an amino or imino polymer to improve the membrane strength. However, in this case, although the protein membrane is reinforced, such a membrane does not have the function of a permselective membrane.
また従来用いられている選択透過膜としては、例えば
特開昭60−56254号に提案されている様にアセチルセル
ロース等のセルロース系高分子を用いるものが知られて
いるが、多大の時間と非常な手間をかけなければ、実用
的な選択透過膜を得ることはできなかった。Further, as a conventionally used permselective membrane, for example, a membrane using a cellulosic polymer such as acetylcellulose as proposed in JP-A-60-56254 is known. Without much effort, a practical permselective membrane could not be obtained.
「発明が解決しようとする課題」 本発明は、電気化学的に検出可能な物質の生成または
消費を検出する方式の固定化生体触媒電極に用いられる
選択透過膜を提供するものであり、特にタンパク質を用
いて製造した選択透過能及び物理的強度に優れた選択透
過膜を提供すること、その選択透過膜を設けた電極を提
供すること及びその電極に固定化酵素層を設けて、電気
化学的に検出可能な物質の生成または消費を検出する酵
素電極を提供することを目的とする。"Problem to be Solved by the Invention" The present invention provides a permselective membrane used for an immobilized biocatalyst electrode of a type that detects the production or consumption of a substance that can be detected electrochemically, To provide a permselective membrane excellent in permselectivity and physical strength manufactured by using the above, to provide an electrode provided with the permselective membrane and to provide an immobilized enzyme layer on the electrode, and to provide an electrochemically It is an object of the present invention to provide an enzyme electrode for detecting the production or consumption of a detectable substance.
「課題を解決するための手段」 酵素、微生物菌体等の生体触媒を固定化してなる固定
化生体触媒電極において、電極の寿命を長くするために
は、選択透過膜の物理的強度を向上させる必要がある。"Means for solving the problems" In order to prolong the life of the electrode in the immobilized biocatalyst electrode obtained by immobilizing a biocatalyst such as an enzyme or a microbial cell, the physical strength of the permselective membrane is improved. There is a need.
タンパク質固定化膜の物理的強度を向上させるために
は、タンパク質膜中の架橋剤の濃度を濃くすれば良い
が、架橋剤濃度を上げると固定化タンパク質膜の性質が
変化し、選択透過能が低下してしまうことがあるため望
ましくない。To improve the physical strength of the protein-immobilized membrane, the concentration of the cross-linking agent in the protein membrane may be increased. It is not desirable because it may decrease.
また、固定化タンパク質膜中に架橋剤と反応する補強
物質を共存させ強度を向上させる方法もあるが、補強物
質が固定化タンパク質膜の物理的特性に悪影響を与え、
選択透過性を失わせてしまう場合が多い。There is also a method for improving the strength by coexisting a reinforcing substance that reacts with a crosslinking agent in the immobilized protein membrane, but the reinforcing substance adversely affects the physical properties of the immobilized protein membrane,
In many cases, the selectivity is lost.
従って、この様な補強物質は、 固定化を行うタンパク質の溶液、またはタンパク質
と架橋剤の混合溶液に溶解する物質であること。Therefore, such a reinforcing substance must be a substance that dissolves in a solution of the protein to be immobilized or a mixed solution of the protein and the crosslinking agent.
タンパク質を用いて選択透過膜を製造する場合に選
択透過膜の性質に悪影響を与えず、少量の添加で膜強度
の向上をもたらす物質であること。A substance that does not adversely affect the properties of the permselective membrane when a permselective membrane is produced using proteins, and that improves the strength of the membrane with a small amount of addition.
架橋剤に対してはタンパク質と同じ程度の反応性を
有し架橋反応によって不溶化する物質であること。A substance that has the same degree of reactivity as a protein to a cross-linking agent and is insolubilized by a cross-linking reaction.
望ましくは補強物質自体がタンパク質と反応するこ
と。Preferably, the reinforcing substance itself reacts with the protein.
などの諸性質が要求される。And other properties are required.
本発明者等は、このような性質を持つ化合物を探索し
た結果、タンパク質、架橋剤混合溶液に補強物質として
アセトアセチル化ポリビニルアルコールを使用すれば、
固定化タンパク質膜の選択透過性に悪影響を与えること
なく、固定化タンパク質膜の物理的強度を向上させるこ
とができることを見いだした。しかも本発明によれば、
容易に優れた選択透過膜を製造することができる。ま
た、白金等の導電性基体表面上に選択透過膜を直接設け
ることが容易であり、さらに選択透過膜上に固定化酵素
層を形成することにより、酵素電極を製造することがで
きる。The present inventors have searched for a compound having such properties, and as a result, if acetoacetylated polyvinyl alcohol is used as a reinforcing substance in a mixed solution of a protein and a crosslinking agent,
It has been found that the physical strength of the immobilized protein membrane can be improved without adversely affecting the permselectivity of the immobilized protein membrane. Moreover, according to the present invention,
An excellent permselective membrane can be easily manufactured. Further, it is easy to provide a permselective membrane directly on the surface of a conductive substrate such as platinum, and an enzyme electrode can be manufactured by forming an immobilized enzyme layer on the permselective membrane.
本発明は、タンパク質、少なくとも１種類の架橋剤及
びアセトアセチル化ポリビニルアルコールを含有する溶
液を膜状に展開し、架橋反応により固定化してなる選択
透過膜である。The present invention is a permselective membrane obtained by developing a solution containing a protein, at least one kind of crosslinking agent and acetoacetylated polyvinyl alcohol into a membrane, and immobilizing the solution by a crosslinking reaction.
また本発明は、タンパク質が少なくとも１種類以上の
球状タンパク質を含み、架橋剤がアミノ基と架橋反応す
る架橋剤を含むことを特徴とする選択透過膜である。Further, the present invention is a permselective membrane characterized in that the protein contains at least one kind of globular protein and the crosslinking agent contains a crosslinking agent that undergoes a crosslinking reaction with an amino group.
