JP2619268B2 - New peptide sulfate derivatives - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医学的あるいは生理学的に有用な生理活性を
示す新規なペプチド誘導体に関する。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel peptide derivative exhibiting a medically or physiologically useful physiological activity.

〔背景技術〕(Background technology)

VIP（Vasoactive Intestinal Polypeptide）は1972年
セイド等により、消化管粘膜中に存在する血流増加、血
圧降下作用を有する物質として単離され〔S.I.Said and
V.Mutt;Eur.J.Biochm.,Vol.28,199（1972）〕、1973年
に製造決定されたポリペプチドである〔M.Bodanszky,Y.
S.Klansner and S.I.Said;Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.7
0,382（1973）〕。この物質は、28個のアミノ酸からな
る一本鎖のポリペプチドであって、次式で表わされるア
ミノ酸配列を有する。VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide) was isolated as a substance having an effect of increasing blood flow and lowering blood pressure existing in the gastrointestinal mucosa by 1972 and the like [SISaid and
V. Mutt; Eur. J. Biochm., Vol. 28, 199 (1972)], a polypeptide produced and determined in 1973 [M. Bodanszky, Y.
S. Klansner and SISaid; Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 7
0,382 (1973)]. This substance is a single-chain polypeptide consisting of 28 amino acids and has an amino acid sequence represented by the following formula.

His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr
−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Val−Lys
−Lys−Tyr−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−Asn−NH₂ このVIPは、その後の研究により脳内にも存在している
ことが明らかとなると共に、単に血流増加作用、血圧低
下作用のみならず呼吸促進作用、強心作用、血糖上昇作
用、抗アレルギー作用等、各種の作用を有することが明
らかにされている。しかしながらこのVIPを、そのまま
人を含めた、哺乳動物に投与する場合には、トリプシン
やキモトリプシンの様な各種酵素により分解されて了う
ため、その活性の発現時間が非常に短いという欠点を有
している。His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr
-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys
-Lys-Tyr-Leu-Asn- Ser-Ile-Leu-Asn-NH 2 The VIP is together that are also present in the brain Subsequent studies become apparent, simply blood flow increasing action, hypotensive It has been shown to have various effects such as a respiratory stimulating effect, a cardiotonic effect, a blood sugar increasing effect, an antiallergic effect, etc. as well as the effect. However, when this VIP is administered to mammals, including humans, as it is, it is degraded by various enzymes such as trypsin and chymotrypsin. ing.

〔M.P.Barrowcliffe,A.Morice,J.G.Jones and P.S.Seve
r;Thorar,Vol.41,88（1986）,G.H.Caughey,F.Leidig,N.
F.Viro and J.A.Nadel;J.Pharmacol.Exp.Ther.,Vol.24
4,No.1,133（1988）,C.W.Brook,R.B.Sewell,A.Shulkes
and R.A.Smallwood;Regul.Pept.,Vol.20,No.4,311（198
8）等〕。(MPBarrowcliffe, A. Morice, JG Jones and PSSeve
r; Thorar, Vol. 41, 88 (1986), GH Caughey, F. Leidig, N.
F. Viro and JANadel; J. Pharmacol.Exp.Ther., Vol. 24
4, No.1,133 (1988), CWBrook, RBSewell, A.Shulkes
and RASmallwood; Regul. Pept., Vol. 20, No. 4, 311 (198
8) etc.].

このVIPについては、その各種誘導体に関し、数多く
の報告がなされている。〔J.Fahrenkrug;Digestion Vo
l.19,149（1979）,S.I.Said;Gastrointestinal Hormone
s,245（1980）,S.I.Said;Peptides,Vol.5,143（1984）
等〕。Regarding this VIP, many reports have been made on various derivatives thereof. (J. Fahrenkrug; Digestion Vo
l.19,149 (1979), SISaid; Gastrointestinal Hormone
s, 245 (1980), SI Said; Peptides, Vol. 5, 143 (1984)
etc〕.

それらは、VIPのアミノ酸配列中のアミノ酸を別のア
ミノ酸に置換したもの、あるいは、短鎖ペプチドとした
ものについての報告であり、これらの誘導体において
は、VIPの欠点である酵素分解に対する抵抗性を高めた
例は見当らない。They report the substitution of an amino acid in the amino acid sequence of VIP for another amino acid, or the use of a short-chain peptide.These derivatives demonstrate resistance to enzymatic degradation, which is a disadvantage of VIP. I can't find any of the enhanced examples.

