JP2608023B2 - Interleukin-1β derivative and pharmaceutical - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新しいポリペプチド、更
に詳しくはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の新
しい誘導体、並びにＩＬ−１β及びその新しい誘導体の
医薬用途に関する。第２回国際リンホカインワークシヨ
ツプにおいて、かつてリンパ球活性化因子（Ｌymphocyt
e Ａctivating Ｆactor ；ＬＡＦ）、マイトジエニツク
プロテイン（Ｍitogenic Ｐrotein）、ヘルパーピー
ク−１（Ｈelper peak−１）、Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ
−cell replacing factorIII（ＴＲＦ−III ）、Ｔ−ce
ll replacing factor Ｍφ（ＴＲＦＭ）〕、Ｂセルアク
チベーテイング フアクター（Ｂ−cell activating fa
ctor）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−cell differationfa
ctor ）などの呼称で報告されてきた生理活性物質は、
いずれもインターロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に
統一されることが決定された〔Ｃellular Ｉmmunol. ，
４８、４３３−４３６（１９７９）〕。この決定は、上
記各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異
なる角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に
基づいている。上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球
やＢリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢
進作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞
に作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プスタグラン
デイン産生を亢進させる作用等を有することも報告され
ている〔Ｒeviews of Ｉnfectious Ｄisease，Ｖol.
６，No. １，５１−５９（１９８４）、Ｎew Ｅnglan
d. Ｊ．of Ｍed. ，３１１，１４１３（１９８４）等
参照〕。しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に関し
ては現在尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活性を
有するポリペプチドもしくはその前駆体をコードする異
なる２種の遺伝子の存在がようやく報告された〔Ｐroc.
Ｎatl.Ａcad ．Ｓci. ，Ｖol. ８１，７９０７−７９１
１（１９８４）、Ｎature ．Ｖol. ３１５，６４１（１
９８５）、ＮucleicＡcid Ｒesearch ，Ｖol. １３（１
６），５８６９（１９８５）〕。これらの報告は２種の
遺伝子の塩基配列から推定される１５９個のアミノ酸配
列を有する「ＩＬ−１α」と１５３個のアミノ酸からな
る「ＩＬ−１β」を記している。しかしながら、従来よ
りコンデイシヨンド メデイウム（conditioned mediu
m）もしくは部分精製したと報告されるものの前述の生
理活性と、上記塩基配列から推定されるポリペプチドと
の関連は、今尚明らかにはされていない。また、上記公
知の生理活性物質としてのＩＬ−１は、内因性の発熱物
質（endogeneous pyrogen ：ＥＰ）とも同一物質である
とされ、発熱性を示すことが知られている〔Ｎature ，
３０４，４４９（１９８３）；Ｃell.Ｉmmunol. ，６
３，１６４（１９８１）；Ｊ．Ｅxp．Ｍed.,１５０，７
０９（１９７９）；Ｊ．Ｉmmunol. ，１３０，（６）２
７０８（１９８３）；同，１３２（３）１３１１（１９
８４）等参照〕。この事実から、従来の生理活性として
のＩＬ−１はもとより、仮に物質として均一なＩＬ−１
が提供されたとしても、その医薬用途への適用は、極め
て困難とされている。本発明は医薬用途に有効に使用で
きる新しい有用なＩＬ−１β誘導体であるポリペプチド
を提供しようとするものである。本発明は新しいＩＬ−
１β誘導体であるポリペプチドの医薬用途を提供しよう
とするものである。本発明は新しいＩＬ−１β誘導体を
コードする遺伝子及びこれを用いて遺伝子工学的手法で
ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドを製造する方法を
提供しようとするものである。本発明はまた均質なＩＬ
−１β自身の新しい医薬用途を提供しようとするもので
ある。上記本発明の目的及びそれら以外の本発明の目的
は以下の記載により明かにする。本発明のＩＬ−１β誘
導体（ポリペプチド）はインターロイキン−１βの下記
（Ａ）式で表されるアミノ酸配列に於て、 式（Ａ） ａ）１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａrg、５位Ｓer、８位Ｃ
ys、１１位Ａrg、３０位Ｈis、７１位Ｃys、９３位Ｌy
s、９７位Ｌys、９８位Ａrg、９９位Ｐhe、１０３位Ｌy
s、１２０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerから
選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されていること、 ｂ）１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列又は
その中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
こと（但し上記ａに記載の１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａ
rg、５位Ｓer及び８位Ｃysから成る群から選ばれたアミ
ノ酸残基の少くとも１つが欠失されている場合を除
く）、 ｃ）１０３位のＬysから１５３位のＳerに至るアミノ酸
配列又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失さ
れていること（但し上記ａに記載の１０３位Ｌys、１２
０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerから成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つが欠失されてい
る場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Ｍet又は下記式（Ｂ）で示さ
れる１’位のＭetから１１６’位のＡspに至るアミノ酸
配列若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加
されていること、 式（Ｂ）The present invention relates to new polypeptides, more particularly to new derivatives of interleukin-1β (IL-1β), and to the pharmaceutical use of IL-1β and its new derivatives. In the 2nd International Lymphokine Workout, once lymphocyte activating factor (Lymphocyt
e Activating Factor (LAF), mitogenic protein, helper peak-1, T lymphocyte surrogate factor [T
-Cell replacing factor III (TRF-III), T-ce
ll replacing factor Mφ (TRFM)], B-cell activating fa
ctor), B lymphocyte differentiation factor
bioactive substances that have been reported under names such as ctor)
All were decided to be unified into the name of interleukin-1 (IL-1) [Cellular Immunol.,
48 , 433-436 (1979)]. This determination is based on the reason that each of the above-mentioned physiologically active substances cannot be distinguished as a substance and merely expresses the physiological activity from different angles. The above-mentioned IL-1 further activates, for example, T lymphocytes and B lymphocytes, has an action of increasing production of interleukin 2 and an action of increasing antibody production, and has an action of increasing protein synthesis by acting on hepatocytes. Has been reported to have an effect of enhancing the production of pstaglandin [Reviews of Infectious Disease, Vol.
6, No. 1, 51-59 (1984), New Englan
d. of Med., 311 , 1413 (1984), etc.]. Although the identity of IL-1 as a substance is currently unknown, the existence of two different genes encoding a polypeptide having LAF activity or a precursor thereof has recently been reported [ Proc.
Natl. Acad. Sci., Vol. 81, 7907-791.
1 (1984), Nature. Vol. 315, 641 (1
985), Nucleic Acid Research, Vol.
6), 5869 (1985)]. These reports describe "IL-1α" having a 159 amino acid sequence deduced from the nucleotide sequences of two genes, and "IL-1β" consisting of 153 amino acids. However, traditionally, conditioned mediu
m) Although it is reported to be partially purified, the relationship between the above-mentioned physiological activity and the polypeptide deduced from the above nucleotide sequence has not been clarified yet. In addition, IL-1 as a known physiologically active substance is considered to be the same substance as an endogenous pyrogen (endogeneous pyrogen: EP), and is known to exhibit pyrogenicity [Nature,
304 , 449 (1983); Cell. Immunol., 6
3 , 164 (1981); Exp. Med., 150 , 7
09 (1979); Immunol., 130 , (6) 2
708 (1983); ibid., 132 (3) 1311 (19)
84) etc.]. From this fact, not only IL-1 as a conventional biological activity but also IL-1 as a substance
Even if is provided, it is extremely difficult to apply it to pharmaceutical uses. An object of the present invention is to provide a polypeptide that is a new and useful IL-1β derivative that can be effectively used for pharmaceutical applications. The present invention provides a new IL-
It is intended to provide a pharmaceutical use of a polypeptide which is a 1β derivative. An object of the present invention is to provide a gene encoding a novel IL-1β derivative and a method for producing a polypeptide which is an IL-1β derivative by genetic engineering using the gene. The present invention also relates to homogeneous IL
It is intended to provide a new pharmaceutical use of -1β itself. The above objects of the present invention and other objects of the present invention will be clarified by the following description. The IL-1β derivative (polypeptide) of the present invention has the following formula (A) in the amino acid sequence of interleukin-1β represented by the following formula (A): a) 1st place Ala, 3rd place Val, 4th place Arg, 5th place Ser, 8th place C
ys, Arg at position 11, His at position 30, Cys at position 71, Ly at position 93
s, Lys at position 97, Arg at position 98, Phe at position 99, Ly at position 103
s, at least one amino acid residue selected from Trp at position 120, Tyr at position 121, and Ser at position 153 has been deleted or substituted with another amino acid; b) position 9 from position Ala at position 9 The amino acid sequence leading to Thr or at least one amino acid residue in the amino acid sequence has been deleted (provided that the first position Ala, the third position Val and the fourth position
rg, unless at least one of the amino acid residues selected from the group consisting of Ser at position 5, and Cys at position 8 is deleted), c) Amino acid sequence from Lys at position 103 to Ser at position 153 or At least one amino acid residue therein has been deleted (however, Lys at position 103, 12
Excluding the case where at least one amino acid residue selected from the group consisting of Trp at position 0, Tyr at position 121 and Ser at position 153 is deleted), d) Met at the N-terminus of the formula (A) or An amino acid sequence from Met at position 1 'to Asp at position 116' shown in formula (B) or a partial amino acid sequence at the C-terminal thereof has been added;