本発明は、タンパク質とアセトアセチル化ポリビニル
アルコールとの構成重量比が150:1から1:1の範囲である
選択透過膜である。The present invention is a permselective membrane wherein the constituent weight ratio of protein to acetoacetylated polyvinyl alcohol is in the range of 150: 1 to 1: 1.
本発明は、タンパク質と架橋剤との構成重量比が100:
5から1:1の範囲である選択透過膜である。The present invention has a composition weight ratio of the protein and the crosslinking agent of 100:
A permselective membrane ranging from 5 to 1: 1.
更に本発明は、上記の選択透過膜を、導電性基体近傍
に設けたことを特徴とする電極である。Further, the present invention is an electrode characterized in that the above-mentioned permselective membrane is provided near a conductive substrate.
また本発明は、選択透過膜の導電性基体とは反対側表
面上に、少なくとも１種類のオキシダーゼを固定化した
固定化酵素層を設けたことを特徴とする酵素電極であ
る。Further, the present invention is the enzyme electrode, wherein an immobilized enzyme layer on which at least one type of oxidase is immobilized is provided on the surface of the permselective membrane opposite to the conductive substrate.
「作用」 第２図は本発明の酵素電極を例示した断面図である。
白金等の導電性基体（21）上に、タンパク質、架橋剤、
アセトアセチル化ポリビニルアルコールを含有する溶液
を塗布、乾燥してなる選択透過膜（22）を形成し、さら
に固定化酵素層（23）を設けた構成を有している。本発
明において選択透過膜は導電性基体の近傍に設けられる
が、必ずしも直接導電性基体上に形成される必要はな
く、導電性基体をシート状選択透過膜でおおい、選択透
過膜をＯリングで保持することにより選択性を有する電
極を作成することもできる。シート状選択透過膜は、例
えば清浄なガラス板上に、タンパク質、架橋剤、アセト
アセチル化ポリビニルアルコールの混合溶液を展開し、
架橋反応を行わせた後、この膜をガラス板からはがすこ
とにより得ることができる。[Operation] FIG. 2 is a cross-sectional view illustrating an enzyme electrode of the present invention.
On a conductive substrate (21) such as platinum, a protein, a crosslinking agent,
It has a configuration in which a solution containing acetoacetylated polyvinyl alcohol is applied and dried to form a permselective membrane (22), and an immobilized enzyme layer (23) is further provided. In the present invention, the permselective membrane is provided in the vicinity of the conductive substrate, but need not necessarily be formed directly on the conductive substrate, and the conductive substrate is covered with a sheet-shaped permselective film, and the permselective film is covered with an O-ring. By holding the electrode, an electrode having selectivity can be formed. The sheet-shaped permselective membrane, for example, on a clean glass plate, spread a mixed solution of protein, crosslinking agent, acetoacetylated polyvinyl alcohol,
After the cross-linking reaction is performed, the film can be obtained by peeling the film from the glass plate.
測定に用いる電極の構成は作用電極、対極、参照電極
の３本を用いても良いし、作用電極と対極の２本のみを
用いてもよい。The configuration of the electrodes used for the measurement may be three of the working electrode, the counter electrode, and the reference electrode, or only two of the working electrode and the counter electrode.
選択透過膜を構成するタンパク質は、アルブミン、グ
ロブリン、プロラミン等の球状タンパク質を少なくとも
一種類以上含むものが優れた選択透過能を有するため好
ましい。As the protein constituting the permselective membrane, those containing at least one kind of globular protein such as albumin, globulin, prolamin and the like are preferable since they have excellent permselectivity.
架橋剤としては各種架橋剤を使用することができる
が、アミノ基と架橋反応を行うものが好ましく、具体的
にはグルタルアルデヒド、グリオキザール、ホルマリン
等のアルデヒドや、ヘキサメチレンジイソシアネートな
どのイソシアネート等の架橋剤が例示できる。As the cross-linking agent, various cross-linking agents can be used, but those which perform a cross-linking reaction with an amino group are preferable.Specifically, aldehydes such as glutaraldehyde, glyoxal and formalin, and cross-linking of isocyanate such as hexamethylene diisocyanate Agents can be exemplified.
タンパク質と架橋剤との構成重量比は、得られる選択
透過膜の選択透過性の点で、好ましく100:5から1:1の範
囲である。The constituent weight ratio between the protein and the crosslinking agent is preferably in the range of 100: 5 to 1: 1 from the viewpoint of the permselectivity of the permselective membrane obtained.
本発明は更にタンパク質および架橋剤と反応する高分
子物質として、アセトアセチル化ポリビニルアルコール
を用いることに特徴を有する。アセトアセチル基は、そ
れ自体がタンパク質分子中のアミノ基と反応し、さらに
アルデヒド基とアセトアセチル基が反応する。このよう
にタンパク質とアセトアセチル化ポリビニルアルコール
と架橋剤の三者間で架橋が行われることにより強固な膜
が形成されると考えられる。The present invention is further characterized in that acetoacetylated polyvinyl alcohol is used as a polymer substance that reacts with a protein and a crosslinking agent. The acetoacetyl group itself reacts with the amino group in the protein molecule, and furthermore, the aldehyde group and the acetoacetyl group react. It is considered that a strong film is formed by the crosslinking between the protein, the acetoacetylated polyvinyl alcohol, and the crosslinking agent.
また架橋剤が、イソシアネート基を含むものである場
合は、アセトアセチル化ポリビニルアルコール中の水酸
基が架橋剤と反応し強固な膜が形成される。When the crosslinking agent contains an isocyanate group, the hydroxyl group in the acetoacetylated polyvinyl alcohol reacts with the crosslinking agent to form a strong film.