〔発明の開示〕[Disclosure of the Invention]

本発明者の１人森川は、先に、小橋等と共に、ペプチ
ド中のチロシン部位のみを特定の酵素を用いることによ
り選択的に硫酸エステル化する方法を見出し〔K.Kobash
i,D−H.Kim and T.Morikawa;J.Protein Chemistry Vol.
6,No.3.237（1987）〕、この酵素で、コレシストキニン
パンクレオザイミンを製造する方法を見出すことにも成
功した〔特開昭60-197699、特開昭62-295、特願昭62-23
5742参照〕。この酵素による硫酸エステル化方法は極め
て温和な条件で、ペピチド中のチロシン部位のみを特異
的に硫酸エステル化し得るという特徴を有するものであ
るが、この方法を使用してVIPの構造中に含まれるチロ
シンを温和な条件で容易に硫酸エステル化することに成
功した。こうして硫酸エステル化することによって得ら
れた新規なVIP誘導体は、VIPの欠点とされているキモト
リプシンに対する抵抗性がVIPに比し、著しく大きいこ
とが見出された。かくして本発明により、式（Ｉ） His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr
（X₁）−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Va
l−Lys−Lys−Tyr（X₂）−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−A
sn−NH₂ （Ｉ） （式中、Tyr（X₁）およびTyr（X₂）は、夫々独立して
Tyrにおける水酸基が硫酸エステル化しているか、又は
していないTyrを表わし、Tyr（X₁）およびTyr（X₂）の
うちの少なくとも一方は硫酸エステル化したTyrを表わ
す）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド誘導体ま
たはその付加塩が提供される。Morikawa, one of the present inventors, has previously found a method of selectively sulfate-forming only the tyrosine site in a peptide by using a specific enzyme together with Kobashi et al. [K. Kobash
i, D-H.Kim and T.Morikawa; J. Protein Chemistry Vol.
6, No.3.237 (1987)] and succeeded in finding a method for producing cholecystokinin pancreozaimine using this enzyme [Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 62-23
5742]. The method of sulfate esterification by this enzyme has the feature that, under extremely mild conditions, only the tyrosine site in the peptide can be specifically sulfated, but it is included in the structure of VIP using this method. Tyrosine was easily sulfated under mild conditions. The novel VIP derivative thus obtained by sulfate esterification was found to have significantly higher resistance to chymotrypsin, which is a disadvantage of VIP, as compared to VIP. Thus, according to the present invention, the formula (I) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr
(X ₁ ) -Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Va
l-Lys-Lys-Tyr ( X 2) -Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-A
sn-NH ₂ (I) (wherein Tyr (X ₁ ) and Tyr (X ₂ ) are each independently
Wherein the hydroxyl group in Tyr represents Tyr with or without sulfate esterification, and at least one of Tyr (X ₁ ) and Tyr (X ₂ ) represents sulfated Tyr). A peptide derivative or an addition salt thereof is provided.

本発明に係る新規なVIP誘導体を製造するための原料
であるVIPそれ自体は、いかなる方法によって製造した
ものでもよい。VIP itself, which is a raw material for producing the novel VIP derivative according to the present invention, may be produced by any method.

具体的には「ザ・ペプチド」第１巻（1966年）〔Schr
oder and Lnhke著、Academic Press New Tork,U.S.A.〕
「ペプチド合成の基礎と実験」〔泉屋信夫ら著、丸善株
式会社（1985年）〕に記載されるごときペプチド合成に
通常用いられる方法に従って製造することができる。こ
のペプチド合成にあたっては、当該分野で分類される液
相法、固相法さらには各種の組換えDNA法のいずれも、
適用することができる。Specifically, "The Peptide", Volume 1 (1966) [Schr
oder and Lnhke, Academic Press New Tork, USA)
It can be produced according to a method generally used for peptide synthesis as described in “Basic and Experimental Peptide Synthesis” [Nobuo Izumiya et al., Maruzen Co., Ltd. (1985)]. In synthesizing the peptide, any of a liquid phase method, a solid phase method, and various recombinant DNA methods classified in the field,
Can be applied.