【化１】 というａ）〜ｄ）の条件の少くとも１つを充足する改変
されたアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる
（但し、少くとも７１位Ｃysが他のアミノ酸で置換され
たポリペプチドを除く）。上記及び以下の本明細書に於
けるアミノ酸及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及
びＩＵＡＣ−ＩＵＢによる命名法又は規則に於ける略号
乃至当該分野で慣用されている略号による表示法に従う
ものとする。また塩基配列に於ける核酸の表示も同様と
する。アミノ酸の数又は位置は、欠落及び付加がある場
合であっても、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前記
式（Ａ）アミノ酸配列に従って表示する。但しアミノ酸
位置を示す数値のうちダッシュを付したものは式（Ｂ）
のアミノ酸配列に従う。本発明のＩＬ−１β誘導体は、
ＩＬ−１βの前記式Ａ）に示されるアミノ酸配列におい
て、上記ａ）〜ｄ）の要件の１つ又は２以上を組み合わ
せて充足するアミノ酸配列を含有する新規なポリペプチ
ドである。好ましい誘導体は前記要件ａ）〜ｃ）の少く
とも１つを充足するアミノ酸配列を有するもの及びａ）
〜ｃ）の少くとも１つの要件とｄ）の要件を同時に満足
するアミノ酸配列を有するものである。本発明のＩＬ−
１β誘導体であるポリペプチドの好ましい具体例を挙げ
ると次の通りである。 １）少くとも１位Ａlaが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。 ２）少くとも３位Ｖalが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。 ３）少くとも４位Ａrgが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。 ４）少くとも５位Ｓerが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。 ５）少くとも８位Ｃysが欠失されているか又は他のアミ
ノ酸で置換されているポリペプチド。 ６）少くとも１１位Ａrgが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ７）少くとも３０位Ｈisが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ８）少くとも７１位Ｃysが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ９）少くとも９３位Ｌysが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 10）少くとも９７位Ｌysが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 11）少くとも９８位Ａrgが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 12）少くとも９９位Ｐheが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 13）少くとも１０３位Ｌysが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 14）少くとも１２０位Ｔrpが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 15）少くとも１２１位Ｔyrが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 16）少くとも１５３位Ｓerが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 17）１位のＡlaから３位のＶalに至るアミノ酸配列、１
位のＡlaから６位のＬeuに至るアミノ酸配列又は１位の
Ａlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列が少くとも欠失
されているポリペプチド。 18）１５１位Ｖalから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配
列、１４９位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配
列、１４５位Ａspから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配
列、１４１位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配
列、１２１位Ｔyrから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配列
又は１０３位Ｌysから１５３位Ｓerに至るアミノ酸配列
が少くとも欠失されているポリペプチド。 19）式（Ａ）のＮ末端にＭet、式（Ｂ）で表わされるア
ミノ酸配列７７’位のＭetから１１６’位Ａspに至るア
ミノ酸配列、７１’位Ｍetから１１６’位Ａspに至るア
ミノ酸配列、３２’位Ｍetから１１６’位Ｓerに至るア
ミノ酸配列又は１’位Ｍetから１１６’位Ａspに至るア
ミノ酸配列を少くとも有するポリペプチド。上記本発明
のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βのアミノ酸配列の特
定位置の特定アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、この置換
を行い得る他のアミノ酸は、人体蛋白質を構成するα−
アミノ酸であれば、いずれでもよいが、中性アミノ酸で
あるのが好適である。但し、Ｃysは、そのＳＨ基に基づ
いて、分子内又は分子間ジスルフイド結合を形成するこ
とがあり、これを考慮すれば該アミノ酸はＣys以外の上
記アミノ酸であるのが好ましい。特に好ましいものとし
て例えば４位Ａrgの場合はＧlyを、８位Ｃysの場合はＳ
er又はＡlaを、１１位Ａrgの場合はＧlnを、３０位Ｈis
の場合はＴyrを、７１位Ｃysの場合はＳer、Ａla又はＶ
alを、９３位Ｌysの場合はＬeuを、９８位Ａrgの場合は
Ｌeuを、１０３位Ｌysの場合はＧlnを、１２０位Ｔrpの
場合はＡrgを、１２１位Ｔyrの場合はＧlnを、それぞれ
好ましいものとして例示することができる。本発明のＩ
Ｌ−１β誘導体ならびに本明細書に記載の方法に従い得
られる均質なＩＬ−１βは、例えばＬＡＦ活性、腫瘍細
胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）、即ち腫瘍細胞に対して
特異的にその増殖を抑制する活性、コロニー刺激因子
（Ｃolony stimulating factor：ＣＳＦ）、インターフ
エロン（interferon：ＩＦＮ）、インターロイキン２
（interleukin −２：ＩＬ−２）、インターロイキン３
（interleukin −３：ＩＬ−３）等の種々のサイトカイ
ン（cytokine）類の産生促進活性、即ち例えばヒト細胞
に作用してそれらサイトカイン類の産生を著しく促進さ
せる活性、抗炎症活性、特に例えば関節炎モデル動物に
投与することによって関節炎の進行を効果的に抑制する
活性、放射線障害防止作用、即ち骨髄移植時の放射線全
身照射、癌治療等における放射線照射、放射線事故時に
おける生体障害乃至は重篤な副作用等を予防する作用乃
至防止する作用等を有している。本発明誘導体は上記各
活性のいずれか少なくともひとつの点で優れているか、
或いは（及び）より毒性が低く副作用が少ない点で優れ
ている。従って本発明誘導体ならびに上記の均質なＩＬ
−１βは例えば抗体産生促進やワクチンの効果増強等の
免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例えばＣＳＦ、ＩＬ−２及び
ＩＬ−３等のサイトカイン産生促進剤、抗炎症剤、放射
線障害防止剤等の医薬品として有用である。殊に上記均
質なＩＬ−１β自身が関節炎等の炎症に著効を示すとい
う本発明による新たな知見は、従来ＩＬ−１が炎症をメ
デイエートし、その惹起に関与するとされていた事実に
よれば、おどろくべきことてある。また、本発明誘導体
は上記各活性のいずれか少なくともひとつの点で優れて
いるか、或いは（及び）より毒性が低く副作用が少ない
点で優れている。とりわけ、本発明誘導体は、ＣＳＦ産
生促進剤として有効であり、これをヒトに投与するとき
には、ウィルス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じる
ことなく、癌化学療法や放射線療法後の骨髄低形成によ
る顆粒球減少を有効に回復できる（顆粒球減少治療
剤）。上記ＣＳＦ産生促進剤は、またその本来のＣＳＦ
産生促進作用により、ＣＳＦの作用に基づく各種疾病の
予防及び治療剤としても有効に利用できる。例えば、Ｃ
ＳＦは顆粒球やマクロファージの機能を促進させる作用
がある〔ロペッツら（Ｌopez, Ａ．Ｆ．et al.),Ｊ．Ｉ
mmunol.,１３１，２９８３（１９８３）、ハンダムら
（Ｈandam,Ｅ．et al.),同１２２，１１３４（１９７
９）及びバダスら（Ｖadas, Ｍ．Ａ．et al.), 同１３
０，７９５（１９８３）〕ので、種々の感染症の予防及
び治療剤として臨床応用が期待されており、上記ＣＳＦ
産生促進剤も同様に臨床応用が期待される。殊に、近年
生体防御能が低下乃至障害された個体（compromised ho
st）に、それまで無害であった病原体が病原性を発揮し
て惹起される、所謂日和見感染症（opportunistic infe
ction 或いは terminal infection）は、臨床的に問題
となる病原体（起炎菌）がシュードモナス（Ｐseudomon
as）セラティア（Ｓerratia)等のグラム陰性桿菌、ヘル
ペス（Ｈerpes simplex,ＨＳＶ）、バリセラ−ゾースタ
（Ｖaricella zoster,ＶＺＶ）、サイトメガロウイルス
（Ｃytomegalovirus，ＣＭＶ）等のウイルス、キャンデ
ィダ（Ｃandida albicans ）アスペルギルス（Ａspergi
llus fumigatus）、ノカルディア（Ｎocardia asteroid
ea）等の真菌、カリニ原虫（Ｐneumocystis carinii)、
トキソプラズマ（Ｔoxoplasma gondii）等の原虫等であ
り、現用の抗生物質中には、之等の病原菌に対して充分
な効果を奏し難く、該日和見感染症に対する新しい薬剤
の研究開発が切望されている。本発明誘導体は、かかる
日和見感染症の予防及び治療剤としても有用であり、特
にかかる日和見感染症が高頻度に見られる抗癌剤投与
時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄移植時における各
種の感染症、例えばガンジダ症、クリプトコックス症、
アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感染症、ウィル
ス感染症、サイトメガロウィルス肺炎、之等の合併症等
の予防及び治療剤として有用なものである。更に本発明
誘導体ならびに上記のＩＬ−１βは、上記医薬用途以外
に、そのサイトカイン産生促進活性に基づいて、例えば
細胞株からの各種有用サイトカインのインビトロ（in v
itro）製造に際して極めて有効に使用し得る。かかる細
胞株からの天然型サイトカインの製造は、ことに糖蛋白
質であるサイトカインにおいて着目されており、効率的
にかつ大量に有用サイトカインを収得することができ
る。本発明誘導体中、少くとも７１位Ｃysを置換乃至は
欠失させたもの、特に上記Ｃysを他のアミノ酸、例えば
Ｓer、Ａla、Ｖal等で置換したものは、高活性を示す。
また、少くとも４位Ａrg又は少くとも８位Ｃysを置換乃
至は欠失させた本発明誘導体、及び少くとも１０３位以
降の少なくともひとつのアミノ酸を欠失させた本発明誘
導体は、いずれもプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）産生
促進作用が弱く、従って発熱作用等の副作用ならびに毒
性がより少ない特徴を有し、更に少くとも４位Ａrgを置
換乃至は欠失させた本発明誘導体は、ＧＩＦならびにＬ
ＡＦ活性に比較して、ＣＳＦ産生促進活性ならびに抗炎
症活性がより強い特徴を有している。更に、本発明誘導
体中、式（Ａ）のＮ末端に少くとも上記特定のアミノ酸
もしくはポリペプチドが付加したものは、ＧＩＦ活性及
びＬＡＦ活性に比してＣＳＦ産生促進作用及び抗炎症作
用がより高い特徴を有し、しかも毒性が低く且つ作用の
持続性の点で医薬品として、殊に経口剤乃至は座剤とし
て利用する場合に、より有効である。更に、本発明誘導
体、ことに少くとも８位Ｃys及び／又は７１Ｃysを置換
乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃysを他のアミノ酸、
例えばＳer、Ａla、Ｖal等で置換したものは、種々の条
件下におけるＩＬ−１受容体への結合性において優れて
いる。尚、本発明誘導体の内でＩＬ−１βに比しその分
子中にＣysをより少なく含むか又は含まないものは、Ｃ
ysのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の不要な
形成を考慮すれば、より好ましいものである。本発明の
ポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法により製造す
ることができる。即ち、前記本発明に係わる特定のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を利用し、これを微生物の
ベクターに組込んで該微生物細胞内で、複製、転写、翻
訳させることによって製造することができる。この方法
は、特に大量生産が可能である点より有利である。上記
方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例えば
ホスフアイト トリエステル法〔ネイチヤー（Ｎature
），３１０，１０５（１９８４）〕等の常法に従っ
て、核酸の化学合成により全合成することもできるが、
ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコードする遺伝子を利
用するのが簡便であり、該遺伝子より、上記化学合成手
段を含む常法に従って、前記特定のアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列に改変することにより容易に製造でき
る。ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺伝子は公
知（記述）であり、我々も我々の先の出願（特願昭６０
−１３８２８１号）に記したようにＩＬ−１βをコード
する遺伝子を得、これを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ
−１βを収得するに成功した。之等の一連の遺伝子工学
的手法は後記の参考例において明らかにする。上記核酸
（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよく、目的
とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実施される
〔遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍolecular Ｃ
loning Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory （１９
８２）が参照される〕。例えば、ＤＮＡの切断、結合、
リン酸化等を目的とする制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポ
リヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種
の酵素処理等の常套手段等が採用でき、それら酵素は市
販品として容易に入手できる。之等各操作における遺伝
子乃至核酸の単離、精製も常法、例えばアガロース電気
泳動法等に従えばよい。また得られる遺伝子の複製は、
一部後述するように通常のベクターを利用する方法に従
えばよい。また、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ断片や合成リンカーは上記した化学合成により容易に
製造できる。尚、上記において所望のアミノ酸に対応す
るコドンは自体公知でありまたその選択は任意でよく、
例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法
に従えばよい〔Ｎucl. Ａcids. Ｒes. ，９，４３−
７４（１９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを
一部改変するには、例えば常法どうり、１５〜３０マー
程度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーを用いたサイト−スペシフィック
ミュータジエネシス（Ｓite −Ｓpecific Ｍutagenes
is）〔Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,８１，５６６２−５６
６６（１９８４）〕等の方法を採用することができる。
なお、特許請求の範囲に記載される１もしくは数個のア
ミノ酸を置換・欠失・付加してなるアミノ酸配列とは、
上記サイト−スペシフィック ミュータジエネシスなど
の周知の改変手段を用いて得られる、インターロイキン
−１β活性を損なわない程度に改変されたものをいう。
上記方法により得られる所望の遺伝子は、例えばマキサ
ム−ギルバートの化学修飾法〔Ｍaxam−Ｇilbert, Ｍet
h.Ｅnzym.,６５，４９９−５６０（１９８０）〕やＭ１
３フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
〔Ｍessing, Ｊ．and Ｖieira,Ｊ.,Ｇene,１９，２６９
−２７６（１９８２）〕等により、その塩基配列の決定
及び確認を行なうことができる。上記操作及び方法の具
体例は、後記参考例及び実施例に記述するが、該方法は
特に限定されず、当業界において周知の各種方法のいず
れを採用してもよい。かくして、本発明によれば前記し
た特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
る新規な遺伝子も提供される（以下この遺伝子を「本発
明遺伝子」という）。本発明のポリペプチドは、上記特
定の遺伝子（本発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般
的な遺伝子組換え技術に従い製造できる。より詳細に
は、上記本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できるような
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質
転換し、該形質転換体を培養すればよい。ここで宿主細
胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも用いる
ことができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母
等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばサル
の細胞であるＣos細胞〔Ｙ．Ｇluzman，Ｃell,２３，１
７５−１８２（１９８１）〕やチヤイニーズ・ハムスタ
ー卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｇ．Ｕ
rlaub and Ｌ．Ａ．Ｃhasin ，Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓ
ci.,ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１９８０）〕
等がよく用いられているが、之等に限定される訳ではな
い。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現し
ようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮ
Ａのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了
配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要によ
り複製起源を保有していてもよい。該発現ベクターの例
としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr〔Ｓ．Ｓubramani, Ｒ．Ｍulligan and Ｐ．Ｂ
erg,Ｍol. Ｃell.Ｂiol., １（９），８５４−８６４〕
等を例示できるが、これに限定されない。また真核微生
物としては酵母が一般によく用いられており、その中で
もサツカロミセス属酵母が有利に利用できる。該酵母等
の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホス
フアターゼ遺伝子に対するプロモーターを持つp ＡＭ８
２〔Ａ．Ｍiyanohara et al，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.,ＵＳＡ，８０，１−５（１９８３）〕等を好ましく
利用できる。原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては
一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定さ
れず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用で
きる。プロモーターとしては、例えばトリプトフアン・
プロモーター、Ｐ_Lプロモーター、lacプロモーター、lp
pプロモーター等を使用することができ、いずれの場合
にも本発明遺伝子を発現させることができる。トリプト
フアン・プロモーターを用いる場合を例にとり詳述すれ
ば、発現ベクターとしてトリプトフアン・プロモーター
及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１〔今本文男、代
謝、Ｖol. ２２，２８９（１９８５）〕を使用し、ＳＤ
配列の下流に存在する制限酵素ＣlaＩ部位に、必要に応
じてＡＴＧを付与した所望のポリペプチドをコードする
遺伝子を連結させればよい。尚、直接発現系に限らず、
例えばβ−ガラクトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利
用する融合蛋白質発現系によることもできる。かくして
得られる発現ベクターの宿主細胞への導入及びこれによ
る形質転換の方法としては、一般に用いられている方
法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、Ｃａ
Ｃｌ₂処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にし
て、ベクターを取込ませる方法等を採用できる。上記方
法においては、通常知られているように形質転換の効率
を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂やＲｂＣｌを更に共
存させることもできる。また、宿主細胞をスフエロプラ
スト又はプロトプラスト化してから形質転換させる方法
も採用することができる。かくして得られる所望の形質
転換株は、常法に従い培養することができ、該培養によ
り、所望のポリペプチドが生産、蓄積される。該培養に
用いられる培地としては、通常の細胞培養に慣用される
各種の培地のいずれでもよく、その具体例としては、例
えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知られ
ている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を
添加した培地を例示できる。尚、上記トリプトフアン・
プロモーターを用いた場合には、一般にプロモーターが
働くようにするためにカザミノ酸を添加した、例えばＭ
９最小培地を用いて培養することができ、該培地中には
培養の適当な時期にインドールアクリル酸等のトリプト
フアン・プロモーターの働きを強めるための薬剤を添加
することもできる。このようにして得られる活性物を含
有する培養物からの目的ポリペプチド、即ち本発明ポリ
ペプチドの精製、単離は常法に従って行なうことができ
る。尚、本発明ポリペプチドを宿主から抽出するに当っ
ては、例えば浸透圧シヨツク法等の温和な条件を採用す
るのが、その高次構造保持の面からより好ましい。上記
精製、単離は、例えば当該ポリペプチドの物理、化学的
性質を利用した各種の処理操作に従い実施することがで
きる〔例えば「生化学データーブツクII」pp１１７５〜
１２５９、第１版第１印刷、１９８０年６月２３日、株
式会社東京化学同人発行参照〕。該方法としては、具体
的には例えば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、
分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル濾過）、液体クロ
マトグラフイー、遠心分離、電気泳動、アフイニテイク
ロマトグラフイー、透析法、之等の組合せ等を採用でき
る。より具体的には、上記操作は、例えば以下のごとく
して実施できる。即ち、まず培養上清より予め目的とす
るポリペプチドを部分精製する。この部分精製は、例え
ばアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、
過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸
を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニウム、硫
酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処
理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限
外濾過処理等により行なわれる。之等の各処理の操作及
び条件は、通常のこの種方法のそれらと同様のものとす
ればよい。次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過
に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を収
得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に限
定はなく、例えばデキストランゲル、ポリアクリルアミ
ドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロ
ースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも利
用できる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧタ
イプ、同ＬＨタイプ、セフアロースタイプ、セフアクリ
ルタイプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン
（チツソ株式会社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ
（バイオ−ラド社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示で
きる。目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過により
得られる活性画分を、例えばハイドロキシアパタイトカ
ラムを用いたアフイニテイークロマトグラフイー、ＤＥ
ＡＥ法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマト
グラフイー、クロマトフオーカシング法、逆相高速液体
クロマトグラフイー等に付すことにより、又は之等各操
作の組合せにより更に精製することができ、均質な物質
として単離することができる。上記クロマトフオーカシ
ング法は、公知の各種方法により実施できる。カラムと
しては、例えばＰＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、
開始緩衝液としては、例えばイミダゾール−塩酸等を、
また溶出液としては、例えばポリバツフアー７４（フア
ルマシア社製）−塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。
上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、例えばＣ₄ハ
イポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラド社（Ｂio−
Ｒad Ｌaboratories ））等を用いて、移動剤としてア
セトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及び
之等の混合溶媒を用いて実施できる。かくして本発明Ｉ
Ｌ−１β誘導体（ポリペプチド）を単離、収得できる。
ＩＬ−１βをコードする遺伝子から同種の遺伝子組換え
操作でＩＬ−１βを収得できる。得られる本発明ポリペ
プチド又はＩＬ−１βは、前述した如く優れた薬理活性
を有することから、前述した各種の医薬用途に有用な医
薬製剤とすることができる。斯かる医薬製剤にはたとえ
ば抗体産生やワクチン効果の増強並びに免疫不全症の治
療等の免疫刺激剤、抗腫瘍剤、サイトカイン類の産生促
進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤、日和見感染症治療
剤等が包含される。該医薬製剤は、通常本発明ポリペプ
チド又はＩＬ−１βの薬理有効量と共に適当な医薬製剤
担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。該製剤
担体としては使用形態に応じた製剤を調製するのに通常
慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用でき
る。製剤組成物の形態は、これが本発明ポリペプチド又
はＩＬ−１βを効果的に含有する状態であれば、特に限
定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤
であつてもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤
形態とするのが好適である。またこれは使用前に適当な
担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることも
できる。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調製さ
れ得る。得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応
じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤は、
静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により投与
され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され
得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与量
は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適用
される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定ではな
いが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する製
剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効成
分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度と
なる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１回
である必要はなく一日３〜４回に分けることもできる。Embedded image Characterized by having a modified amino acid sequence that satisfies at least one of the conditions a) to d) (excluding polypeptides in which at least Cys at position 71 is substituted with another amino acid). Above and below, the designation of amino acids and polypeptides in the present specification is based on the abbreviations in the nomenclature or rules according to IUPAC and IUAC-IUB or the abbreviations commonly used in the art. The same applies to the display of nucleic acids in base sequences. The number or position of amino acids are indicated in accordance with the amino acid sequence of IL-1β, that is, the amino acid sequence of the above formula (A), even if there is a deletion or addition. However, the numerical value indicating the amino acid position with a dash is the formula (B)
According to the amino acid sequence of The IL-1β derivative of the present invention comprises
It is a novel polypeptide containing an amino acid sequence that satisfies one or more of the above requirements a) to d) in the amino acid sequence represented by the formula A) of IL-1β. Preferred derivatives are those having an amino acid sequence satisfying at least one of the above requirements a) to c) and a)
It has an amino acid sequence that satisfies at least one of the requirements (c) and (d) at the same time. IL- of the present invention
Preferred specific examples of polypeptides that are 1β derivatives are as follows. 1) A polypeptide in which at least position 1 Ala has been deleted or replaced with another amino acid. 2) A polypeptide in which at least Val in position 3 has been deleted or substituted with another amino acid. 3) A polypeptide wherein at least position 4 Arg has been deleted or replaced with another amino acid. 4) A polypeptide wherein at least Ser at position 5 has been deleted or substituted with another amino acid. 5) A polypeptide wherein at least Cys at position 8 has been deleted or replaced with another amino acid. 6) A polypeptide wherein at least position 11 Arg has been deleted or substituted with another amino acid. 7) A polypeptide wherein at least His at position 30 has been deleted or substituted with another amino acid. 8) A polypeptide wherein at least Cys at position 71 has been deleted or substituted with another amino acid. 9) A polypeptide wherein at least Lys at position 93 has been deleted or substituted with another amino acid. 10) A polypeptide wherein at least Lys at position 97 has been deleted or substituted with another amino acid. 11) A polypeptide wherein at least position 98 Arg has been deleted or substituted with another amino acid. 12) A polypeptide wherein at least Phe at position 99 has been deleted or substituted with another amino acid. 13) A polypeptide wherein at least Lys at position 103 has been deleted or substituted with another amino acid. 14) A polypeptide wherein at least Trp at position 120 has been deleted or substituted with another amino acid. 15) A polypeptide wherein at least Tyr at position 121 has been deleted or substituted with another amino acid. 16) A polypeptide wherein at least Ser at position 153 has been deleted or substituted with another amino acid. 17) Amino acid sequence from Ala at position 1 to Val at position 3, 1
A polypeptide wherein the amino acid sequence from Ala at position 6 to Leu at position 6 or the amino acid sequence from Ala at position 1 to Thr at position 9 is at least deleted. 18) an amino acid sequence from Val 151 to Ser at position 153, an amino acid sequence from Gln to Ser at position 153, an amino acid sequence from Asp to Ser at position 153, and an amino acid sequence from Gln to Ser at position 153; A polypeptide wherein the amino acid sequence from Tyr at position 121 to Ser at position 153 or the amino acid sequence from Lys at position 103 to Ser at position 153 is at least deleted. 19) Met at the N-terminus of formula (A), amino acid sequence from Met at position 77 'to Asp at position 116', amino acid sequence from Met at position 71 'to Asp at position 116' represented by formula (B), A polypeptide having at least an amino acid sequence from Met 32 'to Ser at 116' or an amino acid sequence from Met at 1 'to Asp at 116'. The IL-1β derivative of the present invention includes a polypeptide having an amino acid sequence in which a specific amino acid at a specific position in the amino acid sequence of IL-1β has been substituted with another amino acid. Α- which constitutes human protein
Any amino acid may be used, but a neutral amino acid is preferred. However, Cys may form an intramolecular or intermolecular disulfide bond based on its SH group, and in consideration of this, it is preferable that the amino acid is the above amino acid other than Cys. Particularly preferred are, for example, Gly in the case of 4-position Arg and S in the case of 8-position Cys.
er or Ala, Gln for 11th Arg, 30th His
Is Tyr, and in the case of Cys at position 71, Ser, Ala or V
al, Leu for Lys at position 93, Leu for Arg at position 98, Gln for Lys at position 103, Arg for Trp at position 120, and Gln for Tyr at position 121, respectively. Can be exemplified. I of the present invention
L-1β derivatives as well as homogeneous IL-1β obtained according to the methods described herein, for example, have LAF activity, tumor cell growth inhibitory activity (GIF activity), ie, specifically inhibit its growth on tumor cells Activity, colony stimulating factor (CSF), interferon (IFN), interleukin 2
(Interleukin-2: IL-2), interleukin-3
(Interleukin-3: IL-3) and other cytokines, such as an activity for promoting the production of cytokines by acting on human cells, for example, an anti-inflammatory activity, particularly, for example, an arthritis model Activity that effectively suppresses the progression of arthritis when administered to animals, radiation-inhibiting action, ie, whole-body irradiation during bone marrow transplantation, irradiation during cancer treatment, etc., biological damage or serious side effects during radiation accidents And the like. The derivative of the present invention is excellent in at least one of the above activities,
Alternatively, it is superior in that it is less toxic and has fewer side effects. Therefore, the derivative of the present invention and the above-mentioned homogeneous IL
-1β is, for example, an immune system stimulant for promoting antibody production or enhancing the effect of a vaccine, an antitumor agent, for example, a cytokine production promoter such as CSF, IL-2 and IL-3, an anti-inflammatory agent, a radiation damage inhibitor, Useful as pharmaceuticals. In particular, the new finding of the present invention that the above-mentioned homogeneous IL-1β itself has a remarkable effect on inflammation such as arthritis is based on the fact that IL-1 conventionally mediates inflammation and is involved in causing it. There's something amazing to do. Further, the derivative of the present invention is superior in at least one of the above-mentioned activities, and / or is superior in that it has lower toxicity and fewer side effects. In particular, the derivative of the present invention is effective as a CSF production promoter, and when administered to humans, does not cause risks such as virus infection or antigen-antibody reaction, and causes bone marrow hypoplasia after cancer chemotherapy or radiation therapy. Can effectively recover granulocytopenia caused by the drug (therapeutic agent for granulocytopenia). The above-mentioned CSF production promoter also has its original CSF
Due to the production promoting action, it can be effectively used as an agent for preventing and treating various diseases based on the action of CSF. For example, C
SF has an effect of promoting the function of granulocytes and macrophages [Lopez, AF et al., J. Am. I
mmunol., 131 , 2983 (1983); Handam, E. et al., 122 , 1134 (197).
9) and Vadas, MA et al., 13
0 , 795 (1983)], and is expected to be applied clinically as a prophylactic and therapeutic agent for various infectious diseases.
Production promoters are also expected to have clinical applications. In particular, individuals whose biological defense ability has been reduced or impaired in recent years (compromised ho
St), a so-called opportunistic infectious disease (opportunistic infe
ction or terminal infection is a clinically problematic pathogen (causative agent) caused by Pseudomonas
as) Gram-negative bacilli such as Serratia, herpes (Herpes simplex, HSV), viruses such as Varicella zoster (VZV), cytomegalovirus (Cytomegalovirus, CMV), Candida (Candida albicans) Aspergillus ( Aspergi
llus fumigatus, Nocardia asteroid
ea), fungi such as Carini parasite (Pneumocystis carinii),
It is a protozoan such as Toxoplasma gondii and the like, and it is difficult for current antibiotics to exert a sufficient effect against such pathogens. Therefore, research and development of a new drug for the opportunistic infectious disease is strongly desired. The derivative of the present invention is also useful as a prophylactic and therapeutic agent for such opportunistic infections, and in particular, for various infectious diseases at the time of administration of anticancer drugs where such opportunistic infections are frequently observed, that is, at the time of chemotherapy or bone marrow transplantation for acute leukemia. For example, gandidosis, cryptococcosis,
It is useful as a preventive and therapeutic agent for complications such as aspergillosis, zygomycosis, black fungal infection, viral infection, cytomegalovirus pneumonia, etc. Furthermore, in addition to the above-mentioned pharmaceutical uses, the derivative of the present invention and the above-mentioned IL-1β can be used, for example, in vitro (in v
Itro) can be used very effectively in production. The production of natural cytokines from such cell lines has attracted particular attention for cytokines that are glycoproteins, and useful cytokines can be obtained efficiently and in large quantities. Among the derivatives of the present invention, those in which at least the Cys at position 71 has been substituted or deleted, particularly those in which the above Cys has been substituted with another amino acid such as Ser, Ala, Val, etc., show high activity.
In addition, the derivatives of the present invention in which at least the 4-position Arg or at least the 8-position Cys are substituted or deleted, and the derivatives of the present invention in which at least one amino acid after the 103-position are deleted are all prostaglandins. The derivative of the present invention, which has a weak characteristic of promoting the production of gin E (PGE) and therefore has less side effects such as a pyrogenic effect and less toxicity, and further has a GIF and L
Compared with AF activity, CSF production promoting activity and anti-inflammatory activity have stronger characteristics. Further, among the derivatives of the present invention, those in which at least the specific amino acid or polypeptide described above is added to the N-terminus of the formula (A) have a higher CSF production promoting action and anti-inflammatory action than GIF activity and LAF activity. It is more effective when it is used as a pharmaceutical, especially as an oral preparation or a suppository, because it has characteristics, low toxicity and long-lasting action. Furthermore, the derivatives of the present invention, particularly those in which at least Cys and / or 71 Cys at the 8-position are substituted or deleted, especially the above-mentioned Cys is replaced with another amino acid,
For example, those substituted with Ser, Ala, Val and the like are excellent in binding to the IL-1 receptor under various conditions. Among the derivatives of the present invention, those containing less or no Cys in the molecule compared to IL-1β are
This is more preferable in consideration of unnecessary formation of intramolecular or intermolecular bonds based on the SH group of ys. The polypeptide of the present invention can be produced by, for example, a genetic engineering technique. That is, it can be produced by utilizing a gene encoding the specific polypeptide according to the present invention, integrating the gene into a vector of a microorganism, and replicating, transcribing and translating in the cells of the microorganism. This method is particularly advantageous in that mass production is possible. The gene used in the above method can be prepared by a conventional method, for example, the phosphite triester method [Nature (Nature)
), 310 , 105 (1984)], etc., and can be totally synthesized by chemical synthesis of nucleic acids.
It is convenient to use a gene encoding IL-1β or its precursor, and it is easy to modify the gene into a nucleic acid sequence encoding the specific amino acid sequence according to a conventional method including the above-described chemical synthesis means. Can be manufactured. The gene encoding IL-1β or a precursor thereof is known (description), and we have also filed our earlier application (Japanese Patent Application No. Sho 60 (1994)).
No. 138281), a gene encoding IL-1β was obtained, and the gene encoding IL-1β was used by genetic engineering techniques.
-1β was successfully obtained. Such a series of genetic engineering techniques will be clarified in Reference Examples described later. Modification of the nucleic acid (base) sequence may be performed according to a known method, and is carried out in accordance with the amino acid sequence of the target polypeptide [Genetic engineering techniques include, for example, Molecular C
loning Cold Spring Harbor Laboratory (19
82)]. For example, DNA cleavage, binding,
Conventional means such as various enzyme treatments such as restriction enzymes for the purpose of phosphorylation, DNA ligase, polynucleotide kinase, and DNA polymerase can be employed, and these enzymes can be easily obtained as commercial products. The isolation and purification of the gene or nucleic acid in each operation may be performed according to a conventional method, for example, agarose electrophoresis. The resulting gene replication is
As described later in part, a method using a normal vector may be used. In addition, DN encoding the desired amino acid sequence
The fragment A and the synthetic linker can be easily produced by the chemical synthesis described above. In the above, the codon corresponding to the desired amino acid is known per se and its selection may be arbitrary,
For example, a conventional method may be used in consideration of the codon usage of the host to be used [Nucl. Acids. Res., 9, 43-
74 (1981)]. In order to partially modify the codons of these nucleic acid sequences, for example, in the usual manner, a site-specific mutagenesis (about 15 to 30 mer) using a primer composed of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification is used. Site-Speccific Mutagenes
is) [Proc. Natl. Acad. Sci., 81 , 5662-56.
66 (1984)].
It should be noted that one or several contacts described in the claims may be used.
The amino acid sequence obtained by substituting, deleting, or adding amino acids is
The above site-specific Mutagenesis etc.
Interleukin obtained using known modification means of
Refers to those modified so as not to impair -1β activity.
The desired gene obtained by the above method can be obtained by, for example, a chemical modification method of Maxam-Gilbert [Maxam-Gilbert, Met.
h. Enzym., 65 , 499-560 (1980)] and M1
Dideoxynucleotide chain termination using 3 phages [Messing, J. et al. and Vieira, J., Gene, 19 , 269
-276 (1982)] can determine and confirm the nucleotide sequence. Specific examples of the above operations and methods are described in Reference Examples and Examples below, but the methods are not particularly limited, and any of various methods known in the art may be employed. Thus, according to the present invention, there is also provided a novel gene encoding a polypeptide having the specific amino acid sequence described above (hereinafter, this gene is referred to as "gene of the present invention"). The polypeptide of the present invention can be produced using the above-mentioned specific gene (the gene of the present invention) according to a conventionally known general gene recombination technique. More specifically, a recombinant DNA capable of expressing the gene of the present invention in a host cell may be prepared, introduced into the host cell, transformed, and the transformant may be cultured. Here, any of eukaryotes and prokaryotes can be used as host cells. The eukaryotic cells include cells such as vertebrates and yeast, and the vertebrate cells include, for example, Cos cells [Y. Gluzman, Cell, 23 , 1
75-182 (1981)] and a dihydrofolate reductase-deficient strain of Chinese hamster ovary cells [G. U
rlaub and L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. S
ci., USA, 77 , 4216-4220 (1980)]
Are often used, but are not limited to these. Examples of vertebrate cell expression vectors include a promoter, RN, which is usually located upstream of the gene to be expressed.
Those having a splice site, polyadenylation site, transcription termination sequence and the like of A can be used, and may further have an origin of replication if necessary. Examples of the expression vector include pS carrying the early promoter of SV40.
V2dhfr [S. Subramani, R.A. Mulligan and P.M. B
erg, Mol. Cell. Biol., 1 (9), 854-864].
Etc. can be exemplified, but the present invention is not limited to this. In addition, yeast is generally used as a eukaryotic microorganism, and among them, yeast belonging to the genus Saccharomyces can be advantageously used. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include pAM8 having a promoter for the acid phosphatase gene.
2 [A. Miyanohara et al, Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, 80 , 1-5 (1983)]. Escherichia coli and Bacillus subtilis are commonly used as prokaryotic hosts. In the present invention, for example, a plasmid vector capable of replicating in the host bacterium is used, and a promoter and an SD (Shine and Dalgarno) base sequence, as well as protein synthesis, are upstream of the gene so that the gene of the present invention can be expressed in the vector. An expression plasmid provided with ATG necessary for initiation can be used. Escherichia coli as the host bacterium includes Escherichia coli.
coli) K12 strain and the like, and the vector is generally pBR322, but is not limited thereto, and any of various known strains and vectors can be used. As a promoter, for example, tryptophan
Promoter, P _L promoter, lac promoter, lp
A p promoter or the like can be used, and in any case, the gene of the present invention can be expressed. For example, using the tryptophan promoter as an example, the vector pTM1 having a tryptophan promoter and an SD sequence [Kokubunko, Metabolism, Vol. 22, 289 (1985)] is used as an expression vector.
The gene encoding the desired polypeptide to which ATG has been added may be ligated to the restriction enzyme ClaI site located downstream of the sequence, if necessary. In addition, not only in the direct expression system,
For example, a fusion protein expression system utilizing β-galactosidase or β-lactamase can be used. As a method for introducing the thus obtained expression vector into a host cell and transforming the same with a host cell, generally used methods, for example, collecting cells mainly in logarithmic growth phase,
It is possible to employ a method in which the DNA is naturally taken up by treatment with Cl ₂ to incorporate the vector. In the above method, MgCl ₂ or RbCl can be further coexistent to further improve the efficiency of transformation, as is generally known. Alternatively, a method of transforming a host cell into spheroplasts or protoplasts and then transforming the same can be employed. The desired transformant thus obtained can be cultured according to a conventional method, and the desired polypeptide is produced and accumulated by the culture. The medium used for the culture may be any of various types of medium commonly used for ordinary cell culture, and specific examples thereof are generally known in, for example, L medium, E medium, M9 medium and the like. A medium to which various carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and the like are added can be exemplified. In addition, the tryptophan
When a promoter is used, casamino acid is generally added to make the promoter work.
Culture can be performed using 9 minimal media, and an agent for enhancing the function of a tryptophan promoter such as indoleacrylic acid can be added to the culture at an appropriate time during the culture. Purification and isolation of the target polypeptide, ie, the polypeptide of the present invention, from the culture containing the active substance thus obtained can be carried out according to a conventional method. In extracting the polypeptide of the present invention from a host, it is more preferable to adopt mild conditions such as an osmotic pressure method from the viewpoint of maintaining the higher-order structure. The above-mentioned purification and isolation can be performed, for example, according to various processing operations utilizing the physical and chemical properties of the polypeptide [for example, “Biochemical Database II” pp1175-
1259, 1st edition, 1st printing, June 23, 1980, issued by Tokyo Chemical Co., Ltd.). As the method, specifically, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration,
Molecular sieve chromatography (gel filtration), liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, affinity chromatography, dialysis, combinations thereof, and the like can be employed. More specifically, the above operation can be performed, for example, as follows. That is, first, the target polypeptide is partially purified from the culture supernatant in advance. This partial purification includes, for example, acetone, methanol, ethanol, propanol,
Organic solvents such as dimethylformamide (DMF) and acetic acid,
Treatment using an acid such as perchloric acid (PCA) or trichloroacetic acid (TCA) as a protein precipitant, treatment using a salting-out agent such as ammonium sulfate, sodium sulfate, sodium phosphate and / or dialysis membrane, flat membrane, hollow fiber It is performed by an ultrafiltration treatment using a membrane or the like. The operation and conditions of each of these processes may be the same as those of a normal method of this kind. Next, the crude product obtained above is subjected to gel filtration to obtain a fraction in which the activity of the target substance is recognized. The gel filtration agent used here is not particularly limited, and for example, any of dextran gel, polyacrylamide gel, agarose gel, polyacrylamide-agarose gel, cellulose and the like can be used. Specific examples of these include Cephadex G type, LH type, Cephaloose type, Cefacryl type (above, Pharmacia), Cellulofine (Chitsuso), Biogel P type, A type (Bio-Rad) , Ultrogel (LKB), TS
Commercially available products such as KG type (Toyo Soda Co., Ltd.) can be exemplified. The polypeptide of interest is obtained by subjecting the active fraction obtained by the above gel filtration to affinity chromatography using, for example, a hydroxyapatite column, DE
It can be further purified by ion exchange column chromatography such as AE method, CM method, SP method, etc., chromatofocusing method, reversed phase high performance liquid chromatography, or a combination of these operations. Can be isolated as a homogeneous substance. The above-described chromatofocusing method can be performed by various known methods. Examples of the column include PBE94 (manufactured by Pharmacia) and the like.
As the starting buffer, for example, imidazole-hydrochloride,
As the eluate, for example, Polybuffer 74 (manufactured by Pharmacia) -hydrochloric acid (pH 4.0) or the like can be used.
The reverse-phase high-performance liquid chromatography, for example C ₄ Haipoa reverse phase HPLC column (Bio - Rad (Bio-
Rad Laboratories)) and the like, and acetonitrile, trifluoroacetic acid (TFA), water and the like and a mixed solvent thereof as a transfer agent. Thus, the present invention I
An L-1β derivative (polypeptide) can be isolated and obtained.
IL-1β can be obtained from the gene encoding IL-1β by the same genetic recombination operation. Since the obtained polypeptide of the present invention or IL-1β has excellent pharmacological activity as described above, it can be used as a pharmaceutical preparation useful for the above-mentioned various pharmaceutical uses. Such pharmaceutical preparations include, for example, immunostimulants for enhancing antibody production and vaccine effects and for treating immunodeficiency, antitumor agents, cytokines promoters, anti-inflammatory agents, radiation damage inhibitors, treatment of opportunistic infections Agents and the like. The pharmaceutical preparation is usually prepared in the form of a pharmaceutical composition by mixing a pharmacologically effective amount of the polypeptide of the present invention or IL-1β with an appropriate pharmaceutical preparation carrier. As the pharmaceutical carrier, a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant, ordinarily used for preparing a pharmaceutical preparation according to a use form,
Any excipient or diluent such as a surfactant can be used. The form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it contains the polypeptide of the present invention or IL-1β effectively. For example, the composition may be a solid preparation such as a tablet, a powder, a granule or a pill. However, it is usually preferable to prepare an injection preparation such as a solution, suspension, emulsion and the like. It can also be a dry product which can be made liquid before use by adding an appropriate carrier. Any of these pharmaceutical compositions can be prepared according to a conventional method. The obtained pharmaceutical preparation may be administered by an appropriate route depending on the form of the pharmaceutical composition, for example, a pharmaceutical preparation in the form of an injection,
It is administered by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal administration and the like, and a solid pharmaceutical preparation can be administered orally or enterally. The amount of the active ingredient in the pharmaceutical preparation and the dosage of the preparation are appropriately selected depending on the administration method of the preparation, the administration form, the purpose of use, the symptoms of the patient to whom the preparation is applied, etc. The preparation is prepared in the form of a preparation containing about 1 to 80% by weight of the active ingredient, and this preparation is administered so that the amount of the active ingredient contained therein is about 0.1 μg to 10 mg per adult per day. Is desirable. The administration need not be once a day, but can be divided into three to four times a day.

