JP2617946B2 - Coccidiosis vaccine - Google Patents

Abstract

Substantially purified Eimeria maxima gametocytes have been prepared and methods for their preparation are disclosed. A proteinaceous extract derived from the gametocytes comprises at least nine proteins of varying molecular weights. Vaccines for conferring upon a chicken active immunity against infection comprise an effective immunizing amount of Eimeria maxima gametocytes or gametocyte extract and a carrier. Also provided is a method if in vitro development of Eimeria spp. gametocytes or oocysts and a method of assaying drug or anti-gametocyte antibody effectivity on Eimeria spp. development in vitro.

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本明細書では種々の出版物の参照番号を括弧内にアラ
ビア数字で示した。これら参考文献は一覧表にして本明
細書に添付した。これら出版物の開示は、本明細書での
発明開示時点において当業者に知られている当該技術の
現状をより詳細に説明すべく、本明細書にそのまま包含
することとす。BACKGROUND OF THE INVENTION References to various publications are provided herein with Arabic numerals in parentheses. These references are tabulated and attached herein. The disclosures of these publications are incorporated by reference herein in order to more fully describe the state of the art known to those skilled in the art at the time of disclosure of the invention herein.

ニワトリのコクシジウム症（coccidiosis）として知
られている病気を起こす微生物はApicomplexa門、Sporo
zoa網、Coccidia亜科、Eucoccidia目、Eimeriorina亜
目、Eimeriidae科、Eimeria属に属する。Eimeria属には
多くの種があり、そのうちの或るものがニワトリの病因
となる。養鶏産業にとって重要な問題となる種はEimeri
a tenella、Eimeria maxima Eimeria acervulina、Ei
meria necatrix及びEimeria brunettiである。The disease-causing microorganism known as coccidiosis in chickens is the phylum Apicomplexa , Sporo
zoa network, Coccidia subfamily, Eucoccidia eyes, Eimeriorina suborder, Eimeriidae family, belonging to the genus Eimeria. There are many species of the genus Eimeria , some of which are pathogenic to chickens. Eimeri is an important species for the poultry industry
a tenella , Eimeria maxima Eimeria acervulina , Ei
meria necatrix and Eimeria brunetti .

コクシジウム症は、主に鶏舎の過密状態を薬剤耐性と
に起因して、過去20年の間に養鶏産業の大きな経済問題
となった。藁床上での過密状態のニワトリ飼育はコクシ
ジウムの成長及び繁殖にとって最適の条件を提供する。
このような状態では衛生管理が殆ど不可能であるため、
業者は抗コクシジウム剤の効果に頼らざるをえない。し
かしながら薬剤は常時飼料中に混入しておかなければな
らないためコストが極めて高くつき、薬剤によっては大
きな犠牲を伴う副作用をもたらす。また、薬剤耐性も大
きな問題となっている。これら薬剤の主要製造業者の一
部は、コクシジウム症を抑制する実現可能な方法が恐ら
くはワクチンの開発以外にないと認識するようになっ
た。Coccidiosis has been a major economic problem in the poultry industry over the past 20 years, mainly due to the overcrowding of the poultry house and drug resistance. Overcrowding of chickens on straw beds provides optimal conditions for coccidia growth and reproduction.
In such a state, hygiene management is almost impossible,
Traders have to rely on the effects of anticoccidial agents. However, the cost of the drug must be extremely high since the drug must always be mixed in the feed, and some drugs have side effects that are costly. In addition, drug resistance is also a major problem. Some of the major manufacturers of these drugs have come to realize that there is no feasible way to control coccidiosis, perhaps beyond vaccine development.

Eimeria原虫は腸管の粘膜中で複雑な生活環を送る。
この寄生虫は感染する種に関しても腸内での位置に関し
ても大きな特異性を示す。実際、感染の部位特異性は診
断の主要基準として使用されている。診断上の他のパラ
メータとしては、接合子嚢（oocyst）の大きさ及び形
状、感染した腸の特徴、体重減、ならびに皮膚の色素沈
着変化が挙げられる。 Eimeria parasites have a complex life cycle in the intestinal mucosa.
The parasite shows great specificity both for the species it infects and for its location in the gut. In fact, the site specificity of the infection has been used as a primary criterion for diagnosis. Other diagnostic parameters include oocyst size and shape, infected bowel characteristics, weight loss, and changes in skin pigmentation.

Eimeria生活環は節足動物ベクター（arthropodvecto
r）が無いことを除いてヘモスポリディア原虫（即ちマ
ラリア原虫）のそれに極めて類似している。接合子嚢は
藁床上で***して胞子になり、４つのスポロシスト（sp
orocyst）を生じる。各スポロシストは２つのスポロゾ
イト（sporozoite）を有する。これらのスポロシストは
ニワトリによって摂取され、スポロゾイトが砂嚢内での
接合子嚢の機械的粉砕とそれに次ぐ嚢壁のタンパク質分
解酵素による消化とによって放出される。スポロゾイト
は次いでリンパ球を侵襲し、続いて上皮細胞に侵入し、
そこで無性生殖期が開始される。この寄生虫は複製及び
***を２〜４サイクル繰り返し（***回数は各種毎に決
まっている）、多数のメロゾイトを産生する。メロゾイ
ト発生の最終サイクルが終了すると性周期が始まって、
大配偶子母細胞（macrogametocyte）（雌性）及び小配
偶子母細胞（microgametocyte）が生じる。大配偶子母
細胞は接合子嚢の壁の製造に関与する壁形成体の産生を
特徴とする。小配偶子母細胞は細胞内寄生虫の表面から
芽体となって分離する小配偶子の形成に関与する成分を
含む。小配偶子は鞭毛を有し、大配偶子の受胎（配偶子
合体）を生起させる。その結果接合体（zygote）が形成
され、これが前記壁形成体の融合と核の縮合（condensa
tion）とによって接合子嚢に成長する。接合子嚢は***
物中に隠れ、このようにして生活環が完了する。 The Eimeria life cycle is an arthropod vector (arthropodvecto
Very similar to that of Hemosporidia (i.e., malaria parasite) except for the absence of r). The oocysts divide on the straw bed into spores and form four sporocysts (sp.
orocyst). Each sporocyst has two sporozoites. These sporocysts are ingested by chickens, and sporozoites are released by mechanical disruption of the oocysts in the gizzard, followed by digestion of the sac wall with proteolytic enzymes. Sporozoites then invade the lymphocytes, and subsequently invade epithelial cells,
The asexual phase begins there. This parasite repeats replication and division for 2 to 4 cycles (the number of divisions is determined for each type) and produces a large number of merozoites. When the last cycle of merozoite development ends, the sexual cycle begins,
Large gameteocytes (female) and small gameteocytes (microgametocytes) result. Large gametocytes are characterized by the production of wall formers involved in the production of oocyst walls. The small gametocyte contains components involved in the formation of small gametes that separate as buds from the surface of the intracellular parasite. Small gametes have flagella and give rise to conception (gamete union) of large gametes. The result is the formation of a zygote, which fuses the wall former and condensates the nucleus.
) to grow into oocysts. The oocysts are hidden in the faeces, thus completing the life cycle.

Eimeriaに一度感染すると、その種の同一株による後
の再感染に対する防御効果が与えられ得る。この発見は
コクシジウム症に対する生ワクチンの製造の基本原理と
して使用された。総ての主要病原種から得た少数の接合
子嚢を水中に導入して（COCCIVAC^TM）又は水溶性多糖中
に封入して（英国特許第2,008,404A号）投与し、無症状
感染を生起させるのである。しかしながら、少数の接合
子嚢でもコクシジウム症が大発生したことがあるため、
業者は生きた病原寄生虫を鶏舎に入れたがらない。Once infected with Eimeria , it can provide a protective effect against subsequent re-infection by the same strain of the species. This finding was used as a basis for the production of a live vaccine against coccidiosis. A small number of oocysts from all major pathogens are introduced into water (COCCIVAC ^™ ) or encapsulated in water-soluble polysaccharide (GB 2,008,404A) and administered to produce asymptomatic infection It is. However, a small number of oocysts had a large outbreak of coccidiosis,
Traders do not want to put live pathogenic parasites in poultry houses.

生ワクチンに病原コクシジウムを導入する問題を解決
するために、幾つかの研究所は弱毒化生ワクチンの製造
を研究してきた。卵のエンブリオ（embryos）中で継代
（passasge）を繰り返すか又は早熟系列（precocious l
ines、即ち生活環を６日又は７日ではなく５日で終了す
る寄生虫）を分離することによって、大部分の主要種の
毒性の大幅に低下した非病原株が分離された。この方法
を使用すると十分な防御効果が観察されたが、それでも
まだ様々な問題、例えば生ワクチンの貯蔵寿命；弱毒化
系列の病原株への復帰突然変異；特にEimeria maxima
の場合の株変化；長期防御能力の欠如等の問題があるた
め、業者は生ワクチンを鶏舎に導入することに反対する
と思われる。これらの問題を抱えながらも、弱毒化生ワ
クチンはより決定的な非感染症のサブユニットワクチン
が開発されるまでは現場で使用され得よう。To solve the problem of introducing the pathogenic coccidial into live vaccines, several laboratories have studied the production of live attenuated vaccines. Repeat passasge in egg embryos or precocious l
By isolating ines (parasites whose life cycle ends in 5 days instead of 6 or 7 days), non-pathogenic strains with greatly reduced virulence of most major species were isolated. Although a sufficient protective effect was observed using this method, various problems still exist, such as the shelf life of the live vaccine; reversion of the attenuated line to the pathogenic strain; especially Eimeria maxima
Due to problems such as strain change in the case of L .; lack of long-term protective ability, it seems that vendors are opposed to introducing live vaccines into poultry houses. Despite these problems, live attenuated vaccines could be used in the field until more critical non-infectious subunit vaccines were developed.

サブユニットワクチンの分野では、生活環の細胞外時
期（スポロゾイト、メロゾイト並びに小配偶子及び大配
偶子）が免疫攻撃を最も受け易い。スポロゾイトは寄生
虫が接合子嚢から放出され、次いで余り時間をおかずに
内胞中でリンパ球中を侵襲した後の最初の発生段階にあ
たる。自然感染ではスポロゾイトに対する抗体の大きな
力価が発見され、この時期はワクチンの開発にとって最
も有望なものとみなされている。そこで、幾つかの研究
所はスポロゾイトワクチンの研究を推進してきた。In the field of subunit vaccines, the extracellular phases of the life cycle (sporozoites, merozoites and small and large gametes) are most susceptible to immune attack. Sporozoites are the first developmental stage after the parasites are released from the oocysts and then in a short time invade the lymphocytes in the endocysts. Large titers of antibodies to sporozoites have been found in natural infections, and this time is considered the most promising for vaccine development. Thus, several laboratories have been promoting research on sporozoite vaccines.

E. tennellaスポロゾイト抽出物及び粉砕した胞子化
接合子嚢の上澄みは、日齢７週間までのブロイラーを攻
撃感染（challenge infection）から防御することが判
明した（１）。モノクローナル抗体を使用した研究で
は、スポロゾイトを表面抗原に対するモノクローナル抗
体と共に予めインキュベートしてニワトリの排出腔に注
入すると、感染に対する部分的防御効果が得られること
が判明した。これらのモノクローナル抗体によって識別
された抗原はウェスターン法（Western blotting）で同
定され、そのうちの１つ、分子量25,000のタンパク質が
クローニング処理及びシーケンス処理にかけられた（欧
州特許公開第0,164,176号、公開日1985年12月11日）。
この抗原を攻撃感染に対して防御を与える免疫原として
テストした結果、部分的免疫が観察された。American C
yanamidもスポロゾイト表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を幾つか製造し、そのうちの幾つかがEimeria t
enella感染に対して部分的防御効果を示した（欧州特許
公開第0,135,712号、公開日1985年４月３日及び欧州特
許公開第0,135,073号、公開日1985年３月27日）。これ
らの実験で精製抗原が部分的防御効果しか示さなかった
理由は、Eimeria tenellaがその表面抗原を被覆（ca
p）し且つ落として捨てる（shed）ことができるという
宿主免疫攻撃の重要なメカニズムの発見にあり得る
（２）。従って、スポロゾイト時期は部分的防御を与え
得る幾つかの抗原を含み得ると考えられるが、完全な防
御がスポロゾイトワクチンのみの使用によって達成され
るとは思われない。 The extract of E. tennella sporozoites and the supernatant of the crushed sporulated oocysts were found to protect broilers from challenge infection up to 7 weeks of age (1). Studies using monoclonal antibodies have shown that pre-incubating sporozoites with monoclonal antibodies against surface antigens and injecting them into the cloaca of chickens provides a partial protective effect against infection. The antigens identified by these monoclonal antibodies were identified by Western blotting, and one of them, a protein having a molecular weight of 25,000, was subjected to cloning and sequencing (European Patent Publication No. 0,164,176, publication date 1985). December 11).
When this antigen was tested as an immunogen that provides protection against challenge infection, partial immunity was observed. American C
yanamid also produced several monoclonal antibodies against sporozoite surface antigens, some of which were Eimeria t
It showed a partial protective effect against enella infection (EP-A-0,135,712, published on April 3, 1985 and EP-A-0,135,073, published on March 27, 1985). The reason that the purified antigen showed only a partial protective effect in these experiments is that Eimeria tenella coated its surface antigen (ca
p) It may be in the discovery of an important mechanism of host immune attack that can be dropped and shed (2). Thus, although it is possible that the sporozoite phase may include some antigens that may provide partial protection, it is unlikely that full protection would be achieved by using a sporozoite vaccine alone.

Rose及びLongの幾つかの研究（３〜８）では、E．ten
ella又はE．maximaの感染から回復した鳥から採取した
血液が、これらの種による攻撃感染に対して受動防御
（passive protection）を与え得ることが発見された。
これらの血清はin vitroのスポロゾイトによる侵襲に対
する効果についてもテストされ、その結果in vitroスポ
ロゾイト中和とin vivo防御との間に相関関係のあるこ
とが判明した。しかしながらスポロゾイト又はメロゾイ
ト抽出物で免疫した鳥はE．tenella接合子嚢の経口感染
には耐性を示さず、これらの鳥の血清も未処理の鳥の感
染防御に使用することはできなかった（これらの血清は
スポロゾイト及びメロゾイトをin vitroで中和すること
ができたにも拘わらずである）。In some studies by Rose and Long (3-8), E. ten
ella or E. It has been discovered that blood collected from birds that have recovered from maxima infection can provide passive protection against challenge by these species.
These sera were also tested for their effect on sporozoite invasion in vitro, and found a correlation between in vitro sporozoite neutralization and in vivo protection. However, birds immunized with sporozoites or merozoite extracts were E. coli. Tenella oocysts were not resistant to oral infection and their sera could not be used to protect untreated birds (these sera neutralize sporozoites and merozoites in vitro) Despite being able to do that).

メロゾイト時期から得た抗原を使用するワクチンもテ
ストされている（欧州特許公開第0,135,073号）。幾つ
かの研究所はメロゾイト表面抗原に対するモノクローナ
ル抗体を作って、in vitro及びin vivoの侵襲に関する
これら抗体の抑制能力をテストしている。これらの抗原
の大部分はスポロゾイト及び種々のEimeria種に存在す
ることも発見された（9,10）。これらのモノクローナル
抗体を使用した場合のin vivo防御効果も、極めて少な
い寄生虫数で部分的抑制しか示さなかった（攻撃用量
（challenge dosage）：スポロゾイト200個）（欧州特
許公開第0,135,172号）。マラリアメロゾイト表面抗体
に関しても同様の研究が進められており、この場合はモ
ノクローナル抗体を使用すると優れたin vitro侵襲抑制
効果が得られた（11,12）が、in vivoの結果はおもわし
くなかった。その主な理由は恐らく、このマラリア成長
時期における抗原の変化と多様性とにある。現在では、
これらの抗原中の不変エピトープを同定し且つ重要な抗
原決定基を含む小ペプチドを製造する試みがなされてい
る。Vaccines using antigens obtained from the merozoite stage have also been tested (EP-A-0,135,073). Several laboratories have made monoclonal antibodies against merozoite surface antigens and tested their ability to suppress in vitro and in vivo invasion. Most of these antigens have also been found to be present on sporozoites and various Eimeria species (9,10). The in vivo protective effect using these monoclonal antibodies also showed only partial suppression with an extremely small number of parasites (challenge dosage: 200 sporozoites) (European Patent Publication No. 0,135,172). Similar studies have been conducted on malaria merozoite surface antibodies. In this case, the use of monoclonal antibodies was effective in suppressing in vitro invasion (11, 12), but the in vivo results were poor. . The main reason is probably due to the change and diversity of antigens during this malaria development period. Currently,
Attempts have been made to identify invariant epitopes in these antigens and to produce small peptides containing important antigenic determinants.

Eimeria発生の配偶子母細胞時期は分析が最も難し
く、下記の理由から文献にも配偶子サブユニットに関す
る記述は殆ど見られない：多大な努力にも拘わらずEime
ria配偶子はこれまで分離不可能であったため、この発
生時期を分子レベルで研究するためには新規の方法を開
発する必要がある；Eimeria発生の生殖期を研究するた
めの効果的in vitroシステムが開示されていない；当該
分野の著名な研究者による報告によって、配偶子は感染
防御免疫では殆ど役割をもたないと結論された（13,14,
30）。The gametocyte stage of Eimeria development is the most difficult to analyze, and there are few descriptions of gamete subunits in the literature for the following reasons: despite the great efforts, Eime
Because ria gametes have previously been inseparable, new methods need to be developed to study their timing at the molecular level; an effective in vitro system for studying the reproductive phase of Eimeria development Are not disclosed; reports from prominent researchers in the art conclude that gametes have little role in protective immunity (13,14,
30).

E.maximaに対する免疫に関してRoseにより実施された
研究（５〜８）では、感染後14日の回復した鳥から採取
した血清はE．maximaでの攻撃に対して最高93％（接合
子嚢の発生量に基づく）の受動防御を与え得ることが判
明した。またOuchterlonyによるこれらの血清は、スポ
ロゾイトタンパク質を用いずに配偶子母細胞時期を含む
粘膜から調製した抗原を沈降させることが判明した
（８）。しかしながら、これらの研究では配偶子が感染
防御免疫で何等かの役割を果たすという直接的証拠は記
述されておらず、回復抗血清を使用してOuchterlonyに
より観察された抗原を同定する実験も記載されていな
い。実際、配偶子母細胞は精製されずテストもされなか
った。テストされたのは粘膜抽出物だけである。その後
の研究でもRose等は、彼等が得た結果にも拘わらず、生
殖時期即ち配偶子がE.maximaに対する（14）又は他の任
意のEimeria種に対する感染防御免疫の誘発において何
等かの役割を果たすという結論を出してはいない。感染
防御免疫における回復血清の役割を評価するためには、
識別されるタンパク質とこれらのタンパク質が合成され
る特定時期との特徴を調べるための分子レベルの研究が
必要である。 In a study performed by Rose on immunity to E. maxima (5-8), sera from recovered birds 14 days post-infection showed E. coli . It has been found that up to 93% (based on the number of oocysts) passive protection can be provided against maxima attacks. These sera from Ouchterlony were also found to sediment antigens prepared from mucous membranes containing gametocyte stages without sporozoite protein (8). However, these studies do not provide direct evidence that gametes play any role in protective immunity, but also describe experiments using recovery antisera to identify the antigens observed by Ouchterlony. Not. In fact, gametocytes were neither purified nor tested. Only mucosal extracts were tested. In a later study, Rose et al. Also concluded that, despite the results they obtained, their role in reproductive time, that is, when gametes play a protective immunity against E. maxima (14) or against any other Eimeria species. Do not conclude that To evaluate the role of restoring serum in protective immunity,
Molecular studies are needed to characterize the proteins identified and the specific times at which these proteins are synthesized.

マラリア配偶子母細胞及び配偶子に関する研究では、
これらの時期から得た抗原は病気の伝染から鳥を防御す
るために使用できることが判明した（15）。また、これ
らの抗原に対するモノクローナル抗体はマラリア原虫の
それ以上の成長を抑制するのに使用できる（16）。In studies on malaria gametocytes and gametes,
Antigens obtained from these periods have been shown to be able to be used to protect birds from disease transmission (15). In addition, monoclonal antibodies against these antigens can be used to inhibit further growth of malaria parasites (16).

