JP2649287B2 - 単子葉植物の形質転換方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、単子葉植物の形質転換方法に関する。

背景技術 単子葉植物の形質転換方法としては、従来より、エレ
クトロポレーション法、ポリエチレングリコール法（PE
G法）、パーティクルガン法その他が知られている。

エレクトロポレーション法は、プロトプラストと目的
のDNAを混合し、電気刺激で細胞膜に穴を開けることに
よりDNAを細胞内に導入し、形質転換を図る方法であ
る。現在、最も再現性のある手法で、この方法で種々の
遺伝子が単子葉植物、特にイネに導入されている（Tori
yama K.et al.,1988;Bio/Technol.6:1072−1074,Shimam
oto K.et al.,1989;Nature338:274−276,Rhodes C.A.et
al.,1989;Science240:204−207）。しかしながら、こ
の方法は、１）プロトプラストからの個体再生系が確立
されている植物種にのみ適用可能である、２）プロトプ
ラストから個体再生までには数か月を要するので、形質
転換体を得るのに時間がかかる、３）培養期間が長期化
するので、それに伴う培養変異の頻度が高くなり、正常
な形質転換体を得る確率が低くなる、という問題点を有
する。

PEG法は、目的遺伝子とプロトプラストとを混合し、P
EGで処理することによって遺伝子の導入を図る方法であ
り、エレクトロポレーション法とは電気刺激がPEGに変
わった点で異なる。導入効率はエレクトロポレーション
法よりはいくぶん低いと考えられる。この方法で形質転
換体を得た報告はあるものの、広く用いられているとは
言い難い。プロトプラストを用いるため、エレクトロポ
レーション法と同様な問題点を持つ（Zhang W.et al.,1
988;Theor.Appl.Genet.76:835−840,Datta S.K.et al.,
1990;Bio/Technol.8:736−740）。

パーティクルガン法は、目的の遺伝子を微細な金属粒
子に付着させ、金属粒子を高速で細胞あるいは組織に打
ち込むことによって形質転換を行わせる方法である。従
って、原理的にはあらゆる組織を対象に形質転換を行う
ことができ、特に、プロトプラストからの再生系が確立
されていない植物種に有効である。形質転換効率は、遺
伝子を打ち込んだ後の選抜に依存する。エレクトロポレ
ーション法と効率を比較したデータはない（Gordon−Ka
mm W.J.et al.,1990;Plant Cell2:603−618,Fromm M.E.
et al.,1990;Bio/Technol.8:833−839,Christou P.et a
l.,1991;Bio/Technol.9:957−962）。

その他の方法としては、１）種子、胚とDNAの共存培
養（Topfer R.et al.,1989;Plant Cell1:133−139,Ledo
ux L.et al.,1974Nature249:17−21）、２）花粉管への
処理（Luo and Wu1988;Plant Mol.Biol.Rep.6:165
−）、３）リポソーム法（Caboche M.1990;Physiol.Pla
nt.79:173−176,Gad A.E.etal.,1990:177−183）及び
４）マイクロインジェクション法（Neuhaus G.et al.,1
987;Theor.Appl.Genet.75:30−36）があるが、形質転換
の効率、再現性、あるいは汎用性に関して問題があり、
一般的な方法とは言い難い。

一方、アグロバクテリウム属細菌のTiプラスミドをベ
クターとして用いた遺伝子導入法は、タバコ、ペチュニ
ア、ナタネ等の双子葉作物の形質転換法として普遍的に
用いられている。しかしながら、アグロバクテリウム属
細菌の宿主は双子葉植物のみに限られ、単子葉植物には
寄生しないとされている（De Cleene M.1976;Bot.Rev.4
2:389−466）。

アグロバクテリウムによる単子葉植物の形質転換に関
してはアスパラガス（Bytebier B.et al.,1987:Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA:84:5345−5349）、そしてヤム（Diosc
orea bulbifera）（Schaferw,et al.,1987;Nature327:5
29−532）で報告されているが、その他の単子葉植物、
特にイネ科作物にはこの方法を適用できないとされてい
る（Potrykus I.1990;Bio/Technol.8:535−543）。

Grimsley et al,1987:Nature325:177−179はアグロバ
クテリウムのＴ−DNAの中にトウモロコシストリークウ
イルス（Maize streak virus）のDNAを挿入したものを
トウモロコシの生長点に接種したところ、トウモロコシ
ストリークウイルスの感染を確認したことを報告してい
る。トウモロコシストリークウイルスのDNAを接種した
だけではこのような感染症状が認められないことから、
上の観察結果はアグロバクテリウムがトウモロコシにDN
Aを導入することができることを示すものと解釈してい
る。しかし、ウイルスは核ゲノムに組み込まれなくても
増殖する可能性があるので、この結果はＴ−DNAが核に
組み込まれたことを示すものではない。その後、感染効
率はトウモロコシの茎頂の生長点に接種した時が最も高
く（Grimsley et al.,1988;Bio/Technol.6:185−18
9）、感染にはアグロバクテリウムのプラスミドのvirC
遺伝子が必須であることを示した（Grimsley et al.,Mo
l.Gen.Genet.217:309−316）。

Gould J.et al.（1991;Plant Physiol.95:426−434）
はトウモロコシの茎頂に針で傷をつけた後カナマイシン
抵抗性遺伝子とGUS遺伝子を持った強病原性アグロバク
テリウムEHAlを接種し、処理後の茎頂組織をカナマイシ
ンで選抜したところ、抵抗性を示す植物体を得た。この
後代の種子の一部は導入した遺伝子を持つことをサザン
分析で確認した（キメラ現象）。

Mooney P.A.et al.,（1991;Plant Cell,Tissue,Organ
Culture25:209−218）は、アグロバクテリウムを用い
て小麦の胚にカナマイシン抵抗性遺伝子の導入を試み
た。まず、胚を酵素で処理し、細胞壁に傷をつける処理
をし、その後アグロバクテリウムを接種した。処理した
カルスのうち極めて少数のカナマイシン抵抗性と思われ
るカルスが増殖したが、このカルスからの植物体の再生
はできなかった。また、カナマイシン抵抗性遺伝子の存
在をサザン分析で確認したところ、全ての抵抗性カルス
で導入遺伝子の構造変異が見られた。

Raineri et al.（1990;Bio/Technol.8:33−38）はイ
ネの胚盤に傷をつけた後、強病原性のアグロバクテリウ
ムA281（pTiBo542）をイネの８品種に処理したところ、
日本晴、藤坂５号の２品種で腫瘍状の組織の増殖が見ら
れた。さらに、Ｔ−DNAからホルモン合成遺伝子を除い
たTiプラスミドにカナマイシン抵抗性遺伝子とGUS遺伝
子を挿入したプラスミドを持つアグロバクテリウムをイ
ネの胚に接種したところカナマイシン抵抗性カルスの増
殖が見られた。この抵抗性カルスではGUS遺伝子の発現
が認められたが、形質転換植物を得ることはできなかっ
た。これらのことから、アグロバクテリウムのＴ−DNA
がイネ細胞に導入されたと解釈している。