アセトアセチル化ポリビニルアルコールは分子量１万
〜100万程度で、アセトアセチル化度が0.1〜10モル％の
ものが好ましい。分子量が低すぎると補強効果に劣る場
合もあり、高すぎると溶液粘度が上昇し作業効率が低下
する場合がある。アセトアセチル化度が低すぎると反応
性が低下し、高すぎると水溶性が低下して使い難い場合
がある。The acetoacetylated polyvinyl alcohol preferably has a molecular weight of about 10,000 to 1,000,000 and a degree of acetoacetylation of 0.1 to 10 mol%. If the molecular weight is too low, the reinforcing effect may be poor, and if it is too high, the solution viscosity may increase and the working efficiency may decrease. If the acetoacetylation degree is too low, the reactivity may be reduced, and if it is too high, the water solubility may be reduced, making it difficult to use.
タンパク質とアセトアセチル化ポリビニルアルコール
の構成重量比は150:1から1:1の範囲にあることが好まし
い。アセトアセチル化ポリビニルアルコールのタンパク
質に対する構成重量比が低いと充分な膜強度の向上が認
められないことがある。The constituent weight ratio of protein to acetoacetylated polyvinyl alcohol is preferably in the range from 150: 1 to 1: 1. If the weight ratio of acetoacetylated polyvinyl alcohol to protein is low, sufficient improvement in film strength may not be observed.
一方1:1より大きくなると選択透過能が低下する場合
もある。この原因については定かではないが、アセトア
セチル化ポリビニルアルコールのタンパク質に対する構
成重量比が大きくなることにより相対的にタンパク質に
対する架橋剤濃度が低下すると同時に固定化膜が脆くな
り導電性基体表面との結合性、密着性およびタンパク質
間の結合性に影響し、膜の緻密さが保たれなくなるため
と考えられる。On the other hand, when the ratio is larger than 1: 1, the permselectivity may decrease. Although the cause is not clear, the concentration of the cross-linking agent for the protein is relatively decreased due to the increase in the constituent weight ratio of the acetoacetylated polyvinyl alcohol to the protein, and at the same time, the immobilization film becomes brittle and the bond with the conductive substrate surface is increased. This is considered to affect the properties, adhesion, and binding between proteins, and the denseness of the film cannot be maintained.
因みにアセトアセチル化ポリビニルアルコールとタン
パク質のみの混合溶液を膜状に展開して形成した膜は、
水に不溶化するが、物理的強度に劣る。By the way, a film formed by developing a mixed solution of only acetoacetylated polyvinyl alcohol and protein into a film form,
Insoluble in water, but poor in physical strength.
またタンパク質を添加しない場合はアセトアセチル化
ポリビニルアルコールとアルデヒド基のみを含む架橋剤
の反応が非常に緩慢に進行し、架橋反応の完結までに10
時間程度を要する。また形成される膜は選択透過性を示
さない。アセトアセチル化ポリビニルアルコールとイソ
シアネート基を含む架橋剤混合溶液は速やかに架橋反応
が起きるがこれも選択透過性を示さない。When no protein is added, the reaction between the acetoacetylated polyvinyl alcohol and the crosslinking agent containing only aldehyde groups proceeds very slowly, and it takes about 10 minutes to complete the crosslinking reaction.
It takes time. Further, the formed membrane does not show selective permeability. A solution of acetoacetylated polyvinyl alcohol and a cross-linking agent containing isocyanate groups rapidly undergoes a cross-linking reaction, but also does not exhibit selective permeability.
固定化する生体触媒としては酵素等があり、グルコー
スオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコー
ルオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ等のオキシダ
ーゼを含む固定化酵素層を選択透過膜の導電性基体とは
反対側の表面に形成して酵素電極を製造することができ
る。Examples of biocatalysts to be immobilized include enzymes and the like, and an immobilized enzyme layer containing an oxidase such as glucose oxidase, galactose oxidase, alcohol oxidase, or lactate oxidase is formed on the surface of the permselective membrane opposite to the conductive substrate. An enzyme electrode can be manufactured.
本発明の製造法によりタンパク質を用いて選択透過膜
を製造すると、例えば超音波処理等の物理的衝撃試験に
対しても耐久性のある選択透過膜が得られ、物理的強度
に優れることが判った。When a permselective membrane is produced by using the protein according to the production method of the present invention, a permselective membrane that is durable even in a physical impact test such as ultrasonic treatment can be obtained, and it has been found that the membrane has excellent physical strength. Was.
「実施例」 以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
が、もちろん本発明はこれらのみに限定されるものでは
ない。なお％は重量％を表す。"Examples" Examples are shown below to explain the present invention more specifically, but of course, the present invention is not limited to these. In addition,% represents weight%.
測定装置 第１図に示すフロー型測定装置は、高速液体クロマト
グラフ用のインジェクタ（レオダイン社製、7125型）
（３）と、本発明に従う選択透過膜を用いた電極E1〜E4
（C1〜C2）および参照電極としてのAg/AgCl電極（８）
が取り付けられ、対極（７）としてステンレス鋼製の管
路が備えられた測定用セル（５）とを含んで構成され
る。内径0.5mm、長さ1.5mのテフロン（商品名）製の希
釈用管路（４）は、インジェクタ（３）と、測定用セル
（５）との間に接続される。測定用セル（５）の内容積
は40μｌであり、電極E1〜E4（C1〜C2）とAg/AgCl電極
（８）とが、緩衝液の管路を介して対向して配置され
る。電極E1〜E4（C1〜C2）には、ポテンシオスタット
（９）によってAg/AgCl電極（８）に対して＋0.60Vの電
圧が印加される。Measuring device The flow type measuring device shown in Fig. 1 is an injector for high performance liquid chromatograph (manufactured by Leodyne, model 7125).
(3) and electrodes E1 to E4 using the permselective membrane according to the present invention
(C1-C2) and Ag / AgCl electrode as reference electrode (8)
And a measuring cell (5) provided with a stainless steel pipe as a counter electrode (7). A dilution pipe (4) made of Teflon (trade name) having an inner diameter of 0.5 mm and a length of 1.5 m is connected between the injector (3) and the measuring cell (5). The internal volume of the measurement cell (5) is 40 μl, and the electrodes E1 to E4 (C1 to C2) and the Ag / AgCl electrode (8) are arranged to face each other via a buffer solution channel. A voltage of +0.60 V is applied to the electrodes E1 to E4 (C1 to C2) by the potentiostat (9) with respect to the Ag / AgCl electrode (8).
