JP2623325B2 - Immunoassay reagents - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫分析用試薬、更に詳細には、試料中に存
在する特定の抗原又は抗体を簡単な操作で、感度よく測
定することのできる免疫分析用試薬に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention provides a reagent for immunoassay, and more specifically, a specific antigen or antibody present in a sample can be measured with a simple operation with high sensitivity. The present invention relates to a reagent for immunoassay.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は各種内分泌疾患
の臨床診断等において極めて重要であり、種々の測定法
が知られている。その中でも、近年、マーカーを封入さ
せたリポソームを調製してこれに抗原又は抗体を感作さ
せ、この感作リポソームを検体と共存させてリポソーム
に共有結合している抗原又は抗体と検体中の抗体又は抗
原と反応させて抗原抗体複合体を形成し、この複合体を
特異的に破壊させてリポソームから流出するマーカーを
測定し、一方上記と同様の感作リポソームを種々既知量
の抗原又は抗体と共存させ、且つ上記と同様に流出マー
カーを測定して標準検量線を予め作成しておき、検体に
関する上記測定結果を上記標準検量線と照合させて、抗
体又は抗原を定量する方法が提案されており、この方法
は操作が簡単な点で注目をあびている。An immunoassay utilizing an antigen-antibody reaction is extremely important in clinical diagnosis of various endocrine diseases and the like, and various assays are known. Among them, in recent years, a liposome encapsulating a marker has been prepared and sensitized to an antigen or antibody, and the antigen or antibody covalently bonded to the liposome and the antibody in the sample have been sensitized with the sensitized liposome. Or reacting with an antigen to form an antigen-antibody complex, measuring the marker that specifically disrupts this complex and flows out of the liposome, while sensitizing liposomes similar to those described above with various known amounts of antigen or antibody. A method has been proposed in which a standard calibration curve is prepared in advance by coexisting, and measuring an outflow marker in the same manner as described above, and comparing the measurement result regarding the sample with the standard calibration curve, to quantify an antibody or an antigen. This method has attracted attention because of its simple operation.

〔発明が解決しょうとする課題〕[Problems to be solved by the invention]

上記方法に使用される感作リポソームは、リポソーム
の表面に抗体又は抗原を、例えば、Ｎ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（SPDP）、
Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）
ブチレート（SMPB）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−
マレイミドフェニル）アセテート（SMPA）、Ｎ−スクシ
ンイミジル４−（ｐ−マトレイミドフェニル）プロピオ
ネート（SMPP）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキ
シ）スクシンイミド（GMBS）及びＮ−（ε−マレイミド
カプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）等の二官能
試薬を架橋剤として用いて固定したものである。そして
また、本発明者は、抗体を温和な条件で過ヨウ素酸で酸
化し、次いでこれをヒドロキシアミノ基、ヒドラジノ
基、ウレイド基、又はアミノ基を有する化合物を含有す
るリポソームに結合させて感作リポソームを得る方法
（以下、「過ヨウ素酸法」と称する）を見出し、先に特
許出願した。The sensitized liposome used in the above method comprises an antibody or antigen on the surface of the liposome, for example, N-succinimidyl 3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP),
N-succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl)
Butyrate (SMPB), N-succinimidyl 4- (p-
(Maleimidophenyl) acetate (SMPA), N-succinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) propionate (SMPP), N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide (GMBS) and N- (ε-maleimidocaproyloxy) It is immobilized using a bifunctional reagent such as succinimide (EMCS) as a crosslinking agent. Further, the present inventors oxidized the antibody with periodic acid under mild conditions, and then sensitized the antibody by binding it to a liposome containing a compound having a hydroxyamino group, a hydrazino group, a ureido group, or an amino group. A method for obtaining liposomes (hereinafter, referred to as "periodic acid method") was found, and a patent application was previously filed.