【実施例】以下、ＩＬ−１βを製造する参考例及び本発
明誘導体を製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳し
く説明する。下記各例では、本発明誘導体に関して、之
等を簡略化するため、以下の略号を付した。また、以下
の各例において各種生理活性は、次の方法により測定し
た。The present invention will be described in more detail with reference to the following Reference Examples for producing IL-1β and Examples for producing the derivatives of the present invention. In each of the following examples, the following abbreviations have been assigned to the derivatives of the present invention in order to simplify the description. In each of the following examples, various physiological activities were measured by the following methods.

【化２】 Embedded image

【化３】 Embedded image

【化４】 Embedded image

【化５】 Embedded image

【化６】 〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オツペンハインら（Ｊ．Ｊ．Ｏppenhein et al）の方法
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１１６，１４６６（１９７６）〕に従
い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウスの胸腺細胞を利用して測定
したＬＡＦ活性により表示した。 （２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０⁴個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニユウト
ラルレツド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこの ＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。 参考例１ プラスミドｐＧＩＦ−αの製造 (1)ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾
配遠心法〔Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．４，８０８（１９７
４）〕により末梢血リンパ球１．９×１０¹⁰個を得た。
このリンパ球を４×１０⁸／ｍｌの細胞濃度で、ヒト血
清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、直径９
cmのシヤーレに分注後、５％炭酸ガス中、３７℃で１時
間培養した。その後、シヤーレ底部に付着していない細
胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ（シグマ（Ｓ
igma）社製）０．５ng／ｍｌ及びＬＰＳ（デイフコ（Ｄ
ifco）社製）１０μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０培
地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガス中、３７℃で４時
間培養した後、ＰＢＳ及び０．０２％ＥＤＴＡにて付着
性リンパ球９×１０⁸個を得た。 (2) mＲＮＡの調製 上記(1)で得たヒト付着性リンパ球を、６Ｍ−グアニジ
ンチオシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシア
ネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、
０．１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシ
ル（Ｓarkosyl ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注射針
をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断した。
この溶液に塩化セシウム（ＣｓＣｌ）１２ｇを添加し、
完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７Ｍ
ＣｓＣｌ（５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．１ＭＥＤＴＡ）４
ｍｌに重層し、ベツクマンローター（Ｂeckman ＳＷ−
４０Ｔi rotor ）にて２５℃で３１５００rpm で２０時
間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレツトを７０％エタノ
ールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ
７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．２容のエタノー
ルを加えて、−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５
０００rpm で２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ溶
液に溶解させた。かくして付着性リンパ球約９×１０⁸
細胞から、全ＲＮＡ２５０μｇを得た。次に、上記で得
たＲＮＡからｍＲＮＡを取得するために、オリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロース（Ｃollaborative Ｒesearch Ｉn
c．）を用いてカラムクロマトグラフイーを行なつた。
吸着は、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．５
ＭＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡにて行ない、カラムを同
溶液にて洗浄後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）
及び１ｍＭ ＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。この結
果、溶出されたｍＲＮＡ量は、１７．５μｇであつた。 (3)ｃＤＮＡの調製 上記(2)で得たｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを、インビトロ
で合成し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Ｏ
kayama，Ｈ．and Ｂerg,Ｐ.,Ｍol．Ｃell.Ｂiol., ２，
１６１（１９８２）〕を用いて組換え体ＤＮＡを作成
し、これをエシエリヒア・コリにトランスホームして、
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通りで
ある。 (3)−１）ベクター・プライマーとリンカーＤＮＡの調
製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫpnＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７℃
で５時間消化し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を停止
させた後、等容のフエノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心後、
７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得られ
たＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ₂，０．
１ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭｄＴＴＰ（α−³²Ｐ−ｄ
ＴＴＰ ０．５μＣi を含む）２００μｌに溶解させ、
ターミナルトランスフエラーゼ（ＴＴase ，ＰＬ）４０
０単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ １０μｌとを加
えて反応を停止させ、フエノール−クロロホルム抽出を
４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収し
た。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。次に、
上記で得たＤＮＡを、ＨpaＩ（ＮＥＢ）１７単位を用い
て、３７℃で６時間消化し、アガロース（低融点アガロ
ース，ＢＲＬ，１％）電気泳動にて約２．７kbのＤＮＡ
断片の回収を行なつた。電気泳動後、エチジウムブロマ
イド０．５μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下
で約２．７kbの断片を含むアガロースを切り出し、５倍
容の２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを加え、６５℃で５分間でアガロースを溶解後、
フエノール抽出、フエノール−クロロホルム（１：１）
抽出及びクロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈
澱にてＤＮＡを回収した。 次にオリゴ（ｄＡ）セルロ
ースカラムクロマトグラフイーでベクタープライマーＤ
ＮＡの精製を行なつた。上記ＤＮＡを１０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１Ｍ ＮａＣ
ｌ緩衝液１ｍｌに溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡
化したカラムに載せ、同緩衝液１ｍｌで洗浄後、室温に
戻して、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ
ＥＤＴＡで、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を
集め、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収後、１０m Ｍト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ１００μ
ｌに溶かし、４℃で保存した。リンカーＤＮＡを次の通
り調製した。即ち、ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．１９
〜０．３２）ＤＮＡ１００μｇを、ＰstＩ（ＮＥＢ）１
２０単位で、３７℃下、１．５時間消化後、反応を停止
させ、フエノール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱
を行なつた。ＤＮＡを回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナ
トリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ （ｐＨ６．８）、１
ｍＭ ＣｏＣｌ₂、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍＭ
ｄＧＴＰ（１μＣi のα−³²Ｐ−ｄＧＴＰを含む）５０
μｌに溶解し、ＴＴase ６０単位を２０分間作用させ
た。この結果、１８残基のｄＧ鎖が付加された。反応停
止後、ＤＮＡを回収し、Ｈind III（宝酒造）５０単位
で消化し、前記したようにアガロース（１．８％）電気
泳動で約０．２８kbのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇ
のリンカーＤＮＡを得た。 (3)−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリーの作
製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μｌ（５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、３０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μＣi α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、
５分間３７℃にて保温した。ＲＴase（リバーストラン
スクリプターゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、３
７℃で１５分間反応させた後、再度ＲＴase １０単位を
加え、更に１５分間保温した。０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐ８．０）２μｌと１０％ＳＤＳ１μｌとを加えて反
応を停止させた後、フエノール−クロロホルム抽出を行
ない、４Ｍ酢酸アンモニウム２０μｌとエタノール８０
μｌとを加え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室温で
融解し、１５０００rpm、４℃で１０分間遠心し、沈澱
させた。沈澱を１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）２
０μｌに溶かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μｌとエタ
ノール８０μｌとを加えて再沈澱させた。沈澱を回収
し、７０％エタノールで洗つた後、１４０ｍＭカコジル
酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、
１ｍＭ ＣｏＣｌ₂、０．１ｍＭＤＴＴ、０．２μｇポ
リＡ及び６６μＭ〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（１０μＣｉ）
１５μｌに溶解した。ＴＴase（Ｐ．Ｌ．）１８単位を
加え、３７℃で５分間反応させた後、０℃に急冷し、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１．３μｌと１０％ＳＤＳ ０．
６５μｌとで反応を停止させ、フエノール−クロロホル
ム抽出及びエタノール沈澱を行なつた。沈澱を遠心して
回収後、Ｈind III（宝酒造）４単位で３７℃で２時間
消化し、反応停止後、フエノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈澱を行なつた。沈澱を回収後、１０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）及び１ｍＭ ＥＤＴＡの
１０μｌに溶かし、エタノール３μｌを加え、−２０℃
で保存した。上記で得た試料１μｌをリンカーＤＮＡ５
ngと共に、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ ＮａＣｌ １０μｌ中で、６
５℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した後、０
℃に冷却した。これに２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、
０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ、５０μｇ
／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌエシエリヒア コリＤＮ
Ａリガーゼの混合溶液を９０μｌ加え、全液量を１００
μｌとし、１２℃で一夜保存した。次いで、１０ｍＭ
ｄＮＴＰ ０．５μｌ、 １０ｍＭ ＮＡＤ ０．５６
μｌ、エシエリヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ベー
リンガーマンハイム社製）０．５μｌ及びＲＮase Ｈ
（ＰＬ）０．２μｌを加え、１２℃及び２５℃で順次１
時間ずつ保温した後、−２０℃で凍結保存した。エシエ
リヒア コリＨＢ１０１株を、ＬＢ培地（バクト−トリ
プトン１０ｇ、バクト−イースト抽出物５ｇ及びＮａＣ
ｌ １０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ₅₅₀＝０．４５まで培養
し、５分間氷冷後、４℃で８０００rpmで５分間遠心し
て菌体を回収した。菌体のペレツトを氷冷した３０ｍＭ
酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣｌ、１０ｍＭ Ｃa
Ｃｌ₂、５０ｍＭ ＭｎＣｌ、１５％グリセリンに懸濁
させ、０℃で５分間保ち、４℃、８０００rpm 、５分間
遠心し、得られた菌体を、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホ
リノプロパンスルホニツクアシツド）、７５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、１５％グリセリンに再度
懸濁させ、０℃にて１５分間保温して、コンピテント細
胞を作製した。かくして得られたコンピテント細胞は、
その後−７０℃で保存した。凍結菌液を室温で融解し、
４００μｌの菌液に対して上記ＤＮＡ試料２０μｌを加
え、３０分間０℃に放置した後、４２℃で９０秒間熱シ
ヨツクを与え、再び０℃で１〜２分間静置した。これに
ＬＢ培地２ｍｌを加え、３７℃で３０分間保温し、５０
容のＬＢ培地に植菌し、３７℃で６時間培養した後、５
０μg ／ｍｌになるようにアンピシリンを加え、更に一
夜培養し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤ
ＮＡライブラリーは、５０％グリセリン中で−２０℃に
て保存した。 (3)−３）合成プローブの作製 ＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する形質転換株の
選出のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相
補的な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により
合成した。Embedded image <Measurement of Activity> (1) Measurement of IL-1 Activity The method of JJ Oppenhein et al [J. Immunol., 116, 1466 (1976)] and the LAF activity was measured using thymocytes of C3H / HeJ mice. (2) Measurement of GIF activity 0.1 ml of a test solution diluted to various concentrations was added to a 96-well microplate (Corning), and then human melanoma cells A375 were added to each well at a concentration of 2 × 10 ⁴ cells / ml. 0.1 ml of Eagles MEM suspension containing 10% FCS is added, and carbon dioxide incubator (manufactured by Nafco)
And culture for 4 days. After completion of the culture, 0.05 ml of 0.05% Neutral Red (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to each well, and the cells are cultured at 37 ° C. for 2 hours. After removing the supernatant,
Wash wells gently by adding 0.3 ml of phosphate buffered saline to each well. After the washing solution was removed, each well was mixed with a monosodium phosphate-ethanol equivalent mixture 0.1 m
was shaken with a micromixer for several minutes, and the amount of the dye incorporated into the cells was measured using a 96-well microtitration plate photometer (Titer Check Multiscan, manufactured by Flow Laboratories). 5
Measure at 40 mμ to determine growth inhibitory activity. The reciprocal of the dilution ratio of the control group (control group) showing 50% inhibition of cell proliferation, that is, the test group showing half the absorbance measured value of the control group, was taken, and this was taken as the GIF activity. Unit. Thus, for example, if the GIF activity is 10 units, the test solution has an activity of inhibiting cell growth by 50% even after dilution 10-fold. Reference Example 1 Production of plasmid pGIF-α (1) Preparation of human lymphocytes Human peripheral blood was collected and subjected to density gradient centrifugation using Ficoll-Hypaque [Eur. J. Immunol. 4 , 808 (197
4)], 1.9 × 10 ¹⁰ peripheral blood lymphocytes were obtained.
The lymphocytes were suspended at a cell concentration of 4 × 10 ⁸ / ml in RPMI 1640 medium containing 5% of human serum, and the cells were collected at a diameter of 9 × 10 ⁸ / ml.
After dispensing into a cm dish, the cells were cultured in 5% carbon dioxide at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, cells not attached to the bottom of the dish were removed, and fetal bovine serum 10%, TPA (Sigma (S)
igma) 0.5 ng / ml and LPS (Difco (D
The cells were stimulated with RPMI 1640 medium containing 10 μg / ml. After culturing at 37 ° C. for 4 hours in 5% carbon dioxide, 9 × 10 ⁸ adherent lymphocytes were obtained with PBS and 0.02% EDTA. (2) Preparation of mRNA The human adherent lymphocytes obtained in the above (1) were treated with a 6M-guanidine thiocyanate solution (6M-guanidine isothiocyanate, 5 mM sodium citrate (pH 7.0),
After dissolving in 30 ml of 0.1 M 2-mercaptoethanol, 0.5% Sarkosyl, the DNA was sheared using a 50 ml syringe with a G18G needle.
12 g of cesium chloride (CsCl) is added to this solution,
After complete dissolution, 6.4 ml of each was dissolved in 5.7 M
CsCl (5.7M CsCl-0.1MEDTA) 4
ml of Beckman rotor (Beckman SW-
The mixture was centrifuged at 25 ° C. and 31,500 rpm for 20 hours in a 40 Ti rotor. After washing the pellet of the precipitated RNA with 70% ethanol, a TE solution (10 mM Tris-HCl, pH
7.5, 1 mM EDTA) and 1/9 volume of 3M
Sodium acetate (pH 5.2) and 2.2 volumes of ethanol were added and left at -70 ° C for 1 hour. 15 at 4 ° C
After centrifugation at 000 rpm for 20 minutes, the RNA was recovered and dissolved in a TE solution. Thus, adherent lymphocytes about 9 × 10 ⁸
250 μg of total RNA was obtained from the cells. Next, in order to obtain mRNA from the RNA obtained above, oligo (d
T) -Cellulose (Collaborative Research In)
c. ) Was used to perform column chromatography.
The adsorption was performed using 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5
The column was washed with MNaCl and 1 mM EDTA, and the column was washed with the same solution. After that, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) was used.
And 1 mM EDTA to elute the RNA. As a result, the amount of eluted mRNA was 17.5 μg. (3) Preparation of cDNA From the mRNA obtained in (2) above, cDNA was synthesized in vitro and a plasmid vector of Okayama-berg [O
Kayama, H .; and Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2 ,
161 (1982)], and transformed into Escherichia coli.
A cDNA library was prepared. Each method is as follows. (3) -1) Preparation of vector / primer and linker DNA pBR322-SV40 (0.71-0.86) DNA
400 μg in KpnI (NEB) 700 units at 37 ° C.
With 0.25 M EDTA (pH 8.0)
After stopping the reaction with a mixture of 40 μl and 20 μl of 10% SDS, an equal volume of phenol-chloroform (1: 1) was used.
, DNA was precipitated with ethanol, centrifuged,
After washing with 70% ethanol, DNA was recovered. The obtained DNA was treated with 140 mM sodium cacodylate, 30 mM
Tris HCl (pH 6.8), 1 mM CoCl ₂ , 0.
1 mM DTT and 0.25 mM dTTP (α- ³² P-d
Dissolved in 200 μl containing 0.5 μCi of TTP)
Terminal transfer erase (TTase, PL) 40
Allow the dT chain to elongate at 0 units for 30 minutes,
The reaction was stopped by adding 20 μl of M EDTA and 10 μl of 10% SDS, and phenol-chloroform extraction was repeated four times, and then DNA was recovered by ethanol precipitation. As a result, the dT chain was extended by about 70 bases. next,
The DNA obtained above was digested with 17 units of HpaI (NEB) at 37 ° C. for 6 hours and subjected to agarose (low melting point agarose, BRL, 1%) electrophoresis to obtain a DNA of about 2.7 kb.
The fragments were collected. After electrophoresis, the DNA was stained with ethidium bromide 0.5 μg / ml, agarose containing a fragment of about 2.7 kb was cut out under UV irradiation, and 5 volumes of 20 mM Tris HCl (pH 8.0) -1 mM E
After adding DTA and dissolving the agarose at 65 ° C for 5 minutes,
Phenol extraction, phenol-chloroform (1: 1)
Extraction and chloroform extraction were sequentially performed, and DNA was recovered by ethanol precipitation. Next, the vector primer D was subjected to oligo (dA) cellulose column chromatography.
Purification of NA was performed. The above DNA was purified with 10 mM Tris H
Cl (pH 7.3) -1 mM EDTA-1M NaC
After dissolving in 1 ml of buffer solution and cooling on ice, the solution was placed on a column equilibrated with the same buffer solution, washed with 1 ml of the same buffer solution, returned to room temperature, and returned to 10 mM Tris-HCl (pH 7.3) -1 mM.
The DNA was eluted with EDTA. The eluted peak fractions were collected, and the DNA was collected by ethanol precipitation, and then 10 mM Tris-HCl (pH 7.3) -1 mM EDTA 100 μm.
and stored at 4 ° C. Linker DNA was prepared as follows. That is, pBR322-SV40 (0.19
~ 0.32) 100 μg of DNA was transferred to PstI (NEB) 1
After digestion for 20 hours at 37 ° C. for 1.5 hours, the reaction was stopped, and phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation were performed. The DNA was recovered and 140 mM sodium cacodylate, 30 mM Tris HCl (pH 6.8),
mM CoCl ₂ , 0.1 mM DTT, 0.25 mM
dGTP (containing 1 μCi of α- ³² P-dGTP) 50
After dissolving in μl, 60 units of TTase were allowed to act for 20 minutes. As a result, a dG chain of 18 residues was added. After the reaction was stopped, the DNA was recovered, digested with 50 units of Hind III (Takara Shuzo), and a DNA fragment of about 0.28 kb was recovered by agarose (1.8%) electrophoresis as described above.
Was obtained. (3) -2) Synthesis of cDNA and preparation of cDNA library After drying 5 μg of RNA under reduced pressure, 5 mM Tris HCl was added.
(PH 8.3) Dissolved in 10 μl and heated at 65 ° C. for 5 minutes. Immediately transfer to 37 ° C. and add 20 μl (50 μl) of the reaction mixture.
mM Tris HCl (pH 8.3), 8 mM MgC
l ₂ , 30 mM KCl, 0.3 mM DTT, 2 mM
dNTP, 10 μCi α- ³² P-dCTP),
Incubated for 5 minutes at 37 ° C. Add 10 units of RTase (reverse transcriptase, manufactured by Seikagaku Corporation) and add 3 units.
After reacting at 7 ° C for 15 minutes, 10 units of RTase was added again, and the mixture was kept warm for another 15 minutes. 0.25 mM EDTA
(P8.0) After stopping the reaction by adding 2 μl and 1 μl of 10% SDS, phenol-chloroform extraction was performed, and 20 μl of 4M ammonium acetate and ethanol 80 were added.
Then, the mixture was frozen at -70 ° C for 15 minutes, thawed at room temperature, and centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C for 10 minutes to precipitate. The precipitate was washed with 10 mM Tris HCl (pH 7.3) 2
It was dissolved in 0 μl, and reprecipitated by adding 19 μl of 4M ammonium acetate and 80 μl of ethanol. After collecting the precipitate and washing with 70% ethanol, 140 mM sodium cacodylate, 30 mM Tris HCl (pH 6.8),
1 mM CoCl ₂ , 0.1 mM DTT, 0.2 μg poly A and 66 μM [α- ³² P] dCTP (10 μCi)
Dissolved in 15 μl. After adding 18 units of TTase (PL) and reacting at 37 ° C. for 5 minutes, the mixture was rapidly cooled to 0 ° C.
1.3 μl of 0.25 M EDTA and 10% SDS
The reaction was stopped with 65 μl, and phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation were performed. After collecting the precipitate by centrifugation, it was digested with 4 units of Hind III (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 2 hours. After terminating the reaction, phenol-chloroform extraction was performed, followed by ethanol precipitation. 10 m after collecting the precipitate
M Tris HCl (pH 7.3) and dissolved in 10 μl of 1 mM EDTA, and 3 μl of ethanol was added thereto.
Saved in. 1 μl of the sample obtained above was used for linker DNA5.
10 mM Tris HCl (pH 7.5) -1 m
M EDTA-0.1 M NaCl
After incubating at 5 ° C for 2 minutes and then at 42 ° C for 30 minutes,
Cooled to ° C. 20 mM Tris HCl (pH 7.
5) 4 mM MgCl ₂ , 10 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ ,
0.1 M KCl, 0.1 mM β-NAD, 50 μg
/ Ml BSA and 6 units / ml Escherichia coli DN
90 μl of the mixed solution of A ligase was added, and the total amount was 100
and stored overnight at 12 ° C. Then 10 mM
dNTP 0.5 μl, 10 mM NAD 0.56
μl, 0.5 μl of Escherichia coli DNA polymerase I (Boehringer Mannheim) and RNase H
(PL) 0.2 μl, and add 1 at 12 ° C. and 25 ° C.
After keeping it warm for hours, it was frozen and stored at -20 ° C. Escherichia coli HB101 strain was cultured in an LB medium (10 g of Bacto-tryptone, 5 g of Bacto-yeast extract, and NaC
(10 g / l) until OD ₅₅₀ = 0.45, cooled on ice for 5 minutes, and centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. to collect the cells. Ice-cooled 30 mM pellet of bacterial cells
Potassium acetate, 100 mM RbCl, 10 mM Ca
Suspended in Cl ₂ , 50 mM MnCl, 15% glycerin, kept at 0 ° C. for 5 minutes, centrifuged at 4 ° C., 8000 rpm for 5 minutes, and the obtained cells were cultured in 10 mM MOPS (morpholinopropane sulfonate acid), 75 mM Ca
The cells were resuspended in Cl ₂ , 10 mM RbCl, and 15% glycerin, and incubated at 0 ° C. for 15 minutes to prepare competent cells. The competent cells thus obtained are:
Thereafter, it was stored at -70 ° C. Thaw the frozen bacterial solution at room temperature,
20 μl of the above DNA sample was added to 400 μl of the bacterial solution, left at 0 ° C. for 30 minutes, heat-shocked at 42 ° C. for 90 seconds, and left again at 0 ° C. for 1-2 minutes. To this, 2 ml of LB medium was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
Of LB medium, and cultured at 37 ° C. for 6 hours.
Ampicillin was added to a concentration of 0 μg / ml, and the mixture was further cultured overnight to prepare a cDNA library. This cD
The NA library was stored at -20 ° C in 50% glycerin. (3) -3) Preparation of synthetic probe As a probe for selecting a transformant having a cDNA encoding IL-1β, a base sequence complementary to the following nucleic acid sequence (shown at the bottom) was prepared by the following method. Was synthesized.