実施例を含めて本明細書中全般にわたって使用されて
いる、アミノ酸およびその誘導体、あるいはこれらの構
造中に存在する基、反応試薬等を表現する各略号は以下
に例示列挙するとおり、ペプチド合成化学の分野におい
て慣用されている記号によったものである（IUPAC-IUB
Commission on Biological Nomenclature参照）。The abbreviations used throughout the present specification, including the examples, representing amino acids and derivatives thereof, or groups, reaction reagents, and the like present in these structures are as exemplified below. (IUPAC-IUB)
Commission on Biological Nomenclature).

Ala:アラニン、Ara:アルギニン、Asn:アスパラギン、As
p:アスパラギン酸、Gln:グルタミン、His:ヒスチジン、
Ile:イソロイシン、Leu:ロイシン、Lys:リジン、Met:メ
チオニン、Phe:フエニルアラニン、Ser:セリン、Thr:ス
レオニン、Tyr:チロシン、Val:バリン、PNS:p−ニトロ
フエニールスルフエート、PNP:p−ニトロフエノール。
前記の酵素法に使用する酵素としてはアリルスルフオト
ランスフエラーゼ活性を有するものであれば特に限定さ
れるものではないが、例えば小橋らがヒト腸内細菌より
見出した〔K.Kobashi,Y.Fukaya,D−H.Kim,T.Akao and
S.Takebe;Arch.Biochem.Biophys.,Vol.245,537（198
6）〕ユウバクテリウムレクテール（Eubacteriumrectal
e）菌の産生するアリルスルフオトランスフエラーゼ等
が使用される。Ala: Alanine, Ara: Arginine, Asn: Asparagine, As
p: aspartic acid, Gln: glutamine, His: histidine,
Ile: Isoleucine, Leu: Leucine, Lys: Lysine, Met: Methionine, Phe: Phenylalanine, Ser: Serine, Thr: Threonine, Tyr: Tyrosine, Val: Valine, PNS: p-Nitrophenylsulfate, PNP: p-Nitrophenol.
The enzyme used in the enzymatic method is not particularly limited as long as it has allyl sulfotransferase activity.For example, Kobashi et al. Found from human intestinal bacteria (K. Kobashi, Y. Fukaya, D-H. Kim, T. Akao and
S. Takebe; Arch. Biochem. Biophys., Vol. 245, 537 (198
6)] Eubacterium rectal
e) Allyl sulfotransferase produced by bacteria is used.

前記式（Ｉ）で表わされる新規なポリペプチドの付加
塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リ
ン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸
塩、コハク酸塩、乳酸塩、しゅう酸塩、酒石酸塩、ナト
リウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、アルミニウム塩、ピペリジン塩、モルホリン酸、ジ
メチルアミン塩、ジエチルアミン塩等をあげることがで
きる。Examples of the addition salt of the novel polypeptide represented by the formula (I) include hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, formate, acetate, propionate, malonate, and succinate. Acid salts, lactates, oxalates, tartrate salts, sodium salts, potassium salts, magnesium salts, calcium salts, aluminum salts, piperidine salts, morpholinic acid, dimethylamine salts, diethylamine salts and the like.

前述したとおり、VIPの最も大きな欠点は、生体に投
与した際に受ける酵素による分解でありその結果、短時
間に活性を失うということである。これに対し本発明に
係る新規なVIP−硫酸エステル誘導体は、その分解酵素
の１つであるキモトリプシン〔G.H.Caughey,F.Leidig,
N.F.Viro and J.A.Nadel;J.Pharmcol.Exp.Ther.,Vol.24
4 No.1,133（1988）〕に対する抵抗性が著しく大きいと
いう利点を有する。As described above, the biggest disadvantage of VIP is that it is degraded by enzymes when administered to a living body, and as a result, its activity is lost in a short time. On the other hand, the novel VIP-sulfuric acid ester derivative according to the present invention is chymotrypsin [GHCaughey, F. Leidig,
NFViro and JANadel; J.Pharmcol.Exp.Ther., Vol. 24
4 No. 1,133 (1988)].