しかしなら、上記以外の固定化法、例えば、カルボジ
イミド法、カルバミル化法、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドパルミチン酸エステル等の活性エステルを用いる方
法等によって固定化した感作リポソームの場合には、リ
ポソームの表面上で抗原抗体反応が生起しているにもか
かわらず、充分に補体を活性化することができないた
め、充分なマーカーリリースが得られず、上記の免疫測
定法に使用できなかった。However, in the case of a sensitized liposome immobilized by an immobilization method other than the above, for example, a carbodiimide method, a carbamylation method, a method using an active ester such as N-hydroxysuccinimide palmitate, etc. However, despite the occurrence of an antigen-antibody reaction, the complement could not be sufficiently activated, and thus a sufficient marker release could not be obtained, and the enzyme could not be used in the above immunoassay.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

斯かる実情において、本発明者は鋭意研究を行なった
結果、ハプテン化リン脂質を配合して構成したリポソー
ムに抗体又は抗原を固定化すれば、補体活性が向上し、
何れの固定化法によって得られた感作リポソームでも上
記免疫測定法に使用できることを見出し、本発明を完成
した。Under such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies and as a result, if an antibody or antigen is immobilized on a liposome composed of a haptenated phospholipid, complement activity is improved,
The present inventors have found that sensitized liposomes obtained by any of the immobilization methods can be used in the above immunoassay, and completed the present invention.

すなわち、本発明は、リン脂質、ハプテン化リン脂質
及びコレステロールを主要構成成分とするリポソームの
表面に抗体又は抗原を固定し、かつリポソーム内に親水
性標識物質を封入したことを特徴とする免疫分析用試薬
を提供するものである。That is, the present invention provides an immunoassay characterized in that an antibody or antigen is immobilized on the surface of a liposome containing phospholipids, haptenated phospholipids and cholesterol as main components, and a hydrophilic labeling substance is encapsulated in the liposome. To provide a reagent for use.

本発明のリポソームは、従来一般に使用されているリ
ン脂質、コレステロールとハプテン化リン脂質によって
構成される。The liposome of the present invention is composed of conventionally used phospholipids, cholesterol and haptenated phospholipids.

ハプテン化リン脂質としては、トリニトロフェニル
（TNP）−アミノカプロイル（Cap）−Ｌ−α−ジパルミ
トイルホスファチジルエタノールアミン（DPPE）、ジニ
トロフェニル（DNP）−DPPE、DNP−Cap−DPPE、フルオ
レッセインチオカルバミル（Fl）−DPPE、アゾベンゼン
アルソネート（ABA）−チロシル（Tyr）−DPPE、ダンシ
ル（DNS）−DPPE、４−ジメチルアミノ−アゾベンゼン
−４′−スルホニル（DABS）−DPPE、マレイミドベンゾ
イル（MB）−DPPE、ジチオピリジル（DTP）−DPPE等が
挙げられる。Haptenized phospholipids include trinitrophenyl (TNP) -aminocaproyl (Cap) -L-α-dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dinitrophenyl (DNP) -DPPE, DNP-Cap-DPPE, fluorescein Inthiocarbamyl (Fl) -DPPE, azobenzene arsonate (ABA) -tyrosyl (Tyr) -DPPE, dansyl (DNS) -DPPE, 4-dimethylamino-azobenzene-4'-sulfonyl (DABS) -DPPE, maleimidobenzoyl (MB) -DPPE, dithiopyridyl (DTP) -DPPE and the like.

本発明のリポソームの主要構成成分のリン脂質とコレ
ステロールは約1:1（モル比）が好ましい。またハプテ
ン化リン脂質はリン脂質１モルに対し0.005〜0.1モルで
あることが必要であり、これより少ないと補体の活性化
が不十分であり、またこれを超えて配合すると補体活性
が強くなりすぎて、試料中の不純物によってリポソーム
が破壊されてしまうので、正確な測定を行うことができ
ない。The ratio of phospholipid and cholesterol as main components of the liposome of the present invention is preferably about 1: 1 (molar ratio). The haptenated phospholipid must be present in an amount of 0.005 to 0.1 mol per 1 mol of the phospholipid. If the amount is less than this, complement activation is insufficient. Since the liposome is so strong that impurities in the sample destroy the liposome, accurate measurement cannot be performed.