【化７】 即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロアミダイト誘
導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホスフアイト
トリエステル法〔Ｎature,３１０，１０５（１９８
４）〕にて、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ Ｓynthes
izer，Ａpplied Ｂiosystems Ｉnc.,Ｆoster Ｃity,Ｃ
alifornia ９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目的とする
完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護ＤＮＡを
２８％アンモニア水で５５℃で１０時間処理することに
より、５’末端のＯＨ基に結合している保護基としての
ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、
Ｇ、Ｃのアミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部
分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴ
ｒ体をＣ₁₈を担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製した
後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記ＤＭＴｒ
基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素を含む
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びバイオ−ゲ
ルＰ−３０（バイオ−ラド社製）により精製して、目的
のＤＮＡ（６０mer）を得た。上記で得たＤＮＡ６μｇ
を、５０μｌの反応溶液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ、
５０μＣi〔γ−²¹Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３７℃にて１
時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルした。ラベル
されたＤＮＡと未反応の³²Ｐを分別するために、バイオ
ゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカラムクロマト
グラフイーを行なつた。ラベルされたＤＮＡ画分を１／
９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエタノールにて
沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ ４００μｌに溶解
し、−２０℃で保存した。得られたプローブの比活性は
１０⁷cpm ／μｇＤＮＡ以上であつた。 (3)−４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径
８０mmのニトロセルロースフイルター（ミリポアＨＡＩ
Ｆ０８２５０）を置き、この上にフイルター当り５００
０コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブラ
リー菌液をまき、３７℃にて一夜培養した。フイルター
は、合計２４枚を作製した。コロニーの出現したフイル
ターに新しいニトロセルロースフイルターを載せること
によつて、レプリカフイルターを作製した。元のフイル
ター（マスターフイルター）を、４℃にて保存し、レプ
リカフイルターを、上記した寒天培地上で３７℃で６時
間培養後、クロラムフエニコール２００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地上に移し替え、３７℃で一夜培養した。
フイルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）及び１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−
１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風乾後、８０℃真空
下で２時間ベーキングを行なつた。ベーキング済みのフ
イルターを、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸
３ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆicoll
）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌ
サルモン スペラム（Ｓalmon Ｓperm）ＤＮＡの２０ｍ
ｌ中で軽く振盪しながら、６８℃にて一夜保温した。溶
液を１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸３ナトリ
ウム、１０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆicoll ）、１０ｍ
ｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ、０．１％ＳＤＳ及び１０⁶cpm ／ｍｌプローブに替
え、４２℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブリダイゼーシヨ
ンを行なつた。ハイブリダイゼーシヨンの終わつたフイ
ルターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍク
エン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄
し、その後、６０℃で同溶液にてフイルターのバツクグ
ラウンドのカウントがＧＭサーベイメーターで２００cp
mになるまで洗浄した。フイルターを風乾後、増感紙を
用いてＸ線フイルム（フジＲＸ）に−７０℃にて２日間
オートラジオグラムを行なつた。フイルムを現像後、シ
グナル領域に存在するコロニーをマスターフイルターよ
りかき取り、上記の方法を繰返してポジテイブシグナル
を有するコロニーの単離を行ない、強いシグナルを有す
るクローンＩ−２を単離した。 (3)−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。その結果を図１に示
す。図１よりｃＤＮＡ中には、ＮcoＩ（日本ジーン）、
Ｈind III （日本ジーン）、ＰvuII（日本ジーン）及び
ＡccＩ（日本ジーン）により切断される個所がそれぞれ
１個所ずつ存在し、５’末端よりその順序で之等制限酵
素による切断個所が存在していることが確認された。ま
た、ｃＤＮＡの長さは、約１．５kbであり、分子量約１
８kdのＩＬ−１を充分にコードできることが判った。次
に、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの塩基配列を、マキサム−
ギルバートの化学修飾法及びＭ１３フアージを用いるジ
デオキシヌクレオチド鎖終結法にて決定した。その結果
を次式に示す。Embedded image That is, a solid-phase phosphite using an N, N-dialkylmethyl phosphoramidite derivative as a condensation unit.
Triester method [Nature, 310 , 105 (198)
4)], an automatic synthesizer (380A DNA Synthes)
izer, Applied Biosystems Inc., Foster City, C
alifornia 94404, USA) to synthesize the desired fully protected DNA. Subsequently, the completely protected DNA was treated with 28% aqueous ammonia at 55 ° C. for 10 hours, whereby a protecting group other than a DMTr (dimethoxytrityl) group as a protecting group bonded to the 5 ′ terminal OH group (A,
G and C amino groups) were deprotected to obtain a partially protected DNA (DMTr form). Then this DMT
The r-isomer was purified by reverse phase HPLC using _C18 as a carrier, and then treated with 80% acetic acid at room temperature for 10 minutes to obtain
The base is removed, and the resulting base is purified by 10% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea and Bio-Gel P-30 (manufactured by Bio-Rad) to obtain the desired DNA (60 mer). Obtained. 6 μg of the DNA obtained above
With 50 μl of reaction solution (50 mM Tris HCl (pH
7.6) 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.2 mg / ml calf thymus DNA,
In 50μCi [.gamma. ²¹ P] -ATP) in the T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) 12 units, 1 at 37 ° C.
The reaction was allowed to proceed for a time to label the 5 'end of the DNA. In order to separate the labeled DNA from unreacted ³² P, column chromatography using Biogel P-30 (Bio-Rad) was performed. Label the labeled DNA fraction with 1 /
Precipitate in 9 volumes of 3M sodium acetate and 2.5 volumes of ethanol, centrifuge, collect and recover 10 mM Tris HCl.
(PH 8.0)-Dissolved in 400 µl of 1 mM EDTA, and stored at -20 ° C. The specific activity of the obtained probe was 10 ⁷ cpm / μg DNA or more. (3) -4) Screening of cDNA library A nitrocellulose filter (Millipore HAI) having a diameter of 80 mm was placed on an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin.
F08250) and put on it 500
The cDNA library bacterial solution diluted so as to have 0 colonies was sowed and cultured overnight at 37 ° C. A total of 24 filters were produced. A replica filter was prepared by placing a new nitrocellulose filter on the filter where the colony appeared. The original filter (master filter) was stored at 4 ° C., and the replica filter was cultured on the above agar medium at 37 ° C. for 6 hours, and then transferred to an LB agar medium containing 200 μg / ml of chloramphenicol. At 37 ° C. overnight.
Filter with 0.5 N NaOH, 1 M Tris HCl
(PH 8.0) and 1 M Tris HCl (pH 8.0)-
The mixture was treated in the order of 1.5 M NaCl, air-dried, and baked under vacuum at 80 ° C. for 2 hours. The baked filter was washed with 1.2 M NaCl, 0.12 M trisodium citrate, 10 mg / ml Ficoll (Ficoll).
), 10 mg / ml polyvinylpyrrolidine, 10 mg
/ Ml BSA, 0.1% SDS and 0.1 mg / ml
20m of Salmon Sperm DNA
Incubate at 68 ° C. overnight with gentle shaking in 1 l. The solution was diluted with 1.2 M NaCl, 0.12 M trisodium citrate, 10 mg / ml Ficoll, 10 m
g / ml polyvinylpyrrolidine, 10 mg / ml BS
A, replaced with 0.1% SDS and 10 ⁶ cpm / ml probe, and lightly shaken at 42 ° C. for 24 hours to perform hybridization. The filter at the end of the hybridization was taken out, washed three times with 1.2 M NaCl, 0.12 M sodium citrate, and 0.1% SDS at room temperature, and then filtered at 60 ° C. with the same solution at the background. Count is 200cp with GM survey meter
m. After the filter was air-dried, autoradiogram was performed on the X-ray film (Fuji RX) at -70 ° C for 2 days using an intensifying screen. After the film was developed, the colony present in the signal region was scraped off from the master filter, and the above method was repeated to isolate a colony having a positive signal, thereby isolating a clone I-2 having a strong signal. (3) -5) Analysis of clone cD of plasmid pGIF-α of clone I-2
A restriction map of NA was made. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, NcoI (Nippon Gene),
There is one site cut by Hind III (Nippon Gene), one site cut by PvuII (Nippon Gene), and one site by AccI (Nippon Gene). It was confirmed that. The length of the cDNA is about 1.5 kb and the molecular weight is about 1
It turned out that 8 kd of IL-1 can be satisfactorily encoded. Next, the nucleotide sequence of the cDNA of pGIF-α was
It was determined by the Gilbert chemical modification method and the dideoxynucleotide chain termination method using M13 phage. The result is shown in the following equation.