以下に実施例により本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

実施例１ VIPモノ硫酸エステル誘導体の合成 VIP 2.2mg（6.6×10^-7モル）を0.1Mグリシン緩衝液0.
68mlに溶解する。50mM p−ニトロフエニルサルフエート
0.27ml、250mM MgCl₂0.68mlおよびアリルスルフオトラ
ンスフエラーゼ40U/mlを加える。0.1Mグリシン緩衝液
（pH8.6）で全量を6.8mlとした後、37℃で24時間反応さ
せる。反応液の1/4量を、高速液体クロマトグラフイー
〔カラム;Nucleosil 5C₁₈（ナーゲル社）（４×150m
m）〕にインジエクトし、アセトニトリル−0.1％トリフ
ルオロ酢酸水溶液（混合比10:90）から、アセトニトリ
ル−0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（混合比60:40）への
直線グラジエント法で溶出した（流速1ml/min）。23分
から25分の溶出液を分取し減圧下に溶媒を除去した。残
留分を0.1M−酢酸に溶解し上記カラムにインジエクト
し、アセトニトリル−0.1％トリフルオロ酢酸水溶液
（混合比26:74）で溶出した。8.0〜9.5分に溶出する、
メインピークを分取する。残りの反応液も同様に処理
し、同画分を合し、溶媒を除去する。残留分を0.1M酢酸
に溶解した後、凍結乾燥を行いVIPモノ硫酸エステルの
白色粉末0.93mgを得た。Example 1 Synthesis of VIP Monosulfate Derivative 2.2 mg (6.6 × 10 ⁻⁷ mol) of VIP was added to 0.1 M glycine buffer solution in 0.1 ml.
Dissolve in 68 ml. 50 mM p-nitrophenyl sulfate
Add 0.27 ml, 0.68 ml of 250 mM MgCl ₂ and 40 U / ml of allyl sulfotransferase. After adjusting the total volume to 6.8 ml with 0.1 M glycine buffer (pH 8.6), the reaction is carried out at 37 ° C. for 24 hours. 1/4 volume of the reaction solution was subjected to high performance liquid chromatography [column: Nucleosil 5C ₁₈ (Nagel) (4 × 150 m
m)], and eluted from acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (mixing ratio 10:90) to acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (mixing ratio 60:40) by a linear gradient method (flow rate 1 ml). / min). The eluate was collected for 23 to 25 minutes, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in 0.1 M acetic acid, injected into the column, and eluted with acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (mixing ratio 26:74). Eluting between 8.0-9.5 minutes,
Collect the main peak. The remaining reaction solution is treated in the same manner, the same fractions are combined, and the solvent is removed. The residue was dissolved in 0.1 M acetic acid and freeze-dried to obtain 0.93 mg of VIP monosulfate white powder.

比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼−243（0.1M AcOH）、6N・HCl、
110℃、24時間加水分解後のアミノ酸分析値 Asp 5.03（５）,Thr 2.04（２）,Ser 2.03（２）,Glu
1.16（１）,Ala 2.00（２）,Val 1.86（２）,Met 0.93
（１）,Tyr 1.97（２）,Phe 0.87（１）,His 1.28
（１）,Lys 2.98（３）,Arg 2.10（２）,Ile 0.97
（１）,Leu 2.91（３）。Specific rotation ▲ [α] ²⁵ _D ▼ -243 (0.1 M AcOH), 6N HCl,
Amino acid analysis value after hydrolysis at 110 ° C for 24 hours Asp 5.03 (5), Thr 2.04 (2), Ser 2.03 (2), Glu
1.16 (1), Ala 2.00 (2), Val 1.86 (2), Met 0.93
(1), Tyr 1.97 (2), Phe 0.87 (1), His 1.28
(1), Lys 2.98 (3), Arg 2.10 (2), Ile 0.97
(1), Leu 2.91 (3).

トリプシン＋アミノペプチダーゼＭ消化後のアミノ酸分
析値Tyr 0.92、Tyr（SO₃H）1.13。VIPと上記のVIPモノ
硫酸エステル誘導体をそれぞれトリプシン消化した後、
フラグメント１−12、21-28および22-28の高速液体クロ
マトグラムの挙動から、ここで得たVIPモノ硫酸エステ
ル誘導体は、22位のチロシンが硫酸エステル化された化
合物であることが同定された。Amino acid analysis values after digestion of trypsin + aminopeptidase M: Tyr 0.92, Tyr (SO ₃ H) 1.13. After trypsin digestion of VIP and the above VIP monosulfate derivative, respectively,
The behavior of the high performance liquid chromatograms of fragments 1-12, 21-28 and 22-28 identified that the VIP monosulfate derivative obtained here was a compound in which tyrosine at position 22 was sulfated. .