リポソーム内に封入される標識物質は、親水性であっ
て、リポソーム外に溶出された際に定量可能な物質でな
ければならない。かかる物質としては、例えば、高濃度
では自己消光により蛍光は示さないが、低濃度（10^-3M
以下）で非常に強い蛍光を発するカルボキシフルオレセ
インのような蛍光性化合物；リポソーム外で酸化反応に
より発行するルミノールやルシフェリンのような発光性
化合物；可視部あるいは紫外部に特異的な吸収帯を有す
る吸光性化合物（水溶性色素等）；酸化酵素の作用によ
り分解され酸素消費あるいは過酸化水素生成をもたらす
グルコース及びシュークロースなどの糖類；テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合
物；ニコチンアミドアデニジンヌクレオチド（NAD）の
ような補酵素類；メチルピオロゲンを初めとするラジカ
ル化合物などが望ましい。しかしながら、酵素類は本発
明においては標識物質として使用しない。これらの化合
物は、検出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子
を勘案した上で、適宜に選択される。The labeling substance encapsulated in the liposome must be hydrophilic and can be quantified when eluted out of the liposome. Such a substance, for example, does not show fluorescence due to self-quenching at a high concentration, but has a low concentration (10 ⁻³ M
A fluorescent compound such as carboxyfluorescein which emits very strong fluorescence in the following); a luminescent compound such as luminol or luciferin which is generated by an oxidation reaction outside the liposome; an absorption having a specific absorption band in the visible or ultraviolet region. Saccharides such as glucose and sucrose which are decomposed by the action of oxidase to cause oxygen consumption or hydrogen peroxide production; relatively large ionic compounds such as tetrapentylammonium; nicotinamide adenidine Coenzymes such as nucleotides (NAD); radical compounds such as methylpiologen are desirable. However, enzymes are not used as labeling substances in the present invention. These compounds are appropriately selected in consideration of factors such as a detection method, sensitivity, and liposome stability.

本発明の免疫分析用試薬は、例えば次の方法で製造さ
れる。まず、リン脂質、ハプテン化リン脂質、コレステ
ロール、更に必要に応じて、抗体又は抗原と結合し得る
官能基を有する化合物、例えばDPPE、ヒドラジン化合
物、ヒドロキシルアミン化合物、ヒドラゾン化合物を加
え、Vortexing法によってリポソームを調製する。具体
的には、上記混合物に溶媒を加えて反応させた後、溶媒
を留去し、吸引乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成
されたフラスコ内に所定の標識物質の水溶液を加え、密
栓をして振とうし、リポソームの懸濁液を得る。The immunoassay reagent of the present invention is produced, for example, by the following method. First, a phospholipid, a haptenated phospholipid, cholesterol, and, if necessary, a compound having a functional group capable of binding to an antibody or an antigen, such as DPPE, a hydrazine compound, a hydroxylamine compound, and a hydrazone compound, are added to the liposome by the Vortexing method. Is prepared. Specifically, after a solvent is added to the above mixture to cause a reaction, the solvent is distilled off, followed by suction drying. Thereafter, an aqueous solution of a predetermined labeling substance is added to a flask having a thin film formed on the wall surface, and the flask is sealed and shaken to obtain a liposome suspension.

一方、抗体又は抗原は、過ヨウ素酸法の場合には、抗
体の分子中の糖鎖水酸基のみがホルミル基に酸化される
ような温和な条件で、過ヨウ素酸等を用いて酸化して修
飾抗体とする。またＮ−ヒドロキシスクシンイミドパル
ミチン酸エステル（NHSP）等の活性エステル法の場合に
は、抗原又は抗体と当該活性エステルをインキュベート
して修飾抗体とする。On the other hand, in the case of the periodate method, the antibody or antigen is modified by oxidation with periodate or the like under mild conditions such that only the sugar chain hydroxyl groups in the antibody molecule are oxidized to formyl groups. Antibody. In the case of the active ester method such as N-hydroxysuccinimide palmitate (NHSP), a modified antibody is obtained by incubating the active ester with an antigen or antibody.