【化８】 Embedded image

【化９】 Embedded image

【化１０】 Embedded image

【化１１】 上記図より、合成プローブと相補的な領域が５’末端よ
り３１２番目〜３７１番目に存在（図に下線を付して示
す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩基配列に７５
％の相同性を示した。また、ｐＧＩＦ−αのc ＤＮＡ中
の最長のリーデイングフレーム（reading frame）を検
索したところ、５’末端より５７番目から７７１番目の
領域である。上記ヒトＩＬ−１前駆体蛋白質をコードす
るｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＦ−αは、これを
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli ）χ１７７６
株に保有させ、該株を工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に、「Ｅscherichia coli χ１７７６／ｐＧ
ＩＦ−α」なる名称で、微工研条寄第９４８号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−９４８）として寄託されている 参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵
素ＡccＩ及びＣlaＩにより切断した後、約１．２キロベ
ースペアー（kbp）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動により単離精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素ＡccＩ
及びＣlaＩ切断部分を平滑末端とした。一方ＢamＨＩリ
ンカー（ 5’HOＣＧＧＡＴＣＣＧOH 3’）の５’末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、これ
を先の平滑末端としたＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した後、制限酵素ＢamＨＩで切断し、更
に制限酵素ＭspＩで切断し、得られた反応物をアガロー
スゲル電気泳動に付し、約５４０ベースペア（bp）のＭ
spＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片を単離精製した次に、下記
オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び（II）を以下の
ようにして合成した。 5’HOＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣ ＡＣＴＣＴＣOH 3’ （Ｉ） 5’HOＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣ ＣＡＴＴＡＴOH 3’ （II） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライド バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３’側より５’側へ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３’−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフエノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
つた〔Ｈunkapiller等、Ｎature ，３１０，１０５（１
９８４）〕。次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオ
チドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５℃で１０時間処
理してＮ−保護基を脱離させ、５’−Ｏ−ジメトキシト
リチルオリゴヌクレオチドを得た。この１／５量を用い
て、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高
速液体クロマトグラフイーにより精製後、８０％酢酸１
５０μｌで室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチ
ドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフイーにより更に精製して、目的とするオリゴ
ヌクレオチドを得た。上記で合成した合成オリゴデオキ
シヌクレオチド（Ｉ）及び（II）の各５’末端を、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、上記で得
たＭspＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結後、制限酵素ＢamＨＩ及びＣlaＩで切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し
て、約５８０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片を単離精
製した。他方、プラスミドp ＴＭＩ〔今本文男，代謝，
Ｖol. ２２，２８９（１９８５）〕を、制限酵素ＢamＨ
Ｉ及びＣlaＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により
trp プロモーター領域を含む約４．４kbp のＤＮＡ断片
を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先に調製した約５
８０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで連結して所望のポリペプチドＩ発現用プラス
ミドp trp ＧＩＦ−αを得た。該プラスミドを、エシエ
リヒア・コリーＨＢ１０１にトランスフオームさせ、目
的のトランスフオーマントを、ボイリング法（boiling
method）により得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分
析により選択した〔Ｔ．Ｍaniatis ，Ｅ．Ｆ．Ｆritsch
and Ｊ．Ｓambrook ，Ｍolecular Ｃloning，pp３６
６，Ｃold Ｓpring Ｈarfor Ｌaboratory,（１９８
２）〕。以上の概略を図２に示す。また上記トランスフ
オーマントに組込まれたプラスミドp trp ＧＩＦ−α
は、これをエシェリヒア・コリχ１７７６にトランスフ
オームさせ、該形質転換体を、「Ｅscherichia coliχ
１７７６／p trp ＧＩＦ−α」なる名称で１９８５年１
２月１２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄
第９４９号（ＦＥＲＭＢＰ−９４９）として寄託した。 （２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p tr
p ＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＬ
−トリプトフアン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（１％
トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％Ｎa Ｃ
ｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この１ｍ
ｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１％カザミノ酸を
含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．３％Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ₄Ｃｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％グルコース及び０．１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ₂）５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養
し、５５０nmでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）が１．０となつた
時点で菌体を集め、１５％シユークロース−５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、１０ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解し
た溶液〕５００μｌを加え、更に０．３％トリトンＸ１
００−１８７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）−１５
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌを加
え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分
離によつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。 （３）ポリペプチドＩの精製イオン交換クロマトグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ） 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ギルソンハイパーフオー
マンス リキツド クロマトグラフイー システム（ギ
ルソン（Ｇilson ）社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の
通りである。カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０×１
５０mm、東洋曹達社製）溶離液：Ａ液＝５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５、Ｂ液＝０．５Ｍ ＮａＣｌ含有
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）流 速：０．５
ｍｌ／分 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たリテンシヨンタイム９０〜９
１分の画分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイー
に付した。その条件は、次の通りである。カラム：Ｃ₄
ハイポアー逆相カラム（ＲＰ３０４）バイオ−ラド社、
直径４．６×２５０ｍｍ溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦ
Ａ、Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ（９：１） リテンシヨンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的の
ポリペプチドＩが得られた。得られたポリペプチドＩ
は、ＩＬ−１活性を有し、その比活性は、ＧＩＦ活性と
して２．７×１０⁷単位／ｍｇ蛋白であった。 （４）ポリペプチドＩの同定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） Ｌaemmli，Ｕ．Ｋ．の方法〔Ｎature ，２７７，６８０
（１９７０）〕に従い、上記（３）で得たポリペプチド
ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なつた。その条件は次の通り
である。 試 料：上記逆相高速液体クロマトグラフイーににおけ
るポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエメリーのサン
プル バツフアー〔１／２０体積の２−メルカプトエタ
ノールを含む（２ＭＥ⁺）又は含まない（２ＭＥ^-）〕に
溶解し、１００℃で４分間処理した。 ゲル：厚さ１．５mmの１５％ポリアクリルアミドゲルを
使用した。 電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂio−Ｒad）社製プロテ
アンを用いた。 泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。 泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキツ
ト（Ｓilver stain kit ）を用いて染色した。その結
果、ポリペプチドＩは２ＭＥ⁺下においては約１７Ｋの
位置に、また２ＭＥ^-下においては約１７．５Ｋの位置
にそれぞれ単一のバンドとして泳動された。等電点電気泳動法（ＩＥＦ） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜
９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）
及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行な
つた。その条件は次の通りである。試 料：前記（３）
で得たポリペプチドＩの０．０３７μｇ、０．０７４μ
ｇ及び０．７４μｇの各々、及び以下のマーカープロテ
イン（ｐＩマーカープロテイン）の計４レーンを使用し
た。 〈マーカープロテイン〉 アミログルコシダーゼ（３．５０）、大豆トリプシンイ
ンヒビター（４．５５）、β−ラクトグロブリンＡ
（５．２０）、ウシ カルボニツク アンヒドラーゼ
（bovine carbonic anhydrase ）Ｂ（５．８５）、ヒト
カルボニツク アンヒドラーゼ（human carbonic anh
ydrase）Ｂ（６．５５）、ウマ ミオグロビン−アシデ
イツクバンド（horse myoglobin-acidic band ）（６．
８５）ウマ ミオグロビン−ベイシツクバンド（horse
myoglobin-basic band）（７．３５）、レンチル レク
チン−アシデイツクバンド（lentil lectin-acidic ban
d ）（８．１５）、レンチル レクチン−ミドルバンド
（lentillectin-middle band）（８．４５）、レンチル
レクチン−ベイシツクバンド（lentil lectin-basic
band）（８．６５）及びトリプシノーゲン（９．３
０）。 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。 染 色：染色は、シルバー スタイン キツトで行なつ
た。 上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライスし、蒸留水１
ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定し、等電点を
算出した。その結果、ポリペプチドＩの等電点（ｐＩ）
は６．８±０．１であり、この位置に単一のバンドとし
て泳動された。アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより得
られたポリペプチドＩ画分の３０μｌを、１２ｍｍ×１
２０ｍｍのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意
深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターに
て減圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に４Ｎ−メタ
ンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）イ
ンドール含有、ピアース（Ｐierce）社製〕５０μｌを
加え、０．１〜０．２mmＨgで１分間脱気後、減圧封管
した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時間を要
して行なつた。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム４６μ
ｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌとし
た。アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作
所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５
０μｌを注入して行なつた。分離されたアミノ酸は、オ
ルトフタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料
の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によつ
て行なつた。その結果を、Ｐheを基準（９モル）とし
て、各アミノ酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、
上記分析条件下においては、Ｐro及びＣysは測定できな
い。またＳer、Ｔhr及びＭetについては、上記分析条件
下での回収率を（）内に示した。 アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリペ
プチドＩ画分の１５０μｌを、アプライドバイオシステ
ムズ社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じ
たＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１
００〜５０μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウオータ
ーズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。クロマ
トグラフイーのシステムは、ベツクマン１１２型ポンプ
２台を、４２１型コントローラーで作働させた。カラム
はウルトラスフエアーＯＤＳ−５μm の充填された２ｍ
ｍ×２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保
つた。流速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジエント
溶出法で分離し、２６９nmでモニターした。分析は４５
分とした。２０サイクルの分析の結果、前記（３）で得
たポリペプチドＩのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、以
下のものであると認められた。Ａla−Ｐro−Ｖal−Ａrg
−Ｓer−Ｌeu−Ａsn−Ｃys−Ｔhr−Ｌeu−Ａrg−Ａsp−
Ｓer−Ｇln−Ｇln−Ｌys−Ｓer−Ｌeu−Ｖal−Ｍet−
尚、Ｓerは副生物の一つで確認し、更に３２２nmに吸収
を示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイクル８
では副生物のピークからＣysであると推定し、更に元の
試料をカルボキサミドメチル化した後の分析でＣysと確
認した。また、ポリペプチドＩをトリプシンで消化して
得たペプチド断片につき、それらのアミノ酸組成を分析
し、Ｃ端部ペプチドも欠損することなく、正確に含まれ
ていることを確認した。即ち、ポリペプチドＩ ６０μ
ｇを１％炭酸水素アンモニウム６００μｌに溶解し、該
溶液に、予め１％炭酸水素アンモニウムに溶解させたト
リプシン（０．２ｍｇ／ｍｌ、クーパー社製）溶液の
２０μｌを加え、３７℃で２４時間放置してトリプシン
切断ペプチドを得た。このペプチド混合物を、逆相ＨＰ
ＬＣ〔Ｃ−１８，３００オングストローム，４．６×１
５０ｍｍ；０．１％ＴＦＡをＡ液及び１％ＴＦＡ１／１
０容を含むアセトニトリルをＢ液として、該Ｂ液を１％
／３分の割合で増加させるプログラムにより溶出させ
る〕に付し、Ｂ液が４０％までで全ての成分を単離し
た。之等のペプチドをアミノ酸分析に供した。このアミ
ノ酸組成から予想される全てのペプチド断片が同定で
き、特にＣ端部ペプチドについては、塩基性アミノ酸が
含まれておらず、そのアミノ酸組成の結果は、予想され
るアミノ酸を正確に含んでいたことから、前記（３）で
得られたポリペプチドＩのＣ端部は、予想された通りに
正確であることが確認された。また、各ペプチド断片に
つき、上記と同様にしてそれらのアミノ酸配列を分析し
た。その結果、確認された配列は全てＩＬ−１βに一致
した。確認されたペプチド断片につき、之等をＩＬ−１
βのアミノ酸番号により次に示す。 〈確認されたペプチド断片（アミノ酸番号）〉 １〜４、５〜１１、１２〜１６、１７〜２７、２８〜６
３、６４〜６５、６６〜７４、７５〜８８、８９〜９
２、９５〜９８、９９〜１０３、１０４〜１０９、１１
０〜１３８、１３９〜１５３以上の結果から、前記
（３）で得たポリペプチドＩは、前記定義の配列で特定
されるポリペプチドＩであることが確認された。尚、ポ
リペプチドＩの分子量の計算値は、１７３７６．５９で
ある。 実施例１ 本発明ＩＬ−１β誘導体の製造 (1) ポリペプチドVIの製造 上記参考例２で得たp trp ＧＩＦ−αを利用して、サイ
ト−スペシフイツクミユータジエネシス（Ｓite −Ｓpe
cific Ｍutagenesis）〔Ｐroc.Ｎat. Ａcad.Ｓci.,８
１，５６６２−５６６６（１９８４）〕の方法に従い、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のアミノ末端から７１番
目のＣysをＳerに変更したポリペプチドVIを以下の通り
製造した。即ち、Ｍ１３mp１１フアージベクターを、一
本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミド
p trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩＤＮＡフラ
グメントを切り出し、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）の
ＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにクローニング
し、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミユータジエネシスの鋳型とした。合
成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴ
ＧＴＴＧ−３’（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでリン酸化し、これをssＭ１３−ＧＩＦ−
α ＤＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、dＮ
ＴＰsの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラ
グメント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５
℃で１８時間インキユベートした。得られたＤＮＡをＪ
Ｍ１０５コンピテント細胞にトランスフオームし、生じ
たコロニーを、寒天プレート上に５０コロニー植菌し、
３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーを含むフ
イルターを通常の方法によりアルカリ変性し、乾燥後、
８０℃で２時間ベーキング処理を行なった。このフイル
ターをプレハイブリダイズした後、このものと、上記プ
ライマーの５’末端を³²Ｐ−r −ＡＴＰでラベルした³²
Ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハイ
ブリダイズさせたフイルターを、６×ssc バッフアー
で、室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間各々洗浄
し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオグラフイ
ーを行なった。変異した５クローンの内から代表として
Ｍ１３−ＧＩＦ−７１s を選びこれをＪＭ１０５に感染
させて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。
上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェイン ター
ミネーション シークエンシングにより目的の遺伝子の
変異の確認を行なった。また上記ＲＦ ＤＮＡにおい
て、新しくできた制限酵素ＤdeＩサイトも確認できた。
ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡより、 ＥcoＲＩ
／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これを前記（１）と
同様にして発現プラスミドに組込み、所望のポリペプチ
ドVI発現プラスミド（p trp ＧＩＦ−α−７１Ｓ）を得
た。該プラスミドは、これをエシエリヒア・コリＨＢ１
０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsherichia coli
ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−７１Ｓ」なる名称で微
工研寄第１２９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９６）とし
て寄託されている。このプラスミドを用いて、参考例２
−（２）と同様にして、菌体抽出物上清を得、該上清の
ＧＩＦ活性を測定した。その結果、培養液１ｍｌ当りの
ＧＩＦ活性（単位／ｍｌ培養液）は、エシェリヒア・コ
リＨＢ１０１を宿主として２．４×１０⁶であつた。こ
れより、参考例２−（３）と同一の手段により、目的の
ポリペプチドVIを単離、精製した。 (2) ポリペプチドIVの製造 プラスミドp trp ＧＩＦ−αを利用して上記(1)と同様
にしてポリペプチドIVを製造した。即ち、Ｍ１３mp１１
フアージベクターを、一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用
いた。まずプラスミドp trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ
／ＢamＨＩＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｍ１３mp１
１フアージ（ＲＦ）のＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サ
イトにクローニングし、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ
（Ｍ１３−ＧＩＦ−α）を得、これをミュータジェネシ
スの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴ
ＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣ−３’（プライマー）〕
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これ
をssＭ１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズし、
アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキユベートし
た。得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞にト
ランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プレート上
に１００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。
生育したコロニーを含むフイルターを通常の方法により
アルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処
理を行なった。このフイルターをプレハイブリダイズし
た後、このものと、上記プライマーの５’末端を、³²Ｐ
−ｒ−ＡＴＰでラベルした³²Ｐ−プローベとを、室温で
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイルタ
ーを、６×ssc バッフアーで、室温で１０分間、次いで
３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８
時間オートラジオグラフイーを行なった。変異した４ク
ローンの内から代表としてＭ１３−ＧＩＦ−８Ｓを選び
これをＪＭ１０５に感染させて培養し、ssＤＮＡ及びＲ
Ｆ ＤＮＡを調製した。上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジ
デオキシチェイン ターミネーシヨン シークエンシン
グにより目的の遺伝子の変異の確認を行なった。また上
記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくできた制限酵素Ｈinf
Ｉサイトも確認できた。ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ
ＤＮＡより、 ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製
し、これを参考例２−（１）と同様にして発現プラスミ
ドに組込み、所望のポリペプチドIV発現プラスミド（p
trp ＧＩＦ−α−８Ｓ）を得た。このプラスミドを用い
て、参考例２−（２）と同様にして、菌体抽出物上清を
得た。該上清のＧＩＦ活性は、宿主してエシェリヒア・
コリＨＢ１０１を用いた場合、１．２×１０⁵単位／ｍ
ｌ培養液であり、エシェリヒア・コリＷ３１１０を用い
た場合、６．２×１０⁵単位／ｍｌ培養液であつた。上
記上清より、参考例２−（３）と同一の手段により、目
的のポリペプチドVIを単離、精製した。 (3) ポリペプチドＶの製造 上記(1)及び(2)で得たプラスミドp trp ＧＩＦ−α−７
１Ｓ及びp trp ＧＩＦ−α−８Ｓの各々を、制限酵素Ｅ
coＲＩ及びＨind III で切断後、p trp ＧＩＦ−α−８
Ｓから約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp
ＧＩＦ−α−７１Ｓから約４６００bpのＤＮＡフラグメ
ントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーシヨンして、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のＮ末端から８番目及び
７１番目のＣysをいずれもＳerに変更させた所望のポリ
ペプチドＶの発現用プラスミドptrp ＧＩＦ−α−８Ｓ
７１Ｓを得た。このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１を宿主とする場合はＧＩＦ活性として
１．４×１０⁴単位／ｍｌ培養液、またエシェリヒア・
コリＷ３１１０を宿主とする場合はＧＩＦ活性として５
×１０⁵単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−
（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドＶを単
離、精製した。 (4) ポリペプチドIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧ
ＴＴＣＴＣＴＧ−３’をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−
α−４Ｇを得た。該プラスミドは、これをエシエリヒア
・コリＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsher
ichia coli ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−４Ｇ」な
る名称で微工研寄第１２９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２
９７）として寄託されている。該プラスミドを用いて、
参考例２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エシェ
リヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性とし
て２．８×１０⁵単位／ｍｌ培養液）を得、これより参
考例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプチ
ドIIを単離、精製した。この精製操作において、ＣＭ−
ＨＰＬＣの主ピークの前半部の再クロマトグラフイーに
よりポリペプチドＸＸＸＸVIIIを精製品として得た。ポ
リペプチドＸＸＸＸVIIIは、ポリペプチドIIと同程度の
ＣＳＦ産生促進活性を有し、同様に、ＧＩＦ活性、ＬＡ
Ｆ活性及びＰＧＥ産生促進活性がいずれも低い特徴を示
した。 (5) ポリペプチドIII の製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＧＡＣＴＣＡＣＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドIII発現用プラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、参考例
２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア
・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として２．
８×１０⁶単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２
−（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドIII
を単離、精製した。 (6) ポリペプチドVIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧ
ＡＴＡＧＡＡ−３’をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドVII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−α
−１０２ＣＴを得た。該プラスミドを用いて、参考例２
−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として７．４
×１０⁴単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−
（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドVIIを
単離、精製した。 (7) ポリペプチドVIIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡ
ＧＧＡＴＡＴＡＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドVIII発現用プラスミドptrp ＧＩ
Ｆ−α−１４０ＣＴを得た。該プラスミドを用いて、参
考例２−（２）と同様にして、エシェリヒア・コリＷ３
１１０を宿主として用いることにより、菌体抽出物上清
（ＧＩＦ活性として５．８×１０³単位／ｍｌ培養液）
を得、これより参考例２−（３）と同一の手段により、
目的のポリペプチドVIIIを単離、精製した。また、上記
プラスミドp trp ＧＩＦ−α−１４０ＣＴを、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１を宿主として発現させることによ
つて、同様に菌体抽出物上清（ＧＩＦ活性として１．３
×１０⁶単位／ｍｌ培養液）が得られ、これより上記と
同様にしてポリペプチドＩが単離、精製された。尚、上
記において、エシェリヒア・コリＨＢ １０１を宿主と
する場合には、ナンセンスサプレツサーとしてＳupＥが
働き、ＵＡＧの終止コドンがＧlnとして読まれて（read
throughされて）ポリペプチドＩが発現される。一方宿
主をエシェリヒア・コリＷ３１１０とする場合には、Ｓ
upＥ遺伝子がコードされていないため、上記ＵＡＧが終
止コドンとして働き、１４０個のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドVIIIが発現される。 (8) ポリペプチドＩ〜VIIIの同定 前記(1)〜(7)で得られた本発明のＩＬ−１β誘導体（ポ
リペプチドＩ〜VIII）につき、参考例２−（４）と同様
にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％ポリアクリルアミドゲ
ル、２ＭＥ⁺）を行なった。 その結果、ポリペプチド
Ｉ〜ポリペプチドVIIは、いずれも約１７．５kdの位置
に、またポリペプチドVIIIは約１６kdの位置に、それぞ
れ単一のバンドとして泳動された。また、ポリペプチド
ＩのＧＩＦ活性に対する中和抗血清（参考例２−（３）
で得たポリペプチドＩを通常の方法に従い、家兎に免疫
して作製した抗血清、以下同じ）を用いたウエスタンブ
ロツテイング〔Ｗestern blotting,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.
Ｓci.,ＵＳＡ，７６，１４２０（１９７９）〕により、
ポリペプチドＩ〜ポリペプチドVIIIの各々を、相当する
位置に単一のバンドとして確認した。 実施例２ (1) 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α）を、アンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトフアン２０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌ中で３７℃で一晩培養
し、この４００ｍｌを１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地２０ｌに植菌し、３７℃で８．５時間培養した。遠心
分離により集菌し、得られる菌体を１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄
に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、１０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２日間透析した。得
られた透析液を遠心分離（１００００rpm 、３０分間）
して上清を得た。大腸菌培養液３００ｌ分に相当する上
記上清を集め、これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ５．０に調
製した後、ＳＰ−ゼータプレツプ２５０カートリツジ
〔ＬＫＢ社製〕に付し、流速３０ｍｌ／分で始め、１０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で１００分、続いて
０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５．５）で２２０分、更に１Ｍ ＮａＣｌを含む５０
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でそれぞれ溶出させ
た。各分画をＨＰＬＣによりチェックし、目的物の含ま
れているフラクション、即ち０．１Ｍ ＮａＣｌを含む
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）のフラクション
（フラクションＮo.８〜１０）を集めた。これを１００
ｍＭ酢酸でｐＨ４．５とした後、ＨＰＬＣ〔東洋曹達株
式会社製、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ、５．５×２０cm〕
に付し、下記条件で溶出させて、リテンションタイム
（r.t.）６５〜７２分の分画を採取した。 溶離液Ａ：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．５） かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。これを、限外
濾過（ＹＭ−５メンブラン）により、２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液組成となるように
緩衝液を交換しつつ、濃縮（２０mg／ｍｌ）した。更
に、ポジタインフイルターＮＦＺ（日本ポール社製）を
装着した濾過装置に、上記濃縮液を供して滅菌濾過した
後、パイロジエンが１００ｐｇ／ｍｇ蛋白以下の精製品
を得た。上記精製法により、大腸菌培養液３００ｌよ
り、ポリペプチドＩの約３ｇを収得した。 (2) 上記(1)のＨＰＬＣ（ＳＰ−５ＰＷ）の溶出におい
て、メインピークの前半のフラクション（r.t.６４〜６
５分）を採取し、これを再度クロマトグラフイーに付す
ことにより、ポリペプチドＸを得た。２．７×１０⁶Ｇ
ＩＦ単位／ｍｇ蛋白。また同様に、メインピークの後半
のフラクション（r.t.７２〜７６分）より、ポリペプチ
ドＸＩを得た。２．８×１０⁷ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。 (3) 上記(1)及び(2)で得られたポリペプチドＩ、Ｘ及
びＸＩのアミノ酸分析を、参考例２−（４）と同様にし
て行なった。結果を下記第２表に示す。またポリペプチ
ドＸ及びＸＩについては、参考例２−（４）におけるア
ミノ酸配列分析と同様にして、それらのＮ末端部配列を
確認、同定した。Embedded imageFrom the above figure, the region complementary to the synthetic probe is
312th to 371st (shown underlined in the figure)
Base sequence derived from human codon usage
% Homology. Also, in the cDNA of pGIF-α
The longest reading frame of the
As a result of the search, 57th to 771th from the 5 'end
Area. Encoding the human IL-1 precursor protein
The plasmid pGIF-α having the cDNA
Escherichia coli 1776
Strain, and the strain is owned by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(Microtechnical Lab), “Escherichia coli @ 1776 / pG
IF-α ”, by the name of KAJI Jyocho No. 948 (FER
Reference Example 2 Production of Polypeptide I Plasmid pGIF-α obtained in Reference Example 1 was replaced with a restriction enzyme
After cutting with elementary AccI and ClaI,
-Agarose gel electrophoresis of DNA fragment of spare (kbp)
It was isolated and purified by electrophoresis. This DNA fragment is
Using Merase I (Klenow fragment), the restriction enzyme AccI
And the ClaI digestion was blunt-ended. On the other hand, BamHI
Linker (5'HOCGGATCCGOH 3 ')
Phosphorylation by T4 polynucleotide kinase,
T4 DNA ligator
After ligating with BamHI, cut with restriction enzyme BamHI,
And cut with the restriction enzyme MspI.
Approximately 540 base pairs (bp) of M
The spI-BamHI DNA fragment was isolated and purified.
The oligodeoxynucleotides (I) and (II) are
Was synthesized as described above. 5'HOCGATAATGGCTCCTGTACGTTCTCTGAACTGCACTCTCOH 3 '(I) 5'HOCGGAGAGTGCAGTCCAGAGAACGTACAGGAGCCATTATOH 3' (II) That is, 5'-O-dimension bound to macroporous silica
Toxitrityl and N-protected deoxynucleosides (A
Pride Biosystems) as a starting material,
5'-O-dimethoxytrityl from the 3 'side to the 5' side and
N-protected deoxymononucleoside-3'-phosphoamid
An automatic synthesizer (applied
Io Systems 380A DNA synthesizer
The nucleotide chain was sequentially extended using-). Continued
By treatment with thiophenol and 2
Treatment at room temperature with 8% ammonia
To remove the fully protected oligonucleotide.
I got it. All of the above operations were performed using an automatic synthesizer.
Ivy [Hunkapiller et al., Nature,310, 105 (1
984)]. Then, the obtained fully protected oligonucleotide is obtained.
Treated with 2 ml of 28% aqueous ammonia at 55 ° C for 10 hours
To remove the N-protecting group to give 5'-O-dimethoxy
Lithyl oligonucleotide was obtained. Using this 1/5 amount
And ODS (manufactured by Yamamura Chemical Laboratory) as a carrier
After purification by high performance liquid chromatography, 80% acetic acid 1
The crude oligonucleotide was treated with 50 μl at room temperature for 20 minutes.
I got it. This is a reversed-phase high-performance liquid chromatography using ODS as a carrier.
The target oligo is further purified by
The nucleotide was obtained. Synthetic oligodeoxy synthesized above
Each 5 'end of each of the nucleotides (I) and (II) is
Phosphorylation by polynucleotide kinase
MspI-BamHI DNA fragment was ligated with T4 DNA ligator.
After ligation using ligase, cut with restriction enzymes BamHI and ClaI.
The resulting reaction was subjected to agarose gel electrophoresis.
Approximately 580 bp ClaI-BamHI DNA fragment
Made. On the other hand, plasmid pTMI
22, 289 (1985)], and the restriction enzyme BamH
After digestion with I and ClaI, agarose gel electrophoresis
Approximately 4.4 kbp DNA fragment containing trp promoter region
Was isolated and purified. This DNA fragment and about 5 previously prepared
An 80 bp ClaI-BamHI DNA fragment was combined with T4 DNA
Ligase-ligated for expression of desired polypeptide I
The midp trp GIF-α was obtained. The plasmid is
Transform to Richia Collie HB101, eyes
Target transformant using the boiling method
method), the restriction enzyme content of the plasmid DNA obtained by
[T. Maniatis, E .; F. Fritsch
 and J. Sambrook, Molecular Cloning, pp36
6, Cold Spring Harfor Laboratory, (198
2)]. The above outline is shown in FIG. The above transfer
Plasmid p trp GIF-α integrated into the aunt
Will transfer this to Escherichia coli 1776
And transform the transformant with “Escherichia coliχ
"1776 / p trp GIF-α"
On February 12, microfabrication was added to the Institute of Microbial Industry of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
No. 949 (FERMBP-949). (2) Culture of transformant The above transformant (Escherichia coli HB101 / ptr)
p GIF-α) was converted to 50 μg / ml ampicillin and L
LB medium containing 20 μg / ml of tryptophan (1%
Tryptone, 0.5% yeast extract and 0.5% NaC
l) Incubate with shaking at 37 ° C. overnight in 10 ml.
1 with 50 μg / ml ampicillin and 1% casamino acid
M9 minimal medium containing 0.6% Na_TwoHPO_Four, 0.3% K
H_TwoPO_Four, 0.05% NaCl, 0.1% NH_FourCl,
2 mM MgSO_Four0.2% glucose and 0.1 m
M CaCl_Two) Inoculate 50ml and shake culture at 37 ℃
And the absorbance (OD) at 550 nm was 1.0.
At this time, cells were collected and 15% sucrose-50 mM
Squirrel HCl (pH 8.0)-50 mM EDTA (pH
8.0), and suspended at 10 mg / ml lyso
Team [dissolve in 10 mM Tris HCl (pH 8.0)
Solution], and then add 0.3% Triton X1
00-187.5 mM EDTA (pH 8.0) -15
5 ml of 0 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added.
After leaving at room temperature for 15 minutes,
By separation, a supernatant of the cell extract having GIF activity was obtained. (3) Purification of polypeptide IIon exchange chromatography (CM-HPLC) The cell extract supernatant obtained above was diluted with 50 mM sodium acetate.
After dialysis with buffer (pH 5.5), Gilson Hyper For
Month liquid chromatography system
Ion-exchange chromatography with Luson (Gilson)
Laugh (CM-HPLC). The condition is
It is on the street. Column: IEX-535CM (6.0 × 1
Eluent: Solution A = 50 mM sodium acetate
Thorium (pH 5.5, solution B = containing 0.5M NaCl)
50 mM sodium acetate (pH 5.5) flow rate: 0.5
ml / min Reversed-phase high-performance liquid chromatography-Retention time 90 to 9 obtained by the above CM-HPLC
One minute fractions are then separated by reversed-phase high-performance liquid chromatography.
Attached. The conditions are as follows. Column: C_Four
Hypore reverse phase column (RP304) Bio-Rad,
4.6 x 250 mm diameter eluent: solution A = 0.1% TF
Solutions A and B = acetonitrile: 1% TFA (9: 1)GIF in retention time of 63.9-65.3 minutes
The purpose is to show the absorbance peak of a single protein that matches the activity
Polypeptide I was obtained. Polypeptide I obtained
Has IL-1 activity and its specific activity is
2.7 × 10⁷Unit / mg protein. (4) Identification of polypeptide ISDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PA
GE) Laemmli, U.S.A. K. [Nature,277, 680
(1970)], and the polypeptide obtained in (3) above.
SDS-PAGE of I was performed. The conditions are as follows
It is. Sample: In the above reversed-phase high-performance liquid chromatography
The polypeptide I fraction is dried to dryness and
Pull buffer [1/20 volume 2-mercaptoeta
Contains Nol (2ME⁺) Or not included (2ME^-)]
Dissolved and treated at 100 ° C. for 4 minutes. Gel: 15% polyacrylamide gel with 1.5mm thickness
used. Electrophoresis device: Bio-Rad protein protector
Anne was used. Electrophoresis conditions: Electrophoresis was performed at a constant current of 40 mA for 2 hours. The gel after the electrophoresis is transferred to Bio-Rad Silver Stunts.
(Silver stain kit). The result
As a result, the polypeptide I has 2ME⁺Below is about 17K
In position, 2ME^-Approximately 17.5K below
Each run as a single band.Isoelectric focusing (IEF) The isoelectric focusing of polypeptide I was carried out in the pH range 3.5-3.5.
9.5 Ampfoline PAG plate (manufactured by LKB)
And model 1415 (Bio-Rad).
I got it. The conditions are as follows. Sample: above (3)
0.037 μg, 0.074 μ of polypeptide I obtained in
g and 0.74 μg, respectively, and the following marker proteins:
In (pI marker protein) using a total of 4 lanes
Was. <Marker protein> Amyloglucosidase (3.50), soybean trypsin
Inhibitor (4.55), β-lactoglobulin A
(5.20), bovine carbonic anhydrase
(Bovine carbonic anhydrase) B (5.85), human
 Carbonic anhydrase (human carbonic anh
ydrase) B (6.55), equine myoglobin-acide
Horse band (horse myoglobin-acidic band) (6.
85) Horse myoglobin-basic band (horse
myoglobin-basic band) (7.35), lentil lek
Lentil lectin-acidic ban
d) (8.15), lentil lectin-middle band
(Lentillectin-middle band) (8.45), lentil
 Lectin-basic band (lentil lectin-basic)
band) (8.65) and trypsinogen (9.3)
0).Electrophoresis conditions: constant power 1W / cm gel width and cooling for 90 minutes
(10 ° C.). Dyeing: Dyeing is done with a silver stein kit.
Was. After the above electrophoresis, the gel was sliced at intervals of 1 cm, and distilled water 1
Extract with shaking (2 days), measure the pH, and determine the isoelectric point.
Calculated. As a result, the isoelectric point (pI) of polypeptide I
Is 6.8 ± 0.1 and a single band at this position
Was electrophoresed.Amino acid composition ratio Obtained by reversed-phase high-performance liquid chromatography described in (3) above.
30 μl of the obtained polypeptide I fraction was added to a 12 mm × 1
Pay attention to the bottom of a 20 mm thick Pyrex hard test tube
Put deeply in a desiccator containing sodium hydroxide granules
And dried under reduced pressure. 4N-meta in test tube containing dried sample
Sulfonic acid [0.2% of 3- (2-aminoethyl) i
Containing Pierce) and 50 μl
In addition, after degassing at 0.1-0.2 mmHg for 1 minute, seal under reduced pressure
did. Hydrolysis requires 24 hours in a heater at 118 ° C.
I went. After opening the tube, 4N-sodium hydroxide 46μ
and make up to 450 μl with citrate buffer for dilution.
Was. For amino acid analysis, use the amino acid analyzer (Hitachi
Using the Hitachi 835 analyzer).
This was done by injecting 0 μl. The isolated amino acids are
It was detected by the orthophthalaldehyde method. The quantification is performed on the sample
By a calibration curve created with standard amino acids analyzed before and after
I went. The result is based on Phe (9 mol).
The content molar ratio of each amino acid is shown in Table 1 below. still,
Under the above analysis conditions, Pro and Cys cannot be measured.
No. For Ser, Thr and Met, the above analysis conditions
The recoveries below are shown in parentheses. Amino acid sequence Polypropylene obtained by reversed-phase high-speed chromatography in (3) above
150 μl of the peptide I fraction was applied to the Applied Biosystem
The analysis was performed using a protein sequencer manufactured by Muzu. Arising
33% acetonitrile aqueous solution 1
Dilute appropriately with 100 to 50 µl, and add 5 µl to the water
Was injected with an automatic sampler type 710B. Chroma
Tografie's system is a Beckman 112 pump
Two were operated with a 421 controller. column
Is 2m filled with Ultrasfair ODS-5μm
mx 250 mm, maintained at 55 ° C with a column heater
I got it. The flow rate was 0.3 ml / min and 20 mM sodium acetate
Gradient using a mixture of sodium and acetonitrile.
Separated by elution and monitored at 269 nm. Analysis is 45
Minutes. As a result of 20 cycles of analysis,
The amino acid sequence of the 20 N-terminals of polypeptide I
It was found to be: Ala-Pro-Val-Arg
-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-
Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-
Ser is confirmed as one of the by-products and is further absorbed at 322 nm.
Was confirmed as a dehydro form. Cycle 8
Presumed to be Cys from the by-product peak,
Cys was confirmed by analysis after carboxamide methylation of the sample.
I accepted. Alternatively, polypeptide I is digested with trypsin
Analyze the amino acid composition of the obtained peptide fragments
However, the C-terminal peptide is accurately contained without loss.
Confirmed that. That is, polypeptide I 60μ
g was dissolved in 600 μl of 1% ammonium bicarbonate.
To a solution previously dissolved in 1% ammonium bicarbonate
Lipsin (0.2 mg / ml, Cooper) solution
Add 20 μl, leave at 37 ° C. for 24 hours and trypsin
A truncated peptide was obtained. This peptide mixture was converted to reverse phase HP
LC [C-18, 300 angstrom, 4.6 × 1
50 mm; 0.1% TFA in solution A and 1% TFA 1/1
Acetonitrile containing 0 volumes was used as solution B, and the solution B was 1%
Eluted with a program increasing at a rate of / 3 min
And all the components are isolated when the solution B is up to 40%.
Was. These peptides were subjected to amino acid analysis. This net
Identification of all peptide fragments expected from the acid composition
Especially for the C-terminal peptide,
Not included and its amino acid composition results are expected
Since the amino acid contained exactly
The C-terminus of the resulting polypeptide I is as expected
It was confirmed to be accurate. In addition, each peptide fragment
And analyze their amino acid sequences as described above.
Was. As a result, all the confirmed sequences corresponded to IL-1β
did. With respect to the confirmed peptide fragments, IL-1
It is shown below by the amino acid number of β. <Confirmed peptide fragment (amino acid number)> 1-4, 5-11, 12-16, 17-27, 28-6
3, 64-65, 66-74, 75-88, 89-9
2, 95-98, 99-103, 104-109, 11
0-138, 139-153
The polypeptide I obtained in (3) is identified by the sequence defined above.
It was confirmed that the polypeptide I was used. In addition,
The calculated molecular weight of Ripeptide I is 17376.59.
is there. Example 1 Production of IL-1β Derivative of the Present Invention (1) Production of Polypeptide VI
To-Specifi mitage Genesis (Site-Spe
cific Mutagenesis) [Proc. Nat. Acad. Sci.,8
1, 5662-5666 (1984)].
No. 71 from the amino terminus of IL-1β (polypeptide I)
Polypeptide VI with Cys in the eye changed to Ser is as follows
Manufactured. That is, the M13mp11 phage vector is
Used as a single-stranded (ss) DNA template. First, the plasmid
EcoRI / BamHI DNA plasmid from p trp GIF-α
And cut out the M13mp11 phage (RF)
Cloning into EcoRI and BamHI restriction sites
From now on, single-stranded (ss) DNA (M13-GIF-
α) was obtained, and this was used as a template for mutagenesis. Combination
Synthetic oligonucleotide [5'-CTGTTCCTCAGT
GTTG-3 '(primer)] with T4 polynucleotide
Phosphorylate with tid kinase and convert it to ssM13-GIF-
After hybridization with α DNA and annealing, dN
DNA polymerase I (Klenowfra) in the presence of TPs
Fragment) and T4 DNA ligase, respectively.
Incubated at 18 ° C. for 18 hours. The obtained DNA is
Transforms into M105 competent cells and produces
50 colonies were inoculated on an agar plate,
The cells were cultured at 37 ° C. for 18 hours. Including the colonies that grew
The ylter is alkali-modified by the usual method, dried,
A baking treatment was performed at 80 ° C. for 2 hours. This file
After pre-hybridizing the
The 5 'end of the primer³²Labeled with Pr-ATP³²
P-probe was hybridized at room temperature. Yes
The filtered filter is placed in a 6 × ssc buffer.
For 10 minutes at room temperature and then at 37 ° C for 10 minutes
After drying, autoradiography was performed at -70 ° C for 18 hours.
Performed. Representative from 5 mutated clones
Select M13-GIF-71s and infect it with JM105
And cultured to prepare ssDNA and RF DNA.
M13 dideoxy chain of ssDNA obtained above
Of the gene of interest by termination sequencing
The mutation was confirmed. In addition, the above-mentioned RF DNA
Thus, a new restriction enzyme DdeI site was also confirmed.
EcoRI from RF DNA grown on JM105
/ BamHI fragment was prepared.
In the same manner, the desired polypeptide is incorporated into the expression plasmid.
To obtain an expression plasmid (ptrp GIF-α-71S)
Was. The plasmid was constructed using Escherichia coli HB1.
01, and the strain was sent to E.I.
HB101 / p trp GIF-α-71S ”
Koken No. 1296 (FERM BP 1296)
Has been deposited. Using this plasmid, Reference Example 2
-In the same manner as in (2), a cell extract supernatant was obtained, and the
GIF activity was measured. As a result, per 1 ml of culture solution
GIF activity (unit / ml culture) was determined by Escherichia coli.
2.4 × 10 using HB101 as host⁶It was. This
Thus, the same means as in Reference Example 2- (3) was used.
Polypeptide VI was isolated and purified. (2) Production of polypeptide IV Same as (1) above using plasmid p trp GIF-α
To produce polypeptide IV. That is, M13mp11
Using phage vectors as single-stranded (ss) DNA templates
Was. First, EcoRI was obtained from plasmid p trp GIF-α.
/ BamHI DNA fragment was cut out and M13mp1
1 phage (RF) EcoRI and BamHI restriction enzymes
Cloned into a single strand (ss) DNA
(M13-GIF-α).
Mold. Synthetic oligonucleotide [5'-CT
GAACTCGACTCTC-3 '(primer)]
Is phosphorylated by T4 polynucleotide kinase,
Was hybridized with ssM13-GIF-α DNA,
After annealing, in the presence of dNTPs, DNA polymerase
-Ase I (Klenow fragment) and T4 DNA liger
Each, and incubate at 15 ° C for 18 hours.
Was. Transfer the obtained DNA to JM105 competent cells.
Transform the resulting colonies on an agar plate.
Was inoculated with 100 colonies and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
Filter the filter containing the grown colonies by the usual method
After alkali denaturation and drying, baking at 80 ° C for 2 hours
Was performed. Pre-hybridize this filter
After that, this and the 5 'end of the primer³²P
Labeled with -r-ATP³²P-probe at room temperature
Hybridized. Hybridized filters
For 10 minutes at room temperature in a 6 × ssc buffer, then
Each was washed at 37 ° C for 10 minutes, dried and then dried at -70 ° C for 18 minutes.
Timed autoradiography was performed. 4 mutated
Select M13-GIF-8S as a representative from the loan
This was infected with JM105 and cultured, and ssDNA and R
F DNA was prepared. M13 di of the ssDNA obtained above
Deoxy chain termination sequencer
The mutation of the target gene was confirmed by the test. Also above
In the RF DNA, the newly formed restriction enzyme Hinf
I site was also confirmed. RF grown on JM105
Preparation of EcoRI / BamHI fragment from DNA
This was expressed in the same manner as in Reference Example 2- (1).
And the desired polypeptide IV expression plasmid (p
trp GIF-α-8S) was obtained. Using this plasmid
Then, in the same manner as in Reference Example 2- (2),
Obtained. The GIF activity of the supernatant was determined to be Escherichia
1.2 × 10^FiveUnit / m
1 culture solution, using Escherichia coli W3110
6.2 x 10^FiveIt was a unit / ml culture solution. Up
From the supernatant, an eye was obtained by the same means as in Reference Example 2- (3).
The target polypeptide VI was isolated and purified. (3) Production of Polypeptide V Plasmid p trp GIF-α-7 obtained in (1) and (2) above
Each of 1S and p trp GIF-α-8S was replaced with restriction enzyme E
After digestion with coRI and HindIII, p trp GIF-α-8
A DNA fragment of about 400 bp from S and p trp
A DNA fragment of about 4600 bp from GIF-α-71S
Take out each one of them, ligate them,
The eighth from the N-terminus of IL-1β (polypeptide I) and
Desired poly-poly with all 71s Cys changed to Ser
Plasmid for expression of peptide V ptrp GIF-α-8S
71S was obtained. Using this plasmid, Reference Example 2-
In the same manner as (2), the cell extract supernatant (Escherichia
When E. coli HB101 is used as a host,
1.4 × 10^FourUnit / ml culture solution, Escherichia
When E. coli W3110 is used as a host, the GIF activity is 5
× 10^FiveUnit / ml of culture solution).
By the same means as in (3), the desired polypeptide V is simply
Separated and purified. (4) Production of polypeptide II In the same manner as in the above (1), 5'-GCCTCGTGAG
To use TTCTCTG-3 'as a primer
From the plasmid p trpGIF-
α-4G was obtained. The plasmid is
・ Kori HB101, and the stock was sent to Eiko
ichia coli HB101 / ptrp GIF-α-4G ”
No. 1297 (FERM BP 12)
97). Using the plasmid,
In the same manner as in Reference Example 2- (2), the cell extract supernatant (Eche
GIF activity using H. coli HB101 as a host
2.8 × 10^FiveUnit / ml culture).
By the same means as in Example 2- (3), the desired polypeptide
Was isolated and purified. In this purification operation, CM-
For rechromatography of the first half of the HPLC main peak
Thus, polypeptide XXXXVIII was obtained as a purified product. Po
Ripeptide XXXXVIII is comparable to polypeptide II.
It has CSF production promoting activity, and also has GIF activity, LA
Both F activity and PGE production promoting activity show low characteristics
did. (5) Production of polypeptide III In the same manner as in the above (1), 5'-GCACTCTCCAG
Using GACTCACA-3 'as a primer
The plasmid p trp GI for polypeptide III expression
F-α-11Q was obtained. Reference example using the plasmid
2- (2) and the cell extract supernatant (Escherichia)
-Using E. coli HB101 as a host and GIF activity
8 × 10⁶Unit / ml of culture solution), and
The desired polypeptide III by the same means as in (3)
Was isolated and purified. (6) Production of Polypeptide VII 5'-TCTTCAACTAG as described in (1) above
By using ATAGAA-3 'as a primer
Plasmid ptrpGIF-α for expressing polypeptide VII
-102CT was obtained. Reference Example 2
-Supernatant of cell extract (Escherichia
Using E. coli HB101 as a host, the GIF activity was 7.4.
× 10^FourUnit / ml of culture solution).
By the same means as (3), the desired polypeptide VII
Isolated and purified. (7) Production of polypeptide VIII 5'-AAAGGCGGCTA in the same manner as in the above (1)
Using GGATATAA-3 'as a primer
The plasmid ptrp GI for polypeptide VIII expression
F-α-140CT was obtained. Using the plasmid,
Escherichia coli W3 in the same manner as in Example 2- (2).
By using 110 as a host, the cell extract supernatant
(5.8 × 10 as GIF activity^ThreeUnit / ml culture solution)
And the same procedure as in Reference Example 2- (3) was performed.
The desired polypeptide VIII was isolated and purified. Also,
Plasmid p trp GIF-α-140CT was replaced with Escherichia coli.
Expression of H. coli HB101 as a host
Similarly, the supernatant of the cell extract (1.3 as GIF activity)
× 10⁶Unit / ml culture solution).
Similarly, polypeptide I was isolated and purified. In addition, above
In the description, Escherichia coli HB101 is used as a host.
If you do, SupE as a nonsense suppressor
Working, the stop codon of UAG is read as Gln (read
 through) polypeptide I is expressed. One-sided accommodation
If the Lord is Escherichia coli W3110, S
Since the upE gene is not encoded, the above UAG is terminated.
Acts as a stop codon, consisting of 140 amino acid sequences
The polypeptide VIII is expressed. (8) Identification of polypeptides I to VIII The IL-1β derivative of the present invention obtained in the above (1) to (7)
Ripeptides I to VIII) as in Reference Example 2- (4)
To SDS-PAGE (18% polyacrylamide gel)
2ME⁺). As a result, the polypeptide
I to Polypeptide VII are all located at about 17.5 kd
And polypeptide VIII is located at about 16 kd.
And run as a single band. Also, polypeptides
Neutralizing antiserum against GIF activity of I (Reference Example 2- (3)
Immunize rabbits with polypeptide I obtained in
Using the antiserum prepared in
Rotting [Western blotting, Proc. Natl. Acad.
Sci., USA,76, 1420 (1979)]
Each of polypeptides I-VIII corresponds to
The position was confirmed as a single band. Example 2 (1) Transformant (Escherichich) obtained in Reference Example 2- (1)
A. coli HB101 / ptrp GIF-α)
Phosphorus 50 μg / ml and L-tryptophan 20 μg /
overnight at 37 ° C in 400ml of LB medium containing 100ml
Then, 400 ml of this was added to the minimum culture medium of M9 containing 1% casamino acid.
The seeds were inoculated in 20 l of the ground and cultured at 37 ° C. for 8.5 hours. Centrifugation
The cells are collected by separation, and the obtained cells are 1 M Na_TwoHPO_Four
Suspended in a cold room overnight, and then 10 mM Tris H
Dialysis was performed for 2 days against a Cl buffer (pH 8.0). Profit
Centrifuged dialysate (10000 rpm, 30 minutes)
To obtain a supernatant. Equivalent to 300 l of E. coli culture
The supernatant was collected and adjusted to pH 5.0 with 100 mM acetic acid.
After production, SP-Zetaprep 250 cartridge
[Manufactured by LKB] and started at a flow rate of 30 ml / min.
100 minutes with mM sodium acetate (pH 5.3), followed by
50 mM sodium acetate containing 0.1 M NaCl (p
H5.5) for 220 min, 50 further containing 1 M NaCl.
elute each with mM sodium acetate (pH 5.5)
Was. Each fraction is checked by HPLC and contains the target compound.
Fraction containing 0.1 M NaCl
Fraction of 50 mM sodium acetate (pH 5.5)
(Fractions No. 8 to 10) were collected. This is 100
After adjusting the pH to 4.5 with mM acetic acid, the HPLC [Toyo Soda strain
TSK gel SP-5PW, 5.5 × 20 cm, manufactured by Shikisha Co., Ltd.]
And eluted under the following conditions, retention time
(R.t.) 65-72 min fractions were collected. Eluent A: 50 mM sodium acetate (pH 5.5) Eluent B: 50 mM sodium acetate containing 0.5 M NaCl
Um (pH 5.5)Thus, a purified polypeptide I was obtained. This is extraordinary
Filtration (YM-5 membrane) resulted in 20 mM sodium phosphate.
So that the solution composition of thorium buffer (pH 7.0)
The solution was concentrated (20 mg / ml) while changing the buffer. Change
And Positain Filter NFZ (Nippon Pall Corporation)
The above-mentioned concentrated solution was supplied to the attached filtration device, and sterilized and filtered.
After that, Pyrogien is a purified product with 100pg / mg protein or less.
I got According to the above purification method, 300 l of E. coli culture
As a result, about 3 g of polypeptide I was obtained. (2) Elution of HPLC (SP-5PW) in (1) above
And the first half of the main peak (r.t.
5 minutes) and re-chromatograph it
Thereby, polypeptide X was obtained. 2.7 × 10⁶G
IF units / mg protein. Also in the second half of the main peak
From the fraction (r.t. 72-76 minutes)
DeXI was obtained. 2.8 × 10⁷GIF units / mg protein. (3) The polypeptides I, X and the polypeptides obtained in (1) and (2) above
And XI were analyzed in the same manner as in Reference Example 2- (4).
I did it. The results are shown in Table 2 below. Also Polypepti
For X and XI, the procedure in Reference Example 2- (4)
Similar to amino acid sequence analysis, their N-terminal sequences were
Confirmed and identified.