感染防御免疫における配偶子母細胞の役割を研究する
ための先要条件の１つは、これら母細胞の分離である。
Eimeriaの配偶子母細胞の分離に関する研究発表はまだ
１つもない。本発明以前に配偶子母細胞に関して公開さ
れた研究の大部分は、電子顕微鏡検査によってin vivo
の配偶子母細胞の成長及び発生を観察するものであっ
た。時期特異的配偶子母細胞抗原の同定に関する研究は
まだ発表されていない。配偶子母細胞抗原を完全体状の
感染腸内又は部分精製製剤中で分析しようという初期の
試みでは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て、感染した腸と正常な腸との間に差異は殆ど又は全く
見られなかった。従って、分子レベル研究を遂行するた
めに、我々は精製度の極めて高い配偶子母細胞の分離方
法を開発しなければならなかった。One of the prerequisites for studying the role of gametocytes in protective immunity is the isolation of these mother cells.
There are no published studies on the isolation of gamete mother cells of Eimeria . Most of the published work on gametocytes prior to the present invention was performed in vivo by electron microscopy.
Was used to observe the growth and development of gametocytes. No studies have been published on the identification of stage-specific gametocyte antigens. In early attempts to analyze gametocyte antigens in whole infected intestines or in partially purified preparations, SDS polyacrylamide gel electrophoresis showed little or no difference between infected and normal intestines. I didn't see it at all. Therefore, in order to perform molecular studies, we had to develop a method of isolating gametes with extremely high purity.

in vitro培養分野では、総てのコクシジウム種の中
で、培養細胞中でのEimeriaの発生が最も広く研究され
てきた。in vitroで研究されるこれらのEimeria種は、
従来は、鳥類又は哺乳類宿主の寄生虫であった。Eimeri
aの発生を支持するために種々の細胞型が使用されてき
たが、最良の成長は自然宿主から得た細胞型内で生じ
る。鳥類Eimeriaは培養細胞の他に、エンブリオ時期の
卵の漿尿膜（CAM）又はその組織培養細胞中でも成長す
る。通常は、細胞培養（例えばニワトリ肝臓細胞、CK）
又はCAMに検査すべき寄生虫のスポロゾイト又はメロゾ
イトを感染させ、無生殖時期又は生殖時期への発生をモ
ニターする。in vitroで最も広く研究されている寄生虫
はE．tenellaであり、その研究は最良の結果をもたらし
ている。即ち、CAM又はCK細胞にスポロゾイトを感染さ
せると接合子嚢が形成される（17）。これらの接合子嚢
は経口摂取によってニワトリに感染する。しかしなが
ら、これらの培養寄生虫の第１及び第２世代のスキゾン
ト（schizont）の多くは自然感染のスキゾントには類似
していない（６）。組織培養CK細胞中に形成された接合
子嚢の数は成長配偶子母細胞の数に比べて少数であっ
た。これは、in vitroの接合子嚢の受胎及び発生が大配
偶子母細胞の成長より誘発し難いことを示唆する。In the field of in vitro culture, the occurrence of Eimeria in cultured cells has been the most widely studied of all coccidial species. These Eimeria species studied in vitro
Previously, they were parasites of birds or mammalian hosts. Eimeri
Although various cell types have been used to support the development of a , the best growth occurs in cell types obtained from natural hosts. The bird Eimeria also grows in embryonic chorioallantoic membrane (CAM) or its tissue culture cells in addition to cultured cells. Usually cell culture (eg chicken liver cells, CK)
Alternatively, CAM is infected with the sporozoite or merozoite of the parasite to be examined, and the development at the asexual or reproductive stage is monitored. The most widely studied parasites in vitro are E. coli . tenella , and his research has yielded the best results. That is, when CAM or CK cells are infected with sporozoites, oocysts are formed (17). These oocysts infect chickens by ingestion. However, many of the first and second generation schizonts of these cultured parasites do not resemble naturally infected schizonts (6). The number of oocysts formed in tissue culture CK cells was smaller than the number of growing gametocytes. This suggests that in vitro conception and development of oocysts is less likely to be induced than the growth of large gametocytes.

E.maximaはこれまで、スポロゾイトから出発して接合
子嚢に至るまでin vitroで首尾よく培養されたことはな
い。Shirley他の研究（18）は、エンブリオ時期の卵のC
AMがE．maximaのメロゾイトに感染し得、その結果接合
子嚢が形成されることを明らかにした。このシステムで
生じる接合体嚢も伝染性であった。しかしながら、これ
らの接合子嚢から得て卵の尿膜腔内に接種したスポロゾ
イトはCAMの細胞を侵襲したものの、それ以上発生する
ことはなかった。従ってE．maximaに関しては、スポロ
ゾイトからの発生プロセスは基本的にその後の時期のプ
ロセスとは異なると考えられる。前記特定要件はCAM細
胞によっても種々の培養細胞によっても満たすことはで
きない。Shirley等はE．maximaが、メロゾイト時期のみ
からではあるが、エンブリオ時期の卵の中で培養できる
ことを示した。しかしながら、彼等のシステムは寄生虫
の更に進んだ研究には適していない。その主な理由は卵
自体が閉鎖システムであることにある。このようなシス
テムでは薬剤又はモノクローナル抗体の効果を調べるの
は極めて難しいと思われる。 E. maxima has never been successfully cultured in vitro, starting from sporozoites and down to the oocysts . A study by Shirley et al. (18) showed that C
AM is E. The researchers found that they could infect maxima merozoites, resulting in the formation of oocysts. The zygote sacs resulting from this system were also contagious. However, sporozoites obtained from these oocysts and inoculated into the allantoic space of the eggs invaded CAM cells, but did not develop further. Therefore, E. With respect to maxima , the process of development from sporozoites is thought to be fundamentally different from that of later periods. Said specific requirements cannot be met by CAM cells nor by various cultured cells. Shirley, etc. E. It was shown that maxima could be cultured in eggs from the embryo stage, but only from the merozoite stage. However, their system is not suitable for further study of parasites. The main reason is that the eggs themselves are closed systems. In such a system, it would be extremely difficult to determine the effect of the drug or monoclonal antibody.

本発明はE．maximaの大配偶子母細胞及び小配偶子母
細胞の分離方法に係わる。本発明の分離方法を用いれ
ば、宿主感染を殆ど又は全く伴わずに（SDS−PAGE分析
に基づく）E．maxima配偶子母細胞を極めて高度に（90
％以上）精製することができる。The present invention relates to E.I. The present invention relates to a method for separating a large gametocyte and a small gametocyte of maxima . Using the method of separating the present invention, a host infected little or no without (based on SDS-PAGE analysis) E. maxima gametocytes at very high (90
%).

本発明はまた、感染防御配偶子母細胞抗原及びこれら
抗原をコードするRNAの同定にも係わる。これらの抗原
はin vivoのE．maximaによる攻撃感染に対して部分的防
御を与えることが判明した。免疫沈降及びウェスターン
法により関連抗原を同定するのには、免疫し且つ回復し
た鳥並びに免疫したマウス、モルモット及びウサギから
採取した抗血清が使用されてきた。これらの抗血清並び
にモノクローナル抗体及び大豆レクチンは、これらの抗
原を配偶子母細胞タンパク質抽出物から分離するか又
は、遺伝子のクローニングによって、これら抗原をコー
ドするRNAから分離するのに使用できる。従ってこれら
の抗体又は抗原は夫々受動（passive）又は能動（activ
e）免疫によって鳥をコクシジウム感染から防御するの
に使用できる。The invention also relates to the identification of protective gametocyte antigens and the RNAs encoding these antigens. These antigens are in vivo E. coli. It was found to provide partial defense against maxima attack. Antisera from immunized and recovered birds and immunized mice, guinea pigs and rabbits have been used to identify relevant antigens by immunoprecipitation and Western methods. These antisera, as well as monoclonal antibodies and soy lectin, can be used to separate these antigens from gamete maternal protein extracts or from RNA encoding these antigens by gene cloning. Therefore, these antibodies or antigens are passive or active, respectively.
e) Can be used to protect birds from coccidial infection by immunization.

本発明はE．maxima原虫をin vitro生体培養システム
で成長させる方法にも係わる。この生体培養システムは
完全体状の感染腸内で寄生虫を成長させ、in vivoの成
長条件を精密に反映させることからなる。この方法は、
E．maximaをメロゾイト時期から接合子嚢時期までin vi
voと同程度の速度で極めて効果的に成長させるのに使用
し得る。こ のシステムは抗体及び薬剤双方の効力を測定するのに使
用し得ると共に、接合子嚢発生の生殖時期を抑制する薬
剤の開発にも使用できる。The present invention relates to E.I. It also relates to a method of growing maxima protozoa in an in vitro biological culture system. This biological culture system consists of growing parasites in the infected intestine in full body and accurately reflecting the growth conditions in vivo. This method
E. maxima in vitro from the merozoite stage to the oocyst stage
Can be used to grow very effectively at a rate similar to vo. This system can be used to measure the efficacy of both antibodies and drugs, and can be used to develop drugs that reduce the reproductive time of oocyst development.

発明の要約 本発明は、本発明は、エイメリア・マクシマ（Eimeri
a maxima）感染に対する防御を与える免疫応答をニワ
トリに誘起することが可能であり、且つSDS−PAGE分析
による測定で、夫々36±5kd,43±5kd,52±5kd,54±5kd,
56±5kd,78±5kd,82±10kd,116±10kdおよび250±20kd
の分子量を有するエイメリア・マクシマ配偶子母細胞由
来の蛋白質から選択される、精製抗原蛋白質を提供す
る。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to an Eimeria Maxima ( Eimeri
a maxima ) is capable of eliciting an immune response in the chicken that confers protection against infection and is determined by SDS-PAGE analysis as 36 ± 5 kd, 43 ± 5 kd, 52 ± 5 kd, 54 ± 5 kd,
56 ± 5kd, 78 ± 5kd, 82 ± 10kd, 116 ± 10kd and 250 ± 20kd
And a purified antigenic protein selected from proteins derived from Eimeria maxima gametocytes having a molecular weight of:

本発明はまた、前記精製抗原蛋白質を、キャリア（担
体）と組合わせて含む、エイメリア種感染に対する免疫
をニワトリに付与するためのワクチンを提供する。The present invention also provides a vaccine for imparting immunity to Eimeria species infection to chickens, comprising the purified antigen protein in combination with a carrier.

詳細な説明 本発明は、実質的に精製されたEimeria種の配偶子母
細胞、及び a.Eimeriaに感染した宿主動物から感染後の適当な時期
で腸組織を摘出し、 b.こうして摘出した腸組織をヒアルロニダーゼと接触さ
せ、組織中に存在しているヒアルロン酸およびある種の
他の酸ムコ多糖類を消化させ、 c.消化した組織から配偶子母細胞が遊離するように、消
化した腸組織を処理し、 d.実質的に精製されたEimeria種の配偶子母細胞を回収
する ことから成る該配偶子母細胞の調製方法を提供するもの
である。DETAILED DESCRIPTION The present invention relates to a substantially purified gametocyte of Eimeria species, and: a. Removing intestinal tissue from a host animal infected with Eimeria at an appropriate time after infection; b. Contacting the tissue with hyaluronidase to digest the hyaluronic acid and certain other acid mucopolysaccharides present in the tissue; c. Digesting intestinal tissue such that gamete mother cells are released from the digested tissue And d. Recovering substantially purified gametes of Eimeria species.

こうして生産される配偶子母細胞は小配偶子母細胞で
も大配偶子母細胞でもよい。本発明の方法で使用される
望ましいEimeria種はEimeria maximaであり、この場合
Eimeria maximaの配偶子母細胞を生産する。望ましい
宿主動物はニワトリである。The gamete cells thus produced may be small gamete cells or large gamete cells. The preferred Eimeria species used in the method of the invention is Eimeria maxima , in which case
Produces gametocytes of Eimeria maxima . A preferred host animal is a chicken.

本発明の配偶子母細胞の生産方法において、適当な感
染後の時間は約121〜144時間、望ましくは約136〜138時
間である。処理は、動物から取り出した腸に適当な緩衝
液、例えば約170mMのNaCl、pH7.0の約10mMのTris、約10
mMのグルコース、約5mMのCaCl₂、約1mMのPMSF及び、約2
00〜約1000単位/ml、例えば350単位/mlの濃度のヒアル
ロニダーゼを含む1mg/mlのウシ血清アルブミンから成る
SAC緩衝液を充填することにより実施される。取り出し
た腸切片の各端部を閉止し、組織を約37℃で適当な緩衝
液、例えばリン酸緩衝溶液（PBS）中に適当な時間、例
えば約15〜約25分間放置後、腸切片を切開し、適当な洗
浄溶液、例えば前記SAC緩衝液と接触させる。回収は、
組織からの配偶子母細胞を含んでいる該洗浄溶液を第１
のフィルターで過し、液を第１のフィルターよりも
小さい孔径を有する第２のフィルターで過することに
より実施する。第１のフィルターの孔径は約15〜約20ミ
クロン、例えば17ミクロンである。第２のフィルターの
孔径は約８〜約12ミクロン、例えば10ミクロンである。
分離されて10ミクロンのフィルターの頂部に蓄積してい
る配偶子母細胞を適当な緩衝液で更に洗い、遠心分離に
より収集してもよい。In the gametocyte production method of the present invention, the appropriate time after infection is about 121 to 144 hours, preferably about 136 to 138 hours. The treatment is performed using a buffer suitable for the intestine taken from the animal, for example, about 170 mM NaCl, about 10 mM Tris at pH 7.0, about 10 mM.
mM glucose, about 5 mM CaCl ₂ , about 1 mM PMSF and about 2 mM
Consisting of 1 mg / ml bovine serum albumin containing hyaluronidase at a concentration of 00 to about 1000 units / ml, e.g. 350 units / ml
It is performed by filling with SAC buffer. After each end of the removed intestinal section is closed, the tissue is left at about 37 ° C. in an appropriate buffer, for example, a phosphate buffer solution (PBS) for an appropriate time, for example, for about 15 to about 25 minutes. Dissect and contact with a suitable wash solution, eg, the SAC buffer described above. Collection is
Washing the wash solution containing gametocytes from the tissue with a first
And the liquid is passed through a second filter having a smaller pore size than the first filter. The pore size of the first filter is about 15 to about 20 microns, for example, 17 microns. The pore size of the second filter is about 8 to about 12 microns, for example, 10 microns.
The gametocytes that have separated and accumulate on top of the 10 micron filter may be further washed with a suitable buffer and collected by centrifugation.

本発明の別の配偶子母細胞調製方法は、 a.Eimeria種に感染した宿主動物から感染後の適当な時
期で腸を摘出し、 b.感染した腸の内腔から粘膜を適当な緩衝液中に取り出
し、 c.粘膜物質及び緩衝液を混合し、 d.漸減する孔径を有する１組のフィルターで粘膜−緩衝
液混合物を過し、 e.該組のうち最小の孔径を有する最後のフィルター上で
実質的に精製されたEimeria種の配偶子母細胞を回収す
る。Another method of preparing gametocytes according to the present invention comprises the steps of: a. Removing the intestine from a host animal infected with Eimeria species at an appropriate time after infection; and b. C. Mix mucosal material and buffer, d. Pass mucosa-buffer mixture through a set of filters with decreasing pore size, e. Last filter with the smallest pore size of the set The Eimeria spp. Gametocytes substantially purified above are recovered.

ことから成る。Consisting of

フィルタ組の最初のフィルタは約150ミクロンの孔径
であり得、最後のフィルタは約10ミクロンの孔径であり
得る。The first filter of the filter set may have a pore size of about 150 microns, and the last filter may have a pore size of about 10 microns.

本発明は、本発明の方法により生産される実質的に精
製されたEimeria種の配偶子母細胞に係る。望ましく
は、実質的に精製されたEimeria maximaの配偶子母細
胞は、本発明の方法により調製され得る。The present invention relates to substantially purified gametes of Eimeria sp. Produced by the method of the present invention. Desirably, substantially purified gametes of Eimeria maxima may be prepared by the methods of the present invention.

Eimeria種による感染に対する能動免疫をニワトリに
与えるためのワクチンは、有効免疫量のEimeria種の配
偶子母細胞と適当なキャリアとから成る。有効免疫量は
約0.5×10⁶〜約2.0×10⁶の配偶子母細胞である。適当な
キャリアはSAC緩衝液、リン酸塩緩衝液（0.01〜0.1M）
又は食塩水（0.8％）である。キャリアは適当なアジュ
バント、例えばフロイントアジュバントも含み得る。A vaccine for providing chickens with active immunity against infection by Eimeria species consists of an effective immunizing amount of gametocytes of Eimeria species and a suitable carrier. An effective immunizing amount is from about 0.5 × 10 ⁶ to about 2.0 × 10 ⁶ gametocytes. Suitable carriers are SAC buffer, phosphate buffer (0.01-0.1M)
Or saline (0.8%). The carrier can also include a suitable adjuvant, such as Freund's adjuvant.

Eimeria maximaによる感染に対する能動免疫をニワ
トリに与えるためのワクチンは、有効免疫量のEimeria
maxima種の配偶子母細胞と適当なキャリアとから成
る。有効免疫化量は約0.5×10⁶〜約2.0×10⁶の配偶子母
細胞である。A vaccine to provide chickens with active immunity against infection by Eimeria maxima has an effective immunizing dose of Eimeria
It consists of gametes of maxima species and a suitable carrier. Effective immunization amounts are from about 0.5 × 10 ⁶ to about 2.0 × 10 ⁶ gametocytes.

本発明の配偶子母細胞ワクチンは、全配偶子母細胞、
配偶子母細胞が例えば音波処理により内部成分を遊離す
るように処理されている分画配偶子母細胞、又は全配偶
子母細胞と分画配偶子母細胞との混合物を含み得る。全
配偶子母細胞と音波処理した配偶子母細胞との望ましい
比は1:1である。The gametocyte vaccine of the present invention is a whole gametocyte,
The gametocyte may comprise a fractionated gametocyte in which the inner components have been treated to release internal components, for example by sonication, or a mixture of whole and fractionated gametocytes. The desired ratio of total gametes to sonicated gametes is 1: 1.

Eimeria種による感染に対する能動免疫をニワトリに
与える一方法は、有効量の本発明のワクチンをニワトリ
に投与することから成る。Eimeria maximaによる感染
に対する能動免疫をニワトリに与える一方法は、Eimeri
a maximaの配偶子母細胞を含む有効量のワクチンをニ
ワトリに投与することから成る。投与は静脈内、筋肉内
又は腹腔組織内注射のいずれでもよい。有効量のワクチ
ンとは、約0.5×10⁶〜約2.0×10⁶の配偶子母細胞から誘
導された量、又は動物の血清の抗血清滴定量を約1:1000
（ELISAにより決定）にするような量である。One method of conferring chickens with active immunity to infection by an Eimeria species comprises administering to the chickens an effective amount of a vaccine of the invention. One method of providing chickens with active immunity to infection by Eimeria maxima is Eimeri
administering to the chicken an effective amount of the vaccine comprising gametocytes of a maxima . Administration may be by intravenous, intramuscular or intraperitoneal injection. An effective amount of vaccine refers to an amount derived from about 0.5 × 10 ⁶ to about 2.0 × 10 ⁶ gametocytes or an antiserum titer of animal serum of about 1: 1000.
(Determined by ELISA).

本発明は、Eimeria maximaによる感染に対する防御
を与える免疫応答をニワトリに誘発することが可能であ
り、洗浄剤を含有する緩衝液に可溶性であり、Eimeria
maximaの配偶子母細胞の抗原として存在しており、回
収されたニワトリ血清のポリクローナル抗体により特異
的に認識され、250±20kd、116±10kd、82±10kd、78±
5kd、56±5kd,54±5kd、52±5kd、43±5kd及び36±5kd
の分子量を有する少なくとも９つのタンパク質を含む、
Eimeria maximaの配偶子母細胞から誘導されるタンパ
ク性抽出物に係る。The present invention, an immune response conferring protection against infection by Eimeria maxima is capable of inducing in a chicken, it is soluble in a buffer containing detergent, Eimeria
It is present as an antigen of gametes of maxima , specifically recognized by the polyclonal antibody of the collected chicken serum, 250 ± 20 kd, 116 ± 10 kd, 82 ± 10 kd, 78 ±
5kd, 56 ± 5kd, 54 ± 5kd, 52 ± 5kd, 43 ± 5kd and 36 ± 5kd
At least nine proteins having a molecular weight of
It relates to a proteinaceous extract derived from gametocytes of Eimeria maxima .