最後に、リポソームと修飾抗体とを緩衝液中で反応せ
しめることにより、本発明の免疫分析用試薬が得られ
る。かかる試薬は、通常、標識物質を内包し、表面に抗
体又は抗原が固定化されたマイクロカプセルとして得ら
れる。Finally, the liposome and the modified antibody are reacted in a buffer to obtain the immunoassay reagent of the present invention. Such a reagent is usually obtained as a microcapsule containing a labeling substance and having an antibody or antigen immobilized on the surface.

本発明の免疫分析用試薬を用いる検体試料中の抗原又
は抗体の定量は例えば次のようにして行なわれる。ま
ず、該試薬、抗原又は抗体を含む試料及び補体を適当な
緩衝液（例えば、ゼラチン−ベロナール緩衝液）中で混
合し、抗原−抗体と補体との結合反応を引き起こさせ
る。すると、かかる反応量に比例して、リポソーム内か
ら標識物質が放出されてくる。次いで、この標識物質に
応じた分析方法（例えば、標識物質が蛍光物質であれ
ば、蛍光分析法）により定量を行い、例えば、予め作成
した検量線により、試料中の抗体又は抗原の量を測定す
ることができる。The quantification of an antigen or an antibody in a specimen sample using the immunoassay reagent of the present invention is performed, for example, as follows. First, a sample containing the reagent, antigen or antibody and complement are mixed in a suitable buffer (eg, gelatin-veronal buffer) to cause a binding reaction between the antigen-antibody and complement. Then, the labeling substance is released from the liposome in proportion to the reaction amount. Next, quantification is performed by an analysis method corresponding to the labeling substance (for example, if the labeling substance is a fluorescent substance, a fluorescent analysis method), and for example, the amount of the antibody or antigen in the sample is measured by a calibration curve prepared in advance. can do.

定量操作において使用する補体は、格別限定されない
が、通常、モルモット血清が用いられる。しかし、ウサ
ギ、マウス、ヒト等の血清を使用してもよい。The complement used in the quantitative operation is not particularly limited, but guinea pig serum is usually used. However, serum from rabbits, mice, humans, etc. may be used.

〔発明の効果〕〔The invention's effect〕

叙上の如く、ハプテン化リン脂質を構成成分としてリ
ポソームを調製した本発明免疫分析用試薬は、抗体又は
抗原の何れの固定化法によっても高い補体活性を示し、
高感度で被検試料中の抗原又は抗体を定量することがで
きる。As described above, the immunoassay reagent of the present invention in which a liposome is prepared using a haptenated phospholipid as a component shows a high complement activity by any method of immobilizing an antibody or an antigen,
The antigen or antibody in the test sample can be quantified with high sensitivity.

〔実施例〕〔Example〕

次に実施例を挙げて説明する。 Next, an example will be described.

実施例１ （ｉ）マーカー封入リポソームの調製： DPPC（10mM,100μ）、コレステロール（10mM,100μ
）、DTP−DPPE（1mM,なし、５μ、10μ又
は20μ）のクロロホルム溶解液を10mlフラスコに入
れ、溶媒のクロロホルムをエボパレータで揮散させれば
フラスコ内面にフィルム状物が付着形成される。このフ
ィルム状物を１〜２時間に亘り真空乾燥した後に、マー
カーとして用いられるカルボキシフルオレセインの0.1N
NaOH溶液100μを添加し、ボルテックスミキサーで５
〜10分間激しく撹拌する。Example 1 (i) Preparation of liposome encapsulating a marker: DPPC (10 mM, 100 μ), cholesterol (10 mM, 100 μ)
), A solution of DTP-DPPE (1 mM, none, 5 μ, 10 μ or 20 μ) in chloroform was placed in a 10 ml flask, and chloroform as a solvent was volatilized with an evaporator to form a film on the inner surface of the flask. After vacuum drying this film-like material for 1-2 hours, 0.1N of carboxyfluorescein used as a marker was used.
Add 100μ of NaOH solution and vortex 5 times
Stir vigorously for ~ 10 minutes.