このように、イネ、トウモロコシ、コムギ等のイネ科
の作物でもアグロバクテリウムによる遺伝子導入が可能
であることを示唆する研究報告が現れてきているが、ま
だ、再現性、導入効率、さらには遺伝子の導入の確認に
ついても完全に説得できる結果を示しているとは言い難
い（Potrykus I.1990;Bio/Technol.8:535−543）。

上述のように、イネ科作物における遺伝子導入法は、
エレクトロポレーション法が主流であるが、プロトプラ
ストを用いるため、再生植物を得るまで長期間を要し、
多大な労力がかかり、また長期間の培養により高頻度で
変異体が出現するという危険性がある。また、この方法
はプロトプラストからの再分化系が確立されていない作
物、例えばトウモロコシには適用できない。そこで、上
述のように、トウモロコシに対しては、生長点組織を用
いることが試みられている（Gould J.et al.,1991）。
しかし、生長点を単離する作業は多くの労力を要し、大
量に調製することは必ずしも容易ではない。

発明の開示 従って、本発明の目的は、従来の方法に比較して、形
質転換から植物体の再生までの時間が短く、プロトプラ
ストからの植物体の再生系が確立されていない植物に対
しても普遍的に適用することができ、さらに用いる材料
の調製が容易な単子葉植物の形質転換方法を提供するこ
とである。

本願発明者らは、アグロバクテリウムで処理する単子
葉の植物組織、アグロバクテリウムの処理条件、及びバ
イナリーベクターの構成等が遺伝子導入効率に及ぼす影
響等を鋭意研究した結果、単子葉植物の培養組織をアグ
ロバクテリウム属細菌を用いて飛躍的に高い効率で再現
性をもって形質転換することができることを見出し、こ
れによれば上記目的を達成することができることを見出
し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、所望の遺伝子を含有するアグロ
バクテリウム属細菌で単子葉植物の脱分化過程にある培
養組織又は脱分化した培養組織を形質転換することから
成る、単子葉植物の形質転換方法を提供する。

本発明の方法により、イネ、トウモロコシ、コムギ、
オオムギ等のイネ科植物を始めとする単子葉植物に目的
の外来遺伝子を再現性良く導入することが初めて可能に
なった。アグロバクテリウムを用いた単子葉植物の形質
転換方法はこれまでにもあるが、前述のとおり確立され
た方法とは言い難い。しかし、本発明ではこれまでに用
いられていない培養組織に本発明で改良した方法でアグ
ロバクテリウムを接種することにより、極めて容易に遺
伝子を導入することができた。本発明の方法では、材料
調製が容易なカルス等の培養組織を用いるので、生長点
を用いる従来技術に比べて供試材料を容易に得ることが
できる。また、培養組織を形質転換するので、プロトプ
ラストを形質転換する場合に比べて植物体再生までの時
間が短く、変異の頻度が低下する。また、スーパーバイ
ナリーベクターを用いれば、一部のイネの品種のように
培養が困難な品種にも高い効率で遺伝子を導入すること
が可能になった。さらに、後述の実施例に記載するよう
に、適切な接種後の選抜法を採用すれば、目的遺伝子が
キメラ状に導入されるキメラ現象を低減させることもで
きる。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の方法に用いることができるアグロバ
クテリウム属細菌に含まれるプラスミドの一例であるpT
OK162の構造と本発明の実施例で用いたプラスミドpTOK2
32の構築方法を示す図である。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法により形質転換される単子葉植物は、特
に限定されるものではなく、イネ、トウモロコシ、オオ
ムギ、コムギ、アスパラガスその他、いかなる単子葉植
物にも適用可能である。

また、本発明の方法に供される培養組織は、単子葉植
物の脱分化過程にある培養組織又は脱分化した培養組織
である。ここで、脱分化過程にある培養組織とは、外植
片をオーキシン及びサイトカイニン等の植物生長調節物
質を含む培地で培養することにより得られる組織で、カ
ルス及び不定胚様組織が形成される前段階の組織を意味
し、脱分化した培養組織とは外植片をオーキシン及びサ
イトカイニン等の植物生長調節物質を含む培地で培養す
ることにより得られるカルス及び不定胚様組織を意味す
る。本発明で用いられる培養組織はいかなる部位由来の
ものであってもよく、例えば、胚盤、茎頂、幼根、未熟
胚、花粉及び葯由来のものを挙げることができる。本発
明で用いられる培養組織としては、脱分化誘導培地に外
植片を置床した後７日以上経過したカルス形成過程にあ
る培養組織、又はカルス及び不定胚様組織を用いること
が好ましい。中でも、カルス及び不定胚様組織を培養組
織として用いることが最も好ましい。脱分化誘導培地は
この分野において周知であり、例えばN6培地（Chu.C.C.
1987;Proc.Symp.Plant Tissue Culture,Science Press
Peking,pp.43−50）の主要無機塩類及びビタミン類に2m
g/l 2,4−Ｄ、1g/lカザミノ酸、30g/lショ糖、2g/ゲル
ライトを添加した培地及びLS培地（Linsmaier,E.,and S
koog,F.1965;Physiol.Plant18:100−127）の無機塩及び
ビタミン類に100mg/lカザミノ酸、700mg/lプロリン、1.
5mg/l 2,4−Ｄ、20g/lショ糖、2.3g/lゲルライトを添
加した培地等を用いることができる。もっとも、本発明
の方法に用いる培養組織は必ずしもカルスである必要は
なく、懸濁細胞であってもよい。

形質転換に用いられるアグロバクテリウム属細菌は、
従来より双子葉植物の形質転換に用いられているものを
用いることができる。これらのものの多くはAgrobacter
ium tumefaciens由来のTiプラスミドのヴィルレンス領
域（vir領域）由来のDNA領域を含むベクターを有してお
り、植物に付与しようとする形質を担う遺伝子はこのベ
クター中に挿入されるか又はこのベクターとは別のプラ
スミド中に存在し、相同組換え等によりTiプラスミド中
にin vivoで挿入されるものである。また、本願発明者
らは、先に、Agrobacterium tumefaciens A281という強
病原性の、形質転換効率が極めて高い株（Hood E.E.et
al.,1984;Bio/Technol.2:702−709,Hood E.E.et al.,19
86;J.Bacteriol.168:1283−1290,Komari T.et al.,198
6;J.Bacteriol.166:88−94,Jin S.et al.,1987;J.Bacte
riol.169:4417−4425,Komari T.1989;Plant Science60:
223−229ATCC37394）に含まれるTiプラスミドpTiBo542
（Jin S.et al.,1987:J.Bacteriol.169:4417−4425）の
ヴィルレンス領域（vir領域）由来のDNA領域の含むベク
ター（本明細書において、このベクターを「スーパーバ
イナリーベクター」と呼ぶことがある）を開発した（特
開平４−222527号）。このようなスーパーバイナリーベ
クターを本発明において好ましく用いることができる。