このような構成は、恒温槽（12）内に配置され、恒温
槽（12）内の温度は37℃に保持される。緩衝液（１）の
送液には高速液体クロマトグラフィ用のポンプ（２）を
用い、緩衝液（１）としてはpH6.0の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液が1.0ml/分の流量で送液される。測定を終え
た試料を含む緩衝液は廃液瓶（11）にて捕捉される。な
お測定値は記録計（10）によって記録され、試料が電極
を通過する際に見られるピーク電流値から、ベース電流
値を引くことにより検出電流値を求めた。Such a configuration is disposed in a thermostat (12), and the temperature in the thermostat (12) is maintained at 37 ° C. The pump (2) for high performance liquid chromatography was used to send the buffer (1), and the buffer (1) was a 0.1 M sodium phosphate buffer at pH 6.0 sent at a flow rate of 1.0 ml / min. Is done. The buffer containing the sample after the measurement is captured by the waste bottle (11). The measured value was recorded by a recorder (10), and the detected current value was obtained by subtracting the base current value from the peak current value observed when the sample passed through the electrode.
実施例１ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション
V,シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアデヒドを用
いた。アセトアセチル化ポリビニルアルコールはアセト
アセチル化度２モル％、分子量約10万のものを用いた。Example 1 Bovine serum albumin (fraction
V, manufactured by Sigma) and glutaraldehyde as a crosslinking agent. The acetoacetylated polyvinyl alcohol used had an acetoacetylation degree of 2 mol% and a molecular weight of about 100,000.
試験管中で５％ウシ血清アルブミン水溶液400μｌ、2
5％グルタルアルデヒド水溶液20μｌ、1.0％アセトアセ
チル化ポリビニルアルコール溶液20μｌ、及び蒸留水56
0μｌを混合し、最終濃度がウシ血清アルブミン２％、
グルタルアルデヒド0.5％、アセトアセチル化ポリビニ
ルアルコール0.02％の混合溶液を調製した。400 μl of 5% bovine serum albumin aqueous solution in a test tube, 2
20 μl of 5% glutaraldehyde aqueous solution, 20 μl of 1.0% acetoacetylated polyvinyl alcohol solution, and 56 μl of distilled water
0 μl and a final concentration of 2% bovine serum albumin,
A mixed solution of glutaraldehyde 0.5% and acetoacetylated polyvinyl alcohol 0.02% was prepared.
この混合溶液のタンパク質とアセトアセチル化ポリビ
ニルアルコールの構成重量比は100:1、タンパク質と架
橋剤の構成重量比は100:25である。In this mixed solution, the constituent weight ratio of the protein to the acetoacetylated polyvinyl alcohol is 100: 1, and the constituent weight ratio of the protein to the crosslinking agent is 100: 25.
直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロン（商品名）
で被覆しその断面を1600番手のエメリー紙で研磨した表
面に、上記混合溶液をマイクロシリンジで５μｌのせて
40℃で乾燥し白金電極上に直接タンパク質膜を形成し
た。このようにして、過酸化水素を検出するための電極
E1を作成した。Heat-shrink Teflon on the side of 2mm diameter platinum wire (trade name)
5 μl of the above mixed solution with a micro syringe on the surface polished with 1600th emery paper
After drying at 40 ° C., a protein film was formed directly on the platinum electrode. Thus, the electrode for detecting hydrogen peroxide
E1 was created.
このタンパク質膜で被覆された白金電極からなる電極
E1を第１図に示すフロー型計測装置に組み込み、0.1Mリ
ン酸緩衝液（１）を流しながら、Ag/AgCl電極（８）に
対して＋0.6Vの電位を印加した。この状態でインジェク
タ（３）から5mM過酸化水素を注入したところ検出電流
値は320nAであった。次に5mMアスコルビン酸の溶液を注
入したところ検出電流値は4.9nAであった。第１表に過
酸化水素の検出電流値と、アスコルビン酸に関しては同
濃度の過酸化水素に対する検出電流値の割合をまとめ
た。第１表に示すようにアスコルビン酸による検出電流
値の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合は1.
5％であった。An electrode consisting of a platinum electrode covered with this protein membrane
E1 was incorporated into the flow-type measuring device shown in FIG. 1, and a potential of +0.6 V was applied to the Ag / AgCl electrode (8) while flowing 0.1 M phosphate buffer (1). When 5 mM hydrogen peroxide was injected from the injector (3) in this state, the detected current value was 320 nA. Next, when a solution of 5 mM ascorbic acid was injected, the detected current value was 4.9 nA. Table 1 summarizes the detected current value of hydrogen peroxide and the ratio of the detected current value to the same concentration of hydrogen peroxide for ascorbic acid. As shown in Table 1, the ratio of the detection current value of ascorbic acid to the detection current value of hydrogen peroxide of the same concentration is 1.
5%.
上述のように作成した電極E1を超音波処理装置（出力
600W）で30分間処理した後、再び第１図に示すフロー型
計測装置に組み込んだ。5mM過酸化水素を注入したとこ
ろ検出電流値は325nAであり、次に5mMアスコルビン酸の
溶液を注入したところ検出電流値は4.8nAであった。The electrode E1 created as described above is connected to an ultrasonic treatment device (output
(600 W) for 30 minutes, and then incorporated into the flow-type measuring device shown in FIG. 1 again. When 5 mM hydrogen peroxide was injected, the detected current value was 325 nA. Then, when a 5 mM ascorbic acid solution was injected, the detected current value was 4.8 nA.
この結果は、超音波処理を行う前の結果と共に第２表
に示した。第２表から、超音波処理の前後において、電
極E1の過酸化水素およびアスコルビン酸に対する感度に
変化はなかったことが判る。The results are shown in Table 2 together with the results before the ultrasonic treatment. Table 2 shows that the sensitivity of the electrode E1 to hydrogen peroxide and ascorbic acid did not change before and after the ultrasonic treatment.