次いで、過剰のカルボキシフルオレセインを10000×
Ｇで遠心除去すれば、カルボキシフルオレセインがマー
カーとして封入されたリポソーム（MLV型）が得られ
る。Then, excess carboxyfluorescein was added to 10,000 ×
After centrifugation at G, liposomes (MLV type) in which carboxyfluorescein is encapsulated as a marker can be obtained.

このリポソームは、0.01MのHEPES緩衝液（0.15M NaC
l、pH7.45）500μ中に懸濁させて保存しておく。The liposomes are prepared in 0.01M HEPES buffer (0.15M NaC
l, pH7.45) Suspend and store in 500μ.

（ii）修飾抗体の調製： 30mM NHSPのジメチルホルムアミド溶液10μを２％
オクチルグルコシド（界面活性剤,1ml）に加えた。これ
に更にヤギIgG（2mg/ml,1ml）を加え、37℃で16時間イ
ンキュベートとする。これをセファデックスＧ−50でゲ
ル濾過して界面活性剤を除去し、蛋白分画（1mg/ml）を
採取して修飾抗体とする。(Ii) Preparation of modified antibody: 10 mM dimethylformamide solution of 30 mM NHSP in 2%
Octyl glucoside (surfactant, 1 ml). To this, goat IgG (2 mg / ml, 1 ml) is further added and incubated at 37 ° C. for 16 hours. This was subjected to gel filtration with Sephadex G-50 to remove the surfactant, and a protein fraction (1 mg / ml) was collected to obtain a modified antibody.

（iii）リポソームの抗体感作； （ｉ）で得たリポソーム懸濁液500μに（ii）で得
た修飾抗体溶液（1mg/ml）500μを添加して、４℃で1
6〜20時間インキュベートし、遠心処理して本発明の免
疫分析用試薬である抗体感作リポソームを得た。(Iii) Antibody sensitization of liposome; 500 μ of the modified antibody solution (1 mg / ml) obtained in (ii) was added to 500 μ of the liposome suspension obtained in (i),
The mixture was incubated for 6 to 20 hours and centrifuged to obtain an antibody-sensitized liposome, which is a reagent for immunoassay of the present invention.

斯くして得た抗体感作リポソームは、1mlのゼラチン
−ベロナール緩衝液に懸濁して、４℃にて保存する。The antibody-sensitized liposome thus obtained is suspended in 1 ml of gelatin-veronal buffer and stored at 4 ° C.

（iv）ウサギ抗ヤギIgGによるリリースアッセイ： 希釈には、ゼラチン−ベロナール緩衝液（GVB^-）に0.
1mM MgCl₂及び0.03mM CaCl₂を添加した緩衝液（GVB⁺⁺）
を使用した。測定には、（iii）で調製した抗体感作リ
ポソーム保存液をGVB⁺⁺で300倍希釈して使用した。又、
モルモット補体は同様にGVB⁺⁺で１〜５単位になるよう
に希釈して用いた。測定は次の様に行なわれた。96穴マ
イクロプレートに、検体〔ウサギ抗ヤギIgG（×10²〜×
10⁷）〕25μを分中し、引き続き300倍希釈したリポソ
ーム懸濁液25μ、補体（３単位）25μの順で分注す
る。37℃,1時間反応させた後、補体反応を停止させるた
め、10mM EDTA含有ベロナール緩衝液100μを加える。
検体中の抗原量は、リポソームから放出されたカルボキ
シフルオレセイン量に比例するので、490nmで励起し、5
30nmのケイ光放出量を測定する。尚ケイ光強度は、界面
活性剤でリポソームを破壊して得られるケイ光量を100
％として、それに対するマーカーリリース％で表わし
た。(Iv) release assay with rabbit anti-goat IgG: the dilution, gelatin - veronal buffer (GVB ^-) to zero.
Buffer (GVB ⁺⁺ ) supplemented with 1 mM MgCl ₂ and 0.03 mM CaCl ₂
It was used. For the measurement, the antibody-sensitized liposome stock solution prepared in (iii) was diluted 300-fold with GVB ⁺⁺ and used. or,
Guinea pig complement was similarly diluted to 1-5 units with GVB ⁺⁺ and used. The measurement was performed as follows. The sample [rabbit anti-goat IgG (× 10 ^2- ×
10 ⁷ )] Dispense 25 μl, then dispense 25 μl of 300-fold diluted liposome suspension and 25 μ of complement (3 units) in this order. After reacting at 37 ° C. for 1 hour, 100 μm of veronal buffer containing 10 mM EDTA is added to stop the complement reaction.
Since the amount of antigen in the sample is proportional to the amount of carboxyfluorescein released from the liposome,
The fluorescence emission at 30 nm is measured. The fluorescence intensity was calculated by subtracting the amount of fluorescence obtained by breaking liposomes with a surfactant by 100.
As%, the marker release% was expressed.