このようなスーパーバイナリーベクターの例としてpT
OK162（特開平４−222527号、欧州特許公開第504869
号、米国特許出願第07/854,844号）を挙げることができ
る。その構造を図１に示す。このプラスミドは、大腸菌
及びAgrobacterium tumefaciens中で増殖可能であるpTO
K154と呼ばれるプラスミド（Tiプラスミドから誘導され
た公知のpGA472プラスミドとpVCK101と呼ばれる公知の
広宿主域プラスミドから後述の方法により構築された、
Ｔ領域を含むプラスミド）にpTiBo542のヴィルレンス領
域由来の既にクローン化されていた上記15.2キロベース
のKpnl断片（virB、virG、virC各遺伝子を含む）を組み
込んだものである。このpTOK154には、Ｔ領域の２つの
境界配列とその間に単子葉植物に導入しようとする遺伝
子としてカナマイシン耐性遺伝子が配列されており、こ
の例は、単子葉植物に導入しようとする遺伝子がpTiBo5
42のヴィルレンス領域由来のクローン化されたDNA断片
を含有するプラスミド上に配置されている例である。な
お、図１中の各符号は次の意味を有する。

SP スペクチノマイシン抵抗性遺伝子 HPT ハイグロマイシン抵抗性遺伝子 NPT カナマイシン抵抗性遺伝子 TC テトラサイクリン抵抗性遺伝子 IG イントロンGUS遺伝子 BR Ｔ−DNAの右ボーダー配列 BL Ｔ−DNAの左ボーダー配列 virB,C,G 強病原性アグロバクテリウムA281由来のvir
領域 ORI ColElの複製開始点 COS ラムダファージのCOS部位 Ｋ 制限酵素Kpn I部位 Ｈ 制限酵素Hind III部位 単子葉植物に組み込もうとする所望の遺伝子は、上記
プラスミドのＴ領域中の制限酵素部位に常法により組み
込むことができ、プラスミドが有する薬剤耐性等の適当
な選択マーカーに基づいて選択することができる。もっ
とも、図１に示すpTOK162のように、大型で多数の制限
部位を持つものは、通常のサブクローニングの手法では
所望のDNAをＴ領域内に導入することが必ずしも容易で
はないことがある。このような場合には、Agrobacteriu
m tumefaciens細胞内のin vivo系での相同組換え（Herr
era−Estrella L.et al.,1983;EMBO J.2:987−995,Hors
ch R.H.et al.,1984;Science223:496−498）を利用する
ことにより、目的のDNAをpTOK162に導入することが可能
になる。すなわち、例えば、先ず、pTOK162をAgrobacte
rium tumefaciensに導入しておいて、この菌にさらに所
望DNAを導入したpBR322と呼ばれるプラスミド（類似の
プラスミドを含む）を導入する。pTOK162のDNAにはpBR3
22と相同な部分があるので、pBR322誘導体は相同配列を
介した組み換えによりpTOK162に組み込まれることにな
る。pBR322はpTOK162と異なりAgrobacterium tumefacie
ns中では複製できないので、このような組み込まれた状
態（pTOK162::pBR322誘導体という）でなければAgrobac
terium tumefaciens中で生存することができない。そし
て、pTOK162とpBR322誘導体のそれぞれに特異的な特性
（薬剤耐性等）について選抜すれば、pTOK162::pBR322
誘導体を有するAgrobacterium tumefaciensを得ること
ができる。さらに、pTOK162を有するAgrobacterium tum
efaciensに各種のプラスミドを導入して研究したとこ
ろ、pBR322誘導体の選抜マーカーとしては、トランスポ
ゾンTn7（De Greve H.H.et al.,1981;Plasmid6;235−24
8）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子（SP）が優れ
ていることが判明した。従って、すでに所望の遺伝子が
pBR322にクローン化されている場合には、SP遺伝子をそ
のプラスミドに挿入すれば、Agrobaoterium tumefacien
s内の相同組換えにより、pTOK162のＴ領域に所望の遺伝
子を導入することができる。またその他の場合には、pB
R322由来のDNAとSP遺伝子から構成されるプラスミドを
用意しておいて、これに所望の遺伝子を挿入する方法も
考えられる。この際、Ｔ領域の境界配列を活用すれば、
最終的に、pTOK162上において、カナマイシン耐性遺伝
子と所望の遺伝子を別々のＴ領域中に配置することも可
能である。カナマイシン耐性をマーカーとして植物を形
質転換した場合、両Ｔ領域とも導入される場合も相当の
比率で生じるわけであるので、目的遺伝子の導入は十分
達成できる。また、両Ｔ領域が別々の染色体に組み込ま
れる場合もあり得るので、後に目的の遺伝子をカナマイ
シン耐性遺伝子から分離することも可能となる。

単子葉植物に導入しようとする所望の遺伝子は、何ら
限定されるものではなく、望まれる性質を付与すること
ができるあらゆる遺伝子が包含される。例えば、除草剤
抵抗性遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、ウイルス病抵抗
性を付与するためのウイルスのコート蛋白質遺伝子及び
胚乳の澱粉形質関連遺伝子などを挙げることができる
が、もちろんこれらに限定されるものではない。

寄主となるアグロバクテリウム属細菌としては、特に
限定されないが、Agrobacterium tumefaciensを好まし
く用いることができる。

プラスミドをAgrobacterium tumefaciens等のアグロ
バクテリウム属細菌に導入する操作は従来法により行う
ことができ、例えば、細菌の三系交雑手法（Ditta G.et
al.,1980;Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7347−7351）に
より行うことができる。

このようにして調製されるアグロバクテリウム属細菌
には、pTOK162由来のヴィルレンス能力の高いDNAが含ま
れるので、高い効率で単子葉植物の形質転換を行うこと
が可能である。

尚、本発明においては、単子葉植物に導入しようとす
る遺伝子は、従来の技術と同様にＴ領域の境界配列の間
に配置されるものであるが、アグロバクテリウム属細菌
中で、Tiプラスミド上に配置されてもよく又は他のプラ
スミド上に配置されてもよい。