本発明の抽出物の調製方法は、 a.Eimeria maximaの配偶子母細胞を適当な条件下で緩
衝洗浄剤溶液と接触させ、配偶子母細胞から全タンパク
質を抽出し、 b.SDS−PAGEにより決定される夫々250±20kd、116±10k
d、82±10kd、78±5kd、56±5kd,54±5kd、52±5kd、43
±5kd及び36±5kdの分子量の９つのタンパク質バンドを
有する抽出物の部分を単離する ことから成る。The method for preparing the extract of the present invention comprises the steps of: a. Contacting a gametocyte of Eimeria maxima with a buffered detergent solution under appropriate conditions to extract total protein from the gametocyte; b. 250 ± 20kd, 116 ± 10k respectively
d, 82 ± 10kd, 78 ± 5kd, 56 ± 5kd, 54 ± 5kd, 52 ± 5kd, 43
Isolating portions of the extract having nine protein bands with molecular weights of ± 5 kd and 36 ± 5 kd.

本発明の抽出方法において、緩衝洗浄剤溶液はSAC緩
衝液中に0.5％のNP−40又は0.5％のDOCを含有してい
る。適当な条件とは、配偶子母細胞を４℃で約１時間緩
衝洗剤溶液と共にインキュベートすることである。In the extraction method of the present invention, the buffered detergent solution contains 0.5% NP-40 or 0.5% DOC in SAC buffer. Suitable conditions are to incubate the gametocytes with the buffered detergent solution at 4 ° C. for about 1 hour.

Eimeria maximaによる感染に対する能動免疫をニワ
トリに与えるための別のワクチンは、有効免疫量の本発
明の抽出物とキャリアとから成る。有効免疫量の抽出物
は、約0.5×10⁶〜約2.0×10⁶の配偶子母細胞から誘導さ
れる量の抽出物である。Another vaccine for providing chickens with active immunity against infection by Eimeria maxima consists of an effective immunizing amount of an extract of the invention and a carrier. An effective immunizing amount of an extract is an amount of extract derived from about 0.5 × 10 ⁶ to about 2.0 × 10 ⁶ gametocytes.

Eimeria maximaによる感染に対する能動免疫をニワ
トリに与えるための方法は、Eimeria maximaの配偶子
母細胞抽出物から誘導される有効量のワクチンをニワト
リに投与することから成る。ワクチンの友好量とは、血
清の抗血清滴定量を約1:1000にするような量である。A method for conferring chickens with active immunity against infection by Eimeria maxima consists of administering to chickens an effective amount of a vaccine derived from a gametocyte extract of Eimeria maxima . The vaccinating dose is such that the serum antiserum titer is about 1: 1000.

本発明は更に、本発明の配偶子母細胞抽出物から誘導
され、夫々250±20kd、116±10kd、82±10kd、78±5k
d、56±5kd,54±5kd、52±5kd、43±5kd及び36±5kdの
分子量を有する各抗原タンパク質も提供する。The present invention further provides 250 ± 20 kd, 116 ± 10 kd, 82 ± 10 kd, 78 ± 5 kd derived from the gametocyte extract of the invention.
d, each antigen protein having a molecular weight of 56 ± 5 kd, 54 ± 5 kd, 52 ± 5 kd, 43 ± 5 kd and 36 ± 5 kd is also provided.

82±10kdの分子量を有する本発明の配偶子母細胞抽出
物から誘導される抗原タンパク質の調製方法は、本発明
のタンパク性抽出物からタンパク質を別々に回収するこ
とから成る。タンパク質の回収は、アガロースに結合し
た大豆レクチンを含むカラム上で本発明の抽出物をアフ
ィニティ精製するか、又はハイブリドーマ細胞系1A−１
（ATCC受託番号HB 9552）、1A−２（ATCC受託番号HB 95
53）又は1A−３（ATCC受託番号HB 9554）により産生さ
れたモノクローナル抗体を使用する免疫アフィニティク
ロマトグラフィにより実施され得る。A method for preparing an antigenic protein derived from a gametocyte extract of the invention having a molecular weight of 82 ± 10 kd comprises separately recovering the protein from the proteinaceous extract of the invention. Protein recovery can be achieved by affinity-purifying the extract of the present invention on a column containing soybean lectin bound to agarose, or by hybridoma cell line 1A-1.
(ATCC accession number HB 9552), 1A-2 (ATCC accession number HB 95
53) or 1A-3 (ATCC accession number HB 9554) can be performed by immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody produced.

56±5kdの分子量を有する本発明の配偶子母細胞抽出
物から誘導される抗原タンパク質の調製方法は、本発明
のタンパク性抽出物からタンパク質を別々に回収するこ
とから成る。タンパク質の回収は、アガロースに結合し
た大豆レクチンを含むカラム上で本発明の抽出物をアフ
ィニティ精製するか、又はモノクローナル抗体1E11−11
（ATCC受託番号HB 9558）、1C3−23（ATCC受託番号HB 9
555）、6B3−27（ATCC受託番号9557）及びE9−10（ATCC
受託番号HB 9556）のいずれか１種を使用する免疫アフ
ィニティクロマトグラフィにより実施され得る。A method for preparing an antigenic protein derived from a gametocyte extract of the invention having a molecular weight of 56 ± 5 kd comprises separately recovering the protein from the proteinaceous extract of the invention. Protein recovery can be achieved by affinity-purifying the extract of the invention on a column containing soybean lectin bound to agarose, or by monoclonal antibody 1E11-11.
(ATCC accession number HB 9558), 1C3-23 (ATCC accession number HB 9558)
555), 6B3-27 (ATCC accession number 9557) and E9-10 (ATCC
Accession No. HB 9556).

43±5kd分子量を有する本発明の配偶子母細胞抽出物
から誘導される抗原タンパク質の生産方法は、本発明の
タンパク性抽出物からタンパク質を別々に回収すること
から成る。タンパク質の回収は、単一特異性ポリクロー
ナルニワトリIgGを含むカラム上で本発明の抽出物をア
フィニティ精製することにより実施される。A method for producing an antigenic protein derived from a gametocyte extract of the invention having a molecular weight of 43 ± 5 kd comprises separately recovering the protein from the proteinaceous extract of the invention. Recovery of the protein is performed by affinity purification of the extract of the invention on a column containing monospecific polyclonal chicken IgG.

本発明は更に、ハイブリドーマ細胞系1A−１、1A−
２、1A−３、1E11−11、1C3−23、6B3−27及びE9−10に
より産生されるモノクローナル抗体を提供する。更に、
82±10kdの分子量を有する本発明の配偶子母細胞抽出物
から誘導されるタンパク質に対するモノクローナル抗
体、及び56±5kdの分子量を有する本発明の配偶子母細
胞抽出物から誘導されるタンパク質に対するモノクロー
ナル抗体も提供する。The present invention further provides the hybridoma cell lines 1A-1, 1A-
2, 1A-3, 1E11-11, 1C3-23, 6B3-27 and monoclonal antibodies produced by E9-10. Furthermore,
A monoclonal antibody against a protein derived from a gametocyte extract of the present invention having a molecular weight of 82 ± 10 kd, and a monoclonal antibody against a protein derived from a gametocyte extract of the present invention having a molecular weight of 56 ± 5 kd Also provide.

Eimeria maximaによる感染に対する能動免疫をニワ
トリに与えるための更に別のワクチンは、有効免疫量の
これらのタンパク質のいずれか１種と適当なキャリア、
又は有効免疫量のこれらのタンパク質の２種以上及び適
当なキャリアから成る。Yet another vaccine for providing chickens with active immunity to infection by Eimeria maxima is an effective immunizing amount of any one of these proteins and a suitable carrier,
Alternatively, it comprises an effective immunizing amount of two or more of these proteins and a suitable carrier.

Eimeria種の配偶子母細胞又は接合子嚢のin vitro発
生方法は、 a.Eimeriaに感染したニワトリから感染後４又は５日後
に腸組織を摘出し、 b.こうして摘出した腸組織を適当な条件下で適当な培地
で処理し、組織内における配偶子母細胞又は接合子嚢の
産生を促進し、 c.約１日のインキュベーション期間後に追加のイオン性
成分を含んでいる新しい培地に培地を交換し、配偶子母
細胞又は接合子嚢が産生されるまで組織を更に約１日処
理し、 d.こうして産生された配偶子母細胞又は接合子嚢を回収
する ことから成る。In vitro generation method of Eimeria species gametocytes or oocysts are, a. Excised intestinal tissue from infected chickens Eimeria 4 or 5 days after infection, b. Thus excised intestinal tissue appropriate conditions Treated with a suitable medium underneath to promote the production of gametocytes or oocysts in the tissue, and c. After about one day incubation period, replace the medium with a fresh medium containing additional ionic components Treating the tissue for about one additional day until gametocytes or oocysts are produced, and d. Recovering the gamete cells or oocysts thus produced.

本発明のin vitro発生方法において、段階（ｂ）の
培地は５％の不活性化した正常ニワトリ血清、ペニシリ
ン−ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンを含むRPMI
1640培地から成る。適当な条件は、40℃及び95％O₂/5
％CO₂の雰囲気から成る。段階（ｃ）のイオン成分は、4
0mMのNaHCO₃及び20mMのCaCl₂から成る。In the in vitro generation method of the present invention, the medium in step (b) is RPMI containing 5% inactivated normal chicken serum, penicillin-streptomycin and L-glutamine.
Consists of 1640 medium. Suitable conditions, 40 ° C. and 95% O _2/5
% CO ₂ atmosphere. The ionic component of step (c) is 4
Consists of 0 mM NaHCO ₃ and 20 mM CaCl ₂ .

Eimeria種の増殖に関する薬剤又は抗配偶子母細胞抗
体の有効性のin vitro試験方法は、 a.薬剤又は抗体の存在下で本発明のin vitro方法によ
りEimeria種の配偶子母細胞を調製し、 b.感染後の適当な時期で配偶子母細胞及び／又は接合子
嚢の有無を決定し、 c.段階（ｂ）の結果を、薬剤又は抗配偶子母細胞抗体の
不在下で本発明のin vitro増殖方法によりEimeria種の
配偶子母細胞及び／又は接合子嚢を調製することにより
得られた結果と比較し、こうしてEimeria種の発生に関
する薬剤又は抗体の有効性を決定する ことから成る。 In vitro test method for efficacy of the drug or anti-gametocyte antibody regarding Eimeria species proliferation, a. The Eimeria species gametocytes prepared by in vitro methods of the present invention in the presence of the agent or antibody, b. determining the presence or absence of gametocytes and / or oocysts at an appropriate time after infection; c. determining the results of step (b) in the absence of the drug or anti-gametocyte antibody of the present invention. comparing the results obtained by preparing gametocytes and / or oocysts of Eimeria species by an in vitro propagation method, and thus determining the efficacy of the agent or antibody with respect to the development of Eimeria species.

本発明は更に、Eimeria maximaの配偶子母細胞から
誘導され、無細胞翻訳系と接触した場合、225±20kd、1
00±10kd、90±10kd、65±5kd、45±5kd、40±5kd及び3
4±5kdの分子量を有する少なくとも７つの免疫沈降可能
なタンパク質を翻訳するmRNAの抽出物も提供する。本発
明は、mRNA抽出物中に存在しているmRNA分子のいずれか
からcDNAを産生することも意図している。The present invention further provides 225 ± 20 kd, 1 derived from gamete mother cells of Eimeria maxima ,
00 ± 10kd, 90 ± 10kd, 65 ± 5kd, 45 ± 5kd, 40 ± 5kd and 3
Also provided is an extract of mRNA that translates at least seven immunoprecipitable proteins having a molecular weight of 4 ± 5 kd. The present invention also contemplates producing cDNA from any of the mRNA molecules present in the mRNA extract.

実施例１ エイメリア・マクシマ配偶子母細胞の精製E.maxima. から配偶子母細胞を精製するのに２つの方法
を用いた。方法Ｉは初期の研究時に用いたものだが、顕
微鏡観察ではかなり清澄にみえたにも拘わらず、この方
法による調製物は宿主蛋白で非常に汚染されていること
が判った。方法IIはこれよりもはるかに優れるものであ
って、90％以上の精製度を持つ配偶子母細胞調製物を得
ることができた。これらの方法を以下に詳しく記載す
る。Example 1 Purification of Eimeria maxima gametocytes Two methods were used to purify gametocytes from E. maxima . Although Method I was used during the initial studies, the preparations from this method were found to be very contaminated with host proteins, despite the fact that they appeared quite clear on microscopic observation. Method II was much better and resulted in a gametocyte preparation with a purity of more than 90%. These methods are described in detail below.

方法I:チキンそれぞれを10,000個の接合子細胞嚢で感染
し、感染後６日目に犠牲にした。各チキンの腸を切り開
き、ガラススライドでその粘膜をこすり取りSACバッフ
ァ（170mM NaCl,10mMトリスpH7,10mMグルコース,5mM Na
Cl₂,1mM PMSF、1mg/ml牛血清アルブミン）中に入れた。
10秒間迅速に混合した後、150ミクロンのポアーサイズ
から10ミクロンのポアーサイズの一連のポリモンフィル
ター（polymon filter）を使って混合物を濾過した。10
ミクロンのフィルター上に堆積した物質を洗浄し、回転
し、顕微鏡で観察、検査した。この方法によると、１つ
の腸から10〜20×10⁶個の配偶子母細胞が得られるが、
上記したように方法IIでえられるもの程純粋ではなかっ
た。Method I: Each chicken was infected with 10,000 oocysts and sacrificed 6 days after infection. The intestine of each chicken is cut open, the mucous membrane is scraped with a glass slide, and SAC buffer (170 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7, 10 mM glucose, 5 mM Na
Cl ₂ , 1 mM PMSF, 1 mg / ml bovine serum albumin).
After mixing rapidly for 10 seconds, the mixture was filtered using a series of polymon filters ranging from 150 micron pore size to 10 micron pore size. Ten
The material deposited on the micron filter was washed, spun, and observed and inspected under a microscope. According to this method, 10 to 20 × 10 ⁶ gametocytes are obtained from one intestine,
As mentioned above, it was not as pure as that obtained with Method II.

方法II:チキン（２〜６週令）を上と同様にして感染さ
せた。配偶子母細胞生成の最適時間は、感染後136〜138
時間であった。次いでチキンを犠牲にし、それぞれの腸
を取り出して氷冷したSACで洗浄した。その臓器の一端
を糸で結紮し、やや温かい37℃のPBSのビーカー中に入
れ、振盪しながら37℃で20分間インキュベートした。こ
の間に配偶子母細胞が腸から離脱した。インキュベーシ
ョン後腸を切り開き、内容物を廃棄した。次いで、17ミ
クロンのポリモンフィルター（スイス国チューリヒ所在
のSwiss Silk Bloting Cloth Mfg.Co.Ltd.製）を介して
配偶子母細胞を腸粘膜からSACを用いて洗浄除去した。
濾液を10ミクロンのポリモンフィルターで更に濾過し、
該フィルター上に堆積した配偶子母細胞をSACで洗浄
し、800×ｇで５分間遠心分離して収集した。この配偶
子母細胞を次いで顕微鏡で観察検査し、改良型Fuchs−R
osenthal計数チャンバでカウントした。収量は１つの感
染腸あたり0.5〜２×10⁶個の配偶子母細胞であったが、
なかには感染した鳥１羽あたり10〜20×10⁶個の配偶子
母細胞という非常に高い収量を有するものもあった。こ
の理由は明らかでないが、しかし鳥の感染の強さ及び鳥
のサイズには関係していないものと思われる。Method II: Chicken (2-6 weeks old) was infected as above. The optimal time for gametocyte generation is 136-138 post-infection
It was time. The chicken was then sacrificed and each intestine was removed and washed with ice-cold SAC. One end of the organ was ligated with a string, placed in a slightly warm 37 ° C. PBS beaker, and incubated at 37 ° C. for 20 minutes with shaking. During this time, gametocytes detached from the intestine. After the incubation, the intestine was cut open and the contents were discarded. The gametocytes were then washed away from the intestinal mucosa using a SAC through a 17 micron polymon filter (Swiss Silk Bloting Cloth Mfg. Co. Ltd., Zurich, Switzerland).
The filtrate was further filtered through a 10 micron Polymon filter,
Gametocytes deposited on the filters were washed with SAC and collected by centrifugation at 800 × g for 5 minutes. The gametocytes were then observed under a microscope and the modified Fuchs-R
Counted in an osenthal counting chamber. The yield was 0.5-2 × 10 ⁶ gametocytes per infected intestine,
Some had very high yields of 10-20 × 10 ⁶ gametocytes per infected bird. The reason for this is not clear, but does not appear to be related to the intensity of the bird infection and the size of the bird.

実施例２ インビボ能動免疫化 鳥における免疫原としての精製E.maxima.配偶子母細
胞をテストする実験を行なった。この鳥に後に胞子形成
したE.maxima.接合子嚢で感染した。これら一連の実験
は以下の４つの実験にまとめることができる。Example 2 In Vivo Active Immunization Experiments were performed to test purified E. maxima. Gametocytes as immunogens in birds. The bird was infected with a later sporulated E. maxima oocyst . These series of experiments can be summarized into the following four experiments.

実験1:この実験では、カゴの中に入れた生後１日目のチ
キンを方法Ｉで調製した0.5〜1.0×10⁶個の配偶子母細
胞で免疫化した（この配偶子母細胞の半分は超音波処理
して内部成分を脱離させた）。５羽の鳥には、フロイン
トアジュバントIMを用い前記配偶子細胞を３週間連注し
た。別の５羽の鳥には、フロイントアジュバントのみを
３週間連注した。他の５羽の鳥には、配偶子細胞IVの注
射だけをし、更にその他の５羽の鳥は免疫化しないでネ
ガティブコントロールとした。最後の免疫化から１週間
を経過した時に、各鳥を2000個の胞子形成したE.maxim
a.接合子嚢で経口により感染させた（ただしネガティブ
コントロールは感染させなかった）。感染後５日目に、
２日間のふん便***物サンプルを集め、接合子嚢***量
を調べた。第１表に示すごとく、５羽のネガティブコン
トロールはすべて予想したとおりゼロであった。フロイ
ントアジュバントのみを投与した鳥は１羽の鳥あたり平
均26×10⁶個の接合子嚢を***し、配偶子母細胞IV又はI
Mで免疫化した鳥は現実に平均してコントロール以上の
接合子嚢（両方ともに１羽の鳥あたり37×10⁶個の接合
子嚢）を生産していた。これらの結果から、本実験で用
いた抗原調製物はチックの感染に対する抵抗力に関して
免疫抑制能を有していることが判った。純粋の接合子嚢
を用いた免疫化実験からも同様の結果が得られている
が、本実験で用いた抗原調製物は少量の接合子嚢で汚染
されていたので、これは前記効果を説明している。Experiment 1: In this experiment, 1 day old chickens in cages were immunized with 0.5-1.0 × 10 ⁶ gametocytes prepared by Method I (half of the gametocytes were The internal components were eliminated by sonication). The gametes cells were continuously infused into 5 birds using Freund's adjuvant IM for 3 weeks. The other five birds received Freund's adjuvant alone for 3 weeks. The other five birds received only gamete cell IV injections and the other five birds were not immunized and served as negative controls. One week after the last immunization, each bird had 2,000 sporulated E. maxim
a. Infected orally in oocysts (but not negative controls). Five days after infection,
Fecal excrement samples for two days were collected and oocyst excretion was determined. As shown in Table 1, all five negative controls were zero as expected. Birds receiving Freund's adjuvant alone excreted an average of 26 × 10 ⁶ oocysts per bird and gamete cells IV or I
Birds immunized with M actually produced, on average, more zygotes than controls (both 37 × 10 ⁶ oocysts per bird). From these results, it was found that the antigen preparation used in this experiment had immunosuppressive ability with respect to the resistance to tic infection. Similar results were obtained from immunization experiments using pure oocysts, but the antigen preparation used in this experiment was contaminated with a small amount of oocysts, which explains this effect. doing.