その結果を第１図に示す。第１図中、曲線はDTP−D
PPE無添加、曲線は５μ添加、曲線は10μ添
加、曲線は20μ添加のものを示す。第１図に示す如
く、DTP−DPPEの添加によって補体活性が向上したこと
がわかる。The result is shown in FIG. In FIG. 1, the curve is DTP-D
PPE was not added, the curve shows 5 μ addition, the curve shows 10 μ addition, and the curve shows 20 μ addition. As shown in FIG. 1, it can be seen that complement activity was improved by the addition of DTP-DPPE.

実施例２ （ｉ）マーカー封入リポソームの調製： DPPC:コレステロール:DPPE:DTP−DPPEを1:1:0.1:（0,
0.005,0.01,0.02）で用いて実施例１の（ｉ）と同様に
してリポソームを得た。Example 2 (i) Preparation of marker-encapsulated liposomes: DPPC: cholesterol: DPPE: DTP-DPPE was mixed with 1: 1: 0.1: (0,
0.005, 0.01, 0.02) to obtain liposomes in the same manner as in Example 1 (i).

（ii）修飾抗体の調製： 抗CRP抗体（ヤギIgG分画）（4.6mg/ml,500μ）を0.
1M酢酸バッファー（pH4.0）を用いるセファデックスG25
のゲル濾過によりバッファー交換を行なった。得られた
タンパク分画1.6ml（4.3mg蛋白/ml）を分取し、これに
過ヨウ素酸ナトリウムを0.01Mとなるように加え、25℃
のウォーターバス中で30分放置した。次いで、反応物を
0.15M NaClを含む0.01M炭酸バッファー（pH9.2）を用
い、セファデックスG25でゲル濾過し、タンパク分画1ml
（約1.9mg蛋白/ml）を得た。(Ii) Preparation of modified antibody: Anti-CRP antibody (goat IgG fraction) (4.6 mg / ml, 500μ)
Sephadex G25 using 1M acetate buffer (pH 4.0)
The buffer was exchanged by gel filtration. 1.6 ml (4.3 mg protein / ml) of the obtained protein fraction was collected, and sodium periodate was added thereto to a concentration of 0.01 M.
Left in a water bath for 30 minutes. The reactants are then
Gel filtration using Sephadex G25 using 0.01M carbonate buffer (pH 9.2) containing 0.15M NaCl, 1 ml of protein fraction
(About 1.9 mg protein / ml).

（iii）リポソームの抗体感作： （ii）で得たタンパク分画（修飾抗体）に、（ｉ）で
得たリポソームペレットを加え、４℃で一昼夜転倒混和
した。次いで、GVB^-で遠心洗浄し、1ml GVB^-（0.1％NaN
₃含有）に懸濁してヤギIgG結合リポソーム（以下「抗CR
Pリポソーム」と略称する）を得た。(Iii) Antibody sensitization of liposome: The liposome pellet obtained in (i) was added to the protein fraction (modified antibody) obtained in (ii), and the mixture was inverted and mixed overnight at 4 ° C. Then, GVB ^- centrifuged washed with, 1ml GVB ^- (0.1% NaN
₃ containing goat IgG-bound liposomes (hereinafter “anti-CR
P liposome).