アグロバクテリウム属細菌で単子葉植物の培養組織を
形質転換する方法は、培養組織をアグロバクテリウム属
細菌と単に接触させることにより行うことができる。例
えば、10⁶/10¹¹細胞/ml程度の細胞濃度のアグロバクテ
リウム属細菌懸濁液を調製し、この懸濁液中に培養組織
を３〜10分間程度浸漬後、固体培地上で数日間共存培養
することにより行うことができる。あるいは、培養組織
の培養液中にアグロバクテリウム属細菌を添加して共存
培養することにより形質転換を行うこともできる。この
ように、本発明の方法では、培養組織を酵素処理や傷つ
ける等の前処理を行わずに形質転換に供することができ
る。

形質転換に供試した培養組織は、その後、脱分化過程
又は脱分化状態で形質転換細胞又は形質転換組織を選抜
することが好ましい。これは当該培養組織をオーキシ
ン、サイトカイニン等の植物生長調節物質を含み、ハイ
グロマイシン等の選抜マーカー及びアグロバクテリウム
属細菌に対する抗生物質を添加した培地で培養すること
により行うことができる。

選抜した細胞又は組織は公知の方法により再分化培養
を行うことができる。これにより、形質転換により所望
の形質を獲得した植物体を再生することができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。

実施例１ （１）供試培養組織の調製 （ｉ）イネの品種 日本稲品種、朝の光、月の光及びコシヒカリを選定し
て供試した。

（ii）胚盤、胚盤カルス イネの完熟種子を70％エタノールに１分間、１％次亜
塩素酸ナトリウム３に０分間浸漬することによって消毒
した後、2N6固体培地（N6の無機塩類及びビタミン類（C
hu C.C.1978;Proc.Symp.Plant Tissue Culture,Science
Press Peking,pp.43−50）、1g/lカザミノ酸、2mg/l
2,4−Ｄ、30g/lショ糖、2g/lゲルライト）に置床した。
また、完熟種子を置床後４日目に種子より胚盤部位を摘
出し胚盤として供試した。完熟種子を約３週間培養後、
形成された胚盤由来のカルスを2N6培地に移植し、４〜
７日経過したカルスを胚盤カルスとして用いた。

（iii）茎頂組織 イネの完熟種子を上記の方法で消毒した後、1/2N6固
体培地（1/2量のN6の主要無機塩類及び微量塩類、N6ビ
タミン類、1g/lカザミノ酸、20g/lショ糖、2g/lゲルラ
イト）に置床し、培養３日後の幼苗から、頂端***組織
を含む２〜3mmの組織を切り出し、材料とした。

（iv）幼根組織、幼根カルス （iii）の方法で得た幼植物体から種子根の先端部を
５〜10mm切り出して材料とした。また、これらの幼根を
2N6固体培地上で約２週間培養して得たカルスを幼根カ
ルスとして用いた。

（ｖ）懸濁培養細胞 （ii）の方法で得た胚盤由来のカルスをAA液体培地
（AA主要無機塩類、AAアミノ酸及びAAビタミン類（Tori
yama and Hinata1985;Plant Science41:179−183,MS微
量塩類（Murashige and Skoog 1962;Physiol.Plant,15:
473−497）、0.5g/lカザミノ酸、1mg/l 2,4−Ｄ、0.2m
g/lカイネチン、0.1mg/lジベレリン、20g/lショ糖）に
移し、25℃、暗黒下で120rpmで振盪することによって懸
濁培養細胞を得た。なお、培地の更新は１週間毎に行っ
た。

（２）Tiプラスミド（バイナリーベクター） ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（HPT）及びβ−Ｄ−
グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子をTiプラスミドのＴ−D
NA領域に組み込んだ、以下のプラスミドを作製した。

（ｉ）pIG121Hm:ヒマのカタラーゼ遺伝子の第１イント
ロンを含むGUS遺伝子と、ハイグロマイシン抵抗性遺伝
子と連結したプラスミド（中村ら、1991;植物バイオテ
クノロジーII（現代化学増刊、pp.123−132）、名古屋
大学、中村氏より入手）。

（ii）pTOK232: 1.イントロンGUS及びハイグロマイシン抵抗性遺伝子の
中間ベクターpTOK229への導入 Tn7由来のスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含むCla
I断片（2.5kb）をクレノー処理により末端を平滑化
し、これをpUC19のSma I部位に挿入し、アンピシリン及
びスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を持つプラスミドpT
OK107（5.2kb）を得た。pTOK107をEcoR I、Hind IIIで
処理し、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む2.5kb
断片をpGA482のEcoR I、Hind III断片（2.7kb）と連結
し、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子とHind III、Hpa
I部位を含むpTOK170（5.2kb）を得た。

35Sプロモーターにヒマのカタラーゼの第１イントロ
ンとGUS遺伝子を連結したベクターpIG221（Ohta S.et a
l.,1990;Plant Cell Physiol.31:805−813,名古屋大学
中村氏より譲渡）をEcoR Iで切断後クレノー酵素により
末端を平滑化しHind IIIリンカー（pCAAGCTTG;タカラ酒
造コード4660P）を挿入した。35Sプロモーター及びイン
トロンGUSを含む断片をHind IIIにより切り出し、35Sプ
ロモーターにハイグロマイシン抵抗性遺伝子を連結した
プラスミドpGL2（J.Paszkowski,Friedrich Mieocher In
stituteより入手）のHind III部位に挿入しpGL2−IG
（7.6kb）を得た。なお、pGL2はpDH51（Pietrazak et a
l.,1986;Nucleic Acids Research14:5857−5868）にハ
イグロマイシン抵抗性遺伝子（Gritz L.and Davis J.19
83;Gene25:179−188）の挿入したものである。pTOK170
をHpa I処理して得られた断片をpGL2−IGのPvu II断片
（5.2kb）と連結しpTOK229（10.1kb）を得た。

２）スーパーバイナリーベクターpTOK162への導入 バイナリーベクターに強病原性アグロバクテリウムA2
81由来のvirB、virC、virG遺伝子を挿入して得たスーパ
ーバイナリーベクターpTOK162への目的遺伝子（ハイグ
ロマイシン抵抗性遺伝子、イントロンGUS遺伝子）の導
入は相同組換えによって行った。すなわち、両ベクター
は大腸菌プラスミドpBR322に由来する部位を持つので、
スペクチノマイシン、カナマイシンで選抜された菌には
両プラスミドの組換えによって生じたプラスミドのみが
含まれることになる。スーパーバイナリーベクターにハ
イグロマイシン抵抗性遺伝子、イントロンGUS遺伝子が
組み込まれたプラスミドをpTOK232と呼ぶ（図１参
照）。