実施例２ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション
V,シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
用いた。アセトアセチル化ポリビニルアルコールはアセ
トアセチル化度3.5モル％、分子量約15万のものを用い
た。 Example 2 Bovine serum albumin (fraction
V, Sigma) and glutaraldehyde as a crosslinking agent. The acetoacetylated polyvinyl alcohol used had an acetoacetylation degree of 3.5 mol% and a molecular weight of about 150,000.
試験管中で５％ウシ血清アルブミン水溶液400μｌ、2
5％グルタルアルデヒド水溶液20μｌ、1.0％アセトアセ
チル化ポリビニルアルコール溶液100μｌ、及び蒸留水5
80μｌを混合し、最終濃度でウシ血清アルブミン２％、
グルタルアルデヒド0.5％、アセトアセチル化ポリビニ
ルアルコール0.1％の混合溶液を調製した。400 μl of 5% bovine serum albumin aqueous solution in a test tube, 2
20 μl of 5% glutaraldehyde aqueous solution, 100 μl of 1.0% acetoacetylated polyvinyl alcohol solution, and distilled water 5
Mix 80 μl of bovine serum albumin 2% at final concentration,
A mixed solution of glutaraldehyde 0.5% and acetoacetylated polyvinyl alcohol 0.1% was prepared.
この混合溶液のタンパク質とアセトアセチル化ポリビ
ニルアルコールの構成重量比は100:5、タンパク質と架
橋剤の構成重量比は100:25である。In this mixed solution, the constituent weight ratio of protein to acetoacetylated polyvinyl alcohol is 100: 5, and the constituent weight ratio of protein to cross-linking agent is 100: 25.
一方、導電性基体である直径2mmの白金線の側面を熱
収縮テフロン（商品名）で被覆し、その断面を1600番手
のエメリー紙で研磨した。この研磨された表面に、マイ
クロシリンジで上記混合溶液を５μｌのせて40℃で乾燥
し、白金電極上に直接タンパク質膜を形成した。このよ
うにして、過酸化水素を検出するための電極E2を作成し
た。On the other hand, a side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm, which is a conductive substrate, was covered with a heat-shrinkable Teflon (trade name), and the cross section was polished with 1600th emery paper. On the polished surface, 5 μl of the above mixed solution was applied using a microsyringe and dried at 40 ° C. to form a protein film directly on the platinum electrode. Thus, an electrode E2 for detecting hydrogen peroxide was prepared.
このタンパク質膜で被覆された白金電極からなる電極
E2を第１図に示すフロー型測定装置に組み込み、0.1Mリ
ン酸緩衝液（１）を流しながら、Ag/AgCl電極に対して
＋0.6Vの電位を印加した。この状態でインジェクタ
（３）から5mM過酸化水素５μｌを注入したところ検出
電流値は350nAであった。次に5mMアスコルビン酸の溶液
を５μｌ注入したところ検出電流値は4.0nAであった。
従って、第１表に示すようにアスコルビン酸による検出
電流値の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合
は1.1％であった。An electrode consisting of a platinum electrode covered with this protein membrane
E2 was incorporated in the flow-type measuring apparatus shown in FIG. 1, and a potential of +0.6 V was applied to the Ag / AgCl electrode while flowing 0.1 M phosphate buffer (1). In this state, when 5 μl of 5 mM hydrogen peroxide was injected from the injector (3), the detected current value was 350 nA. Next, when 5 μl of a 5 mM ascorbic acid solution was injected, the detected current value was 4.0 nA.
Therefore, as shown in Table 1, the ratio of the detection current value of ascorbic acid to the detection current value of hydrogen peroxide of the same concentration was 1.1%.
また、電極E2を超音波処理装置（出力600W）で30分間
処理した後、再び第１図に示すフロー型計測装置に組み
込み過酸化水素およびアスコルビン酸に対する応答を調
べたが第２表に示すように変化は見られなかった。After treating the electrode E2 with an ultrasonic treatment device (output: 600 W) for 30 minutes, the electrode E2 was incorporated into the flow-type measurement device shown in FIG. 1 again, and the response to hydrogen peroxide and ascorbic acid was examined. Did not change.
実施例３ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション
V,シグマ社製）を、架橋剤としてグリオキザールを用い
た。アセトアセチル化ポリビニルアルコールはアセトア
セチル化度3.5モル％、分子量約15万のものを用いた。Example 3 Bovine serum albumin (fraction
V, Sigma) and glyoxal as a crosslinking agent. The acetoacetylated polyvinyl alcohol used had an acetoacetylation degree of 3.5 mol% and a molecular weight of about 150,000.
試験管中で５％ウシ血清アルブミン水溶液400μｌ、1
0％グリオキザール水溶液50μｌ、1.0％アセトアセチル
化ポリビニルアルコール溶液100μｌ、蒸留水560μｌを
混合し、最終濃度がウシ血清アルブミン２％、グリオキ
ザール0.5％、アセトアセチル化ポリビニルアルコール
0.1％の混合溶液を調製した。400 μl of 5% bovine serum albumin aqueous solution in a test tube, 1
A 50% aqueous solution of 0% glyoxal, a 100% aqueous solution of 1.0% acetoacetylated polyvinyl alcohol, and 560 μl of distilled water are mixed to a final concentration of 2% bovine serum albumin, 0.5% glyoxal, and acetoacetylated polyvinyl alcohol.
A 0.1% mixed solution was prepared.
この混合溶液のタンパク質とアセトアセチル化ポリビ
ニルアルコールの構成重量比は100:5、タンパク質と架
橋剤の構成重量比は100:25である。In this mixed solution, the constituent weight ratio of protein to acetoacetylated polyvinyl alcohol is 100: 5, and the constituent weight ratio of protein to cross-linking agent is 100: 25.