実施例２ VIPジ硫酸エステル誘導体の合成 実施例１の２回目の高速液体クロマトグラフイーにお
いて3.0〜4.0分に溶出する画分を集め、溶媒を留去、残
留分を0.1M酢酸に溶解した後、凍結乾燥を行いVIPジ硫
酸エステルの白色粉末0.11mgを得た。トリプシン＋アミ
ノペプチダーゼＭ処理後のアミノ酸分析Ala 2.0（２）
に対しTyr（SO₃H）2.2（２）。Example 2 Synthesis of VIP Disulfate Derivatives Fractions eluted at 3.0 to 4.0 minutes in the second high performance liquid chromatography of Example 1 were collected, the solvent was distilled off, and the residue was dissolved in 0.1 M acetic acid. The solution was freeze-dried to obtain 0.11 mg of VIP disulfate white powder. Amino acid analysis after trypsin + aminopeptidase M treatment Ala 2.0 (2)
Tyr (SO ₃ H) 2.2 (2).

試験例１ 酵素に対する安定性 実施例１で得られた0.5mM VIPモノ硫酸エステル誘導
体８μｌを0.1Mトリス緩衝液（pH7.6）30μｌに溶解
し、α−キモトリプシン（Type VII、シグマ社）0.1Uを
加え、37℃で30分間反応した。高速液体クロマトグラフ
イーにより、22位のチロシンと23位のロイシンの結合は
95％以上、残存していることが確認された。同条件でVI
Pを使用し、試験を行ったところ22位のチロシンと23位
のロイシンの結合は、完全に切断していることが確認さ
れた。Test Example 1 Stability to Enzyme 8 μl of 0.5 mM VIP monosulfate derivative obtained in Example 1 was dissolved in 30 μl of 0.1 M Tris buffer (pH 7.6) and 0.1 U of α-chymotrypsin (Type VII, Sigma) was added. Was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes. By high performance liquid chromatography, the binding of tyrosine at position 22 and leucine at position 23 was
It was confirmed that 95% or more remained. VI under the same conditions
A test was performed using P, and it was confirmed that the bond between tyrosine at position 22 and leucine at position 23 was completely cleaved.

試験例２ 生物活性 VIPとVIPモノ硫酸エステル誘導体のそれぞれの生物活
性を摘出したラツト胃の平滑筋を用いて比較した。セロ
トニンで収縮させた本標本に対してそれぞれ用量依存的
に弛緩作用を示した。両者の効力比を平行線検定法で求
めた結果、1:19（信頼区間5.8〜63.5）であった。Test Example 2 Biological Activity The biological activities of the VIP and VIP monosulfate derivatives were compared using the extracted rat stomach smooth muscle. Each of the specimens contracted with serotonin exhibited a relaxation effect in a dose-dependent manner. As a result of determining the efficacy ratio of both by the parallel line test method, it was 1:19 (confidence interval 5.8 to 63.5).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＣＥ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＤＰ ＡＣＪ ＡＢＰ ＡＤＰ ＡＣＥ ＡＥＥ ＡＥＥ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，70（２）（1973）Ｐ．382−384 Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，６（３）（1987）Ｐ．237−244──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical indication A61K 38/22 ACE A61K 37/24 ADP ACJ ABP ADP ACE AEE AEE (56) Reference Proc. Nat. Acad. Sc i. , 70 (2) (1973) p. 382-384 J.C. Protein Chemistry, 6 (3) (1987) p. 237-244

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】式（Ｉ） His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−Tyr
（X₁）−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Va
l−Lys−Lys−Tyr（X₂）−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−A
sn−NH₂ （Ｉ） （式中、Tyr（X₁）およびTyr（X₂）は、夫々独立してTy
rにおける水酸基が硫酸エステル化しているか、又はし
ていないTyrを表わし、Tyr（X₁）およびTyr（X₂）のう
ちの少なくとも一方は硫酸エステル化したTyrを表わ
す）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド誘導体ま
たはその付加塩。(1) Formula (I) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr
(X ₁ ) -Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Va
l-Lys-Lys-Tyr ( X 2) -Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-A
sn-NH ₂ (I) (wherein Tyr (X ₁ ) and Tyr (X ₂ ) are each independently Ty
the hydroxyl group in r represents sulfated or unsulfated Tyr, and at least one of Tyr (X ₁ ) and Tyr (X ₂ ) represents sulfated Tyr) A peptide derivative or an addition salt thereof.