（３）寄主アグロバクテリウム Ｔ−DNA領域を削除した菌系、LBA4404とEHA101とを寄
主バクテリアとして使用した。LBA4404はヘルパープラ
スミド（vir領域を完全な形で持つ）PAL4404を有する菌
系であり、American Type Culture Colletionより入手
可能である（ATCC 37349）。EHA101はヘルパープラス
ミドのvir領域が強病原性アグロバクテリウムA281由来
であり、Hood E.E.et al.1986から入手可能である。

（２）項で述べた種々のバイナリーベクターをこれら
２種類のアグロバクテリウムに導入し、以下の菌系を遺
伝子導入用として用いた。これらのプラスミドをアグロ
バクテリウムに導入する方法は細菌の三系交雑手法（Di
tta G.et al.1980;Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:7347−73
51）によった。

LBA4404（pTOK232） LBA4404（pIG121Hm） EHA101（pIG121Hm） （４）アグロバクテリウム懸濁液の調製 ハイグロマイシン（50μg/ml）とカナマイシン（50μ
g/ml）を含むAB培地（Drlica K.A.and Kado C.I.1974;P
roc.Natl Acad.Sci.USA71:3677−3681）上で３〜10日間
培養したアグロバクテリウムのコロニーを白金耳でかき
とり、修正AA培地（前述のAA培地において、ショ糖を0.
2M、グルコースを0.2Mに変更し、アセトシリンゴンを10
0μＭ添加、pH5.2）に懸濁し、菌濃度を３〜５×10⁹細
胞/mlに調整し接種に用いた。

（５）接種条件 供試組織を滅菌水で洗浄後、上述のアグロバクテリウ
ムの懸濁液に３〜10分間浸漬した。浸漬処理後、茎頂組
織は100μＭアセトシリンゴン、10g/lグルコース、20g/
lショ糖を含むN6S3固体培地（1/2N6主要無機塩類、N6微
量塩類、N6ビタミン類、Chu C.C.1978、AAアミノ酸（To
riyama and Hinata1985）,1g/lカザミノ酸、0.2mg/l NA
A、1.0mg/lカイネチン、3g/lゲルライト）に、胚盤カル
スなどのその他の培養組織はアセトシリンゴン、グルコ
ース、ショ糖を同濃度で含む2N6固体培地に移植し、25
℃、暗黒下で２〜５日間培養した。その後、接種組織を
250mg/lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、同濃度
のセフォタキシムを含むそれぞれの固体培地で培養を続
けた。

（６）GUS活性の調査方法 共存培養処理直後、組織を0.1％Triton X−100を含む
0.1Mリン酸緩衝液（pH6.8）に浸漬し、37℃で１時間静
置した。リン酸緩衝液でアグロバクテリウムを洗浄除去
した後、0.1mM ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルコン酸（Ｘ−gluc）及び20％メタノ
ールを含むリン酸緩衝液を添加した。37℃で24時間処理
した後、青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察し、供
試組織数に対する百分率で表した。なお、選抜処理後得
られた形質転換体と考えられる植物体でのGUS活性の判
定に際しては、植物体から葉片を採取し、同様な方法に
従ってGUS染色を行った。個体ごとの発現様式で、葉片
全体又は葉片の切り口が一様に青色に呈色するものを陽
性個体、キメラ状に呈色するものをキメラ個体とした。

（７）形質転換細胞、組織の選抜 （ｉ）茎頂組織 ５日間アグロバクテリウムと共存培養した茎頂組織を
250mg/lセフォタキシムを含むN6S3培地で２週間培養
し、生長した茎頂組織を40mg/lハイグロマイシンを含む
N6S3培地に移して、形質転換体の選抜を行った。

（ii）胚盤 ３日間共存培養した胚盤を250mg/lセフォタキシムを
含む2N6培地で１週間培養した後、50mg/1ハイグロマイ
シンを含む2N6培地で形質転換細胞の選抜を行った。

（iii）培養組織（胚盤カルス） ３日間共存培養した培養組織を、250mg/lセフォタキ
シムを含む2N6培地で１週間培養した後、同培養組織を5
0mg/lハイグロマイシンを含む2N6培地で３週間培養して
ハイグロマイシン抵抗性の培養組織を選抜した（１次選
抜）。得られた抵抗性組織をさらに50mg/lハイグロマイ
シンを含むN6−12培地（N6無機塩類、N6ビタミン類、2g
/lカザミノ酸、0.2mg/12,4−Ｄ、0.5mg/l 6BA、5mg/l
ABA、30g/lソルビトール、20g/lショ糖、2g/lゲルラ
イト）で２〜３週間培養し（２次選抜）、この培地上で
増殖したカルスを０、20、50mg/lハイグロマイシンを含
む個体再生用培地N6S3に移した。なお、共存培養後の培
地には全て250mg/lセフォタキシムを添加した。

（iv）懸濁培養細胞 ５日間共存培養した懸濁培養細胞を250mg/lセフォタ
キシムを含む2N6培地で１週間培養した後、50mg/lハイ
グロマイシンを含む2N6培地で形質転換細胞の選抜を行
った。

（８）形質転換次世代における導入遺伝子の発現 形質転換次世代の種子を70mg/lハイグロマイシンを含
む400倍ホーマイ水和剤水溶液中に播種後、25℃で10日
間処理し、ハイグロマイシン抵抗性を調査した。また、
形質転換次世代の種子を各20粒づつ播種し、約３週間後
の苗から葉片を採取し、GUS遺伝子の発現を調査した。

（９）サザン法による導入遺伝子の分析 品種、朝の光、月の光の形質転換体当代について、小
鞠らの方法（Komari et al.,1989;Theoretical and App
lied Genetics77:547−552）に従いDNAを抽出し、抽出
したDNAに制限酵素Hind IIIを処理し、HPT遺伝子をプロ
ーブとし、サザン法による導入遺伝子の検出を行った。
バイナリープラスミド上のHPT遺伝子を含むHind III断
片の長さは、約5.5Kbであり、この領域のＴ−DNAの内部
のHind IIIサイトからＬボーダー配列の末端までのDNA
領域の長さは、約5.4Kbである（図１）。なお、サザン
法についてはMolecular Cloning（Sambrook et al.198
9;Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方
法に従って行った。また、”月の光”の形質転換次世代
の２系統について、GUS陽性、GUS陰性、ハイグロマイシ
ン抵抗性の各個体を２個体づつ供試し、同様な手法によ
りサザン分析を行った。