一方、導電性基体である直径2mmの白金線の側面を熱
収縮テフロン（商品名）で被覆し、その断面を1600番手
のエメリー紙で研磨した。この研磨された表面に、マイ
クロシリンジで上記混合溶液を５μｌのせて４℃で乾燥
し、白金電極上に直接タンパク質膜を形成した。このよ
うにして、過酸化水素を検出するための電極E3を作成し
た。On the other hand, a side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm, which is a conductive substrate, was covered with a heat-shrinkable Teflon (trade name), and the cross section was polished with 1600th emery paper. On the polished surface, 5 μl of the above mixed solution was applied with a microsyringe and dried at 4 ° C. to form a protein film directly on the platinum electrode. Thus, an electrode E3 for detecting hydrogen peroxide was prepared.
このタンパク質膜で被覆された白金電極からなる電極
E3を第１図に示すフロー型測定装置に組み込み、0.1Mリ
ン酸緩衝液（１）を流しながら、Ag/AgCl電極に対して
＋0.6Vの電位を印加した。この状態でインジェクタ
（３）から5mM過酸化水素５μｌを注入したところ検出
電流値は365nAであった。次に5mMアスコルビン酸の溶液
を５μｌ注入したところ検出電流値は6.3nAであった。
従って、第１表に示すようにアスコルビン酸による検出
電流値の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合
は1.7％であった。An electrode consisting of a platinum electrode covered with this protein membrane
E3 was incorporated in the flow-type measurement device shown in FIG. 1, and a potential of +0.6 V was applied to the Ag / AgCl electrode while flowing 0.1 M phosphate buffer (1). When 5 μl of 5 mM hydrogen peroxide was injected from the injector (3) in this state, the detected current value was 365 nA. Next, when 5 μl of a 5 mM ascorbic acid solution was injected, the detected current value was 6.3 nA.
Therefore, as shown in Table 1, the ratio of the detected current value of ascorbic acid to the detected current value of hydrogen peroxide of the same concentration was 1.7%.
また、電極E3を超音波処理装置（出力600W）で30分間
処理した後、再び第１図に示すフロー型測定装置に組み
過酸化水素および第２表に示すように変化は見られなか
った。After treating the electrode E3 with an ultrasonic treatment device (output: 600 W) for 30 minutes, the electrode E3 was assembled again into the flow type measurement device shown in FIG. 1, and no change was observed as shown in hydrogen peroxide and Table 2.
比較例１ タンパク質としてウシ血清アルブミン（フラクション
V,シグマ社製）を、架橋剤としてグルタルアルデヒドを
用いた。Comparative Example 1 Bovine serum albumin (fraction
V, Sigma) and glutaraldehyde as a crosslinking agent.
試験管中で５％ウシ血清アルブミン水溶液400μｌ、2
5％グルタルアルデヒド水溶液20μｌ、及び蒸留水580μ
ｌを混合し、最終濃度がウシ血清アルブミン２％、グル
タルアルデヒド0.5％の混合溶液を調製した。400 μl of 5% bovine serum albumin aqueous solution in a test tube, 2
20% of 5% glutaraldehyde aqueous solution and 580μ of distilled water
were mixed to prepare a mixed solution having a final concentration of 2% bovine serum albumin and 0.5% glutaraldehyde.
この混合溶液のタンパク質と架橋剤の構成重量比は10
0:25である。The constituent weight ratio of protein and cross-linking agent in this mixed solution is 10
0:25.
この混合溶液を、直径2mmの白金線の側面を熱収縮テ
フロン（商品名）で被覆しその断面を1600番手のエメリ
ー紙で研磨した表面にマイクロシリンジで５μｌのせて
40℃で乾燥し白金電極上に直接タンパク質膜を形成し
た。このようにして、過酸化水素を検出するための電極
C1を作成した。This mixed solution was covered with a heat-shrinkable Teflon (trade name) on the side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm, and the cross section thereof was polished with 1600th emery paper.
After drying at 40 ° C., a protein film was formed directly on the platinum electrode. Thus, the electrode for detecting hydrogen peroxide
Created C1.
このタンパク質膜で被覆された白金電極からなる電極
C1を第１図に示すフロー型計測装置に組み込み、0.1Mリ
ン酸緩衝液（１）を流しながら、AG/AgCl電極（８）に
対して＋0.6Vの電位を印加した。この状態でインジェク
タ（３）から5mM過酸化水素を注入したところ検出電流
値は330nAであった。次に5mMアスコルビン酸の溶液を注
入したところ検出電流値は4.3nAであった。第１表に過
酸化水素の検出電流値と、アスコルビン酸に関しては同
濃度の過酸化水素に対する検出電流値の割合をまとめ
た。第１表に示すようにアスコルビン酸による検出電流
値の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合は1.
3％であった。An electrode consisting of a platinum electrode covered with this protein membrane
C1 was incorporated into the flow-type measurement device shown in FIG. 1, and a potential of +0.6 V was applied to the AG / AgCl electrode (8) while flowing a 0.1 M phosphate buffer (1). When 5 mM hydrogen peroxide was injected from the injector (3) in this state, the detected current value was 330 nA. Next, when a solution of 5 mM ascorbic acid was injected, the detected current value was 4.3 nA. Table 1 summarizes the detected current value of hydrogen peroxide and the ratio of the detected current value to the same concentration of hydrogen peroxide for ascorbic acid. As shown in Table 1, the ratio of the detection current value of ascorbic acid to the detection current value of hydrogen peroxide of the same concentration is 1.
3%.
上述のように作成した電極C1を超音波処理装置（出力
600W）で30分間処理した後、再び第１図に示すフロー型
計測装置に組み込んだ。5mM過酸化水素を注入したとこ
ろ検出電流値は395nAであり、次に5mMアスコルビン酸の
溶液を注入したところ検出電流値は35.3nAであった。こ
の結果は、超音波処理を行う前の結果と共に第２表に示
されている。この時の、アスコルビン酸による検出電流
値の同濃度の過酸化水素の検出電流値に対する割合は8.