配偶子母細胞蛋白質をSDSアクリルアミドゲルで分析
すると、このタイプの調製物（方法Ｉ）は宿主蛋白質で
高度に汚染されていることが判った。以下に記載する実
験では方法IIで調製した一層清澄な配偶子母細胞を使用
し、生後いく日も経過した鳥を用いた。この方法IIの調
製物は更によい免疫適格性をそなえているものである。
また感染は１羽の鳥あたり500個の接合子嚢に低減し
た。Analysis of gametocyte proteins on SDS acrylamide gels indicated that this type of preparation (Method I) was highly contaminated with host proteins. In the experiments described below, clearer gametocytes prepared by Method II were used, and birds aged several days were used. The preparation of this method II has even better immunocompetence.
Infection was reduced to 500 oocysts per bird.

実験2:本実験においては、方法IIで調製した配偶子母細
胞を使用した。これはゲルエレクトロホレシスによりほ
とんど宿主蛋白質を含んでいないものであることが判っ
た（実施例３参照）。６週令の鳥の十二指腸に、一週間
の間隔をあけて２回、２×10⁶個のE.maxima.配偶子母細
胞を注射し、その後１週間目に500個のE.maxima.接合子
嚢で感染させた。コントロールの鳥を免疫化した鳥と同
じカゴに入れた。感染前においては、すべての鳥の接合
子嚢***はゼロであることが判っていた。感染後７〜９
日目にふん便***物を集め、調査した接合子嚢***デー
タを第２表に示す。コントロールの鳥は平均して１羽の
鳥あたり52.2×10⁶個の接合子嚢***量であったが、免
疫化した鳥にあっては平均して１羽あたり30.5×10⁶個
の接合子嚢***量であた。４羽の免疫化した鳥のうち３
羽はコントロールの平均値よりもはるかに低い数値を示
した。 Experiment 2: In this experiment, gametocytes prepared by Method II were used. This was found to contain little host protein by gel electrophoresis (see Example 3). The duodenum of a 6-week-old bird was injected with 2 × 10 ⁶ E. maxima gametocytes twice a week apart, and then 500 E. maxima zygotes in the first week . Infected in asci. Control birds were placed in the same cage as the immunized birds. Prior to infection, all birds were found to have zero oocyst excretion. 7-9 after infection
Table 2 shows the oocyst excretion data obtained by collecting fecal excrement on the day. The control birds averaged 52.2 × 10 ⁶ oocysts per bird, whereas the immunized birds averaged 30.5 × 10 ⁶ oocysts per bird It was the amount of sac excretion. 3 out of 4 immunized birds
The feathers showed much lower values than the control average.

実験3:本実験では、３羽の５週令鳥を、１〜２×10²の
E.maxima配偶子母細胞の３週間連注により、IVとIPで免
疫化した。３羽のポジティブコントロールを同じカゴに
入れておいた。最後の注射から１日目に500個の接合子
嚢で鳥を経口により感染させた。第３表に示す結果か
ら、３羽のポジティブコントロールは平均して１羽の鳥
あたり約14×10⁶個の２日間接合子嚢***量を示すこと
が判った。１羽の免疫化した鳥は接合子嚢を全く***し
なかったが、１羽の鳥は非常に高い接合子嚢***を示
し、その他の免疫化した鳥はコントロールと同じような
結果を示した。すべての鳥が実際に感染したか否かを確
かめるため、すべてのチキンを再び感染させた。第２の
感染から、すべての鳥は“ゼロ”の鳥を含めてすべて免
疫していることが判った。 Experiment 3: In this experiment, three birds of the 5-week-old birds, of 1~2 × 10 ²
E. maxima gametocytes were immunized with IV and IP by continuous infusion for 3 weeks. Three positive controls were kept in the same basket. Birds were infected orally with 500 oocysts one day after the last injection. From the results shown in Table 3, it was found that the three positive controls showed an average of about 14 × 10 ⁶ oocysts excreted per bird per day. One immunized bird did not excrete oocysts at all, but one bird showed very high oocyst excretion and the other immunized birds showed similar results to controls . All chickens were reinfected to see if all birds were actually infected. The second infection showed that all birds were all immunized, including "zero" birds.

実験4:本実施例では鳥を純粋の配偶子母細胞で免疫化し
た。この純粋配偶子母細胞の半分は超音波処理して、I
P,IM,IVのいずれかとしたものであった。５羽のポジテ
ィブコントロールを用意した。最後の免疫化の後１日目
に鳥を500個の卵母細胞で感染し、その後７〜10日目に
ふん便***物を集めた。第４表に示すとおり、IP及びIM
のグループでは７羽の鳥のうち４羽はコントロールの平
均値の25％にまで定価を示した。IVグループでは７羽の
うち５羽が低かった。これらのグループの平均***量は
次のようであった。すなわち、IP,IMおよびIVグループ
のものはコントロールの平均値よりも低かった（55.6×
10⁶個に対し、それぞれ36.7×10⁶および32.6×10⁶）。
この実験で用いた２羽のコントロール鳥は低い値を示
し、なかでもそのうちの１羽（No.5）は特に低い値を示
した。この鳥は翼をいためていたから、これがこの結果
に影響したものと思われる。 Experiment 4: In this example, birds were immunized with pure gametocytes. Half of this pure gametocyte was sonicated to give I
P, IM, or IV. Five positive controls were prepared. Birds were infected with 500 oocytes one day after the last immunization, and fecal excretion was collected 7-10 days thereafter. As shown in Table 4, IP and IM
In the group, four out of seven birds listed at 25% of the control mean. In the IV group, five out of seven birds were lower. Average excretions in these groups were as follows: That is, those of the IP, IM and IV groups were lower than the mean of the control (55.6 ×
¹⁰⁶ to respectively 36.7 × 10 ⁶ and 32.6 × 10 ^6).
The two control birds used in this experiment showed low values, and one of them (No. 5) showed particularly low values. This bird had been winged, which may have affected this result.

上に記載した諸実験から、IV,IPまたはIMを注射する
か或いは経腸させて純粋の配偶子母細胞で免疫化した鳥
は感染に対して部分的に保護されていることが判る。
（実験１の）清澄でない調製物は、チキンを免疫化する
ために卵母細胞調製物を用いた従前の発表（文献26）に
報告されているとおり、免疫抑制効果を有しているよう
に思われた。これら一連の実験で免疫化した鳥のいくつ
かの血清を分析して、各々の力価、特異性を調べた（実
施例４参照）。免疫血清および回復した鳥（受働的に与
えられた場合に良好な保護レベルを示した鳥）の血清は
共に、免疫沈降反応およびウエスターン法（Western bl
otting）で決定したところによると同一の抗原が認めら
れた。これらの事情から、これらの抗原は保護的であ
り、チキンのコクシジア感染（coccidial infection）
に対し免疫を与えるのに使用できると結論することがで
きた。 The experiments described above show that birds immunized with pure gametocytes injected or enterally injected with IV, IP or IM are partially protected against infection.
The uncleared preparation (of Experiment 1) has an immunosuppressive effect as reported in a previous publication using an oocyte preparation to immunize chicken (ref. 26). I thought. Several sera from birds immunized in these series of experiments were analyzed for their titer and specificity (see Example 4). Both immune sera and sera of recovered birds (birds that showed good protection levels when given passively) were immunoprecipitated and Western blot (Western bl
otting), the same antigen was found. In these circumstances, these antigens are protective and coccidial infection of chicken.
It could be concluded that it could be used to immunize against

実施例３E.maxima 配偶子母細胞タンパク質及びRNAの抽出 方法Ｉ及び方法IIで調製した配偶子母細胞（実施例１
参照）からのタンパク質の抽出を種々の洗剤を用いて行
なった。Bradford（31）の方法で求めたタンパク質の収
量は１×10⁶の純粋配偶子母細胞当り１−2mgであった。
抽出したタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）で測定し、種々の洗剤を用いて行な
った抽出の効率を比較した。SAC中の0.5％ NP−40溶液
において４℃で１時間インキュベートすると、非常に強
力な洗剤であるSDSを使用して抽出され得る全てのタン
パク質は該溶液中に存在することが判明した（SDS PAGE
分析により測定）。方法Ｉで調製した配偶子母細胞はホ
ストタンパク質により非常に汚染されているのに対し、
方法IIを使用した場合はホストによる汚染はほとんどな
いという結果も得られた。この結果は、クーマシーブル
ー染色タンパク質及び³⁵S−メチオニン代謝標識配偶子
母細胞標識タンパク質のSDS−PAGEに基づくものであ
る。これ等のタンパク質は10,000−300,000ダルトンの
分子量を有しており、約85,000、73,000、58,000、52,0
00及び35,000ダルトンの分子量の５つの主要な代謝標識
タンパク質が存在した（表５及び第１図）。配偶子母細
胞調製物中に見られたこれ等の主要標識バンドのほとん
どは、対照の標識非感染腸には全く存在せず、非感染対
照に見られる主要バンドは配偶子母細胞調製物からは非
常に微弱であるか、あるいは全く存在しなかった。従っ
て、これ等のタンパク質は寄生虫由来であり、単離され
た寄生虫は代謝的に活性であると結論された。E.maxima 配偶子母細胞から、２つの方法を使用してRNA
も抽出した。１つはSDS−フェノール（20）に基づくも
のであり、１つはグアニジニウムチオシアナート（21）
を使用するものである。これ等の方法によればいずれを
使用しても、⁷配偶子母細胞当り１−2mgの総RNAが得ら
れた。配偶子母細胞、胞子形成接合子嚢及び非感染ニワ
トリ腸からのRNAを1.5％アガロースゲル上で分析したと
ころ、E.maximaのrRNAがホストRNAからそれぞれ移動し
ていることが判明した。臭化エチジウム染色した主要rR
NAバンドの強度により、配偶子母細胞RNA調製物はホス
トRNAをほとんど含まないことが判明した。いくつかの
調製物中のホストRNA汚染は無視し得る程度のものであ
った。これ等の結果は、タンパク質レベルでの知見を裏
付けるものであり、寄生虫調製物が純度90％以上である
ことを示している。Example 3 Extraction of E. maxima Gametocyte Protein and RNA Gametocyte prepared by Method I and Method II (Example 1
Extraction of the proteins from the above was performed using various detergents. The yield of protein determined by the method of Bradford (31) was 1-2 mg per 1 × 10 ⁶ pure gametocytes.
The extracted proteins were measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the efficiency of the extraction using various detergents was compared. Incubation for 1 hour at 4 ° C. in a 0.5% NP-40 solution in SAC revealed that all proteins that could be extracted using SDS, a very powerful detergent, were present in the solution (SDS PAGE).
Determined by analysis). Gametocytes prepared by Method I are highly contaminated by host proteins, whereas
The use of method II also resulted in little host contamination. The results are based on SDS-PAGE of Coomassie blue stained protein and ³⁵ S-methionine metabolite-labeled gametocyte labeled protein. These proteins have a molecular weight of 10,000-300,000 daltons and are about 85,000, 73,000, 58,000, 52,0
There were five major metabolically labeled proteins with molecular weights of 00 and 35,000 daltons (Table 5 and FIG. 1). Most of these major labeled bands found in gametocyte preparations were absent in control labeled uninfected intestines, and the major band seen in uninfected controls was from gametocyte preparations. Was very weak or nonexistent. Therefore, it was concluded that these proteins were derived from parasites and that the isolated parasites were metabolically active. RNA from E. maxima gametocytes using two methods
Was also extracted. One is based on SDS-phenol (20) and one is guanidinium thiocyanate (21)
Is used. All of these methods resulted in 1-2 mg of total RNA per ⁷ gametocytes. RNA from gametocytes, sporulated oocysts and uninfected chicken intestine was analyzed on a 1.5% agarose gel, which revealed that E. maxima rRNA had migrated from the host RNA, respectively. Major rR stained with ethidium bromide
The intensity of the NA band indicated that the gametocyte RNA preparation contained very little host RNA. Host RNA contamination in some preparations was negligible. These results confirm the findings at the protein level and indicate that the parasite preparation is greater than 90% pure.

ポリＡ含有mRNAを、オリゴ（dT）−セルロースクロマ
トグラフィー（22）により配偶子母細胞全RNAから調製
した。配偶子母細胞ポリＡ＋mRNA及び全RNA並びに対照
非感染腸RNAをウサギ網赤血球無細胞系（23）で翻訳し
たところ、配偶子母細胞無細胞生成物はもし存在すると
してもごくわずかのホスト無細胞系汚染生成物しか含有
していないことが判った。分子量が約34,000、40,000、
45,000、50,000,65,000、90,000、100,000及び225,000
ダルトンの８つの主要バンドが存在し、いくつかは前記
した５つの代謝標識配偶子母細胞主要バンド（35,000、
52,000、58,000、73,000及び85,000）とサイズが同じも
のであった。このバンド間の関係を実施例４に記載した
ように免疫沈降及びウェスタンブロッティングにより分
析した。Poly A-containing mRNA was prepared from gametocyte total RNA by oligo (dT) -cellulose chromatography (22). Translation of gametocyte poly A + mRNA and total RNA and control uninfected intestinal RNA in a rabbit reticulocyte cell-free system (23) showed that little, if any, host cell-free cell gamete product was present. It was found that it contained only system contamination products. Molecular weight of about 34,000, 40,000,
45,000, 50,000, 65,000, 90,000, 100,000 and 225,000
There are eight major bands of Daltons, some of which are the five major metabolically labeled gametocyte major bands (35,000,
52,000, 58,000, 73,000, and 85,000). The relationship between the bands was analyzed by immunoprecipitation and Western blotting as described in Example 4.

接合子嚢感染後５日後に経時的実験を開始して４時間
毎に感染粘膜からRNAを抽出した。これ等のRNAをウサギ
網赤血球無細胞系で翻訳し、６日までの精製配偶子母細
胞RNA並びに対照粘膜RNAによる生成物と比較した。発生
中の異なる時間に種々の配偶子母細胞バンドが存在した
が、成熟配偶子母細胞しないもので配偶子母細胞発生の
初期に検出された主要バンドはなかった。従って、これ
等の調製物は検出可能な配偶子母細胞タンパク質mRNAを
全てではないとしてもそのほとんどを含んでいる結論さ
れる。Five days after infection of the oocysts, a time-course experiment was started, and RNA was extracted from the infected mucosa every four hours. These RNAs were translated in a rabbit reticulocyte cell-free system and compared to purified gametocyte RNA by day 6 as well as products from control mucosal RNA. There were various gametocyte bands at different times during development, but no major band was detected early in gametocyte development without mature gametocytes. Therefore, it is concluded that these preparations contain most if not all detectable gamete protein mRNA.

実施例４ E.maxima配偶子母細胞からの保護抗原の特性化 いくつかの方法を使用してE.maxima配偶子母細胞から
抽出した抗原を分析した。ELISA（enzymelinked immuno
sorbent assay）、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティ
ング及び無細胞翻訳生成物の免疫沈降等である。使用し
た抗血清は、E.maxima感染から回復したニワトリからの
もので、感染後14日に採血した（このタイプの血清はin
vivoで保護能力を有することがRoseにより示されており
（５−８）、以下「回復血清」と指称する）。以下の群
を試験した。超音波処理した全純粋配偶子母細胞で免疫
化したニワトリ、超音波処理した全純粋配偶子母細胞で
免疫化したマウス、純粋配偶子母細胞のNP−40抽出物で
免疫化したマウス及び純粋配偶子母細胞のNP−40抽出物
で免疫化したウサギである。Example 4 Characterization of Protected Antigens from E. maxima Gametocytes Antigens extracted from E. maxima gametocytes were analyzed using several methods. ELISA (enzymelinked immuno
sorbent assay), immunofluorescence, Western blotting and immunoprecipitation of cell-free translation products. The antisera used were from chickens recovered from E. maxima infection and were bled 14 days after infection (serum of this type
It has been shown by Rose to have protective potential in vivo (5-8), hereinafter referred to as "recovery serum"). The following groups were tested: Chickens immunized with sonicated whole pure gametocytes, mice immunized with sonicated whole pure gametocytes, mice immunized with NP-40 extract of pure gametocytes and pure Rabbits immunized with NP-40 extract of gametocytes.

ELISAは、精製したE.maxima配偶子母細胞のNP−40抽
出物を抗原として使用して行なった。試験した種々の血
清のほとんどは少なくとも1:1000の力価を示し、1:10,0
00という高い力価を示すものがあった。正常腸NP−40抽
出物からの抗原を予め吸着した抗血清は、抗配偶子母細
胞胞力価の減少を示さず、反応が寄生虫抗原に特異的で
あることを表わしている。感染から回復したトリから得
た血清がELISAにおいて高い力価を示したという事実
は、これ等の抗原が感染の期間の途中においても免疫原
性であることを示している。ELISAの結果を、以下に記
載するスクリーニング試験に使用する抗血清の選択に使
用した。ELISA was performed using NP-40 extract of purified E. maxima gametocytes as antigen. Most of the various sera tested showed titers of at least 1: 1000 and 1: 10,0
Some showed a high titer of 00. Antiserum pre-adsorbed antigen from normal intestinal NP-40 extract did not show a decrease in anti-gametocyst titers, indicating that the reaction is specific for parasite antigens. The fact that sera from birds recovered from the infection showed high titers in the ELISA, indicating that these antigens were also immunogenic during the course of the infection. ELISA results were used to select antisera for use in the screening tests described below.

免疫蛍光法により配偶子母細胞抗原の位置及び段階特
異性を試験した。簡単に記すと、新鮮配偶子母細胞を調
製し、37℃で20分間血清とインキュベートしてPBSで３
回洗浄し、FITCを抱合する第２抗体と共にインキュベー
トした。対照実験では、FITCを抱合するウサギ抗ニワト
リIgG、ウサギ抗ヒトIgG、ウサギ抗マウスIgG、あるい
はヒツジ抗ウサギIgG（存在する寄生虫に対する抗血清
なしに）と配偶子母細胞をインキュベートしたが、1:10
00という高い希釈でも非常に高い特異的バックグラウン
ドが見られた。非感染ニワトリ腸組織はFITC抱合体のい
ずれとも反応せず、これ等の抗体のニワトリ肝臓均質化
物あるいは精製配偶子母細胞との予備吸着物はこの結合
を減じなかった。さらに、正常ウサギIgGと予めインキ
ュベートした場合、バックグラウンドに影響を与えなか
った。The location and stage specificity of gametocyte antigens were tested by immunofluorescence. Briefly, fresh gametocytes were prepared, incubated with serum at 37 ° C for 20 minutes, and washed with PBS.
Washed twice and incubated with a second antibody conjugated to FITC. In control experiments, gamete mother cells were incubated with rabbit anti-chicken IgG, rabbit anti-human IgG, rabbit anti-mouse IgG, or sheep anti-rabbit IgG (without antiserum to any parasites present) that conjugated FITC. :Ten
Very high specific background was seen even at dilutions as high as 00. Uninfected chicken intestinal tissue did not react with any of the FITC conjugates, and pre-adsorption of these antibodies with chicken liver homogenates or purified gametocytes did not reduce this binding. Furthermore, the background was not affected when pre-incubated with normal rabbit IgG.

バックグラウンドの問題を回避するために、アフィニ
ティー精製ヒツジ抗マウスIgG FITC抱合体（SIGMA,セン
トルイス、ミズーリ）のＦ（ab'）₂フラクションを蛍光
試薬として使用した。実際に対照実験ではこの試薬がそ
れ自体あるいは正常マウス血清と結合したものが非常に
低いバックグラウンドを示した。この結果は、IgGによ
り見られるバックグラウンドは配偶子母細胞の表面上の
Fcレセプターの存在によるものであろうことを示してい
る。To avoid background problems, the F (ab ') ₂ fraction of the affinity purified sheep anti-mouse IgG FITC conjugate (SIGMA, St. Louis, Mo.) was used as the fluorescent reagent. In fact, in control experiments, this reagent bound to itself or to normal mouse serum showed a very low background. This result indicates that the background seen by IgG is on the surface of gametocytes.
This indicates that it may be due to the presence of the Fc receptor.