（10）イネでの供試材料の違いによる遺伝子導入効率
（共存培養後におけるGUS発現） アグロバクテリウムが単子葉作物の細胞に遺伝子を導
入することが可能であることを確認するため、強病原性
のvir領域を持つアグロバクテリウムEHA101にハイグロ
マイシン抵抗性遺伝子とGUS遺伝子を持つバイナリーベ
クターpIG121Hm（上述）を導入した菌をイネ品種月の光
の種々の組織に処理し、共存培養後にGUS活性を調査し
た。供試組織は茎頂、幼根、胚盤、幼根カルス、胚盤カ
ルス及び懸濁培養細胞である。アグロバクテリウムで処
理しなかった場合は、いずれの材料でも青色のGUS発現
を示すものは認められなかった。一方、アグロバクテリ
ウムEHA101（pIG121Hm）で処理した場合には、幼根を除
く組織でGUSの発現が確認された。処理組織数に対する
青色を呈する組織の割合では胚盤カルスが最も高かった
（表１）。さらに、GUSを発現する組織の大きさでも胚
盤カルスが優れていた。胚盤カルスに次いで高い導入率
を示した組織は茎頂であった。また、胚盤の脱分化組織
である胚盤カルスおよび懸濁培養細胞で高い導入率を示
したのに対し、胚盤では明らかに導入効率は低かった。
このことは、より細胞***の活性が高い組織に遺伝子が
導入されやすいことを示唆するものである。

この実験で使用したバイナリーベクターpIG121Hmでは
GUS遺伝子のプロモーターの中にヒマのイントロンが挿
入されているため、アグロバクテリウムの細胞の中では
GUS遺伝子は発現しないことが確認されている（中村
ら、1991）。以上のことから、共存培養後のGUS遺伝子
の発現を指標とした場合、アグロバクテリウムはイネ細
胞に遺伝子を導入できることが確認された。

（11）供試材料の違いによる形質転換組織および細胞の
出現効率 共存培養処理を行った茎頂、胚盤、胚盤カルスおよび
懸濁培養細胞を用いて、ハイグロマイシンによる形質転
換組織および形質転換細胞の選抜を行った。その結果、
胚盤カルスおよび懸濁培養細胞でハイグロマイシンに抵
抗性を示す形質転換細胞の増殖が認められた（表２）。
また選抜された細胞は、GUS遺伝子を一様に発現した。
共存培養後、GUS発現の調査で高い遺伝子導入効率を示
した茎頂組織は、ハイグロマイシンによる選抜の結果、
全ての組織が枯死し、抵抗性組織は得られなかった。茎
頂は生長点を含む組織であるが、遺伝子の導入処理を行
った後、抵抗性組織が増殖するためには、遺伝子が限ら
れた生長点に導入される必要がある。アグロバクテリウ
ムとの共存培養処理後、茎頂には多数の遺伝子が導入さ
れているものの抵抗性組織が得られなかったことは、生
長点近傍に導入される確率が低いことによると考えられ
る。また、生長点近傍に遺伝子が導入され形質転換細胞
が得られたとしても、得られる植物体がキメラ性を示す
可能性が高いことは容易に推測される。これらのことか
ら、Gould et al.（1991）により報告されている茎頂を
用いた形質転換方法は、カルスなど脱分化組織を用いる
方法に比べ、技術的な困難性が高く、再現性の低い手法
であると考えられる。

完熟種子の胚盤に由来する培養組織である胚盤カルス
や懸濁培養細胞で形質転換細胞が得られたのに対し、胚
盤では抵抗性細胞の増殖は認められなかった。また、Ra
ineri et al.（1990）の方法に従い、傷をつけた胚盤を
供試組織として遺伝子導入を試みたが、遺伝子導入効率
の向上はみられず、形質転換細胞も得られなかった。こ
れに対し、胚盤カルスを供試組織とした場合には、傷を
つけるなどの処理も必要なく、再現性良く、しかも高頻
度で形質転換細胞が得られた。これらのことから、アグ
ロバクテリウムによる形質転換の供試組織として、脱分
化状態または脱分化過程にある培養組織が好適であると
判断される。

培養細胞の確立、培養細胞から個体再生に関しては大
きな品種間差異が存在する（Mikami and Kinoshita198
8;Plant Cell Tissue Organ Cult.12:311−314）。日本
稲の中ではコシヒカリは培養が困難とされている。一
方、前項で用いた月の光は比較的培養が容易である。ア
グロバクテリウムによる形質転換法を用いる場合、この
ような品種間差異があると実用的には不都合である。こ
の点を明らかにするため、コシヒカリと月の光の培養容
易性の異なる２品種を用いてアグロバクテリウムによる
遺伝子導入効率の差異を調査した。供試組織は胚盤カル
スとし、アグロバクテリウムとしてはEHA101（pIG121H
m）及びLBA4404（pIG121Hm）を用いた。

月の光では各実験を通じて90％以上のカルスでGUS活
性が認められたが、コシヒカリではこれより低い率でGU
S活性が認められた（表３）。従って、EHA101（pIG121H
m）あるいはLBA4404（pIG121Hm）を用いた場合には、導
入効率に関する品種間差異があるものと解釈される。

（13）アグロバクテリウムの菌系による遺伝子導入効率
の違い（共存培養後におけるGUS発現） EHA101（pIG121Hm）はヘルパープラスミドに強病原性
アグロバクテリウムA281のvir領域を持つ。LBA4404（pI
G121Hm）は通常のvir領域を持つ。一方、LBA4404（pTOK
232）はヘルパープラスミドのvir領域は通常型である
が、バイナリーベクターに強病原性アグロバクテリウム
A281のvir領域の一部の遺伝子を有する。そして、この
バイナリーベクターはpTOK162から派生したもので、LBA
4404（pTOK162）は双子葉作物の中でも形質転換の困難
な植物種に極めて高率で形質転換を可能とした（Saito
Y.et al.,1992;Theor.Appl.Genet.83:679−683）。この
ように、強病原性のvir領域の存在そのもの、あるいは
存在形態は形質変換の効率に大きく影響する可能性があ
る。そこで、強病原性のvir遺伝子に関して異なる上記
の３種類のアグロバクテリウムを用いて、GUS遺伝子の
発現に関する導入効率を比較した。なお、供試材料はコ
シヒカリ、月の光の胚盤カルスである。

強病原性のvir領域を持たないLBA4404（pIG121Hm）で
も両品種ともGUS活性を示す組織が認められたが、コシ
ヒカリではその率は30％程度と低かった。ヘルパープラ
スミドに強病原性のvirを持つEHA101（pIG121Hm）では
コシヒカリの導入率はやや上昇した。バイナリーベクタ
ーに強病原性のvirを持つLBA4404（pTOK232）ではコシ
ヒカリでも月の光と同様に95％以上の組織でGUS活性が
認められた（表３）。さらに、GUS活性を示すそれぞれ
の組織での青色領域の面積に関しては、LBA4404（pTOK2
32）で最も大きく、高い導入率を示すことが観察され
た。