9％であった。アスコルビン酸の検出電流値が上昇し、
選択透過膜としての性能が劣化していることが判る。The electrode C1 created as described above is connected to an ultrasonic treatment device (output
(600 W) for 30 minutes, and then incorporated into the flow-type measuring device shown in FIG. 1 again. When 5 mM hydrogen peroxide was injected, the detected current value was 395 nA. Then, when a 5 mM ascorbic acid solution was injected, the detected current value was 35.3 nA. The results are shown in Table 2 together with the results before performing the sonication. At this time, the ratio of the detection current value of ascorbic acid to the detection current value of hydrogen peroxide of the same concentration was 8.
9%. The detected current value of ascorbic acid increases,
It turns out that the performance as a permselective membrane has deteriorated.
実施例４ 直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロン（商品名）
で被覆し、その断面を1600番手のエメリー紙で研磨した
表面に実施例１と同様な材料および手順で選択透過膜を
形成した。この上に牛血清アルブミンを1mg/ml、グルコ
ースオキシダーゼ（タイプII、シグマ社製）を1mg/ml、
グルタルアルデヒドを0.2％になるように0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH6.0）に溶解した液をマイクロシリ
ンジで５μｌ滴下し、40℃で15分間加熱し、固定化酵素
層を形成し、電極E4とした。Example 4 A side surface of a platinum wire having a diameter of 2 mm was subjected to heat shrink Teflon (trade name).
And a cross-section thereof was polished with emery paper of number 1600 to form a permselective membrane with the same material and procedure as in Example 1. On top of this, bovine serum albumin 1 mg / ml, glucose oxidase (type II, Sigma) 1 mg / ml,
5 μl of a solution prepared by dissolving glutaraldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to a concentration of 0.2% was added dropwise using a microsyringe, and heated at 40 ° C. for 15 minutes to form an immobilized enzyme layer. E4.
この電極E4を第１図に示すフロー型測定装置に組み込
み、0.1Mリン酸緩衝液（１）を流しながら、Ag/AgCl電
極（８）に対して＋0.6Vの電圧を印加した。インジェク
タ（３）から30mMのグルコース水溶液５μｌを注入した
ところ、検出電流値は490nAであった。次に、30mMのア
スコルビン酸水溶液を同量注入したところ、検出電流値
は12.0nAであった。つまり同濃度のグルコースに対する
アスコルビン酸の検出値は2.4％であり、実用上全く無
視できるものである。The electrode E4 was incorporated into the flow-type measuring device shown in FIG. 1, and a voltage of +0.6 V was applied to the Ag / AgCl electrode (8) while flowing a 0.1 M phosphate buffer (1). When 5 μl of a 30 mM glucose aqueous solution was injected from the injector (3), the detected current value was 490 nA. Next, when the same amount of 30 mM ascorbic acid aqueous solution was injected, the detected current value was 12.0 nA. In other words, the detection value of ascorbic acid with respect to the same concentration of glucose is 2.4%, which is completely negligible in practical use.
さらに、この電極E4をフロー型測定装置から一旦取り
外し、超音波処理装置（出力600W）で30分間処理した
後、再度フロー型測定装置に取り付けた。そして超音波
処理前と同様に、30mMのグルコースおよびアスコルビン
酸水溶液を、各々５μｌ注入した。グルコース対する検
出電流値は487nAで、アスコルビン酸に対する検出電流
値は11.8nAであった。この結果を第３表に示した。この
ように、本電極E4は超音波処理による性能劣化がないこ
とが判った。Further, the electrode E4 was temporarily removed from the flow-type measuring device, treated with an ultrasonic treatment device (output: 600 W) for 30 minutes, and then attached to the flow-type measuring device again. Then, as before the ultrasonic treatment, 5 μl of 30 mM glucose and ascorbic acid aqueous solution were injected respectively. The detected current value for glucose was 487 nA, and the detected current value for ascorbic acid was 11.8 nA. The results are shown in Table 3. Thus, it was found that the performance of the present electrode E4 did not deteriorate due to the ultrasonic treatment.
また、超音波処理した本電極を室温、緩衝液中で保存
したところ、３カ月後も感度低下や選択性の低下が認め
られず優れた耐久性を示した。In addition, when this ultrasonically treated electrode was stored in a buffer at room temperature, no decrease in sensitivity or selectivity was observed even after 3 months, showing excellent durability.
比較例２ 直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロン（商品名）
で被覆し、その断面を1600番手のエメリー紙で研磨した
表面に比較例１と同様な材料および手順で選択透過膜を
形成した。この上に牛血清アルブミンを1mg/ml、グルコ
ースオキシダーゼ（タイプII、シグマ社製）を1mg/ml、
グルタルアルデヒドを0.2％になるように0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH6.0）に溶解した液をマイクロシリ
ンジで５μｌ滴下し、40℃で15分間加熱し、固定化酵素
層を形成し、電極C2とした。 Comparative Example 2 Heat-shrink Teflon (trade name) on the side of a 2 mm diameter platinum wire
And a cross-section thereof was polished with emery paper of number 1600 to form a permselective membrane with the same material and procedure as in Comparative Example 1. On top of this, bovine serum albumin 1 mg / ml, glucose oxidase (type II, Sigma) 1 mg / ml,
5 μl of a solution prepared by dissolving glutaraldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) to a concentration of 0.2% was added dropwise using a microsyringe, and heated at 40 ° C. for 15 minutes to form an immobilized enzyme layer. C2.
この電極C2を第１図に示すフロー型測定装置に組み込
み、0.1Mリン酸緩衝液（１）を流しながら、Ag/AgCl電
極（８）に対して＋0.6Vの電圧を印加した。インジェク
タ（３）から30mMのグルコース水溶液５μｌを注入した
ところ、検出電流値は480nAであった。次に、30mMのア
スコルビン酸水溶液を同量注入したところ、検出電流値
は11.3nAであった。つまり同濃度のグルコースに対する
アスコルビン酸の検出値は2.4％であり、実用上全く無
視できるものである。The electrode C2 was incorporated into the flow-type measuring device shown in FIG. 1, and a voltage of +0.6 V was applied to the Ag / AgCl electrode (8) while flowing a 0.1 M phosphate buffer (1). When 5 μl of a 30 mM glucose aqueous solution was injected from the injector (3), the detected current value was 480 nA. Next, when the same amount of 30 mM ascorbic acid aqueous solution was injected, the detected current value was 11.3 nA. In other words, the detection value of ascorbic acid with respect to the same concentration of glucose is 2.4%, which is completely negligible in practical use.