次に、全配偶子母細胞に超音波処理した配偶子母細胞
を加えたものあるいは配偶子母細胞NP−40抽出物のいず
れかにより免疫化したマウスからの13の免疫マウス血清
を試験した。これ等の種々の免疫血清が、全配偶子母細
胞あるいは配偶子母細胞NP−40抽出物に対して血清間で
の有意な差なしに異なる応答強度を示すことが判明し
た。全ての場合において蛍光は配偶子母細胞の表面上で
強くなっており、抗原が表面膜に関連していることを示
している。血清の中には接合子嚢表面と反応するものも
あった。Next, 13 immunized mouse sera from mice immunized with either whole gametocyte plus sonicated gametocyte or gametocyte NP-40 extract were tested. It was found that these various immune sera showed different response intensities to whole gametocyte or gametocyte NP-40 extract without significant difference between serum. In all cases, the fluorescence was intense on the surface of the gametocyte, indicating that the antigen is associated with the surface membrane. Some sera reacted with the oocyst surface.

マウス抗配偶子母細胞血清の段階特異性も試験した。
E.maximaスポロゾイトを文献に記載された方法（22）で
単離し、IFAガラススライド上で乾燥した。免疫蛍光測
定を実施したところ、スポロゾイトはわずかの血清で蛍
光化したが、精製配偶子母細胞で見られる強度とはほど
遠いものであった。従って、スポロゾイトと配偶子母細
胞の両方に存在し交差反応する抗原が存在するが、これ
等のタンパク質の大部分は主として配偶子母細胞に存在
すると結論される。The step specificity of mouse anti-gametocyte serum was also tested.
E. maxima sporozoites were isolated by literature methods (22) and dried on IFA glass slides. When immunofluorescence was performed, sporozoites were fluoresced in a small amount of serum, but far from the intensity seen in purified gametocytes. Thus, it is concluded that although there are antigens present and cross-reactive on both sporozoites and gametocytes, most of these proteins are mainly present on gametocytes.

免疫回復血清により認識される個々の抗原の同定は、
固定化抗原の免疫検出（ウェスタンブロッティング（2
5））及び無細胞合成配偶子母細胞タンパク質の免疫沈
降により行なった。NP−40抽出配偶子母細胞タンパク質
は最初にSDS−PAGEで分離し、その後ニトロセルロース
フィルターに移した。免疫検出の１つの方法では、前記
フィルターをウサギ抗血清とインキュベートし、洗浄
し、その後¹²⁵Ｉ−プロテインＡを被覆した。非結合プ
ロテインＡを洗浄除去し、フィルターペーパーをＸ線フ
ィルムに露出した。正常ウサギ細胞は、対照と配偶子母
細胞抗原調製物の両方で、わずかのバンドだけと非常に
弱く反応することが判った。これに対して、ウサギ抗NP
−40配偶子母細胞抽出物血清は配偶子母細胞タンパク質
抽出物と強く反応し、対照腸タンパク質とは弱く反応し
た。異なるタンパク質抽出物によっては多少の変化が見
られたが、ウサギ抗配偶子母細胞抽出物血清は一貫して
６つの主要な配偶子母細胞特異タンパク質（90k,76k,75
k,73k,58k及び56k）と６つの弱い配偶子母細胞特異タン
パク質（94k,48k,45k,41k,39k及び34k）を検出した（第
２図）。Identification of the individual antigens recognized by the immune recovery serum
Immunodetection of immobilized antigen (Western blotting (2
5)) and immunoprecipitation of cell-free synthetic gametocyte proteins. NP-40 extracted gametocyte proteins were first separated by SDS-PAGE and then transferred to nitrocellulose filters. In one method of immunodetection, the filters were incubated with rabbit antiserum, washed, and then coated with ¹²⁵ I-protein A. Unbound Protein A was washed away and the filter paper was exposed to X-ray film. Normal rabbit cells were found to react very weakly with only a few bands in both control and gametocyte antigen preparations. In contrast, rabbit anti-NP
The -40 gametocyte extract serum reacted strongly with the gametocyte protein extract and weakly with the control intestinal protein. Although some changes were seen with the different protein extracts, the rabbit anti-gametocyte serum was consistent with the six major gamete-specific proteins (90k, 76k, 75%).
k, 73k, 58k and 56k) and six weak gametocyte specific proteins (94k, 48k, 45k, 41k, 39k and 34k) were detected (Fig. 2).

第２の方法では、前記フィルターをニワトリ抗血清で
被覆し、次にホースラディッシュパーオキシダーゼ結合
ウサギ抗ニワトリIgGで被覆した。これは適当な基質を
加えると赤色の呈色反応を起す。いくつかの回復ニワト
リ血清を使用したが、配偶子母細胞タンパク質の抽出に
使用した洗剤に関りなく見かけの分子量82kd、56kd及び
43kdの３つの主要なバンドが一貫して検出された（第3A
図）。これに対して、正常ニワトリ血清は主として43kd
のタンパク質と反応し、その他の２つの主要バンドとは
全く一貫性がなかった（第3B図）。非感染の対照腸タン
パク質は回復あるいは正常ニワトリ血清のいずれとも全
く反応しなかった。上記３つの主要なバンドに加えて６
つの小さなバンドが検出された（250kd,116kd,78kd,54k
d,52kd及び36kd）。これ等の出現はより一貫性が低い。
これ等の結果は表５にまとめた。In a second method, the filters were coated with chicken antiserum and then with horseradish peroxidase-conjugated rabbit anti-chicken IgG. This gives rise to a red color reaction when an appropriate substrate is added. Several recovered chicken sera were used, but the apparent molecular weights were 82 kd, 56 kd and irrespective of the detergent used to extract the gametocyte proteins.
Three major bands at 43 kd were consistently detected (3A
Figure). In contrast, normal chicken serum is mainly 43 kd
And was completely inconsistent with the other two major bands (FIG. 3B). Uninfected control intestinal protein did not react at all with either recovered or normal chicken serum. 6 in addition to the above three major bands
Two small bands were detected (250 kd, 116 kd, 78 kd, 54 kd
d, 52 kd and 36 kd). Their appearance is less consistent.
These results are summarized in Table 5.

正常ニワトリ血清の前記43kdのタンパク質との反応性
は２つの可能性のある説明ができる。ニワトリはE.maxi
maにさらされたことがなくても血清がこの配偶子母細胞
タンパク質に対する抗体を一定のレベルで含んでいる
か、あるいは前記43kdのタンパク質がその由来に関わり
なくニワトリIgGと結合するからである。後者の可能性
が正しいことがアフィニティー精製ニワトリ抗シトクロ
ムIgGを用いて示された。ウェスタンブロッティングに
おいてこれがやはり前記43kdタンパク質バンドと結合す
ることが見出されたものである。従って、前記43kdのタ
ンパク質はIgG結合タンパク質であり、実際に免疫蛍光
試験（上記参照）で見られたIgGの結合に関わりのあるF
cレセプターであり得ると結論される。The reactivity of normal chicken serum with the 43 kd protein can explain two possible reasons. The chicken is E.maxi
Either the serum contains a certain level of antibodies to this gametocyte protein without exposure to ma , or the 43 kd protein binds chicken IgG regardless of its origin. The latter possibility was shown to be correct using affinity purified chicken anti-cytochrome IgG. It was found in Western blotting that it also binds to the 43 kd protein band. Therefore, the 43 kd protein is an IgG binding protein, and the F relevant to IgG binding actually observed in the immunofluorescence test (see above).
It is concluded that it may be a c receptor.

主要な配偶子母細胞タンパク質バンドに対する抗体が
in vivoで感染後何日目に発現するかを調べるための実
験を行なった。ニワトリに経口で10,000E.maxima接合子
嚢を０日に接種し、0,6,11及び14日に採血した。０日及
び６日においては視認できる唯一の主要バンドが43kdの
タンパク質であったのに対し、11日及び14日に採取した
血清は56kdタンパク質と強く反応することが判明した
（第3C図）。Antibodies to major gametocyte protein bands
Experiments were performed to determine the day after infection in vivo. Chickens were inoculated orally with 10,000 E. maxima oocysts on day 0 and blood was drawn on days 0, 6, 11, and 14. The only major band visible on days 0 and 6 was the 43 kd protein, whereas sera collected on days 11 and 14 were found to react strongly with the 56 kd protein (FIG. 3C).

Rose（５）が、実験に使用されたことのないトリにお
いて感染後10日までは新たな感染に対して受動免疫によ
り何等保護を示さないが14日の血清は良好な保護を与え
ると報告しているので、我々の結果は56kdのタンパク質
が保護免疫において重要な役割を演じていることを示し
ている。Rose (5) reported that in birds that had never been used in experiments, no protection was shown by passive immunization against new infections up to 10 days post-infection, but sera at 14 days provided good protection. Thus, our results indicate that the 56 kd protein plays an important role in protective immunity.

最後に、配偶子母細胞メッセンジャーRNAからin vitr
oで合成した抗原を同定するのに抗血清を使用した。mRN
Aはグアニジウムチオシアナート法（21）により抽出し
ウサギ網赤血球無細胞系（BRL、ベテスダ、メリーラン
ド）で翻訳した。無細胞生成物を種々の抗血清で免疫沈
降させ、該タンパク質をSDS−PAGEにより分析した（第
４図）。種々の免疫化動物からの配偶子母細胞に対する
抗血清は無細胞生成物に対する配偶子母細胞と反応し、
非感染腸、メロゾイト段階の感染腸、胞子形成接合子嚢
あるいはヒヨコ脳からの無細胞生成物と反応しないこと
が判った。回復免疫化ヒヨコ血清はいくつかの配偶子母
細胞無細胞翻訳生成物を認識した。オートラジオグラフ
の長い露出により、約34,000−100,000ダルトンの分子
量を有する10以上の免疫沈降可能バンドが示された。10
のバンドのうち６つのバンドは傑出した代表的タンパク
質であり、それぞれ約100,000,90,000,65,000,45,000,4
0,000及び34,000ダルトンの分子量を有する（表５及び
第４図）。これ等のバンドは全無細胞生成物のほとんど
の主要バンドに対応する。いくつかの血清は100,000の
バンドのみを認識し、90,000のバンドのみのものもあ
り、また両方のバンドを沈降させるものもあった。全て
の場合において45,000及び65,000ダルトンのタンパク質
は免疫沈降された。Finally, in vitro from gametocyte messenger RNA
Antiserum was used to identify the antigen synthesized in o. mRN
A was extracted by the guanidium thiocyanate method (21) and translated by a rabbit reticulocyte cell-free system (BRL, Bethesda, MD). The cell-free products were immunoprecipitated with various antisera and the proteins were analyzed by SDS-PAGE (FIG. 4). Antisera to gametocytes from various immunized animals react with gametocytes for cell-free products,
It was found not to react with uninfected intestines, infected intestines at the merozoite stage, sporulated oocysts or cell-free products from chick brain. Recovery immunized chick sera recognized some gametocyte cell-free translation products. Long exposure of the autoradiograph revealed more than 10 immunoprecipitable bands with molecular weights of about 34,000-100,000 daltons. Ten
6 of the bands are outstanding representative proteins, each with about 100,000,90,000,65,000,45,000,4
It has a molecular weight of 0,000 and 34,000 daltons (Table 5 and FIG. 4). These bands correspond to most major bands of all cell-free products. Some sera recognized only 100,000 bands, some only 90,000 bands, and some sedimented both bands. In all cases, 45,000 and 65,000 dalton proteins were immunoprecipitated.

NP−40抽出物で免疫化された動物からの血清は、多少
の変化はあったが同じバンドを沈降させた。ウサギ抗NP
−40抽出物は90,000及び65,000ダルトンのタンパク質と
共に225,000ダルトンのタンパク質を明らかに沈降させ
たが、その他のバンドは非常に弱かった。マウス抗NP−
40抽出物も同様な結果を示したが、全配偶子母細胞及び
超音波処理配偶子母細胞で免疫化したものは約10,000−
20,000ダルトンのさらに２つの低分子量バンドを認識し
た。Sera from animals immunized with the NP-40 extract sedimented the same band with some changes. Rabbit anti-NP
The -40 extract clearly precipitated 225,000 dalton protein with 90,000 and 65,000 dalton protein, while the other bands were very weak. Mouse anti-NP-
The 40 extracts showed similar results, but about 10,000- immunized with whole and sonicated gametocytes.
Two additional low molecular weight bands at 20,000 daltons were recognized.

回復ニワトリ血清を全感染ヒヨコ腸RNA（感染後種々
の時間に採取）の無細胞翻訳生成物と反応させた場合、
免疫沈降したタンパク質は純粋配偶子母細胞無細胞生成
物で見られたものに一致していた（第５図）。抗原性タ
ンパク質は約130時間頃（in vivoにおける配偶子母細胞
生成のピークの138時間の約８時間前）に現われ始め、1
34時間に最も強く識別され、138時間で強度は減少し
た。このように、E.maximaによる感染の間、免疫応答を
刺激する抗原をコードするmRNAの全範囲は、メロゾイト
段階（96時間）では存在せず、遅い配偶子母細胞段階で
初めて検出可能になる。さらに、これ等の抗原は初期発
生段階に保有されるものはないようである。138時間に
おける回復ニワトリ血清で沈降する抗原の減少は、成熟
巨大配偶子母細胞の接合子嚢への変異を反映しているも
のと思われる。When the recovered chicken serum was reacted with the cell-free translation product of all infected chick intestinal RNA (collected at various times after infection),
The immunoprecipitated protein was consistent with that seen in the pure gametocyte cell-free product (FIG. 5). The antigenic protein began to appear around 130 hours (about 8 hours before the peak of gametocyte production in vivo, 138 hours), and 1
The strongest discrimination was at 34 hours and the intensity decreased at 138 hours. Thus, during infection with E. maxima, the entire range of mRNAs encoding antigens that stimulate the immune response is absent at the merozoite stage (96 hours) and is only detectable at the late gamete stage . Furthermore, none of these antigens appear to be retained during the early developmental stage. The decrease in antigen precipitated in the recovered chicken serum at 138 hours appears to reflect a mutation of the mature giant gametocyte into a oocyst.

表５は上記の結果を要約したものである。配偶子母細
胞特異タンパク質は５つ（代謝標識）あるいは８つ（無
細胞抽出物）の主要バンドの特性パターンを示す。これ
等のうちほとんどのものは免疫沈降または抗配偶子母細
胞あるいは回復血清によるウェスタンブロッティングに
より認識される主要抗原性タンパク質と同じサイズであ
る。ウェスタンブロッティング法により定義されたよう
に、回復ニワトリ血清により認識され、82kd、56kd及び
43kdの見かけ分子量を有する３つの主要抗原がある。こ
れ等のうち１つ（56kd）はまた免疫ウサギ血清と強く反
応し、感染後血清を使用した経時的実験（第３図）に基
づけば、保護的免疫において重要な役割を果している。
43kdタンパク質はIgG結合タンパク質のようであり、Fc
レセプターであるらしい（前述の通り）。Table 5 summarizes the above results. The gametocyte specific proteins show characteristic patterns of 5 (metabolically labeled) or 8 (cell-free extracts) major bands. Most of these are the same size as the major antigenic protein recognized by immunoprecipitation or anti-gametocyte or Western blotting with recovered serum. Recognized by recovered chicken serum as defined by Western blotting, 82 kd, 56 kd and
There are three major antigens with an apparent molecular weight of 43 kd. One of these (56 kd) also reacts strongly with immunized rabbit serum and plays an important role in protective immunity, based on time-course experiments using post-infection serum (FIG. 3).
The 43kd protein appears to be an IgG binding protein and has an Fc
Apparently a receptor (as described above).

免疫沈降無細胞翻訳生成物に対して回復ニワトリ血清
を使用して、100kd、65kd及び45kdの見かけ分子量を有
する、定常的に現われる３つの主要バンドを見出した
（第４図及び第５図参照）。これ等の３つのバンドは、
ウェスタンブロッティングで見られた３つの主要バンド
にまさに対応するようである。従って、回復ニワトリ血
清を配偶子母細胞cDNA群のスクリーニングに使用して、
これ等の３つのタンパク質に対するクローンを単離する
ことが可能である。さらにこれ等のクローン化抗原は本
来の配偶子母細胞抗原に対する免疫応答を刺激し、感染
に対してニワトリを保護することが可能なはずである。
研究室及び農場の両方の非感染トリからの正常ニワトリ
血清が、無細胞翻訳生成物中の100kd及び65kdのタンパ
ク質と一貫して反応し（第４図）、それほど一貫性はな
いにしてもウェスタンブロッティングにおける82kd及び
56kdのタンパク質（第３図）と反応したことは興味深
い。驚くべきことに、正常マウス血清及び正常ウサギ血
清も無細胞翻訳生成物中の65kdのタンパク質と反応し
た。この結果は、ほとんどの脊椎動物の血清中における
抗コクシジウム抗体の遍在性についての報告を立証する
ものである。さらにこれ等の抗原は、ニワトリではない
動物に感染するコクシジウムでも、その多様な種間で高
度に保存されることが示されている。Using recovered chicken sera against the immunoprecipitated cell-free translation products, we found three major bands that appeared steadily with apparent molecular weights of 100 kd, 65 kd and 45 kd (see FIGS. 4 and 5). . These three bands are
It appears to correspond exactly to the three major bands seen in Western blotting. Therefore, the recovered chicken serum was used to screen for gamete cDNAs,
It is possible to isolate clones for these three proteins. Furthermore, these cloned antigens should be capable of stimulating an immune response to the original gametocyte antigen and protecting the chicken against infection.
Normal chicken sera from both laboratory and farm uninfected birds consistently reacted with the 100 kd and 65 kd proteins in the cell-free translation product (FIG. 4), and to a lesser extent, Western 82kd in blotting and
Interestingly, it reacted with the 56 kd protein (Figure 3). Surprisingly, normal mouse serum and normal rabbit serum also reacted with the 65 kd protein in the cell-free translation product. This result confirms the report on the ubiquity of anticoccidial antibodies in the serum of most vertebrates. In addition, these antigens have been shown to be highly conserved among various species of coccidia, which infect non-chicken animals.

実施例５ レクチンによる配偶子母細胞（gametocyte）抗原の同定 レクチンは蛋白質で、主として植物中に見出され、細
胞表面のレセプターと極めて特異的に結合する。より正
確には、レクチンはレセプターの明確な糖部分（sugar
moieties）と結合する。大抵のレクチンは細胞表面の単
一糖構造と優先的に相互作用を持つ。この細胞との相互
作用は極めて選択的なので、レクチンは例えば異なる人
の血液群を識別するのに使用することができる（32）。
レクチンのこの特異性は、配偶子母細胞を試験して表面
抗原結合を調べるのに使用された。 Example 5 Identification of Gametocyte Antigen by Lectin Lectin is a protein, found mainly in plants, which binds very specifically to cell surface receptors. More precisely, lectins are defined by the distinct sugar portion of the receptor (sugar
moieties). Most lectins interact preferentially with a single sugar structure on the cell surface. Because this interaction with cells is very selective, lectins can be used, for example, to distinguish between different human blood groups (32).
This specificity of the lectin was used to test gametocytes to determine surface antigen binding.

分析を促進するために、いくかの商業的に入手可能な
レクチン−これらは全てフルオレスセインと結合せしめ
られたものであるが−をチェックした。すなわち、麦芽
レクチン（Triticum vulgare）、大豆レクチン（Glycin
e max）及びコンカナバリンＡ（全てBio−Makor,Revovo
tより入手可能）である。上記レクチンを各々35分間室
温でレクチン濃度10^-2μg/μｌで50,000個の配偶子母細
胞と共に100μlPBS中に浸漬した（incubated）。PBSで
繰返し洗浄した後、配偶子母細胞を1:1PBS−グリセロー
ル中載物ガラス上に載せ、蛍光顕微鏡法によりレクチン
への表面結合を分析した。麦芽レクチンともコンカナバ
リンＡとも何ら特異的な結合は検出できなかった。すな
わち、配偶子母細胞及び細胞破片（cell debris）の両
者とも同じ程度に蛍光を発した。大豆レクチンは、しか
しながら、配偶子母細胞の表面にのみ極めて特異的に結
合した。To facilitate the analysis, several commercially available lectins were checked, all of which were conjugated to fluorescein. That is, malt lectin (Triticum vulgare), soybean lectin (Glycin
e max) and concanavalin A (all Bio-Makor, Revovo)
t). The lectins were each immersed in 100 μl PBS with 50,000 gametocytes at a lectin concentration of 10 ⁻² μg / μl at room temperature for 35 minutes. After repeated washing with PBS, gametocytes were mounted on 1: 1 PBS-glycerol loading glass and analyzed for surface binding to lectin by fluorescence microscopy. No specific binding of either malt lectin or concanavalin A could be detected. That is, both gametocytes and cell debris emitted the same degree of fluorescence. Soy lectin, however, bound very specifically only to the surface of gametocytes.