（14）菌系の違いによる選抜効率（ハイグロマイシン耐
性カルス） 上項と同じ３つの菌系を用いて、月の光、コシヒカリ
の胚盤カルスとの共存培養後のハイグロマイシン抵抗性
カルスの選抜率に関する比較を行った。抵抗性カルスの
出現率に関してはLBA4404（pTOK232）が最も高く、抵抗
性カルスの選抜率に関する品種間差異は認められなかっ
た（表４）。LBA4404（pIG121Hm）あるいはEHA101（pIG
121Hm）の２つの菌系では、選抜率は低く、さらに培養
困難なコシヒカリではハイグロマイシン抵抗性カルスの
出現は２％程度にとどまった。従って、イネの形質転換
に用いるアグロバクテリウムとしてはバイナリーベクタ
ーに強病原性のvir遺伝子の一部を持つLBA4404（pTOK23
2）が最も優れていると判定される。

（15）ハイグロマイシン耐性形質転換体におけるGUS遺
伝子の発現様式 このようにして得られた抵抗性カルスをさらに２次選
抜にかけ、抵抗性カルスから個体を再生させた。再分化
用の培地N6S3にハイグロマイシンを添加した区と無添加
の区を設定したが、無添加の場合には、GUS活性がない
個体あるいはキメラ状に活性を示す個体が多数出現し
た。しかし、再分化培地にハイグロマイシンを添加した
場合はこのような個体は大幅に減少し、個体全体でGUS
活性を示す再生個体が増加した（表５、表６、表７）。
なお、アグロバクテリウムで処理しなかった場合には、
ハイグロマイシン抵抗性あるいはGUS活性を示す個体は
得られなかった。従って、このようなハイグロマイシン
抵抗性カルスから再生したGUS活性を全面に示す個体は
形質転換体と考えられる。

（16）形質転換体の倍数性および種子稔性 得られた形質転換体は、温室内で栽培することにより
正常な生長を示し、外観から４倍体や奇形を示す個体は
全く認められなかった。種子稔性についても、一部に部
分不稔や完全不稔を示す個体もみられたが、大部分の個
体がほぼ正常な稔性を示した。

（17）形質転換当代および次世代における導入遺伝子の
発現と分析 形質転換体の全DNAをHind IIIで切断したDNA断片に対
して、HPT遺伝子をプローブとしたサザン法により形質
転換体当代における導入遺伝子の検出を行った。その結
果、供試した全ての個体で１〜数コピーの導入遺伝子の
存在が認められた（表8,表９）。プラスミドpTOK232の
中ではHPT遺伝子を含むHind III断片は5.5Kbであるのに
対し、供試したすべての形態転換体には、約6Kb以上の
バンドが認められた。このことは、Ｔ−DNAが植物染色
体へ組み込まれたことを裏付けるものである。なお、検
出されたDNA断片の長さが個体で各々異なっていたこと
は、イネの染色体への遺伝子導入箇所がそれぞれ異なる
ことを示すものであり、植物体内でのバクテリアの残存
によるものではないことが確認された。

形質転換次世代個体のハイグロマイシン抵抗性を調査
したところ、対照品種の種子では、ほとんど発芽を示さ
ないかもしくは発芽後の生長は著しく阻害された。これ
に対し、形質転換体から得られた種子の多くは、正常な
発芽と生長を示した（表8,表９）。また、これらのハイ
グロマイシン抵抗性個体は、GUS遺伝子の発現も認めら
れた。多くの系統ではハイグロマイシン抵抗性、GUS遺
伝子の発現ともに１因子分離にほぼ適合する遺伝的分離
を示した。表８における“朝の光”の形質転換系統１−
２および３−２は、分離比から２因子以上の導入遺伝子
の存在が推測されるが、サザン解析の結果も２因子分離
に適合していた。表８の２−１の形質転換個体では、２
コピーの導入遺伝子の存在を確認したが、このうちの一
本のバンドは5Kbより短い断片であり、Ｔ−DNAが不完全
な形で組み込まれたものと推測される。従って、この個
体は次世代でハイグロマイシン抵抗性について１因子様
の分離を示したものと考えられる。

表９では“月の光”の形質転換系統の多くが、次世代
でハイグロマイシン抵抗性およびGUS遺伝子の発現につ
いて１因子様の分離を示した。しかし、当代のサザン分
析では一部の個体が１コピーであったほかは、複数のコ
ピー数を示した。形質転換当代のサザン分析により、導
入遺伝子が１コピーであった18aおよび２コピーであっ
た16cの次世代２系統について、GUS陽性、GUS陰性、ハ
イグロマイシン抵抗性の各個体を２個体づつ供試し、サ
ザン分析を行った。その結果、GUS陰性の個体を除くす
べての個体で、形質転換当代の個体と同一のバンドが検
出され、導入遺伝子が形質転換次世代に遺伝しているこ
とが示された。２コピーの導入遺伝子を持つ系統16cに
ついても、GUS陽性およびハイグロマイシン抵抗性の各
次世代個体で、いずれも同一な２コピーの導入遺伝子を
有していたことは、同一の染色体または遺伝子座に複数
の遺伝子が組み込まれたことを示唆するものである。

これらの結果は、アグロバクテリウムによりイネに導
入された遺伝子が、植物細胞の核に組み込まれ、メンデ
ルの法則に従って、後代に遺伝したことを示すものであ
る。

実施例２ （１）トウモロコシ品種 トウモロコシ品種A188,F1（A188x Black Mexican Swe
et）,F1（A188x B73Ht）,F1（B73Ht x A188）,F1 P3732
を材料として選定した。A188,Black Mexican Sweet,B73
Htのいずれの各品種は農林水産省生物資源研究所から、
また、P3732は磐田酪農協同組合から各々入手した。

（２）生長点近傍組織の調製 完熟種子を70％エタノールに１分間、１％次亜塩素酸
ナトリウムに５分間浸漬した。滅菌水で３回洗浄後、LS
固体培地（Linsmaier and Skoogの無機塩およびビタミ
ン類;Linsmaier,E.and Skoog,F.1965;Physiol.Plant18:
100−127、100mg/lカザミノ酸、700mg/lプロリン、20g/
lショ糖、2.3g/lゲルライト）に置床した。25℃、暗黒
下で４日間培養後、発芽した幼苗から頂端***組織を含
む約0.1 x 0.3mmの組織を切り出し以下の実験に供試し
た。

（３）未熟胚由来カルスの調整 未熟胚をLSD1.5固体培地（Linsmaier and Skoogの無
機塩およびビタミン類、100mg/lカザミノ酸、700mg/lプ
ロリン、1.5mg/l 2,4−Ｄ、20g/lショ糖、2.3g/lゲルラ
イト）に置床した。３週間培養後、形成された胚盤由来
カルスを以下の実験に供試した。