【化１２】 (4) ポリペプチドＩは、分子内に２個のＣys（８位及
び７１位）を有している。之等Ｃysの側鎖ＳＨ基の存在
状態を、下記方法により調べた。a ．参考例２−（３）
で得たポリペプチドＩの約５ナノモル相当（０．１Ｍ
ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
５）溶液１００μｌ）を、Ａ、Ｂ及びＣの３本の試験管
にそれぞれ分取し、各試験管に０．１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．４５）を含有させた６Ｍグアニジン塩酸溶液
各３００μｌを加えた。次に試験管Ａ及びＢには、６Ｍ
グアニジン塩酸溶液２５μｌを加えてブランクとし、試
験管Ｃには還元剤であるジチオスレイトール２μモルを
含む６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを加え、各試験管
に１分間窒素ガスを吹込んだ後、５０℃で２時間放置し
た。次いで、試験管Ａには、ブランクとして、６Ｍグア
ニジン塩酸溶液２５μｌを、試験管Ｂ及びＣにはヨード
アセトアミド４μモルを含む６Ｍグアニジン塩酸溶液２
５μモルを加え、各試験管に１分間窒素ガスを吹込んだ
後、暗所で２５℃下に３０分間放置した。上記の通り処
理した試験管Ａ、Ｂ及びＣに、それぞれ１０％ＴＦＡ５
μｌを加え、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ₃）により蛋白質を精製
した。精製蛋白質の約１／１０量を試験管に取り、乾燥
後、４Ｎ−メタンスルホン酸にて加水分解し、アミノ酸
組成を調べた。その結果、試験管Ｂ及びＣからは、カル
ボキシメチルシステインが、ほぼ同量検出された。この
ことから、試験管ＡではポリペプチドＩはそのままの状
態であるのに対し、試験管Ｂ及びＣでは、Ｓ−カルボキ
サミドメチル化−ポリペプチドＩに変化したことが確認
でき（試験管Ｂは還元剤にさらしていないので）、従っ
てポリペプチドＩに含まれるＣysは、ジスルフィド（Ｓ
−Ｓ）結合を本形成していないことが判った。更に、上
記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生成物の残量（％）を乾燥
後、これらにそれぞれ１％重炭酸アンモニウム溶液６０
０μｌを加えて溶解させて、各々１μｇ／５μｌ濃度に
調製した。之等各液にトリプシン溶液７．５μｌをそれ
ぞれ加え、３７℃で２０時間酵素消化を行なった。その
後、各液に１０％ＴＦＡ１０μｌを加え、酵素反応を停
止させ、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ₁₈）にて、ペプチド断片を分
離した。その結果、試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパターン
を示し、試験管Ａは之等とは異なるパターンを示した。
上記で単離した各ペプチドのアミノ酸組成を、前記と同
様にして求めた結果、試験管Ａのペプチド断片から、Ｃ
ys１個を含まなければ生じないポプチドの存在を確認し
た。以上の結果から、ポリペプチドＩのＣys残基は、分
内及び分子間のいずれでもジスルフィド結合を形成して
いないことが確認された。b ．エルマン法〔Ｅllman
法、Ａrch.Ｂiochem．Ｂiophys.,８２，７０（１９５
９）〕に従い、以下のごとくしてポリペプチドＩのＳＨ
基の定量を行なった。即ち、参考例２−（３）で得たポ
リペプチドＩの２００μｇ（１１．５μモル）を、６Ｍ
塩酸グアニジン及び１−ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解させ
た。一方、新鮮な０．０１Ｍ ＤＴＮＢ〔５，５’−ジ
チオビス（２−ニトロベンゾイック アシッド〕を含む
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下これを
「エルマン試薬」という）を調製した。対照セルに６Ｎ
塩酸グアニジン及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
トリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを、また試料
セルにポリペプチドＩを含む上記溶液１ｍｌをそれぞれ
導入し、その各々にエルマン試薬各４０μｌを加えて混
合し、直ちに４１２nmにおける吸光度を測定した。最大
吸光度になった後、ＤＴＮＢの分解による吸光度の減少
を「０」に補正して、ＳＨ基の濃度を決定したその結
果、実際に得られた４１２nmでの吸光度は０．３２８で
あった。一方、６Ｍ塩酸グアニジンを含む水溶液中での
３−カルボキシレート−４−ニトロチオフエノレート
（３−calboxylate −４−nitrothio-phenolate ）イオ
ンのε₄₁₂は、１３８８０Ｍ^-1cm^-1であり〔Ｅur. Ｊ.
Ｂiochem.,３０，３２（１９７２）〕、このことより、
ポリペプチドＩ溶液のＳＨ基は、０．００００２４５
（Ｍ／e ）であり、ポリペプチドＩの１１．５μモル中
にＳＨ基が２４．５μモル存在することとなることが判
った。上記より、ポリペプチドＩに含まれるＣysは、共
に遊離のＳＨ基を有していることが確認された。尚、ポ
リペプチドＩを水又はＰＢＳ（−）に溶解し、凍結乾燥
を３〜４回繰返した場合においても、ＧＩＦ活性及び上
記エルマン法によるＳＨ基の定量値には、殆んど変化は
認められなかった。 (5) 遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等で多量に異種
蛋白質を発現させる場合、その蛋白質は大腸菌の菌体中
に不溶性物質（inclusion body）として蓄積されること
が多く、このような場合には、目的蛋白質を菌体から採
取するに当って、例えば７Ｍ塩酸グアニジン、８Ｍ尿素
又は０．１％ＳＤＳ等の変性剤を使用する過激な条件下
での処理が必要となる。しかるに、この様な処理によれ
ば、目的蛋白質は、その高次構造を含めて、不可逆的な
損傷を受けるおそれが多分にある。従って、できる限り
上記の如き変性剤を使用することなく、温和な条件下で
目的蛋白質を単離抽出できることが、上記遺伝子組換え
技術上の重要な関心事である。しかして、前記した(1)
に示す方法によれば、目的蛋白質の抽出単離を、浸透圧
ショックという非常に温和な条件の採用により行なうこ
とができ、この点で該方法は極めて好ましい。また該方
法に従い得られる目的蛋白質は、より天然に近い高次構
造を保持されており、この点からも望ましいものであ
る。 (6) 実施例１−(1)に準じて、プラスミドp trp ＧＩＦ
−αを利用したサイト−スペシフィックミュータジェネ
シスにより、下記３表に示す各ポリペプチド（本発明Ｉ
Ｌ−１β誘導体）を得た。尚、各ポリペプチドの発現、
ＧＩＦ活性の測定及び精製は、上記(1)に従うものであ
り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは参考例２−（４）に示す方法に
準じた。以下の各例でも特筆しない限り同様である。Embedded image (4) Polypeptide I has two Cys (positions 8 and 71) in the molecule. The existence state of the side chain SH group of Cys was examined by the following method. a. Reference Example 2- (3)
About 5 nmol of polypeptide I obtained in
50 mM sodium acetate containing NaCl (pH 5.
5) 100 μl of the solution was dispensed into three test tubes A, B and C, respectively, and 0.1 M Tris HCl was added to each test tube.
300 μl each of a 6 M guanidine hydrochloride solution containing (pH 8.45) was added. Next, test tubes A and B contain 6M
25 μl of a guanidine hydrochloride solution was added to make a blank. Test tube C was added with 25 μl of a 6 M guanidine hydrochloride solution containing 2 μmol of dithiothreitol as a reducing agent, and nitrogen gas was blown into each test tube for 1 minute. For 2 hours. Then, 25 μl of a 6 M guanidine hydrochloride solution was used as a blank in test tube A, and 6 M guanidine hydrochloride solution 2 containing 4 μmol of iodoacetamide was used in test tubes B and C.
5 μmol was added, and nitrogen gas was blown into each test tube for 1 minute, and then left at 25 ° C. for 30 minutes in a dark place. Test tubes A, B and C treated as described above were each filled with 10% TFA5.
μl was added, and the protein was purified by reverse phase HPLC (C ₃ ). About 1/10 amount of the purified protein was placed in a test tube, dried, hydrolyzed with 4N-methanesulfonic acid, and the amino acid composition was examined. As a result, almost the same amount of carboxymethylcysteine was detected from test tubes B and C. From this, it can be confirmed that the polypeptide I remains in the test tube A as it is, whereas the test tubes B and C are changed to S-carboxamide methylated-polypeptide I (the test tube B is reduced Cys contained in Polypeptide I is therefore a disulfide (S
-S) It was found that the bond was not completely formed. Further, after drying the remaining amount (%) of the product in the test tubes A, B and C, each of them was added to a 1% ammonium bicarbonate solution 60%.
0 μl was added and dissolved to prepare a concentration of 1 μg / 5 μl, respectively. 7.5 μl of a trypsin solution was added to each of these solutions, and enzyme digestion was performed at 37 ° C. for 20 hours. Thereafter, 10 μl of 10% TFA was added to each solution to stop the enzymatic reaction, and the peptide fragments were separated by reverse phase HPLC (C ₁₈ ). As a result, test tubes B and C showed almost the same pattern, and test tube A showed a different pattern.
The amino acid composition of each peptide isolated above was determined in the same manner as described above.
The presence of a peptide that would not be produced without ys was confirmed. From the above results, it was confirmed that the Cys residue of the polypeptide I did not form a disulfide bond in any of the molecules and between the molecules. b. Ellman method [Ellman
Biochem. Biophys., 82 , 70 (195)
9)], the SH of polypeptide I is determined as follows:
The groups were quantified. That is, 200 μg (11.5 μmol) of the polypeptide I obtained in Reference Example 2- (3) was
0.1 M with guanidine hydrochloride and 1 mM EDTA
It was dissolved in 1 ml of Tris HCl buffer (pH 8.0). On the other hand, a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing fresh 0.01 M DTNB [5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)] (hereinafter referred to as “Ellman's reagent”) was prepared. 6N in control cell
0.1 M with guanidine hydrochloride and 10 mM EDTA
1 ml of Tris-HCl buffer (pH 8.0) and 1 ml of the above solution containing polypeptide I were introduced into the sample cell, respectively, and 40 μl of each Ellman's reagent was added to each, mixed, and the absorbance was immediately measured at 412 nm. After reaching the maximum absorbance, the decrease in absorbance due to the decomposition of DTNB was corrected to "0", and the SH group concentration was determined. As a result, the actually obtained absorbance at 412 nm was 0.328. On the other hand, ε ₄₁₂ of 3-carboxylate-4-nitrothio-phenolate ion in an aqueous solution containing 6 M guanidine hydrochloride is 13880 M ⁻¹ cm ⁻¹ [Eur J.
Biochem., 30 , 32 (1972)].
The SH group of the polypeptide I solution is 0.0000245
(M / e), indicating that 24.5 μmol of SH groups were present in 11.5 μmol of polypeptide I. From the above, it was confirmed that both Cys contained in polypeptide I had a free SH group. Even when polypeptide I was dissolved in water or PBS (-) and freeze-dried three to four times, almost no change was observed in the GIF activity and the quantitative value of the SH group by the above-mentioned Ellman method. I couldn't. (5) When a large amount of a heterologous protein is expressed in E. coli or the like according to the gene recombination technique, the protein is often accumulated as an insoluble substance (inclusion body) in the cells of E. coli. In order to collect the target protein from the cells, treatment under extreme conditions using a denaturant such as, for example, 7M guanidine hydrochloride, 8M urea or 0.1% SDS is required. However, according to such a treatment, the target protein, including its higher-order structure, is likely to be irreversibly damaged. Therefore, it is an important concern in the above-mentioned gene recombination technology that the target protein can be isolated and extracted under mild conditions without using the above-mentioned denaturing agents as much as possible. Then, the above (1)
According to the method described in (1), the extraction and isolation of the target protein can be carried out by employing a very mild condition called osmotic shock, and this method is extremely preferable. In addition, the target protein obtained according to the method retains a higher-order structure that is more natural, and is also desirable in this respect. (6) In accordance with Example 1- (1), plasmid p trp GIF
Each polypeptide shown in Table 3 below (invention I) was obtained by site-specific mutagenesis using
L-1β derivative). In addition, expression of each polypeptide,
The measurement and purification of GIF activity was in accordance with the above (1), and SDS-PAGE was in accordance with the method shown in Reference Example 2- (4). The same applies to the following examples unless otherwise specified.