大豆レクチンにより認識される特異的な糖であるＮ−
アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（32）は、観察された相
互作用が本当に真のレクチン−細胞レセプター反応であ
るならば、結合を抑制すべきである。濃度100mMのこの
糖を使用した競争実験において、大豆レクチンの結合は
完全に抑制することができた。真のレクチン結合の場合
予想されるように、抑制は可逆的であった。この結果は
明らかに、配偶子母細胞の表面部分（moieties）のいく
つかは実際グリコシル化している（glycosylated）とい
うことを示している。N-, a specific sugar recognized by soy lectin
Acetyl-D-galactosamine (32) should suppress binding if the observed interaction is indeed a true lectin-cell receptor response. In a competition experiment using this sugar at a concentration of 100 mM, the binding of soybean lectin could be completely suppressed. Inhibition was reversible, as expected for true lectin binding. This result clearly indicates that some of the moieties of gametocytes are indeed glycosylated.

これらの表面部分が糖蛋白質であるかどうかを決定
し、かつ、それらを免疫血清により検出される抗原と関
連づけるために（実施例４を参照）、レクチンブロット
（lectin blots）を用いた。レクチンブロットの原理は
ウェスタンブロット（Western blots）に類似するが、
レクチンは事前の免疫血清浸漬なしに固定化抗原と直接
に反応せしめられる。凍結乾燥した、配偶子母細胞抗原
及び通常のニワトリの腸のDOC抽出物（実施例６を参
照）を各々10mg/mlの濃度で水に溶解した。抗原はSDS−
PAGE上で分離し、電気泳動的にニトロセルロース紙上へ
吸いとらせた。ついでこの紙を均しい細片に切断し、大
豆レクチンへの結合を試験した。反応性糖蛋白質帯を目
に見えるようにするために、ペルオキシダーゼを結合せ
しめた大豆レクチンを使用した（Sigma,St.Lousi）。Lectin blots were used to determine whether these surface moieties were glycoproteins and correlate them with antigens detected by immune sera (see Example 4). The principle of lectin blot is similar to Western blots,
Lectins are reacted directly with immobilized antigen without prior immersion in immune serum. Lyophilized gametocyte antigen and normal chicken intestinal DOC extract (see Example 6) were each dissolved in water at a concentration of 10 mg / ml. The antigen is SDS-
Separated on PAGE and blotted electrophoretically onto nitrocellulose paper. The paper was then cut into flat strips and tested for binding to soy lectin. To make the reactive glycoprotein band visible, soybean lectin conjugated with peroxidase was used (Sigma, St. Lousi).

ニトロセルロースの細片は阻止溶液（blocking solut
ion）（TBS pH7.0,10％FCS）中に10分間浸漬し、ついで
阻止溶液の他に5mMのMnCl₂、5mMのCaCl₂及び10μg/mlの
大豆レクチン−ペルオキシダーゼを含むトレイに移し
た。細片は室温で１時間浸漬した。対照細片を上記と同
様に処理した。ただし、全ての溶液は更に100mMのＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンを含んでいた。消極的対照
（nagative control）は、固定化した通常のニワトリの
腸蛋白質によるニトロセルロースブロットより成り立っ
ていた。Nitrocellulose strips are blocked solut
ion) (TBS pH 7.0, 10% FCS) for 10 minutes and then transferred to a tray containing 5 mM MnCl ₂ , 5 mM CaCl ₂ and 10 μg / ml soy lectin-peroxidase in addition to the blocking solution. The strip was soaked for 1 hour at room temperature. Control strips were treated as described above. However, all the solutions were 100 mM N-
It contained acetyl-D-glucosamine. The negative control consisted of a nitrocellulose blot with immobilized normal chicken intestinal protein.

浸漬後細片はTBS又はTBS＋糖でそれぞれ広範に洗浄し
た。結合は、ペルオキシダーゼによる転換の際に色反応
を起す基質を含む溶液中に細片を浸漬することにより、
検出された。After immersion, the strips were extensively washed with TBS or TBS + sugar, respectively. Binding is accomplished by immersing the strip in a solution containing a substrate that undergoes a color reaction upon conversion by peroxidase.
was detected.

レクチンブロット分析によれば、通常のニワトリの腸
蛋白質は大豆レクチンとは反応しなかった。配偶子母細
胞抗原は、しかしながら、10個の帯−大きいのを５個と
小さいのを５個−を含み、これらは大豆レクチンで検出
可能である。大きな帯は見掛分子量が82、78、56、54及
び52で、これら全てはウェスタンブロットにおける回収
ニワトリ血清より検出される大きな帯と寸法が同じであ
る（図６及び表５を参照）。上記の免疫蛍光研究から既
に予想されるごとく、糖は大豆レクチン結合を完全に抑
制し、結合が実際にレクチン特異性であることを証明し
ている。大豆レクチンを用いることにより、われわれは
これにより明らかにE.maximaの主要な（major）抗原の
いくつかを表面特異性糖蛋白質であると同定した。これ
らの蛋白質の単離は大豆レクチンアガロースカラムクロ
マトグラフィーによれば容易に行いうる。Lectin blot analysis showed that normal chicken intestinal protein did not react with soy lectin. Gametocyte antigens, however, contain 10 bands-5 large and 5 small-which are detectable with soy lectin. The large bands have apparent molecular weights of 82, 78, 56, 54 and 52, all of which are the same size as the large bands detected from the recovered chicken sera in Western blots (see FIG. 6 and Table 5). As already expected from the above immunofluorescence studies, sugars completely inhibited soy lectin binding, demonstrating that the binding is indeed lectin specific. By using soy lectin, we have thereby clearly identified some of the major antigens of E. maxima as surface-specific glycoproteins. Isolation of these proteins can be easily performed by soybean lectin agarose column chromatography.

実施例６ E.maxima配偶子母細胞抗原の貯蔵と分別 蛋白質の貯蔵に通常使用もっとも使用される方法の１
つは、凍結乾燥の技法である。凍結乾燥したものは通常
活性を失うことなしに長期間の貯蔵が可能である。方法
II（実施例１を参照）により精製した配偶子母細胞を種
々の洗浄剤で抽出した。抽出物は回収ニワトリ血清を用
いてウェスタンブロッティング（Western Blotting）に
より分析し、Na₂DOCによる抽出が最良の結果をもたらす
ことが見い出された（図７を参照）。従って、大規模な
抽出はNa₂DOCを用いて行なった。抽出物はついで４℃の
PMSFを含有するpH8.0の10mMの燐酸塩緩衝液で透析し
た。被透析物は−80℃で凍結し、ついで凍結乾燥した。
抗原は、−20℃で乾燥剤と共に貯蔵する。凍結乾燥物の
ウェスタンブロットは、回収鶏のひな血清で展開したと
き抗原蛋白質は全て保持されていることを示した。新鮮
物と凍結乾燥抗原のエライサ（ELISA）の比較では、何
らの差も見出されなかった。従って、我々は、配偶子母
細胞の全抗原を貯蔵する最善の方法は凍結乾燥粉末の形
態におくことである、と結論した。Example 6 Storage and Differentiation of E. maxima Gametocyte Antigen One of the Most Commonly Used Methods for Protein Storage
One is a freeze-drying technique. The freeze-dried product can be stored for a long time without losing its activity. Method
Gametocytes purified according to II (see Example 1) were extracted with various detergents. The extract was analyzed by Western Blotting using recovered chicken serum and found that extraction with Na ₂ DOC gave the best results (see FIG. 7). Therefore, large-scale extraction was performed using Na ₂ DOC. The extract is then
Dialysis was performed against 10 mM phosphate buffer at pH 8.0 containing PMSF. The dialysate was frozen at -80 ° C and then freeze-dried.
The antigen is stored at -20 ° C with desiccant. Western blot of the lyophilizate showed that all antigen proteins were retained when developed in recovered chicken serum. Comparison of fresh and lyophilized antigen ELISA did not find any difference. Therefore, we concluded that the best way to store the whole antigen of gametocyte was to put it in lyophilized powder form.

配偶子母細胞抽出物は、蛋白質、脂質、その他のもの
の混合物を含有する。異なる成分を分離し同時にまた様
々な抗原を分別するために、我々は後述のカラムクロマ
トグラフィーの技法を採用した。Gametocyte extracts contain a mixture of proteins, lipids, and others. In order to separate the different components and simultaneously separate the different antigens, we employed the column chromatography technique described below.

精製配偶子母細胞を0.5％NP−40で抽出した（実施例
３を参照）。抽出物に濃度10％になるまで硫酸アンモニ
ウムを加えて蛋白質を沈澱させた。沈澱を除去し、上澄
みは硫酸アンモニウム濃度を50％とした。沈澱した蛋白
質（50％カット）をエライサ及びウェスタンブロットの
両者で試験したところ活性を保持していることを示し
た。カラムクロマトグラフィーにかけるために、上記50
％カットをカラム貫流緩衝液（column running buffe
r）、即ち、10mMのトリスpH8.0、150mMのNaCl、1mMのPM
SF、0.05％のDOC及び1mMのEDTAに溶解した。Purified gametocytes were extracted with 0.5% NP-40 (see Example 3). Ammonium sulfate was added to the extract to a concentration of 10% to precipitate the protein. The precipitate was removed, and the supernatant was adjusted to a concentration of ammonium sulfate of 50%. The precipitated protein (50% cut) was tested on both ELISA and Western blot and showed that it retained activity. To perform column chromatography, use the above 50
% Cut into column running buffer
r), ie 10 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PM
Dissolved in SF, 0.05% DOC and 1 mM EDTA.

２つの異なるカラム媒体（column media）を用いた。
両者共にサイズ分別の原理によって分離するもので、即
ち、Sephadex G−200及びSephacryl S−300（共にPharm
acia、フィンランド製）である。同じカラム貫流緩衝液
（上記）をいずれのカラムにも用いた。達成された分別
は、両ケースにおいて極めて類似していた、即ち、物は
２つの大きなピークに分離した。エライサ及びウェスタ
ンブロット両者において活性な配偶子母細胞蛋白質は第
１の下向スロープ及びピーク間の谷に濃縮されているこ
とが示された。抗原含有画分はプールし、透析し、そし
て直ちに使用するか４℃で短期間貯蔵した。長期間貯蔵
のためには、画分は上記したように凍結乾燥した。Two different column media were used.
Both are separated by the principle of size separation, that is, Sephadex G-200 and Sephacryl S-300 (both Pharm
acia, Finland). The same column flow-through buffer (above) was used for both columns. The fractionation achieved was very similar in both cases, ie, the product separated into two large peaks. Active gametocyte proteins in both ELISA and Western blots were shown to be enriched in the first downward slope and valley between the peaks. Antigen-containing fractions were pooled, dialyzed and used immediately or stored at 4 ° C. for a short period. For long-term storage, fractions were lyophilized as described above.

第２のピークの主成分は薄層クロマトグラフィーによ
り多くは脂質の性質を有することが示された。主な抗原
活性が実際に蛋白質画分に存在し、脂質画分にではない
ことを確認するために、配偶子母細胞脂質及び通常の鶏
のひなの腸の脂質を2:1クロロホルム−メタノールで抽
出した。エタノール可溶性脂質は、回収鶏のひなの血
清、通常の鶏のひなの血清、免疫マウスの血清、及び通
常のマウスの血清でラジオイムノアッセイ（RIA）及び
エライサの両者を使用して活性を分析した。水溶性脂質
を同じ血清でエライサの技法を使用して分析した。The main component of the second peak was shown by thin layer chromatography to have more lipid properties. To confirm that the major antigenic activity was indeed present in the protein fraction and not in the lipid fraction, gamete mother cell lipids and normal chicken intestinal lipids were treated with 2: 1 chloroform-methanol. Extracted. Ethanol soluble lipids were analyzed for activity in recovered chicken chick serum, normal chicken sera, immunized mouse sera, and normal mouse sera using both radioimmunoassay (RIA) and ELISA. Water-soluble lipids were analyzed in the same serum using the ELISA technique.

いずれの技法によるも、配偶子母細胞の脂質に対する
特異的反応性は回収鶏血清又は免疫マウス血清を使用し
ても検出されなかった。かくして、配偶子母細胞脂質は
パラサイト（parasite）に対する免疫応答の重要な構成
分ではない、と結論する。With either technique, no specific reactivity of gametocytes to lipids was detected using recovered chicken serum or immunized mouse serum. Thus, it is concluded that gametocyte lipids are not an important component of the immune response to parasites.

実施例７ 配偶子母細胞抗原に対するモノクローナル抗体 モノクローナル抗体製造の理論はMcfarlane Burnetの
クローナル仮説に基づく。Ｋhler及びMilsteinが日常
的にハイブリドーマを得て以来ずっと、彼らのプロトコ
ールはモノクローナル抗体製造の優れた方法である。我
々は、配偶子母細胞抗原に対するモノクローナル抗体を
製造するのにKohler−Milstein法を採用した。得られた
モノクローナル抗体はアフィニティーカラム上に固定さ
れ、大量の所要の抗原をDOC抽出物から得るのに使用さ
れるであろう（実施例６を参照）。Example 7 Monoclonal Antibodies to Gametocyte Antigen The theory of monoclonal antibody production is based on the Mcfarlane Burnet clonal hypothesis. Since Khler and Milstein routinely obtained hybridomas, their protocol has been an excellent method of monoclonal antibody production. We have adopted the Kohler-Milstein method to produce monoclonal antibodies against gametocyte antigens. The resulting monoclonal antibody will be immobilized on an affinity column and will be used to obtain large amounts of the required antigen from the DOC extract (see Example 6).

最初のモノクローナル抗体は、150,000個の精製配偶
子母細胞を腹腔内注射で４回Balb/Cマウスに投与するこ
とにより単離した。配偶子母細胞のNP−40抽出物（実施
例１を参照）の第５回目の注射は脾臓内であった。マウ
スは最後の注射の後４日後に犠牲となり、その脾臓細胞
は骨髄腫細胞と公刊された手法（34）に従って融合させ
た。モノクローナル抗体2B 8−10（第２プレート、列
Ｂ、くぼみ８、第10回融合）はエライサ技法によって活
性を試験したところ配偶子母細胞抗原に強く反応し、程
度は弱いが対照のニワトリの腸にも反応することがわか
った。2B 8−10が２以上のクローンから成り立っている
かも知れないという可能性を排除するために、細胞をサ
ブクローンし、再試験した。かくして第２のモノクロー
ナル抗体E9−10を単離し、エライサにより試験したとこ
ろ配偶子母細胞抗原にのみ反応することが示された。E9
−10細胞の上澄み、腹水液とそのIgG画分（40％硫酸ア
ンモニウムで沈澱）の両者は、実施例に記載の56kd蛋白
質とだけ反応してウェスタンブロットで単一の帯を示し
た。The first monoclonal antibody was isolated by administering 150,000 purified gametocytes to the Balb / C mouse four times by intraperitoneal injection. The fifth injection of the NP-40 extract of gametocytes (see Example 1) was in the spleen. Mice were sacrificed 4 days after the last injection and their spleen cells were fused with myeloma cells according to published procedures (34). Monoclonal antibody 2B8-10 (2nd plate, row B, indentation 8, 10th fusion), when tested for activity by the ELISA technique, responded strongly to gametocyte antigen and to a lesser extent, control chicken intestine. Was also found to react. To exclude the possibility that 2B8-10 may consist of more than one clone, cells were subcloned and retested. Thus, a second monoclonal antibody, E9-10, was isolated and tested by ELISA and shown to react only with gametocyte antigen. E9
The supernatant of -10 cells, both ascites fluid and its IgG fraction (precipitated with 40% ammonium sulfate), reacted only with the 56 kd protein described in the Examples and showed a single band on the Western blot.

我々の記述する次のモノクローナル抗体は1C3−23で
ある。この抗体は、最初のピークと谷画分とを一緒にし
たものを含有するSephadex G−200カラムの画分（実施
例６を参照）を２回Balb/Cマウスに注射することにより
誘導した。このマウスへの第３回及び最終回の注射は50
％硫酸アンモニウムカット（実施例６を参照）であっ
た。1C3−23はエライサプレート上で配偶子母細胞抗原
とのみ反応し、対照の腸に対してはいかなる応答も示さ
なかった。ウェスタンブロットでは1C3−23は、E9−10
と同じく、単一帯をもって56kd蛋白質と反応することを
見出した。The next monoclonal antibody we describe is 1C3-23. This antibody was induced by injecting Balb / C mice twice with fractions of a Sephadex G-200 column containing the combined first peak and valley fractions (see Example 6). The third and final injection into this mouse was 50
% Ammonium sulfate cut (see Example 6). 1C3-23 reacted only with gametocyte antigen on the ELISA plate and did not show any response to control gut. In Western blot, 1C3-23 was replaced with E9-10
Similarly, it was found that a single band reacted with the 56 kd protein.

更にモノクローナル抗体を単離したが、これもまた5k
d蛋白質帯即ち6B3−27に反応した。1C3−23とは対照的
に、受容体マウスへの第３回目の注射は谷画分を一緒に
したもののみであった。エライサ試験においてもウェス
タンブロットにおいても対照の腸に対する反応は検出さ
れなかった。In addition, we isolated a monoclonal antibody, which was also 5k
dReacted with the protein band, 6B3-27. In contrast to 1C3-23, the third injection into recipient mice was only the combined valley fractions. No response to control intestine was detected in either the ELISA test or the Western blot.

３種の異なる注射プロトコールで処置した３匹の異な
るマウスから我々はかくして４種のモノクローナル抗体
を得たが、これら全ては同じ56kd蛋白質を認識する。従
って、この蛋白質はE.maximaの配偶子母細胞中の主要な
抗原の１つのように思われる。モノクローナル抗体1E 1
1−11を用いて、１個のクローンを分離したが、これも
また56kd蛋白質を認識する。このモノクローナル抗体
は、１回当り平均精製配偶子母細胞150,000個を腹腔内
に５回注射したBalb/Cマウスに由来する。エライサ及び
ウェスタンブロット両者において、このモノクローナル
抗体は極めて強く配偶子母細胞抗原とのみ反応し、ウェ
スタンブロットでは１個の56kdの太い帯が検出された。From three different mice treated with three different injection protocols we thus obtained four monoclonal antibodies, all of which recognize the same 56 kd protein. Thus, this protein appears to be one of the major antigens in E. maxima gametocytes. Monoclonal antibody 1E 1
One clone was isolated using 1-11, which also recognizes a 56 kd protein. This monoclonal antibody is derived from Balb / C mice that were injected intraperitoneally five times with an average of 150,000 purified gametocytes at a time. In both ELISA and Western blot, the monoclonal antibody reacted very strongly only with gametocyte antigen, and a single thick band of 56 kd was detected in Western blot.

新しい一連の融合には極めて異なったアプローチを採
った、即ち、マウスにSDS−PAGEのゲル片（gelpieces）
を注射した。そのような最初の融合は82kd蛋白質（実施
例４を参照）を含むゲル片の注射を３回受けていたマウ
スの脾臓を用いて行なった。このマウスのポリクローナ
ル血清は、マウスの犠牲前に採取したものであるが、予
想通りウェスタンブロットで82kd蛋白質に極めて強い応
答を示した。The new series of fusions took a very different approach, ie, mice were given SDS-PAGE gelpieces.
Was injected. Such an initial fusion was performed with the spleen of a mouse that had received three injections of a piece of gel containing the 82 kd protein (see Example 4). The polyclonal sera from the mice, collected before sacrifice of the mice, showed a very strong response to the 82 kd protein by Western blot, as expected.

82kd蛋白質に対する３種のモノクローナル抗体はこの
融合実験（1A−1,1A−２及び1A−３）から得られた。こ
れらのモノクローナル抗体は上記の他の４種と共に配偶
子母細胞の洗浄剤抽出物からの56kd及び82kd抗原をアフ
ィニティー精製するのに使用することができる。Three monoclonal antibodies against the 82 kd protein were obtained from this fusion experiment (1A-1, 1A-2 and 1A-3). These monoclonal antibodies, along with the other four described above, can be used to affinity purify the 56 kd and 82 kd antigens from detergent extracts of gametocytes.

上記７種のモノクローナル抗体は1987年８月７日ATCC
に寄託された。The above seven monoclonal antibodies were purchased by ATCC on August 7, 1987.
Has been deposited.