（iv）CRPの定量： 96穴マイクロプレートに、GVB⁺⁺で400倍希釈した抗CR
Pリポソーム25μ、精製CRP抗原25μを加え、37℃で
１時間インキュベートする。これに100倍希釈した抗CRP
抗体（ウサギ血清）25μ、補体（4CH₅₀）25μを加
え37℃で１時間インキュベートした。以下実施例１の
（iv）と同様にして補体反応を停止させ、ケイ光放出量
を測定して、マーカーリリース％を求めた。(Iv) Quantitation of CRP: Anti-CR diluted 400 times with GVB ⁺⁺ in a 96-well microplate
Add 25μ of P liposome and 25μ of purified CRP antigen, and incubate at 37 ° C for 1 hour. 100-fold diluted anti-CRP
25 µ of antibody (rabbit serum) and 25 µ of complement (4CH ₅₀ ) were added and incubated at 37 ° C for 1 hour. Thereafter, the complement reaction was stopped in the same manner as in (iv) of Example 1, and the amount of fluorescence emission was measured to determine the marker release%.

その結果を第２図に示す。第２図中、曲線イはDTP−D
PPE無添加、曲線ロは0.005添加、曲線ハは0.01添加、曲
線ニは0.02添加のものを示す。The result is shown in FIG. In FIG. 2, curve A is DTP-D.
Curve B shows 0.005 addition, Curve C shows 0.01 addition, and Curve D shows 0.02 addition without PPE added.

実施例３ 実施例２の（ｉ）〜（iii）におけるDPPEの代りにε
−Cap−DPPEを用いる以外は同様にして抗CRPリポソーム
を得た。これを用いて実施例２の（iv）と同様に操作し
てマーカーリリース％を求めた。Example 3 Instead of DPPE in (i) to (iii) of Example 2,
An anti-CRP liposome was obtained in the same manner except that -Cap-DPPE was used. Using this, the marker release% was determined in the same manner as in Example 2 (iv).

その結果を第３図に示す。第３図中、曲線はDTP−D
PPE無添加、曲線は0.01添加、曲線は0.02添加のも
のを示す。FIG. 3 shows the results. In FIG. 3, the curve is DTP-D
The curve shows the case where no PPE was added, the curve shows the case where 0.01 was added, and the curve the case where 0.02 was added.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、実施例１で得た免疫分析用試薬を用いてウサ
ギ抗ヤギIgG抗体を測定したときのDTP−DPPE添加量とマ
ーカーリリースとの関係を示す図である。第２図は実施
例２で得た免疫分析用試薬を用いてCRP抗原を測定した
ときのDTP−DPPE添加量とマーカーリリースとの関係を
示す図である。第３図は実施例３で得た免疫分析用試薬
を用いてCRP抗原を測定したときのDTP−DPPE添加量とマ
ーカーリリースとの関係を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of DTP-DPPE added and marker release when a rabbit anti-goat IgG antibody was measured using the immunoassay reagent obtained in Example 1. FIG. 2 is a graph showing the relationship between the amount of DTP-DPPE added and the release of a marker when the CRP antigen was measured using the immunoassay reagent obtained in Example 2. FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of DTP-DPPE added and the release of a marker when the CRP antigen was measured using the immunoassay reagent obtained in Example 3.

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】リン脂質、ハプテン化リン脂質及びコレス
テロールを主要構成成分とするリポソームの表面に抗体
又は抗原を固定し、かつリポソーム内に親水性標識物質
を封入したことを特徴とする免疫分析用試薬。An immunoassay wherein an antibody or antigen is immobilized on the surface of a liposome containing phospholipids, haptenated phospholipids and cholesterol as main components, and a hydrophilic labeling substance is encapsulated in the liposome. reagent. 【請求項２】リン脂質１モルに対してハプテン化リン脂
質が0.005〜0.1モルである請求項１記載の免疫分析用試
薬。2. The reagent according to claim 1, wherein the haptenated phospholipid is present in an amount of 0.005 to 0.1 mol per mol of the phospholipid.