【化１３】 Embedded image

【化１４】 (7) 実施例１−(6)で得たプラスミドp trp ＧＩＦ−α
−１０２ＣＴを用いて、宿主をエシェリヒア・コリＷ３
１１０として、同様に発現及び精製して本発明ＩＬ−β
誘導体であるポリペプチドＸＸＸを得た。約１１．４kd
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、以下同じ）。 (8) プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇを利用し、プ
ライマーとして５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴ
ＣＡＣＡ−３’を用いて、上記(6)と同様にしてポリペ
プチドＸIV発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ１
１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、エシェリヒア・コ
リＨＢ１０１を宿主として、同様に発現（２．７×１０
⁵ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製して、本発明ＩＬ
−１β誘導体であるポリペプチドＸIVを得た。約１７．
５kd。 (9) 実施例１−(3)に準じて、プラスミドp trp ＧＩＦ
−α−４Ｇ及びp trp ＧＩＦ−α−９８Ｌを用いて、ポ
リペプチドＸＶ発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４
Ｇ９８Ｌを得た。即ち、上記両プラスミドを制限酵素Ｅ
coＲＩ及びＨind III で切断後、p trpＧＩＦ−α−４
Ｇから約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp
ＧＩＦ−α−９８Ｌから約４．６kbp のＤＮＡフラグメ
ントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーションさせ
た。プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを用い
て、エシェリヒア・コリＷ３１１０を宿主として同様に
発現及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペ
プチドＸＶを得た。約１７．５kd。 〔１０〕 上記(9)において、プラスミドp trp ＧＩＦ
−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩＦ−α−１１
Ｑ（その約４００bpのＤＮＡフラグメントを使用）を用
いて、同様にしてポリペプチドＸVI発現用プラスミドp
trp ＧＩＦ−α−１１Ｑ９８Ｌを得た。該プラスミドを
用い同様にして本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプ
チドＸVIを得た。約１７．５kd。 〔１１〕 上記(9)において、プラスミドp trp ＧＩＦ
−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ
１１Ｑを用いて、該プラスミドからの約４００bpのＤＮ
Ａフラグメントを使用して、同様にしてポリペプチドＸ
III発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ１１Ｑ９
８Ｌを得た。該プラスミドを用い同様にして本発明ＩＬ
−１β誘導体であるポリペプチドＸIIIを得た。約１
７．５kd。 〔１２〕 実施例１−(3)に準じて、プラスミドp trp
ＧＩＦ−α−８Ａ及びp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓを用い
て、ポリペプチドＸＸＸVI発現用プラスミドp trpＧＩ
Ｆ−α−８Ａ７１Ｓを得た。即ち、上記両プラスミドを
制限酵素ＥcoＲＩ及びＨind IIIで切断後、p trpＧＩＦ
−α−８Ａから約４００bpのＤＮＡフラグメントを、ま
たp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓから約４．６kbp のＤＮＡ
フラグメントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーショ
ンさせた。プラスミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを
用い、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として同様
に発現（８．７×１０⁵ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び
精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸ
ＸＸVIを得た。約１７．５kd。 〔１３〕 上記〔１２〕において、プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp trp ＧＩＦ−α
−７１Ａ（その約４．６kbp のＤＮＡフラグメントを使
用）を用い、同様にしてポリペプチドＸＸＸVII 発現用
プラスミドp trpＧＩＦ−α−８Ａ７１Ａを得た。該プ
ラスミドを保有するエシエリヒア・コリＨＢ１０１は微
工研に「Ｅscherihia coli ＨＢ１０１／ｐｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−８Ａ７１Ａ」なる名称で微工条研第１２９８
号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９８）として寄託されてい
る。該プラスミドを用い同様に発現（１．６×１０⁶Ｇ
ＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製して本発明ＩＬ−１β
誘導体であるポリペプチドＸＸＸVII を得た。約１７．
５kd。 〔１４〕 上記〔１２〕において、プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp trp ＧＩＦ−α
−７１Ｖを用いて、該プラスミドからの約４．６kbp の
ＤＮＡフラグメントを使用し、同様にしてポリペプチド
ＸＸＸVIII発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ
７１Ｖを得た。該プラスミドを用いて同様に発現（２．
１×１０⁶ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製して本発
明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＸＸVIIIを得
た。約１７．５kd。 〔１５〕 上記(1)の方法に従い、実施例１−(1)〜(7)
及び後記実施例３−(6)〜(9)の各々で得られた形質転換
体より、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドII
〜VIII及びＸＸＸＩ〜ＸＸＸIVを製造した。之等はいず
れもＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドとして泳動され
た。またポリペプチドII〜VIIIは、前記と同一の位置に
泳動され、ポリペプチドＸＸＸＩ〜ＸＸＸIVは、下記の
通りであった。 ポリペプチドＸＸＸＩ 約２２kd ポリペプチドＸＸＸII 約２３kd ポリペプチドＸＸＸIII 約２７kd ポリペプチドＸＸＸIV 約３１kd 実施例３ (1)Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ａscenso，Ｊ．Ｌ．
et al., Ｂlood，Ｖol．５７，p １７０（１９８１）〕
１．４×１０⁹個を、１２−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（フアルマシア社
製）２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリンＡ（ＣonＡ）（シ
グマ社製）１０μｇ／ｍｌ及び１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に入れて、４×１０
⁵個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を調製した。この細胞浮
遊液１０ｍｌずつを、直径９cmのシヤーレ（フアルコン
３００３）に分注し、５％炭酸ガス中、３７℃で３日間
培養後、培養上清をアスピレーターにて除去し、１０％
ＦＣＳ、細菌リポポリサツカライド（ＬＰＳ）（デイフ
コ社製）１０μｇ／ｍｌ、ムラミルジペプチド（ＭＤ
Ｐ）（和光純薬社製）１μｇ／ｍｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／
ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを、各シヤ
ーレに分注した。この培地にて５％炭酸ガス中、３７℃
で１８時間培養し、シヤーレ底部に付着したＵ９３７細
胞をm ＲＮＡ調製用の材料として利用した。 (2)ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（guan
idium ／hot phenol）法〔Ｆeramisco, Ｊ．Ｒ，et a
l., Ｊ．Ｂiol.Ｃhem., Ｖol. ２５７，p １１０２４
（１９８２）〕とグアニジニウム／セシウムクロライド
（guanidinium ／cesium chloride ）法〔Ｇlisin,Ｖ．
et al., Ｂiochemistry ，Ｖol. １３，p ２６３３（１
９７４）〕との組合せにより行なった。上記(1)で培養
したＵ９３７細胞を洗浄するために、培養上清を除去し
た後、各シヤーレを５ｍｌのＰＢＳ（−）溶液にてすす
ぎ、その後、各シヤーレに１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・
イソチオシアネート混合液〔４Ｍ−グアニジンイソチオ
シアネート（Ｆluka社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザル
コシン酸ナトリウム〕を添加し、細胞を溶解させた。溶
解液をラバーポリスマンとパスツールピペツトにて回収
して、細胞溶解液４２０ｍｌを得た。この溶解液を６０
℃に保ち、１８Ｇ注射針に通過させることにより、染色
体ＤＮＡをせん断し、その後６０℃に保温したフエノー
ルを等量加え、１８Ｇ注射針にて更に溶液を混合し、せ
ん断した。次いでこの混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム
−１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ液２１０ｍｌとクロロホルム−イソアミルアルコー
ル（２４：１容積比）混液４２０ｍｌとを加え、６０℃
に保温しながら、１５分間激しく撹拌した。混合液を氷
冷後、３０００rpm 、４℃で２０分間遠心し、水層を回
収した。水層に２容のエタノールを加え、−７０℃にて
一夜放置後、粗ＲＮＡ沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍ
グアニジン・イソチオシアナート−５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）−０．１Ｍβ−メルカプトエタノ
ール−０．５％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム液
４８ｍｌに溶解させ、塩化セシウム１９．２g を添加し
て溶解させた。次にこの混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ
塩化セシウム−０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４
ｍｌに重層し、ベツクマンＳＷ４０Ｔi ローターにて、
２５℃、３１５００rpm で２０時間遠心して、ＲＮＡを
分取した。かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇであ
つた。次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを取得す
るため、オリゴ(ｄＴ)-セルロース（コラボレイテイブ
リサーチ（Ｃollaborative Ｒesearch,Ｉnc．社製）
を用いて、カラムクロマトグラフイーを行なった。吸着
は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて行い、溶出は１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡにて行っ
た。この結果、得られたｍＲＮＡは、４００μｇであつ
た。 (3)ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Ｏka
yama- Ｂerg ）法により行った。即ち、ｃＤＮＡクロー
ニングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プライマー
は、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の付加した
リンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各々オカヤ
マらの方法〔Ｏkayama, Ｈ. and Ｐ．Ｂerg., Ｍolecul
ar andＣellular Ｂiology, Ｖol．３，p ２８０（１９
８３）〕に従って調製した。次に上記(2)で得た ｍＲＮ
Ａ１５μｇを、５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌに
溶解し、６５℃で５分間、次いで３７℃で５分間インキ
ユベートした後、反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、３
０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍ
Ｍの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、ベ
クター・プライマー ＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮase イン
ヒビター（Ｐromega Ｂiotech社製）６０ユニツト、逆
転写酵素（バイオ−ラド社製）４０ユニツトになるよう
に調整して、３７℃で１時間インキユベートし、０．５
ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）２μｌ及び１０％ＳＤＳ２μ
ｌを加えて反応を停止させた。その後、フエノール・ク
ロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノー
ル沈澱としてベクター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ
を回収した。回収されたベクター・プライマーｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡを、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣａＣｌ
₂、０．１ｍＭジチオスレイトール、０．３μｇポリ
（Ａ）、６６μＭ ｄＣＴＰ及び３８ユニツトのターミ
ナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（フア
ルマシア社製）からなる反応液３０μｌ中で３７℃、５
分間インキユベートした後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）１．５μｌ及び１０％ＳＤＳ１．５μｌを加え
て反応を停止させ、フエノール・クロロホルム抽出及び
クロロホルム抽出を行なって、エタノール沈澱としてオ
リゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライ
マーを回収した。この回収された核酸を、７ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、６０ｍＭ
ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及び１２
ユニツトの制限酵素Ｈind III（日本ジーン社製）から
なる反応液２０μｌ中で、３７℃で９０分間インキユベ
ートし、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１μｌ
及び１０％ＳＤＳ１μｌを加えて反応を停止させた。そ
の後、フエノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム
抽出を行い、エタノール沈澱として、Ｈind III 分解さ
れたオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・
プライマーを回収した。これを１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（Ｔ
Ｅ（ｐＨ７．５）１０μｌに溶解させた。このうちの１
μｌを用いて、上記ＴＥ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ及びオリゴ dＣ鎖の付加されたリンカーＤＮＡ１
４ｎｇからなる反応液１０μｌ中で、６５℃で２分間イ
ンキユベートし、次いで４２℃で３０分間インキユベー
トした後、０℃に冷却した。上記反応液を、更に２０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂、
１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μ
ｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ
（ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、フアル
マシア社製）及び０．６μｇのエシエリヒア・コリＤＮ
Ａリガーゼ（フアルマシア社製）を含む反応液１００μ
ｌとなるように調整し、１２℃で一夜インキユベートし
た。この反応液に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び
ｄＴＴＰの各々を４０μＭになるように、またβ−ＮＡ
Ｄを ０．１５ｍＭになるようにそれぞれ加え、更にエ
シェリヒア・コリＤＮＡリガーゼの０．４μｇ、エシェ
リヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）の４．６ユニツト及びエシェリヒア・コ
リＲＮase Ｈ（フアルマシア社製）の１ユニツトを加
え、１２℃で１時間、次いで２５℃で１時間インキユベ
ートした。上記で得られた反応液を用いて、エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１株を形質転換させた。エシェリヒア
・コリＨＢ１０１株のコンピテント・セルとしては、ベ
テスダ リサーチ ラボラトリーズ社（Ｂethesda Ｒes
earch Ｌaboratories ：ＢＲＬ）の製品を使用し、該Ｂ
ＲＬ社のマニユアルに従って、上記形質転換を行なっ
た。かくして、約２１０００個からなるｃＤＮＡライブ
ラリーが得られた。 (4)サルＣos−１細胞へのトランスフェクシヨン 上記(3)で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グルー
プ当り平均７０クローンのグループに分け、各グループ
からプラスミドＤＮＡを調整した。プラスミドＤＮＡ
は、アルカリ溶菌法（Ｍolecular Ｃloning−Ａ Ｌab
oratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory
，１９８２，p ３６８）に従い調製した。かくして各
グループから調製されたプラスミドＤＮＡを、それぞれ
サル培養細胞のＣos−１細胞〔Ｇluzman, Ｙ.,Ｃell ，
Ｖol. ２３，p １７５（１９８１）〕にトランスフェク
ションした。該トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デ
キストラン法によつた〔Ｙokota,Ｔ．et al., Ｐroc.Ｎ
atl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ.,Ｖol. ８１，p １０７０（１
９８４）〕。即ち、Ｃos−１細胞をトリプシン処理によ
り、１０％ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸
濁させ、細胞数を１×１０⁶個／ｍｌに調整後、１０％
ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル
加えた６ウエルプレートに、各々５００μｌずつ分注し
た。一晩３７℃で培養後、上清を除き、血清を含まない
培地で細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌプラスミドＤＮ
Ａ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（フアル
マシア社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）及
び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を１ｍｌ
／ウエル加えて、４．５時間３７℃で培養した。その
後、上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、
１５０μＭクロロキン（シグマ社製）及び１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え
て、更に３７℃で３時間培養した。上清を除き、血清を
含まない培地で細胞を洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエル加えて、３７℃で
７２時間培養した。上清を回収した後、１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え、凍
結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収した。この培養
上清及び細胞抽出液について、ＧＩＦ活性を測定した。
ＧＩＦ活性を示したグループを１０クローン／グループ
の２４グループに分け、上記と同様の操作を行ない、Ｇ
ＩＦ活性を測定し、活性を示したグループについて、更
にグループ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を
行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同定した。かく
して、pcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−ＧＩＦ−２０７の
２種類のクローンを得た。之等のクローンのＧＩＦ活性
（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を第４表に示す。 (5)クローンの解析 次に、両クローン由来のＧＩＦ活性の物質としての異同
を明白にするため一定のＧＩＦ活性を示すpcＤ−ＧＩＦ
−１６又はpcＤ−ＧＩＦ−２０７の培養上清及び細胞抽
出物のそれぞれに対して、ポリペプチドＩのＧＩＦ活性
に対する中和抗血清の順次希釈液を添加し、上記各上清
及び細胞抽出物に与える影響を試験した。その結果を図
３の第３−ａ図（pcＤ−ＧＩＦ−１６培養上清）、図３
の第３−ｂ図（pcＤ−ＧＩＦ−１６細胞抽出物）、図３
の第３−ｃ図（pcＤ−ＧＩＦ−２０７培養上清）及び図
３の第３−ｄ図（pcＤ−ＧＩＦ−２０７細胞抽出物）に
示す。各図において横軸は血清希釈倍率を、縦軸はＧＩ
Ｆ活性（％）を各々示す。また各図中（１）は抗ポリペ
プチドＩ血清を、（２）は正常血清をそれぞれ示す。第
３−ａ図及び第３−ｂ図に示す通り、pcＤ−ＧＩＦ−１
６由来のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清の添加に
より、濃度依存的に、完全に中和されたが、第３−c 図
及び第３−d 図に示す通り、pcＤ−ＧＩＦ−２０７由来
のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清には全く影響さ
れなかった。従って、pcＤ−ＧＩＦ−２０７由来のＧＩ
Ｆ活性物は、ポリペプチドＩ及びpcＤ−ＧＩＦ−１６由
来のＧＩＦ活性物とは、免疫学的に異なることが判明し
た。また、プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−Ｇ
ＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図４に示す。
更に之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化学修飾法
〔Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol. ６５，p ４９９（１
９８０）〕及びフアージＭ１３ベクター〔Ｇene,Ｖol.
１９，p ２６９（１９８２）〕を使用したジデオキシ・
チエーン・ターミネーシヨン〔Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.,ＵＳＡ ,Ｖol. ７４ ,p ５４６３（１９７７）〕に
より決定した。その結果、pcＤ−ＧＩＦ−１６の有する
ｃＤＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１βの翻訳領域
cＤＮＡ配列と同一であり、pcＤ−ＧＩＦ−２０７の有
するｃＤＮＡは、同じくＩＬ−１αの翻訳領域ｃＤＮＡ
配列と同一であることが確認された〔Ｃarl Ｊ．Ｍarch
et al.,Ｎature,Ｖol．３１５，p ６４１（１９８
５）〕。 (6) ポリペプチドＸＸＸIVの製造 上記(5)で得たフルレングス（full length ）に近いＩ
Ｌ−１βのｃＤＮＡクローンpcＤ−ＧＩＦ−１６を、制
限酵素ＰvuIIで切断し、更に制限酵素ＮcoＩで部分切断
して、３８０bpのＮcoＩ−ＰvuIIＤＮＡフラグメント
を、アロースゲル電気泳動法により単離、精製した。こ
のＤＮＡフラグメントにマング・ビーン・ヌクレアーゼ
（mung bean nuclease）を作用させて、制限酵素ＮcoＩ
切断により生じた接着末端を平滑末端とした。次に、合
成オリゴヌクレオチド〔 5’−ＧＡＴＡＡＴＧ− 3’及
び 5’−ＣＡＴＴＡＴ− 3’〕の各５’末端をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、之等を先のＤ
ＮＡフラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
後、制限酵素ＣlaＩ及びＨind III で切断し、アガロー
スゲル電気泳動法により、約４００bpのＣlaＩ−Ｈind
III ＤＮＡフラグメント〈Ａ〉を単離、精製した。他
方、前記で得た発現プラスミドp trp ＧＩＦ−αを、制
限酵素ＣlaＩ及びＨind III で切断し、大きい方のＤＮ
Ａフラグメント〈Ｂ〉を、アガロースゲル電気泳動方に
より単離、精製した。上記フラグメント〈Ａ〉と〈Ｂ〉
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフオームさせた。
ボイリング法により、得られるトランスフォーマントの
プラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図を
解析して、目的のトランスフオーマントを選択した。か
くして単離された目的トランスフオーマント（エシエリ
ヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−Ｖ）を、５
０μｇ／ｍｌＬ−トリプトファンを含むＬＢ培地１０ｍ
ｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この１ｍｌを５０μ
ｇ／ｍｌアンピシリン及び１％カザミノ酸を含むＭ９最
小培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０
nmでの吸光度が約１．０となった時点で菌体を集め、１
５％シュークロース−５０ｍＭトリスＨＣｌ−５０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、こ
れに１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）で溶解〕溶液５００μｌを加え、更に
０．３％トリトンＸ１００−１８７．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）−１５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）の溶液５ｍｌを加え、室温で１５分間放置後、超音
波処理を行ない、遠心分離により菌体抽出物上清を得
た。得られた菌体抽出物上清について、ＧＩＦ活性の測
定を行なった所、培養液１ｍｌ当り１１２ユニツトであ
った。 (7) ポリペプチドＸＸＸIIの製造 前記で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＮcoＩ
及びＡccＩで切断して、約０．７kbの ＮcoＩ−ＡccＩ
ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法によ
り単離、精製した。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いた処理により、
その両末端を平滑末端とした。他方、プラスミドp ＴＭ
１を、制限酵素Ｈind IIIで切断後、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノー断片）を用いて、切断部位を平滑末端と
した。上記により得られる２つのＤＮＡフラグメント
を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、ボイ
リング法によりトランスフォーマントからプラスミドＤ
ＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図から目的のトラ
ンスフォーマントを選択した。かくして単離されたトラ
ンスフォーマント（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p
trp ＧＩＦ−α−III）を、上記(6)に示すエシェリヒア
・コリＨＢ１０１／ptrp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様
にして培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養上清の
ＧＩＦ活性は培養液１ｍｌ当り１９０ユニツトであっ
た。 (8) ポリペプチドＸＸＸIII の製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−ス
ペシフィック ミユータジェネシスの方法に従い、以下
に詳述するように不要な塩基配列部位を除去することに
より実施した。即ち、ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＰstＩ
及び ＡccＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法によ
り、約０．９kbのＰstＩ−ＡccＩＤＮＡフラグメントを
単離、精製し、その両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑末端とした。このフラグメントを、別途にプ
ラスミドp ＴＭ１を制限酵素Ｈind IIIで切断後、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて平滑末端と
して調製したＤＮＡフラグメントに、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１
０１にトランスフォームし、目的トランスフォーマント
を、ボイリング法により抽出されたプラスミドＤＮＡの
制限酵素地図により選択した。また得られたプラスミド
のＤＮＡ塩基配列も確認した。以下このプラスミドを
「pＴＭ１−Ｉ−２」と呼ぶ。次いで、プラスミドp Ｔ
Ｍ１−Ｉ−２を、制限酵素ＥcoＲＩ及びＨind IIIで切
断して、約７４０bpのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラ
グメントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、精
製した。これを、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）のＥco
ＲＩとＨind III の制限酵素部位に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（mp
１１−trp−Ｉ２（Ｅ／Ｍ））を得、これをミューダジ
ェネシスの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチド〔５’
−ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧ
ＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴ−３’（プライマー）〕を、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これをss mp
１１−trp−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）とハイブリダイズし、ア
ニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下にＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処
理し、１５℃で２晩インキユベートした。得られたＤＮ
ＡをＪＭ１０５コンピテント細胞にトランスフォーム
し、生じたコロニーを、寒天プレート上に２００コロニ
ー植菌し、３７℃で１８時間培養した。生育したコロニ
ーを含むフィルターを通常の方法によりアルカリ処理変
性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処理した。こ
のフィルターをハイブリダイズした後、このものと上記
プライマーの５′末端を³²Ｐ−γ−ＡＴＰでラベルされ
た³²Ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。
ハイブリダイズさせたフイルターを６×ＳＳＣバッファ
ーを用い、室温で１０分間、次いで０．２５×ＳＳＣバ
ッファーを用い６０℃で５分間各々洗浄し、乾燥後、−
７０℃で１８時間オートラジオグラフィーを行なった。
変異したクローンの内から、代表としてmp１１−trp Ｇ
ＩＦ−α−IV（Ｅ／Ｍ）を選び、これをＪＭ１０５に感
染させて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製し
た。上記で得られたssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェイ
ン ターミネーション シークエンシングにより、目的
遺伝子の削除を確認した。また、ＪＭ１０５で増殖させ
たＲＦ ＤＮＡより約６３０bpのＥcoＲＩ−Ｈind III
ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法によ
り単離、精製した。一方、プラスミドp ＴＭ１−Ｉ−２
より、同様にして約４．２kbＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮ
Ａフラグメントを、単離、精製し、これと先の約６３０
bpのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグメントとを、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、連結物をエシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームさせた。目的
のトランスフォーマントは、ボイリング法に従い、トラ
ンスフォーマントよりブラスミドを抽出し、その制限酵
素地図解析により選択した。かくして単離されたトラン
スフォーマント（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p tr
p ＧＩＦ−α−IV）を、前記(6)に示すエシェリヒア・
コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様に
して培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養上清のＧ
ＩＦ活性は培養液１ｍｌ当り３３６ユニツトであった。 (9) ポリペプチドＸＸＸＩの製造 上記(8)と同様にして、所望のポリペプチド発現プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−IIを保有するトランスフォーマ
ントを作成した。鋳型としては、先の一本鎖ＤＮＡmp１
１−trp−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）を用いた。またプライマー
としては、合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＡＣＧＴ
ＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴ
ＣＣＣＴ−３’〕を用いた。上記プラスミドを保有する
トランスフォーマント（エシェリヒア・コリＨＢ１０１
／p trp ＧＩＦ−α−IIを同様にして培養後、菌体抽出
物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養液１ｍ
ｌ当り１１２ユニツトであった。本発明ＩＬ−１β自身
（ポリペプチドＩ）及びその本発明誘導体のＧＩＦ活性
については、既に記載したが、加えて以下の試験を行な
った。尚、前記したポリペプチドＩに対する抗血清を用
いて、ＲＩＡ法により測定したポリペプチドＩ換算蛋白
量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）は、下記第５表に示
す通りである。 薬理試験例１：ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試
験 (1)ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験ＣＳ
Ｆ産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Ｈuman
Ｅmbryonic lung Ｆibroblasts, ＡＴＣＣ登録細胞株
Ｎo.ＣＣＬ−１５３）を用い、以下の試験を行なった。
まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２×１０⁵個／ｍｌの細胞
濃度となるように、１０％ウシ胎児血清加ハムスター１
２Ｋ培養液〔Ｈam, Ｒ．Ｇ.,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,
５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させた。次いで上記
細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した前記参考例で得
たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で
２４時間、４８時間及び７２時間各々培養し、各培養上
清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ量
を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Ｌewis，Ｉ．
Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２８，１６８（１９８
２）〕。ポリペプチドＩを用いて得られた各培養時間(h
r)での結果を図５に示す。図において、横軸はポリペプ
チドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ活
性（単位／ｍｌ）を示す。上記結果より、ポリペプチド
Ｉの添加によれば、ＨＦＬ−１細胞株のＣＳＦ産生量
は、該ポリペプチドの無添加に比べて実に数百倍にも亢
進されることが明らかである。 (2)ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対するポリペプチ
ドＩの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてＣＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎo.）を利用して以下の試験を行なった。上記細
胞を２×１０⁵個／ｍｌの細胞濃度となるように１０％
ウシ胎児血清加ダルベツコＭＥＭ培養液〔Ｄulbeco，
Ｒ．and Ｆreeman，Ｇ.,Ｖirology ，８，３９６（１９
５９）〕に浮遊させた。上記細胞浮遊液に、種々の濃度
の参考例で得たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器
内で３７℃で２４、４８及び７２時間培養した後、培養
上清を集め、産生されたＣＳＦ量をマウス骨髄細胞を使
用して上記試験(1)と同様にして測定した。得られた結
果を図５と同様にして、図６に示す。図６より、ＧＩＦ
活性として１単位／ｍｌ以上のポリペプチドＩをヒト正
常皮膚由来の原線維芽細胞に加えることにより、該細胞
のＣＳＦ産生能は著しく促進されることが明らかであ
る。 (3)生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発２されることを以下の動物実験に
より試験した。即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０⁵
〜１０⁵単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
した。結果を図７に示す。図において横軸は各種濃度
（ＧＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時間
（hr）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を各々
示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万ＧＩＦ
単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／個体