実施例８ インビトロ臓器培養系におけるE.maximaの配偶子母細胞
または接合子嚢の増殖 インビボの条件にできるだけ近いインビトロ増殖条件
を確立するために臓器培養系でE.maximaを成育させた。
この系は、他の球虫綱の寄生虫に対する成育条件（17）
と培養中のマラリヤ配偶子母細胞の増殖に対して要求さ
れる条件（29）に関する知見を参照しながら臓器培養の
基本原理（27,28）に則って確立した。これらの条件全
部と、温度、酸素圧力などの種々のパラメーターの経験
によるテストとを組合せて以下に記載する系を確立し
た。Example 8 E. maxima gametocyte or oocyst growth in an in vitro organ culture system E. maxima was grown in an organ culture system to establish in vitro growth conditions as close as possible to in vivo conditions.
This system is suitable for growth conditions against other cocci parasites (17)
It was established according to the basic principles of organ culture (27, 28) with reference to the knowledge on conditions (29) required for the growth of malaria gametocytes in culture. Combining all of these conditions with empirical testing of various parameters such as temperature, oxygen pressure, etc., established the system described below.

臓器培養皿（Falcon）の中央のウェルに、感染後４〜
５日のニワトリの腸断片（２mm²、粘膜脇下、GF/Cフィ
ルター上）を入れた。このウェルに、５％の不活化した
正常ニワトリ血清＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋
Ｌ−グルタミンを含有するRPMI1640培地を0.8ml入れ
た。この皿の外側の輪にリン酸緩衝衛生理食塩水を2ml
入れた後、気密の滅菌室内で酸素95％CO₂５％を５〜15
分通し、40℃にインキュベートした。感染の６日後（す
なわち感染後４日の断片の場合には上記の処理の２日
後、感染後５日の断片の場合には１日後）培地を５％の
正常ニワトリ血清、40mM NaHCO₃、20mMCaCl₂、ペニシリ
ン−ストレプトマイシン＋Ｌ−グルタミンを含有するRP
MI1640（0.8ml）と交換した後、皿を40℃の５％CO₂培養
器内でさらに１日インキュベートした。インキュベート
の間いろいろな時点で断片の標本をガラススライド上に
塗り、配偶子母細胞および／または接合子嚢の存否を検
査した。In the center well of the organ culture dish (Falcon), 4 ~
Five-day chicken intestinal fragments (2 mm ² , under the mucosa, on GF / C filters) were placed. 5% inactivated normal chicken serum + penicillin-streptomycin +
0.8 ml of RPMI1640 medium containing L-glutamine was added. 2 ml of phosphate buffered saline in the outer ring of this dish
After turning, oxygen 95% CO ₂ 5% in the sterilization chamber airtight 5-15
Separated and incubated at 40 ° C. Six days post-infection (ie, 2 days after treatment as described above for 4 days post-infection, 1 day post-infection fragments) 5% normal chicken serum, 40 mM NaHCO ₃ , 20 mM CaCl 2 _2. RP containing penicillin-streptomycin + L-glutamine
After replacing with MI1640 (0.8 ml), the dishes were incubated for an additional day in a 5% CO ₂ incubator at 40 ° C. At various time points during the incubation, specimens of the fragments were spread on glass slides and examined for the presence of gametocytes and / or oocysts.

感染後４日か５日の腸をインキュベートすると配偶子
母細胞と接合子嚢が産生されること（接合子嚢はインビ
トロで感染後７日目に出現した）が判明した。したがっ
てこれらの寄生虫はこの臓器培養系でメロゾイトから接
合子嚢期まで培養できる。Incubation of the intestine 4 or 5 days after infection revealed that gametocytes and oocysts were produced (the oocysts appeared 7 days after infection in vitro). Therefore, these parasites can be cultured from the merozoite to the oocyst stage in this organ culture system.

次にこれらの断片から接合子嚢を単離するために実験
を行ない、この系の効率を定量化した。臓器の培養断片
をチューブに移し（１本のチューブに断片４個）、20％
クロロックス（chlorox）を0.5ml加えた。このチューブ
を１時間室温でインキュベートし、上清を断片から除
き、放出された接合子嚢を遠沈してその数を数えた。各
チューブには接合子嚢が1,000〜6,000個含まれていた。
インビボで感染させたトリから得た同程度の大きさの断
片を同様に処理したところ、この方法を用いてほぼ同数
の接合子嚢が抽出された。したがって、この系は効率良
く接合子嚢を産生し、インビボでの増殖速度を非常に良
く反映すると結論された。Experiments were then performed to isolate oocysts from these fragments, quantifying the efficiency of the system. Transfer the cultured fragment of the organ to a tube (4 fragments in one tube), 20%
0.5 ml of chlorox was added. The tubes were incubated for 1 hour at room temperature, the supernatant was removed from the fragments, and the released oocysts were spun down and counted. Each tube contained 1,000 to 6,000 oocysts.
Similar treatment of similarly sized fragments from in vivo infected birds resulted in the extraction of approximately the same number of oocysts using this method. Therefore, it was concluded that this system produced oocysts efficiently and very well reflected the rate of growth in vivo.

実施例９ インビトロでの抗−配偶子母細胞抗体の試験および薬剤
の試験のための臓器培養系の使用 臓器培養系はインビトロにおけるE.maximaの配偶子母
細胞と接合子嚢の増殖に有効であることが実施例５で示
された。インビトロでの配偶子母細胞抗原の産生を試験
するための実験において、蛍光抗体法を用いてインキュ
ベーション２日目（感染後６日）の臓器培養断片を配偶
子母細胞抗原に関してアッセイし、感染６日目のニワト
リの腸から得た腸塗抹標本と比較した。両者とも周囲の
組織はまったく蛍光を示さなかったのに対し、配偶子母
細胞は非常に強く染色されるのが観察された。この結果
は、抗血清の特異性を示していると共にインビトロでの
寄生虫の正常な成育を示唆している。したがってこの系
は、配偶子母細胞を単離し、インビトロでの寄生虫の成
育に対する抗配偶子母細胞抗体と薬剤の影響を試験し、
ワクチンと薬剤の開発に対する新しい戦略を発展させる
のに使用できる。Example 9 Use of an Organ Culture System for In Vitro Testing of Anti-gametocyte Antibodies and Testing of Drugs An organ culture system is effective for growing E. maxima gametocytes and oocysts in vitro. This was demonstrated in Example 5. In experiments to test the production of gametocyte antigens in vitro, organ culture fragments at day 2 of incubation (6 days post-infection) were assayed for gametocyte antigen using the immunofluorescence method, and Comparisons were made with intestinal smears obtained from chicken intestine on day. In both cases, the surrounding tissues did not show any fluorescence, while the gametocytes were observed to be very strongly stained. This result indicates the specificity of the antiserum and suggests normal growth of the parasite in vitro. Thus, this system isolates gametocytes and tests the effect of anti-gametocyte antibodies and drugs on parasite growth in vitro,
Can be used to develop new strategies for vaccine and drug development.

二種の抗球虫綱薬、すなわちシゾント期に作用するこ
とが知られているKokzidとKorforan（両者ともサルファ
をベースとする抗コクシジウム剤である）および一種の
モノクローナル抗体1E11−11（実施例７参照）を、配偶
子母細胞および／または接合子嚢の産生に対する影響に
ついて臓器培養系で試験した。腸断片は実施例８と同様
にして調製した。同じ二組のプレートにKorforanを20mg
/mlまたはKokzidを４μl/ml入れた。モノクローナル抗
体の試験は、正常ニワトリ血清の存在下または不在下で
0.5％、1.0％および5.0％の濃度で実施した。コントロ
ールのプレートには添加剤はなにも入れなかった。パラ
メーターはすべて既に記載した通りとした（実施例８参
照）。Two anticoccidal drugs, Kokkid and Korforan, both known to act during the schizont phase (both are sulfa-based anticoccidial agents) and one monoclonal antibody 1E11-11 (Example 7) Was tested in an organ culture system for effects on gametocyte and / or oocyst production. Intestinal fragments were prepared as in Example 8. 20 mg of Korforan in the same two sets of plates
/ ml or 4 μl / ml of Kokzid. Monoclonal antibody testing is performed in the presence or absence of normal chicken serum.
Performed at concentrations of 0.5%, 1.0% and 5.0%. Control plates contained no additives. All parameters were as previously described (see Example 8).

48時間インキュベーションした後腸断片の配偶子母細
胞産生を分析し、正のコントロールプレートと比較し
た。After 48 hours incubation, intestinal fragments were analyzed for gametocyte production and compared to positive control plates.

予想された通り、どちらの抗コクシジウム剤も配偶子
母細胞の形成に影響することはなく、コントロールと同
程度であった。しかしモノクローナル抗体1E11−11は正
常ニワトリ血清の存在下および不在下のいずれでも0.5
％の濃度で既に配偶子母細胞の形成を阻害していた。こ
のように、このモノクローナル抗体1E11−11がインビト
ロで寄生虫の増殖を阻害するのに有効であることが示さ
れた。As expected, neither anticoccidial agent affected gametocyte formation and was comparable to controls. However, monoclonal antibody 1E11-11 had 0.5 in both the presence and absence of normal chicken serum.
% Of the cells already inhibited gametocyte formation. Thus, this monoclonal antibody 1E11-11 was shown to be effective in inhibiting parasite growth in vitro.

実施例10 E.maxima配偶子母細胞抗原に対するマウスモノクローナ
ル抗体を用いたニワトリの受動免疫 感染後14日の血清（本明細書中では「回収ニワトリ血
清」という）は、E.maximaの誘発感染に対してニワトリ
を受動免疫するのに使用することができる［Roseら（5,
7,8）］。ここではこのタイプの血清を、E.maximaに対
してニワトリを受動免疫てきる能力を試験しようとする
マウスモノクローナル抗体に対する正のコントロールと
して使用する。これらのモノクローナル抗体は実施例７
に記載されており、その内の一つ（1E11−11）はインビ
トロで配偶子母細胞の増殖を阻害できることが既に示さ
れている。Example 10 Passive Immunization of Chickens Using a Mouse Monoclonal Antibody Against E. maxima Gametocyte Antigen Serum 14 days post-infection (herein referred to as “collected chicken serum”) was induced by E. maxima- induced infection. Can be used to passively immunize chickens [Rose et al. (5,
7,8)]. Here, this type of serum is used as a positive control for mouse monoclonal antibodies which are to be tested for their ability to passively immunize chickens against E. maxima . These monoclonal antibodies were prepared in Example 7
And one of them (1E11-11) has already been shown to be able to inhibit gametocyte proliferation in vitro.

まず最初に誘発感染の条件を確立する。すなわち、２
〜３週齢のトリに感染させるのにE.maximaのHoughton株
の接合子嚢を50個、100個、200個、500個および2,000個
用いて滴定曲線を作成する。次に、実施例２に記載され
ているようにして、感染後６〜７日、７〜８日および８
〜９日に接合子嚢の個数を数える。各群はニワトリ20匹
であり、平均と標準偏差を計算する。これらの結果に基
づいて、免疫実験に対する誘発用量が決定される。First, the conditions for induced infection are established. That is, 2
Titration curves are generated using 50, 100, 200, 500 and 2,000 oocysts of the Houghton strain of E. maxima to infect birds at 3 weeks of age. Next, as described in Example 2, 6-7 days, 7-8 days and 8 days after infection.
Count oocysts on day -9. Each group consists of 20 chickens and the mean and standard deviation are calculated. Based on these results, the induction dose for the immunization experiment is determined.

上記と同様にして免疫実験を実施する。ただし、感染
後４〜８日に回収ニワトリ血清（１−3ml）、正常ニワ
トリ血清（１−3ml）、配偶子母細胞タンパク質に対す
るマウスモノクローナル抗体（腹水またはそのIg画分と
して）、および負のコントロールとしての多少関係のな
い抗原に対するモノクローナル抗体のいずれかを24時間
の間隔をあけてi.m.、i.v.またはi.p.投与する。上記と
同様にして接合子嚢の個数を数え、各群の統計量を決定
する。回収ニワトリ血清か配偶子母細胞抗原に対するマ
ウスモノクローナル抗体を受容したトリは負のコントロ
ールと比較して接合子嚢の個数が有意に減少しており、
これは正の結果と考えられる。受動免疫はまた、他のEi
meria種による誘発感染に対して防御するために同じモ
ノクローナル抗体を注射することによって異種間の防御
を研究するベースとして使用することも出来る。An immunization experiment is performed as described above. However, 4-8 days after infection, collected chicken serum (1-3 ml), normal chicken serum (1-3 ml), mouse monoclonal antibody against gametocyte protein (as ascites or its Ig fraction), and negative control Im, iv, or ip at 24 hour intervals with any of the monoclonal antibodies against the somewhat unrelated antigen. The number of oocysts is counted in the same manner as above, and the statistics of each group are determined. Birds that received the mouse monoclonal antibody against the recovered chicken serum or gametocyte antigen had significantly reduced numbers of oocysts compared to the negative control,
This is considered a positive result. Passive immunity also affects other Ei
It can also be used as a basis for studying cross-species protection by injecting the same monoclonal antibody to protect against induced infection by meria species.

実施例11 アフィニティーによって精製した配偶子母細胞抗原とcD
NAクローニングによって産生された配偶子母細胞抗原と
を用いた、E.maxima感染に対するニワトリの能動免疫 本明細書に記載した主要保護抗原を用いて能動免疫実
験を実施する。全配偶子母細胞が誘発感染に対して部分
的な防御を与えることができることは既に示されており
（実施例２）、ここでは分子量が82kd、56kdおよび43kd
の３つの主要な配偶子母細胞抗原のE.maxima感染に対し
て保護する能力を試験する。これらの抗原はアフィニテ
ィークロマトグラフィーによって（実施例５と７）、ま
たはcDNAクローニングによって調製する。Example 11 Gametocyte antigen and cD purified by affinity
Active immunization of chickens against E. maxima infection using gametocyte antigens produced by NA cloning Active immunization experiments are performed with the major protective antigens described herein. It has already been shown that whole gametocytes can provide partial protection against induced infection (Example 2), where the molecular weights are 82 kd, 56 kd and 43 kd
Test the ability of three major gametocyte antigens to protect against E. maxima infection. These antigens are prepared by affinity chromatography (Examples 5 and 7) or by cDNA cloning.

条件を確立するために、実施例10に記載したようにし
て滴定実験を実施するが、ニワトリの誘発には米国、ニ
ュージャージー、RahwayのMerck社が単離したE.maxima
のFS 110株を使用する。滴定曲線の結果もまた免疫実験
における誘発用量の選択に使用する。To establish the conditions, a titration experiment is performed as described in Example 10, but for the induction of chickens, E. maxima isolated from Merck, Rahway, NJ, USA
Use FS 110 strains. The results of the titration curves are also used to select the induction dose in the immunization experiment.

実際の免疫プロトコルは以下の通りである。試験で使
用するトリは２日齢のオスPeterson X Arbor Acreであ
る。１群20匹のトリに、ミョウバンで沈澱させた試験抗
原を100ng、300ng、1,000ngのいずれかの濃度で２日、
９日および16日にi.m.注射して免疫する。17日目、トリ
をFS110接合子嚢で誘発し、23日、24日および25日（す
なわち誘発の６日、７日および８日後）に糞を集めてそ
の中の接合子嚢の数を測定する。コントロール群は、２
日、９日および16日に所定数の接合子嚢を少量感染させ
て免疫するか、またはミョウバンだけで偽免疫する。別
の１群は感染をしないコントロールとして用いる。また
２日目と25日目にこれらのトリから採血し、ウェスタン
ブロットで配偶子母細胞抗原に対する反応性を試験す
る。The actual immunization protocol is as follows. The bird used in the test is a 2-day-old male Peterson X Arbor Acre. A group of 20 birds were treated with alum-precipitated test antigen at a concentration of 100 ng, 300 ng, or 1,000 ng for 2 days.
Immunization is performed by im injection on days 9 and 16. On day 17, birds are challenged with FS110 oocysts and feces are collected on days 23, 24, and 25 (ie, 6, 7, and 8 days after challenge) and the number of oocysts therein is determined. I do. The control group was 2
On days 9, 9 and 16, a predetermined number of oocysts are immunized with a small infection or sham-immunized with alum alone. Another group is used as a non-infected control. Blood is also collected from these birds on days 2 and 25 and tested for reactivity to gametocyte antigen by Western blot.

これらの研究で用いた第一の試験抗原はアフィニティ
ーで精製した三種の配偶子母細胞抗原（82kd、56kdおよ
び43kd）のプールである。その後これらの抗原の各々を
個別に試験する。これらの結果によると、最も強力な防
御を示す抗原は配偶子母細胞抗原インサートをコードし
ているcDNAを含有する遺伝子工学で処理した細菌が産生
する。これらのクローン化した抗原がトリを保護する能
力を試験し、良好な保護を示すものを用いて、他のEime
ria種に対する試験並びに野外実験における試験用に大
量の抗原を製造する。The first test antigen used in these studies was an affinity purified pool of three gametocyte antigens (82 kd, 56 kd and 43 kd). Thereafter, each of these antigens is tested individually. According to these results, the antigen with the strongest protection is produced by genetically engineered bacteria containing a cDNA encoding a gametocyte antigen insert. These cloned antigens were tested for their ability to protect birds, and those that showed good protection were used for other Eime
Large quantities of antigen are produced for testing on ria species as well as in field experiments.