さらに、この電極C2をフロー型測定装置から一旦取り
外し、超音波処理装置（出力600W）で30分間処理した
後、再度フロー型測定装置に取り付けた。そして超音波
処理前と同様に、30mMのグルコースおよびアスコルビン
酸水溶液を、各々５μｌ注入した。グルコースに対する
検出電流値は505nAで、アスコルビン酸に対する検出電
流値は22.3nAであった。この結果は第３表に示されてい
る。このように、本電極C2は超音波処理によりアスコル
ビン酸の検出電流値が同濃度のグルコースの検出電流値
に対して4.4％となり性能劣化が認められた。Further, the electrode C2 was once removed from the flow-type measuring device, treated with an ultrasonic treatment device (output: 600 W) for 30 minutes, and then attached to the flow-type measuring device again. Then, as before the ultrasonic treatment, 5 μl of 30 mM glucose and ascorbic acid aqueous solution were injected respectively. The detected current value for glucose was 505 nA, and the detected current value for ascorbic acid was 22.3 nA. The results are shown in Table 3. As described above, as a result of the ultrasonic treatment, the detection current value of ascorbic acid of the present electrode C2 was 4.4% of the detection current value of glucose having the same concentration, and performance degradation was recognized.
また、超音波処理した本電極を室温、緩衝液中で保存
したところ、３カ月後に感度が30％低下し実施例４に比
べて性能が低いことが判った。When this electrode subjected to ultrasonic treatment was stored in a buffer at room temperature, the sensitivity was reduced by 30% after 3 months, and the performance was lower than that of Example 4.
「効果」 以上説明した様に、本発明によれば、タンパク質を用
いて選択透過能を有する機能性膜を製造する場合に、固
定化タンパク質膜の物性に悪影響を与えず、かつ物理的
強度の優れた選択透過膜を容易に作成することができ
た。[Effect] As described above, according to the present invention, when a functional membrane having selective permeation ability is produced using a protein, it does not adversely affect the physical properties of the immobilized protein membrane and has a high physical strength. An excellent permselective membrane could be easily formed.
第１図は本発明の実施例及び比較例におけるフロー型計
測装置の概略図である。 （１）……緩衝液 （２）……ポンプ （３）……インジェクタ （４）……希釈用管路 （５）……測定用セル （６）……ジョイント （７）……対極 （８）……Ag/AgCl電極 （９）……ポテンシオスタット （10）……記録計 （11）……廃液瓶 （12）……恒温槽 第２図は本発明の酵素電極を例示した断面図である。 （21）……導電性基体 （22）……選択透過膜 （23）……固定化酵素層FIG. 1 is a schematic view of a flow-type measuring device according to an embodiment of the present invention and a comparative example. (1) Buffer solution (2) Pump (3) Injector (4) Diluting line (5) Measurement cell (6) Joint (7) Counter electrode (8) Ag / AgCl electrode (9) Potentiiostat (10) Recorder (11) Waste bottle (12) Constant temperature bath FIG. 2 is a cross-sectional view illustrating an enzyme electrode of the present invention. It is. (21) ... conductive substrate (22) ... permselective membrane (23) ... immobilized enzyme layer
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/327 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３４１Ｇ 27/404 ３４１Ｊ ３５３Ｑ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical display location G01N 27/327 G01N 27/30 341G 27/404 341J 353Q
Claims (6)
びアセトアセチル化ポリビニルアルコールを含有する溶
液を膜状に展開し、架橋反応により固定化してなる選択
透過膜。1. A permselective membrane obtained by developing a solution containing a protein, at least one kind of cross-linking agent and acetoacetylated polyvinyl alcohol into a film and fixing the solution by a cross-linking reaction.
タンパク質を含み、架橋剤がアミノ基と架橋反応する架
橋剤を含むことを特徴とする請求項（１）記載の選択透
過膜。2. The permselective membrane according to claim 1, wherein the protein comprises at least one kind of globular protein, and the crosslinking agent comprises a crosslinking agent which undergoes a crosslinking reaction with an amino group.
アルコールとの構成重量比が150:1から1:1の範囲である
請求項（１）記載の選択透過膜。3. The permselective membrane according to claim 1, wherein the weight ratio of protein to acetoacetylated polyvinyl alcohol is in the range of 150: 1 to 1: 1.
5から1:1の範囲である請求項（１）記載の選択透過膜。4. A composition comprising a protein and a crosslinking agent in a weight ratio of 100:
2. The permselective membrane according to claim 1, wherein the ratio ranges from 5 to 1: 1.
（４）に記載された選択透過膜を、導電性基体近傍に設
けたことを特徴とする電極。5. An electrode, wherein the permselective membrane according to claim 1 is provided near a conductive substrate.
電性基体とは反対側表面上に、少なくとも１種類のオキ
シダーゼを固定化した固定化酵素層を設けたことを特徴
とする酵素電極。6. An immobilized enzyme layer on which at least one kind of oxidase is immobilized is provided on the surface of the electrode of the above (5) opposite to the conductive substrate of the permselective membrane. Enzyme electrode.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1183306A JP2651019B2 (en) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Permselective membrane, electrode and enzyme electrode using it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1183306A JP2651019B2 (en) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Permselective membrane, electrode and enzyme electrode using it |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0346553A JPH0346553A (en) | 1991-02-27 |
| JP2651019B2 true JP2651019B2 (en) | 1997-09-10 |
Family
ID=16133377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1183306A Expired - Lifetime JP2651019B2 (en) | 1989-07-13 | 1989-07-13 | Permselective membrane, electrode and enzyme electrode using it |
Country Status (1)
| Country | Link |
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1989
- 1989-07-13 JP JP1183306A patent/JP2651019B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0346553A (en) | 1991-02-27 |
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