（４）アグロバクテリウムの菌系 実施例１に示したアグロバクテリウムの菌系のうち、
LBA4404（pTOK232）およびEHA101（pIG121Hm）を用い
た。

（５）アグロバクテリウム懸濁液の調整 ハイグロマイシン（50mg/l）とカナマイシン（50mg/
l）を含むAB培地上で３〜10日間培養したアグロバクテ
リウムのコロニーを白金耳でかきとり、実施例１に示し
た修正AA培地に懸濁し、菌濃度を３〜５×10⁹細胞/mlに
調整し接種に用いた。

（６）生長点近傍組織への接種、培養条件 切り出した組織をガラス針で穿刺後、上述のアグロバ
クテリウム懸濁液に３〜10分間浸漬した。浸漬処理後、
100μＭアセトシリンゴン、20g/lショ糖、10g/lグルコ
ースを含む修正LS固体培地（Linsmaier and Skoogの無
機塩類、Murashige and Skoogのビタミン類;Murashige,
T.and Skoog,F.1962;Physiol.Plant.15:473−497、0.1m
g/lカイネチン、1.0kg/lカザミノ酸、2.3g/lゲルライ
ト）に移植し、25℃、照明下で２〜３日間培養した。そ
の後、250mg/lセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、
同濃度のセフォタキシムを含むLS固体培地で培養を続け
た。

（７）カルスへの接種、培養条件 カルスを前述のアグロバクテリウム懸濁液に約５分間
浸漬後、実施例１に示したアセトシリンゴンを含む2N6
固体培地に移植し、25℃、暗黒下で３日間共存培養をお
こなった。その後カルスを250mg/lセフォタキシムを含
む滅菌水で洗浄し、同濃度のセフォタキシムおよび30mg
/lハイグロマイシンを含むLSD1.5固体培地で培養を続
け、系質転換カルスの選抜を行った。

（８）GUS活性の調査方法 共存培養処理直後の茎頂組織およびカルス、その後培
養を継続した茎頂組織およびカルスについて実施例１の
方法にもとづきGUS活性を調査した。

（９）茎頂組織への遺伝子導入 Gouldらの報告（Gould J.,et al.1991;Plant Physio
l.95:426−434）による生長点組織（茎頂組織）を材料
とした形質転換が可能である事を確認するため、前述の
アグロバクテリウム菌系EHA101（pIG121Hm）を単離した
茎頂組織に処理し、生長した植物体でのGUS活性を調査
した。アグロバクテリウム非処理の組織では、いずれも
GUS遺伝子の発現はみられなかったが、アグロバクテリ
ウム処理した組織では針で穿刺した部分にGUS遺伝子の
発現が小さな点状に認められた。しかし、その後培養を
続けた植物体でGUS活性を調査したところ、GUS遺伝子の
発現を示すものは全くなかった。生長点近傍は非常に微
細な組織であり、そこに穿刺しアグロバクテリウムを感
染させることは容易でない。本実験の結果から生長点近
傍へのアグロバクテリウムによる形質転換には生長点の
切り出し、穿刺などに熟練した技術が必要であると考え
られた。

（10）トウモロコシの品種および供試菌系による遺伝子
導入効率の違い 供試したいずれの品種でも高頻度でGUS遺伝子の発現
がみられた。EHA101（pIG121Hm）、LBA4404（pTOK232）
の菌系間での遺伝子発現効率の差は認められなかった
（表10）。処理カルスに対するGUS染色部位の大きさも1
0％以上のものが多く、広範囲の細胞で遺伝子発現が示
された。供試したアグロバクテリウムのバイナリベクタ
ーpIG121HmおよびpTOK232はGUS遺伝子中にヒマのイント
ロンが介在しているため、アグロバクテリウムの細胞の
中ではGUS遺伝子を発現しない。このことから、トウモ
ロコシのカルスにおいて認められたGUS遺伝子の発現
は、アグロバクテリウムにより高頻度で遺伝子導入が行
われたことを示すものである。共存培養後、ハイグロマ
イシンを含む固体培地上で培養することにより、供試カ
ルスの一部でコンパクトでこぶ状のカルスが増殖した。
増殖した細胞はGUS遺伝子の発現を示したことから、形
質転換細胞であると考えられる。これらのコンパクトで
こぶ状の形質転換カルスはLupottoらの方法（Lupotto,
E.and Lusardi,M.C.1988;Maydica XXXIII:163−177）に
より再分化可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開91／2071（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／9696（ＷＯ，Ａ１) ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，８ （1990）Ｐ．33−38 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，88（1991）Ｐ．10426− 10430 Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｓ，９（1990）Ｐ．303−306 育雑，44［別１］（1994）Ｐ．52

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】所望の遺伝子を含有するアグロバクテリウ
   ム属細菌で単子葉植物の脱分化過程にある培養組織又は
   脱分化した培養組織を形質転換することから成る単子葉
   植物の形質転換方法。
2. 【請求項２】前記単子葉植物がイネ科植物である請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】前記単子葉植物がイネである請求項１記載
   の方法。
4. 【請求項４】前記の単子葉植物がトウモロコシである請
   求項１記載の方法。
5. 【請求項５】前記アグロバクテリウム属細菌は、Tiまた
   はRiプラスミドを持つアグロバクテリウム属細菌であっ
   て、Agrobacterum tumefaciensのTiプラスミドpTiBo542
   のヴィルレンス領域由来のDNA断片を含むプラスミドを
   導入したアグロバクテリウム属細菌である請求項１ない
   し４いずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】前記DNA断片を含むプラスミドはpTOK162又
   はその誘導体である請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】前記アグロバクテリウム属細菌は、Agroba
   cterium tumefaciensである請求項１ないし６のいずれ
   か１項に記載の方法。
8. 【請求項８】形質転換操作に用いるアグロバクテリウム
   属細菌の菌濃度が10⁶〜10¹¹細菌/mlである請求項１ない
   し７のいずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】前記の培養組織を酵素処理や傷つけるなど
   の前処理を行わず形質転換に供する請求項１ないし８の
   いずれか１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記の培養組織を形質転換に供試した
    後、脱分化過程または脱分化状態で形質転換細胞または
    形質転換組織を選抜する請求項１ないし９のいずれか１
    項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記脱分化過程にある培養組織は、外植
    片を脱分化誘導培地に置床後７日以上のカルス形成過程
    にある培養組織である請求項１ないし９のいずれか１項
    に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記培養組織が単子葉植物の体細胞由来
    の培養組織である請求項１ないし11のいずれか１項に記
    載の方法。
13. 【請求項１３】培養組織が正常な個体を再生する能力を
    有する組織である請求項１ないし12のいずれか１項に記
    載の方法。