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diosis: effect of serum antibodies on cell invasio
n by sporozoite of Eimeria in vitro.Parasitology 6
5:437−445. 7.Rose,M.E.（1974）.Protective antibodies in infec
tions with Eimeria maxima:the reduction of Pathoge
nic effects in vivo and a comparison between oral
and subcutaneous administration of antiserum.Paras
itology 68:285−292. 8.Rose,M.E.（1974）.Immunity to Eimeria maxima:Rea
ctions of antisera in vitro and Protection in viv
o.J.of Parasit.60:528−530. 9.Danforth,H.D.and Augustine,P.C.（1983）.Specific
ity and cross−reactivity of immune serum and hybr
idoma antibodies to various species of avian cocci
dia.Poulty Sci.62:2145−2151. 10.Augustine,P.C.and Danforth,H.D.（1986）.Effects
of hybridoma antibodies on invasion of cultured c
ells by sporozoites of Eimeria.Avian diseases 29:1
212−1223. 11.Freeman,R.R.,Trejdosiewicz,A.J.and Cross,G.A.M.
（1980）.Protective monoclonal antibodies recogniz
ing stage−specific merozoite antigens of a rodent
malaria Parasite.Nature 284:366−368. 12.Perrin,L.H.,Ramirez,E.,Lambert,P.H.and Miesche
r,P.A.（1981）.Inhibition of P.falciparumgrowth in
human erythrocytes by monoclonal antibodies.Natur
e 289 301−303. 13.Kouwenhoven,B.and Kuil,H.（1976）.Demonstration
of circulating antibodies to Eimeria tenella by t
he indirect immunofluorescent antibody test using
sporozoites and second−stage schizonts as antige
n.Vet.Parasit.2:283−292. 14.Rose,M.E.and Hesketh,P.（1976）.Immunity to coc
cidiosis:stages of the life−cycle of Eimeria maxi
ma which induce,and are affected by,the response o
f the host.Parasit.73:25−37. 15.Carter,R.,Gwadz,R.W.and McAuliffe,F.M.（197
9）．Plasmodium qallinaceum:Transmission−blocking
immunity in chickens I.Comparative immunogenicity
of gametocyte−and gamete−containing preparation
s.Exp.Parasit.47:185−193. 16.Harte,P.G.,Rogers,N.C.and Targett,G.A.T.（198
5）.Monoclonal anti−gamete antibodies prevent tra
nsimission of murine malaria.Parasit.immunol.7:607
−615. 17.Doran,D.J.and Augustine,P.C.（1973）.Comparativ
e development of Eimeria tenella from soprozoites
to oocysts in primary kidney cell cultures from ga
llinaceous birds.J.Protozool.20:658−661. 18.Shirley,M.W.,McDonald,V.and Ballingall,S.（198
1）．Eimeria spp.from the chicken:from merozoites
to oocysts in embryonated eggs.Parasitology 83:259
−267. 19.Stotish,R.L.and Wang,C.C.（1975）.Preparation a
nd purification of merozoites of Eimeria tenella.
J.Parasit.61:700−703. 20.Wallach,M.（1982）.Efficient extraction and tra
nslation of Plasmodium falciparum messenger RNA.Mo
l.Biochem.Parasitol.6:335−342. 21.Chirgwin,J,M.,Prezbybyla,A.E.,MacDonald,R.J.and
Rutter,W.J.（1979）.Isolation of biologically act
ive ribonucleic acid from sources enriched in ribo
nuclease.Biochemistry 18:5294−5299. 22.Krystosek,A.,Cawthon,M.and Kabat,D.（1975）.Imp
roved methods for purification and assay of eucary
otic messenger ribonucleic acids and ribosomes.J.B
iol.Chem.250:6077−6084. 23.Pelham,H.R.B.and Jackson,R.J.（1976）.An effici
ent mRNA−dependent translation system from reticu
locyte lysates.Eur.J.Biochem.67:247−256. 24.Wagenbach,G.E.（1969）.Purification of Eimeria
tenella sporozoites with glass bead columns.J.aras
itol.55:833−838. 25.Towbin,H.and Gordon,J.（1984）.Immunoblotting a
nd dot immunoblotting−Current status and outlook.
J.Immunol.Methods 72 :313−340. 26.Horton−Smith,C.,Long,P.L.,Pierce,A.E.and Rose,
M.E.（1983）In:Immunity to coccidia in domestic an
imals,PP.273−293（Ed.P.C.C.Garnham and A.E.Pierc
e）Oxford:Blackwell Scientific Publications. 27.Browning,T.H.and Trier,J.S.（1969）.Organ cultu
re of mucosal biopsies of human small intestine.J.
Clin.Invest.48:1423−1432. 28.Neutra,M.R.（1980）.In:In vitro epithellia and
birth defects Vol.XVI−2,pp.261−273.（Ed.B.Shanno
n Danes）Alan R.Liss Inc.,New York,NY. 29.Nijhout,M.M.,and Carter,R.（1978）.Gamete devel
opment in malaria parasites:bicarbonate−dependent
stimulation by pH in vitro.Parasitology 76:39−5
3. 30.Danforth,H.（1983）.Use of monoclonal antibodie
s directed against Eimeria tenella sporozoites to
determine stage specificity and in vitro effect on
parasite penetration and development.Am.J.Vet.Re
s.44:1722−1727. 31.Bradford,M.（1976）.Anal Biochem.72:248 32.Burnet F.M.（1959）The clonal selection theory
of acquired immunity,Cambridge University Press. 33.Kohler,G.and Milstein C.（1975）.Nature 256:49
5. 34.Kohler,G.and Milstein C.（1976）Eur.J.Immunol.
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life cycle.Poultry Science 64 (Supplement 1), 187. 2.Speer, CA, Wong, RB, Blixt, JAand Schenkel, RH
(1985) .Capping of immune complexes by sporozoite
s of Eimeria tenella .J.Parasit.Z: 33-42. 3.Long, PL, Rose, MEand Pierce, AE (1963) .Effec
ts of fowl sera on some stages in the life cycle o
f Eimeria tenella .Exp.Parasit. 14 : 210-217. 4.Rose, MEand Long, PL (1971) .Immunity to cocci
diosis: protective effects of transferred serum and
cells survey in chick embryos infected with
Eimeria tenella. Parasitology 63 : 299-313. 5.Rose, ME (1971) Immunity to coccidiosis: protec
tive effect of transferred serum in Eimeria maxima
infections.Parasitology 62 : 11-25. 6.Long, PLand Rose, ME (1972) .Immunity to cocci
diosis: effect of serum antibodies on cell invasio
n by sporozoite of Eimeria in vitro .Parasitology 6
5 : 437-445. 7.Rose, ME (1974). Protective antibodies in infec
tions with Eimeria maxima : the reduction of Pathoge
nic effects in vivo and a comparison between oral
and subcutaneous administration of antiserum.Paras
itology 68 : 285-292. 8.Rose, ME (1974) .Immunity to Eimeria maxima : Rea
ctions of antisera in vitro and Protection in viv
o .J. of Parasit. 60 : 528-530. 9.Danforth, HDand Augustine, PC (1983) .Specific
ity and cross-reactivity of immune serum and hybr
idoma antibodies to various species of avian cocci
dia.Poulty Sci. 62 : 2145-2151. 10.Augustine, PCand Danforth, HD (1986) .Effects
of hybridoma antibodies on invasion of cultured c
ells by sporozoites of Eimeria .Avian diseases 29 : 1
212-1223.11 Freeman, RR, Trejdosiewicz, AJand Cross, GAM
(1980) .Protective monoclonal antibodies recogniz
ing stage-specific merozoite antigens of a rodent
malaria Parasite.Nature 284 : 366-368.12.Perrin, LH, Ramirez, E., Lambert, PHand Miesche
r, PA (1981) .Inhibition of P.falciparum growth in
human erythrocytes by monoclonal antibodies.Natur
e 289 301-303. 13.Kouwenhoven, B. and Kuil, H. (1976) .Demonstration
of circulating antibodies to Eimeria tenella by t
he indirect immunofluorescent antibody test using
sporozoites and second-stage schizonts as antige
n.Vet.Parasit. 2 : 283-292. 14.Rose, MEand Hesketh, P. (1976) .Immunity to coc
cidiosis: stages of the life−cycle of Eimeria maxi
ma which induce, and are affected by, the response o
f the host.Parasit. 73 : 25-37. 15.Carter, R., Gwadz, RWand McAuliffe, FM (197
9). Plasmodium qallinaceum : Transmission-blocking
immunity in chickens I.Comparative immunogenicity
of gametocyte-and gamete-containing preparation
s.Exp.Parasit. 47 : 185-193. 16. Harte, PG, Rogers, NCand Targett, GAT (198
5) .Monoclonal anti-gamete antibodies prevent tra
nsimission of murine malaria.Parasit.immunol. 7 : 607
−615. 17.Doran, DJand Augustine, PC (1973) .Comparativ
e development of Eimeria tenella from soprozoites
to oocysts in primary kidney cell cultures from ga
llinaceous birds. J. Protozool. 20 : 658-661. 18. Shirley, MW, McDonald, V. and Ballingall, S. (198
1). Eimeria spp.from the chicken: from merozoites
to oocysts in embryonated eggs.Parasitology 83 : 259
−267. 19.Stotish, RLand Wang, CC (1975) .Preparation a
nd purification of merozoites of Eimeria tenella .
J. Parasit. 61 : 700-703. 20. Wallach, M. (1982). Efficient extraction and tra.
nslation of Plasmodium falciparum messenger RNA.Mo
l.Biochem.Parasitol. 6 : 335-342.21.Chirgwin, J, M., Prezbybyla, AE, MacDonald, RJand
Rutter, WJ (1979) .Isolation of biologically act
ive ribonucleic acid from sources enriched in ribo
Nuclease. Biochemistry 18 : 5294-5299. 22. Krystosek, A., Cawthon, M. and Kabat, D. (1975) .Imp
roved methods for purification and assay of eucary
otic messenger ribonucleic acids and ribosomes.JB
iol. Chem. 250 : 6077-6084. 23. Pelham, HRBand Jackson, RJ (1976). An effici
ent mRNA-dependent translation system from reticu
locyte lysates.Eur.J.Biochem. 67 : 247-256.24.Wagenbach, GE (1969) .Purification of Eimeria
tenella sporozoites with glass bead columns.J.aras
itol. 55 : 833-838. 25. Towbin, H. and Gordon, J. (1984). Immunoblotting a
nd dot immunoblotting-Current status and outlook.
J. Immunol.Methods 72 : 313-340. 26. Horton-Smith, C., Long, PL, Pierce, AEand Rose,
ME (1983) In: Immunity to coccidia in domestic an
imals , PP.273-293 (Ed.PCCGarnham and AEPierc
e) Oxford: Blackwell Scientific Publications. 27. Browning, THand Trier, JS (1969). Organ cultu.
re of mucosal biopsies of human small intestine.J.
Clin. Invest. 48 : 1423-1432. 28. Neutra, MR (1980) .In: In vitro epithellia and
birth defects Vol.XVI-2, pp.261-273. (Ed.B.Shanno
n Danes) Alan R. Liss Inc., New York, NY. 29. Nijhout, MM, and Carter, R. (1978). Gamete devel
opment in malaria parasites: bicarbonate-dependent
stimulation by pH in vitro .Parasitology 76 : 39-5
3. 30. Danforth, H. (1983). Use of monoclonal antibodie
s directed against Eimeria tenella sporozoites to
determine stage specificity and in vitro effect on
parasite penetration and development.Am.J.Vet.Re
s. 44 : 1722-1727. 31. Bradford, M. (1976) .Anal Biochem. 72 : 248 32. Burnet FM (1959) The clonal selection theory.
of acquired immunity, Cambridge University Press. 33.Kohler, G. and Milstein C. (1975) .Nature 256 : 49
5. 34. Kohler, G. and Milstein C. (1976) Eur. J. Immunol.
6 : 511.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、代謝標識した無細胞翻訳配偶子母細胞及び宿
主タンパク質のSDS−PAGEに於ける粒子構造の写真を示
している。精製したE.maximaの配偶子母細胞（レーン2,
6）及びヒヨコの非感染腸組織（レーン3,7）の代謝標識
した（³⁵S−メチオニン取り込み）タンパク質抽出物
を、精製した配偶子母細胞（レーン4,5,10）、完全感染
（レーン９）又は非感染のヒヨコの腸（レーン８）から
のmRNAの無細胞翻訳から得た標識タンパク質のパターン
と比較した。タンパク質寸法表示（205kd、116kd、97.5
kd、66kd、45kd及び30kd）は黒い印で示す。 第２図は、ウサギ抗配偶子母細胞NP−40抽出物血清によ
る配偶子母細胞及び対照タンパク質の免疫検出に於ける
粒子構造の写真を示している。配偶子母細胞及び宿主組
織タンパク質をニトロセルロース紙にブロットし、正常
ウサギ血清（レーン1,2,3）又は配偶子母細胞NP−40抽
出物で免疫感作したウサギからの血清（レーン4,5,6）
と反応させた。宿主組織タンパク質抽出物（レーン1,
4）は、配偶子母細胞タンパク質抽出物（レーン2,3,5,
6）に比較してほとんど反応しない。 第３図（A,B,C）は、回収したニワトリ血清及び正常ニ
ワトリ血清による配偶子母細胞抗原の免疫検出に於ける
粒子構造の写真を示す。 第３図Ａは、ニワトリ抗シトクロム血清（レーン21）を
対照とし、個々のストリップを各種の回収したニワトリ
血清（レーン１〜20）と反応させた配偶子母細胞タンパ
ク質を含む予備ウェスタンブロットを示している。 第３図Ｂは、各種の正常ニワトリ血清（レーン１〜８）
と反応させ、回収したニワトリ血清（レーン９）により
検出された抗原と比較した配偶子母細胞タンパク質を含
む予備ウェスタンブロットを示している。 第３図Ｃは、感染後の各時点で取り出されたニワトリ血
清と反応させた配偶子母細胞タンパク質を含む予備ウェ
スタンブロットを示している。ニワトリを１×10⁴のE.m
aximaの接合子嚢で感染させ、感染後０日（レーン
１）、６日（レーン２）、11日（レーン３）及び14日
（レーン４）後に採血した。 第４図は、ウサギ及びヒヨコ抗血清によるE.maximaの無
細胞タンパク質の免疫沈降に於ける粒子構造の写真を示
している。全胞子形成したE.maximaの接合子嚢RNA（レ
ーン６）、精製した配偶子母細胞RNA（レーン８）及び
非感染ヒヨコの腸のRNA（レーン７）の無細胞翻訳生成
物をヒヨコ及びウサギ抗血清と反応させた。配偶子母細
胞の無細胞タンパク質を、回収したヒヨコ血清（レーン
9,10）、ヒヨコ抗配偶子母細胞NP−40抽出物血清（レー
ン11）、正常ヒヨコ血清（レーン１〜3,12）、ウサギ抗
配偶子母細胞抽出物血清（レーン13）及び正常ウサギ血
清（レーン14）で免疫沈降させた。胞子形成した接合子
嚢の無細胞タンパク質を、回収したヒヨコ血清（レーン
４）及び正常ヒヨコ血清（レーン５）で免疫沈降させ
た。 第５図は、各時点で抽出した感染した腸のmRNAから得ら
れた配偶子母細胞の無細胞生成物の免疫沈降に於ける粒
子構造を、純粋なメロゾイト又は配偶子母細胞調製物の
粒子構造と比較して示した写真である。E.maxima感染の
メロゾイト及び配偶子母細胞段階の間に抽出した全腸mR
NAの無細胞翻訳から誘導された配偶子母細胞特異生成物
を、回収したヒヨコ血清で免疫沈降させた。mRNAの無細
胞翻訳からの免疫沈降物は、メロゾイト（レーン１）、
E.maxima感染後118時間（レーン２）、122時間（レーン
３）、126時間（レーン４）、130時間（レーン５）、13
4時間（レーン６）及び138時間（レーン７）における感
染した腸、精製したE.maximaの配偶子母細胞（レーン
８）及びヒヨコ脳髄（レーン９）から得た。 第６図は、ペルオキシダーゼと結合し、大豆レクチンに
より検出された配偶子母細胞タンパク質のウェスタンブ
ロットに於ける粒子構造の写真を示している。図中最も
顕著なタンパク質は82kd、56kd及び40kdの分子量を有す
るタンパク質である。 第７図は各種の洗剤を使用する配偶子母細胞の抽出物の
粒子構造の写真を示している。同数の配偶子母細胞を、
0.5％CHAPS（３′−［（３′−コラミドプロピル）ジメ
チルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）（レー
ン１）、0.5％NP−40（レーン２）、0.5％TRITON X−10
0（レーン３）、0.5％SDS（レーン４）及び0.5％Na₂DOC
（レーン５）で抽出し、ニトロセルロース紙にブロット
し、回収したニワトリ血清と反応させた。FIG. 1 shows a photograph of the particle structure in SDS-PAGE of metabolically labeled cell-free gametocytes and host proteins. Purified E. maxima gametocytes (lanes 2,
6) and uninfected intestinal tissue chicks (they were metabolically labeled lanes 3, 7) ⁽³⁵ S- methionine incorporation) protein extracts, purified gametocytes (Lanes 4, 5, 10), complete infection (lanes 9) or compared to the pattern of labeled proteins from cell-free translation of mRNA from intestinal chick intestine (lane 8). Protein size display (205kd, 116kd, 97.5
kd, 66 kd, 45 kd and 30 kd) are indicated by black marks. FIG. 2 shows a photograph of the particle structure in the immunodetection of gametocytes and control proteins with serum of rabbit anti-gametocyte NP-40 extract. Gametocyte and host tissue proteins were blotted on nitrocellulose paper and serum from rabbits immunized with normal rabbit serum (lanes 1, 2, 3) or gametocyte NP-40 extract (lanes 4, 7). 5,6)
And reacted. Host tissue protein extract (lanes 1,
4) is a gametocyte protein extract (lanes 2, 3, 5,
Little reaction compared to 6). FIG. 3 (A, B, C) shows a photograph of the particle structure in the immunodetection of gametocyte antigens using the collected chicken serum and normal chicken serum. FIG. 3A shows a preliminary Western blot containing gametocyte proteins with chicken anti-cytochrome serum (lane 21) as a control and individual strips reacted with various collected chicken sera (lanes 1-20). ing. FIG. 3B shows various normal chicken sera (lanes 1 to 8).
Figure 9 shows a preliminary Western blot containing gametocyte proteins compared to antigen detected by collected chicken serum (lane 9). FIG. 3C shows a preliminary Western blot containing gametocyte proteins reacted with chicken serum removed at each time point after infection. 1 × 10 ⁴ chicken Em
The mice were infected with axima oocysts and blood was collected on day 0 (lane 1), day 6 (lane 2), day 11 (lane 3) and day 14 (lane 4). FIG. 4 shows a photograph of the particle structure upon immunoprecipitation of E. maxima cell-free proteins with rabbit and chick antisera. Cell-free translation products of whole sporulated E. maxima oocyst RNA (lane 6), purified gametocyte RNA (lane 8) and uninfected chick intestinal RNA (lane 7) were collected from chicks and rabbits. Reacted with antiserum. The cell-free protein of gametocytes was recovered from chick serum (lane).
9,10), chick anti-gametocyte NP-40 extract serum (lane 11), normal chick serum (lanes 1-3,12), rabbit anti-gametocyte extract serum (lane 13) and normal rabbit Immunoprecipitated with serum (lane 14). Cell-free proteins of sporulated oocysts were immunoprecipitated with recovered chick serum (lane 4) and normal chick serum (lane 5). FIG. 5 shows the particle structure in the immunoprecipitation of the cell-free product of gametocytes obtained from infected intestinal mRNA extracted at each time point, with the particles of pure merozoites or gametocyte preparations. It is a photograph shown in comparison with the structure. Whole intestinal mR extracted during merozoite and gametocyte stages of E. maxima infection
Gamete-specific products derived from cell-free translation of NA were immunoprecipitated with collected chick serum. Immunoprecipitates from cell-free translation of mRNA were merozoites (lane 1),
118 hours (lane 2), 122 hours (lane 3), 126 hours (lane 4), 130 hours (lane 5), 13 hours after E. maxima infection
Obtained from infected intestine, purified E. maxima gametocytes (lane 8) and chick brain cord (lane 9) at 4 hours (lane 6) and 138 hours (lane 7). FIG. 6 shows a photograph of the particle structure in a Western blot of gametocyte proteins bound to peroxidase and detected by soy lectin. The most prominent proteins in the figure are proteins having molecular weights of 82 kd, 56 kd and 40 kd. FIG. 7 shows a photograph of the particle structure of an extract of gametocyte using various detergents. The same number of gametocytes
0.5% CHAPS (3 '-[(3'-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate) (lane 1), 0.5% NP-40 (lane 2), 0.5% TRITON X-10
0 (lane 3), 0.5% SDS (lane 4) and 0.5% Na ₂ DOC
Extracted in (lane 5), blotted on nitrocellulose paper, and reacted with the collected chicken serum.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/569 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Agency reference number FI Technical indication location C12N 15/02 G01N 33/569 A 15/09 9282-4B C12N 15/00 A C12P 21/08 9282 -4B C G01N 33/569 5/00 B (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】エイメリア・マクシマ（Eimeria maxim
a）感染に対する防御を与える免疫応答をニワトリに誘
起することが可能であり、且つSDS−PAGE分析による測
定で、夫々36±5kd,43±5kd,52±5kd,54±5kd,56±5kd,
78±5kd,82±10kd,116±10kdおよび250±20kdの分子量
を有するエイメリア・マクシマ配偶子母細胞由来の蛋白
質から選択される、精製抗原蛋白質。(1) Eimeria maxim
a ) It is possible to elicit an immune response in the chicken that confers protection against infection and, as determined by SDS-PAGE analysis, 36 ± 5 kd, 43 ± 5 kd, 52 ± 5 kd, 54 ± 5 kd, 56 ± 5 kd,
A purified antigenic protein selected from proteins derived from Eimeria maxima gametocytes having a molecular weight of 78 ± 5 kd, 82 ± 10 kd, 116 ± 10 kd, and 250 ± 20 kd. 【請求項２】エイメリア・マクシマ感染に対する防御を
与える免疫応答をニワトリに誘起することが可能であ
り、且つSDS−PAGE分析による測定で、夫々36±5kd,43
±5kd,52±5kd,54±5kd,56±5kd,78±5kd,82±10kd,116
±10kdおよび250±20kdの分子量を有するエイメリア・
マクシマ配偶子母細胞由来の蛋白質から選択される、有
効免疫量の精製蛋白質を、キャリアと組合わせて含む、
エイメリア種感染に対する免疫をニワトリに付与するた
めのワクチン。2. It is possible to elicit an immune response in chickens that confers protection against Eimeria maxima infection and, as determined by SDS-PAGE analysis, 36 ± 5 kd, 43 respectively.
± 5kd, 52 ± 5kd, 54 ± 5kd, 56 ± 5kd, 78 ± 5kd, 82 ± 10kd, 116
Eimeria with a molecular weight of ± 10 kd and 250 ± 20 kd
An effective immunizing amount of the purified protein selected from a protein derived from Maxima gametocyte, in combination with a carrier,
A vaccine for imparting immunity to chickens against Eimeria species infection.