投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投与群
を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投与
群）を各々示す。図７より、ポリペプチドＩを動物に与
えた場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなって
いることが判明した。即ち、ポリペプヂトＩは注射され
た量に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させ
る作用のあることが認められた 薬理試験例２：ポリペプチドＩの抗関節炎試験 (1) パースン〔Ｐearson，Ｃ．Ｍ.,Ｐroc.Ｓoc. Ｅxp.
Ｂiol.Ｍed.,９１，９５（１９５６）〕及びワードと
ジヨーンズ〔Ｗard,Ｊ. Ｒ.,Ｊones, Ｒ．Ｓ.,Ａrthrit
is Ｒheumatism,５，５５７（１９６２）〕の方法に準
じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。即ち、雌
性Ｓ．Ｄ．系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテリウム
・ブチリカム（Ｍycobacterium butyricum）死菌を流動
パラフインに懸濁させたアジユバントを０．０５ｍｌ注
射した。１４日目に足腫脹に基づいて群分けし（n ＝
６）、その翌日より５日間に亘って、参考例で得たポリ
ペプチドＩ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮
内投与した。経日的に足容積を測定することにより、関
節炎に対する影響を評価した。結果を図８に示す。図に
おいて横軸はアジユバント投与後日数（日）を、縦軸は
足体積（×０．０１ｍｌ）を各々示す。また図中（１）
はポリペプチドＩの１０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、
（２）は同１万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（３）は同
１０００ＧＩＦ単位／個体投与群を、（４）は同１００
ＧＩＦ単位／個体投与群を、（５）は対照群（生理食塩
水投与群）を、また（６）は正常ラツト群を各々示す。
図８より、対照群（グラフ（５））の足腫脹は、２３日
目まで増悪したのに対し、ポリペプチドＩの投与群（グ
ラフ（１）〜（４））においては、その投与の４日目
（アジユバンド投与後１８日目）より足腫脹の抑制作用
が認められ、最終投与４日後（アジユバンド投与後２３
日目）においても関節炎の進行を阻止できることが確認
された。 薬理試験例３：本発明誘導体のＣＳＦ産生促進効果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇliob
lastoma,Ａstrocytoma, Ｈuman〕を用いて、以下の試験
を行なった。上記細胞を、２×１０⁵個／ｍｌの細胞濃
度となるように、１０％ＦＣＳ（GIBCO 社製）、ＭＥＭ
非必須アミノ酸（Ｆlow 社製）及びＭＥＭピルビン酸ナ
トリウム（Ｆlow 社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地
（日水社製）に浮遊させ、種々の濃度となるように被験
物質を加えて、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培
養した。各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積
されたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した
〔Ｌewis，Ｉ．Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２８，１
６８（１９８２）〕。結果を図９に示す。図において、
横軸は被験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ
活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。また、図中、曲線（１）〜
（７）は、以下の各ポリペプチドを被験物質とした時の
結果を示す。 曲線（１）…ポリペプチドVI 曲線（２）…ポリペプチドII 曲線（３）…ポリペプチドVIII 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドIV 曲線（６）…ポリペプチドIII 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Ｗinter ）らの方法〔Ｐroc.Ｓoc．Ｅxpt
l. Ｂiol.Ｍed.,１１１，５４４−５４７（１９６
２）〕に準じて、この試験を行なった。即ち、６〜８週
齢の雄ラツト（Ｓpraque Ｄawley 系、日本チャールス
リバー社）を、実験前日に体重に基づいて１群６〜８匹
の各群に分けて用いた。起炎剤としてカラゲニン（Ｍar
ine Ｃolloid社製）を、生理食塩水に１％となるように
懸濁させたものを使用し、ラツトの右後肢足蹠皮下に
０．１ｍｌ注射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を評価
するため、起炎剤注射の前後の一定時間に、右後肢足蹠
容積を、プレシモメーター（plethysmometer，Ｕgo−Ｖ
asile 社製）を用いて測定した。前値に対する起炎剤注
射後の容積増加率を浮腫率（swelling％）として表わし
た。被験物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水（Ｄ
ulbeco s phosphate buffered saline）に溶解希釈し、
ラツトの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射の１時間
前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群を作成
し、同一実験に供した。結果を図１０に示す。図におい
て横軸は、起炎剤投与後時間（hr）を、縦軸は浮腫率
（％）を示す。また、図中、曲線（１）は対照群を、曲
線（２）はポリペプチドVIの０．１μｇ投与群を、曲線
（３）はポリペプチドVIの１μｇ投与群を、曲線（４）
はポリペプチドVIの１０μｇ投与群をそれぞれ示す。 薬理試験例５：本発明誘導体の放射線障害防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドVIの１μｇ／マウス又
は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装置
（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、８
５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、以
後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
て、ＰＢＳ投与群をおいた。結果を図１１に示す。図に
おいて横軸はＸ線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動
物の生存率（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドVI
の１μｇ投与群を、曲線（２）はポリペプチドVIの０．
３μｇ投与群を、また曲線（３）はコントロール群をそ
れぞれ示す。図１１より、コントロール群では、Ｘ線照
射後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチドVI
投与群では、その投与量に依存して、放射線障害の防止
作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放射線障
害による死亡から回避され、生存することが確認され
た。 薬理試験例６：本発明誘導体の日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。
ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群７匹）
とし、第１日目に、５−フルオロウラシル（５−Ｆu 、
協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。第
２日目、第４日目及び第６日目に、ポリペプチドVIの１
μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、緑膿菌（Ｐse
udomonas aeruginosa Ｅ−２）の所定量を腹腔内投与し
て感染させた。第１０日目に供試動物の生存数を計数し
て、生存率（％）を求めた。結果を図１２（１）〜
（３）に示す。図１２（１）は上記実験群の結果を、同
（２）はポリペプチドVIを投与しなかった（５−Ｆu の
みを投与した）対照群の結果を、また同（３）は５−Ｆ
u 及びポリペプチドVIのいずれも投与しなかった対照群
の結果をそれぞれ示す。第１２図中、縦軸は生存率
（％）を、横軸は下記各緑膿菌投与量を採用した群Ａ〜
Ｅをそれぞれ示す。 Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 製剤例１ ＧＩＦ活性として１×１０⁷単位／ｍｌのポリペプチドV
Iの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を０．５％となるように添加して、濾過（０．２２μm
メンブランフイルター）後、これを無菌的に１ｍｌずつ
バイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調製し
た。かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸留水
１ｍｌに溶解して利用される。 〈動物細胞からのサイトカインの製造方法〉 (1) 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸVII 及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１３１，１６８２−１６８９（１９８
５）〕を、２×１０⁵cells／wellにて培養した。培養２
４時間後の上清を採取し、そのＩＬ−２活性を、スミス
（Ｋ．Ａ．Ｓmith）らの方法に従い、ＩＬ−２依存性マ
ウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を用いて測定した〔Ｊ．Ｉmm
unol.,１２０，２０２７（１９７８））〕。結果を下記
第６表に示す。 (2) Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ
−１６４０培地で集密的まで培養し、更に２０ｎｇ／ｍ
ｌのポリペプチドＸＸＸVII を含む又は含まない（コン
トロール）上記培地中で１８時間インキュベートした。
培地を除去した後、前記実施例３−(2)に準じて、グア
ニジニウム／セシウムクロライド法により ＲＮＡを抽
出し、オリゴ(ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー
により、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を収得した。
ノザン・ブロッティング法（Ｎorthern blotting）に従
い、上記ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡの１０μｇをアガロースゲ
ル（１．２％）電気泳動に付し分画後、ニトロセルロー
ス・フィルターに転写した。減圧下に８０℃でベーキン
グし、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で１００
℃５分間の処理後、５０％フォルムアミド、５×ｓｓ
ｃ、５０ｍＭソジウムフォスフェート（ｐＨ６．５）、
４×デンハード液（Ｄenhardt's solution）及び２００
μｇ／ｍｌの変性サルモン スペラムＤＮＡ中で４２℃
下にプリハイブリダイゼーションを行った。５時間後、
ニックトランスレーションで放射能標識したＧＭ−ＣＳ
Ｆ ｃＤＮＡ〔Ｓcience, ２２８，８１０（１９８
５）〕のＰstＩ−ＮcoＩＤＮＡ断片又はＢＳＦ−２ｃＤ
ＮＡ〔Ｎature, ３２４，７３（１９８６）〕のＫpnＩ
−ＢamHＩＤＮＡ断片と、４２℃下に２０時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。フィルターを、０．１％ＳＤ
Ｓ加２×ｓｓｃで室温下に１５分間、更に０．１％ＳＤ
Ｓ加０．１×ｓｓｃで５０℃下に１時間洗浄した。オー
トラジオグラムは、増感紙を用いて、−７０℃下に一夜
行った。ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用いた時の結果を
図１３に示す。レーンＡは本発明ポリペプチドを用いた
結果を、レーンＢは本発明ポリペプチドを用いないコン
トロールの結果を示す。また、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片
を用いた時の結果を図１３に準じて図１４に示す。以上
に示す結果より、本発明ポリペプチドを用いることによ
り、動物細胞からの天然サイトカイン類の生産が効率よ
く行い得ることが判る。また、本発明ポリペプチドの、
かかる方法への適用に際しては、極めて微量、通常１０
ｎｇ／ｍｌ程度の使用で十分であり、誘導されたサイト
カイン類の精製過程をも容易にする。 (3) 動物細胞よりサイトカインを生産する場合、産生
誘引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下におい
て構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ−１受容体に
結合することが必須である。すなわち、本発明ポリペプ
チドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必
要なシグナルを細胞内に伝えることが重要である。そこ
で、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結合に関して、
以下の試験を行った。６−wellプレート上で、一面にほ
ぼ均一にまで増殖したＢalb ／３Ｔ３細胞（クローンＡ
３１：ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×１０⁶cells／we
ll）に、 ¹²⁵Ｉで標識したポリペプチドＩ（ＩＬ−１
β）の５００００cpm／well及び事前に１０％ＦＣＳ加
Ｄ−ＭＥＭ中で３７℃下にインキユベートした２０ｎｇ
／ｍｌのポリペプチドＩを加え、４℃で反応させた。反
応液をパスツールピペットで除き、１０％ＦＣＳ加Ｄ−
ＭＥＭの １ｍｌを加えて静かに洗い上清をすてた。こ
の洗浄操作を２回繰返した後、１ｍｌの１％ＳＤＳ、
０．２Ｎ ＮａＯＨで細胞を可溶化し、可溶化液及びさ
らにウエルを洗浄した可溶化液中の放射能（結合放射
能）をγ−カウンターにて測定した。尚、上記 ¹²⁵Ｉ標
識ポリペプチドＩは、ボルトンとハンター（Ｂolton an
d Ｈunter）の方法〔Ｂiochem. Ｊ.,１３３，５２９
（１９７３）〕に従い製造、精製した（比活性；２５０
μＣｉ／μｇprotein 以上）。得られた結果を下記第７
表に示す。 Ａ：未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合した放
射能 Ｂ：プレートに非特異的に吸着した放射能 Ｃ：結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。上記第７表より、ポリペプチ
ドＩ、即ちＩＬ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下
において、時間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合
力が低下してしまうことが明らかとなった。そこで、上
記において、２４時間の事前のインキュベーションを行
ったポリペプチドＩ、ポリペプチドVI又はポリペプチド
ＸＸＸVII を用いた同試験を行った。結果を下記第８表
に示す。 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に際
しては、ＩＬ−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。Embedded image(7) Plasmid p trp GIF-α obtained in Example 1- (6)
Using -102CT, the host was transformed into Escherichia coli W3.
110, and expressed and purified in the same manner as the IL-β of the present invention.
Derivative polypeptide XXX was obtained. About 11.4kd
(SDS-PAGE, hereinafter the same). (8) Using plasmid p trp GIF-α-4G,
5'-GCACTCTCCAGGACT as a primer
Using CACA-3 ', in the same manner as in (6) above,
Plasmid p trp GIF-α-4G1 for peptide XIV expression
1Q was obtained. Using the plasmid, Escherichia coli
Similarly, expression was performed using HB101 as a host (2.7 × 10
^FiveGIF unit / ml culture solution) and purified
Polypeptide XIV, which is a -1β derivative, was obtained. About 17.
5kd. (9) According to Example 1- (3), plasmid p trp GIF
-Α-4G and p trp GIF-α-98L
Plasmid p trp GIF-α-4 for expression of repeptide XV
G98L was obtained. That is, both plasmids were replaced with the restriction enzyme E
After digestion with coRI and HindIII, p trpGIF-α-4
A DNA fragment of about 400 bp from G
DNA fragment of about 4.6 kbp from GIF-α-98L
Take out each one of them and ligate them
Was. Using plasmid p trp GIF-α-4G98L
And Escherichia coli W3110 as a host
A polypeptide which is expressed and purified to be an IL-1β derivative of the present invention
Peptide XV was obtained. About 17.5kd. [10] In the above (9), the plasmid p trp GIF
Plasmid p trp GIF-α-11 instead of -α-4G
Q (using a DNA fragment of about 400 bp)
And a plasmid p for expressing the polypeptide XVI in the same manner.
trp GIF-α-11Q98L was obtained. The plasmid
Polypep which is the IL-1β derivative of the present invention
Pide XVI was obtained. About 17.5kd. [11] In the above (9), the plasmid p trp GIF
Plasmid p trp GIF-α-4G instead of -α-4G
Using 11Q, approximately 400 bp DN from the plasmid
Using the A fragment, polypeptide X
III Expression plasmid p trp GIF-α-4G11Q9
8 L was obtained. The IL of the present invention is similarly prepared using the plasmid.
Polypeptide XIII which is a -1β derivative was obtained. About 1
7.5 kd. [12] In accordance with Example 1- (3), plasmid p trp
GIF-α-8A and ptrp GIF-α-71S
And the plasmid ptrpGI for expressing the polypeptide XXXVI
F-α-8A71S was obtained. That is, both plasmids
After digestion with restriction enzymes EcoRI and HindIII, p trpGIF
A DNA fragment of about 400 bp from α-8A,
About 4.6 kbp DNA from p trp GIF-α-71S
Take out each fragment and ligate them
I did. Plasmid p trp GIF-α-8A71S
Using Escherichia coli HB101 as a host
(8.7 × 10^FiveGIF unit / ml culture solution) and
Purified polypeptide IL of the present invention is IL-1β derivative
XXVI was obtained. About 17.5kd. [13] The method of the above-mentioned [12], wherein the plasmid p trp G
Plasmid p trp GIF-α instead of IF-α-71S
-71A (using a DNA fragment of about 4.6 kbp)
For the expression of polypeptide XXXVII
Plasmid p trpGIF-α-8A71A was obtained. The
Escherichia coli HB101 with Rasmid
Koken reported "Escherihia coli HB101 / ptrp G
IF-α-8A71A ”
No. (FERM BP 1298)
You. Expression (1.6 × 10⁶G
IF unit / ml culture solution) and purified to produce IL-1β of the present invention.
Derivative polypeptide XXXVII was obtained. About 17.
5kd. [14] In the above item [12], the plasmid p trp G
Plasmid p trp GIF-α instead of IF-α-71S
Using -71V, about 4.6 kbp of the plasmid from the plasmid was used.
Using DNA fragments, polypeptides
XXXVIII expression plasmid p trp GIF-α-8A
71 V was obtained. Expression (2.
1 × 10⁶GIF unit / ml culture solution) and purified
Obtaining polypeptide XXXVIII which is a light IL-1β derivative
Was. About 17.5kd. [15] According to the method of the above (1), Examples 1- (1) to (7)
And the transformations obtained in each of Examples 3- (6) to (9) below.
From the body, the polypeptide II which is the IL-1β derivative of the present invention
VIII and XXXI to XXXIV. I do n’t need
They also migrated as a single band on SDS-PAGE
Was. In addition, polypeptides II to VIII are located at the same positions as described above.
The polypeptides XXXI to XXXIV were
It was right. Polypeptide XXXI Approx. 22 kd Polypeptide XXXII Approx. 23 kd Polypeptide XXXIII Approx. 27 kd Polypeptide XXXIV Approx. 31 kd Example 3 (1) Culture of U937 cells Human lymphohistiocytoma U937 cells (Ascenso, JL.
et al., Blood, Vol. 57, p 170 (1981)]
1.4 × 10⁹Are replaced with 12-O-tetradecanoylphor
Ball-13-acetate (TPA) (Pharmacia)
25 ng / ml, Concanavalin A (ConA)
10 μg / ml and 10% fetal bovine serum (FC
S) in RPMI-1640 medium containing 4 × 10
^FiveA cell suspension having a concentration of cells / ml was prepared. This cell float
Add 10 ml of the free solution to a 9 cm diameter dish (Falcon
3003) in 5% carbon dioxide at 37 ° C for 3 days
After the culture, the culture supernatant was removed with an aspirator, and 10%
FCS, bacterial lipopolysaccharide (LPS) (Diff
10 μg / ml, muramyl dipeptide (MD
P) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 1 μg / ml and TPA 1 ng /
of RPMI-1640 medium containing
Dispensed into 37 ° C in 5% carbon dioxide in this medium
Culture for 18 hours, and U937 cells attached to the bottom of the dish.
The vesicle was used as a material for preparing mRNA. (2) Preparation of mRNA RNA was extracted using guanidinium / thermal phenol
idium / hot phenol) method [Feramisco, J. et al. R, et a
l., J. Biol. Chem., Vol. 257, p 11024.
(1982)] and guanidinium / cesium chloride
(Guanidinium / cesium chloride) method [Glisin, V. et al.
et al., Biochemistry, Vol. 13, p. 2633 (1
974)]. Culture in (1) above
The culture supernatant was removed to wash the used U937 cells.
After that, rinse each dish with 5 ml of PBS (-) solution.
And then add 1 ml of 4M-guanidine
Isothiocyanate mixed solution [4M-guanidine isothio
Cyanate (manufactured by Fluka), 50 mM Tris HCl (p
H7.6), 10 mM EDTA, 2% lauroylil monkey
Sodium cosinate] was added to lyse the cells. Dissolution
Collect the lysate with a rubber policeman and Pasteur pipet
Thus, 420 ml of a cell lysate was obtained. Dissolve this solution in 60
C. and passed through an 18G needle to stain
The phenol was sheared from the body DNA and then kept at 60 ° C.
Add an equal volume of the solution and mix the solution further with an 18G syringe needle.
Was cut off. Then add 0.1M sodium acetate to this mixture.
-10 mM Tris HCl (pH 7.4) -1 mM ED
210 ml of TA solution and chloroform-isoamyl alcohol
(24: 1 volume ratio) mixed solution at 420 ° C.
With vigorous stirring for 15 minutes. Ice mixture
After cooling, centrifuge at 3000 rpm at 4 ° C for 20 minutes to recover the aqueous layer.
Received. Add 2 volumes of ethanol to the aqueous layer and at -70 ° C
After standing overnight, a crude RNA precipitate was obtained. The crude RNA was converted to 6M
Guanidine isothiocyanate-5 mM sodium citrate
Lithium (pH 7.0) -0.1 M β-mercaptoethano
-0.5% sodium lauroyl sarcosinate solution
Dissolved in 48 ml and added with 19.2 g of cesium chloride.
To dissolve. Next, 7 ml of this mixture was added to 5.7 M
Cesium chloride-0.1 M EDTA (pH 7.5)
ml, and with a Beckman SW40Ti rotor,
Centrifuge at 25 ° C, 31500 rpm for 20 hours to remove RNA
I took it out. The amount of RNA thus obtained was 9.7 mg.
I got it. Next, mRNA is obtained from the RNA obtained above.
Therefore, oligo (dT) -cellulose (collaborative
 Research (Collaborative Research, Inc.)
Was used to perform column chromatography. adsorption
Is 10 mM Tris HCl (pH 7.5) -0.5 M N
Perform elution with aCl-1 mM EDTA.
Performed with squirrel HCl (pH 7.5)-1 mM EDTA
Was. As a result, the amount of the obtained mRNA was 400 μg.
Was. (3) Preparation of cDNA library Preparation of cDNA library
Can be expressed in animal cells.
(Yama-Berg) method. That is, cDNA clone
/ Primer with dT chain added for tanning
Was obtained from the plasmid pCDV1 with the addition of the dG chain.
The linker DNA was obtained from the plasmid pL1,
[Okayama, H. and P.M. Berg., Molecul
ar and Cellular Biology, Vol. 3, p 280 (19
83)]. Next, the mRN obtained in the above (2)
A 15 μg, 5 mM Tris HCl (pH 7.5)-
To 20 μl of 0.5 mM EDTA (pH 7.5) aqueous solution
Dissolve and incubate at 65 ° C for 5 minutes, then at 37 ° C for 5 minutes
After uvating, the reaction solution (40 μl in total volume) was
Tris HCl (pH 8.3), 8 mM MgCl_Two, 3
0 mM KCl, 0.3 mM dithiothreitol, 2 m
M dATP, dGTP, dCTP and dTTP,
Primer DNA 2.8 μg, RNase in
Hibiter (Promega Biotech) 60 units, reverse
Transcriptase (Bio-Rad) 40 units
And incubate at 37 ° C for 1 hour,
2 μl of MEDTA (pH 7.5) and 2 μm of 10% SDS
The reaction was stopped by adding l. After that,
Extract with chloroform and chloroform, and add ethanol
Vector primer cDNA: mRNA
Was recovered. Recovered vector / primer cDN
A: mRNA was converted to 140 mM sodium cacodylate, 3
0 mM Tris HCl (pH 6.8), 1 mM CaCl
_Two, 0.1 mM dithiothreitol, 0.3 μg poly
(A), 66 μM dCTP and terminus of 38 units
Naldeoxynucleotidyl transerase (fa
Lumasia) at 37 ° C, 5
After incubating for 0.5 min, 0.5M EDTA (pH
7.5) Add 1.5 μl and 1.5 μl of 10% SDS
To stop the reaction, extract with phenol / chloroform and
Perform chloroform extraction and elute as ethanol precipitate.
Rigo dC chain-added cDNA: mRNA-vector ply
The mer was recovered. This recovered nucleic acid was added to 7 mM Tris
HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl_Two, 60 mM
NaCl, 100 μg / ml bovine serum albumin and 12
From the unit restriction enzyme Hind III (Nippon Gene)
Incubate at 37 ° C for 90 minutes in 20 µl of the reaction solution.
And then 1 μl of 0.5 M EDTA (pH 7.5)
And 1 μl of 10% SDS were added to stop the reaction. So
Followed by phenol / chloroform extraction and chloroform
Extraction was carried out, and ethanol precipitation
Oligo dC chain added cDNA: mRNA-vector
The primer was recovered. This is 10 mM Tris HCl
(PH 7.5) -1 mM EDTA (pH 7.5) (T
E (pH 7.5) was dissolved in 10 μl. One of these
The above TE (pH 7.5), 0.1 M N
Linker DNA 1 with aCl and oligo dC chain added
In 10 μl of a 4 ng reaction solution at 65 ° C. for 2 minutes
Incubate and then incubate at 42 ° C for 30 minutes.
After cooling, the mixture was cooled to 0 ° C. The above reaction solution was further 20 m
M Tris HCl (pH 7.5), 4 mM MgCl_Two,
10 mM (NH_Four)_TwoSO_Four, 0.1M KCl, 50μ
g / ml bovine serum albumin, 0.1 mM β-NAD
(Nicotinamide adenine dinucleotide,
Macia) and 0.6 μg of Escherichia coli DN
Reaction solution 100μ containing A ligase (Pharmacia)
1 and incubate overnight at 12 ° C.
Was. In this reaction solution, dATP, dGTP, dCTP and
Each of dTTP was adjusted to 40 μM, and β-NA
D to a concentration of 0.15 mM.
0.4 μg of S. coli DNA ligase,
Richeria coli DNA polymerase I (Boehringer Ma
4.6 units and Escherichia K.
Add one unit of ReRNase H (Pharmacia)
1 hour at 12 ° C, then 1 hour at 25 ° C
I did it. Using the reaction solution obtained above, Escherichi
A. coli HB101 strain was transformed. Escherichia
・ Competent cells of the coli HB101 strain
Bethesda Research Laboratories
earch Laboratories: BRL)
Perform the above transformation according to the manual of RL
Was. Thus, about 21,000 cDNA live
A rally was obtained. (4) Transfection into monkey Cos-1 cells The cDNA library obtained in (3) above was
Divided into groups with an average of 70 clones per group
Was used to prepare a plasmid DNA. Plasmid DNA
Is the alkaline lysis method (Molecular Cloning-A Lab)
oratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
 , 1982, p. 368). Thus each
Plasmid DNA prepared from the group was
Monkey cultured cell Cos-1 cells [Gluzman, Y., Cell,
Vol. 23, p175 (1981)].
Was done. The transfection was performed by DEAE-de
According to the Kistran method [Yokota, T .; et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA., Vol. 81, p 1070 (1
984)]. That is, Cos-1 cells were treated with trypsin.
Suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FCS.
After turbidity, the cell number is 1 × 10⁶10% after adjusting to pieces / ml
2 ml / well of RPMI-1640 medium containing FCS
Dispense 500 μl each to the added 6-well plate
Was. After overnight culture at 37 ° C, remove supernatant and do not contain serum
The cells are washed with medium and 10 μg / ml plasmid DN
A, 0.4 mg / ml DEAE-dextran (Faru
Macia), 50 mM Tris HCl (pH 7.4) and
1 ml of RPMI-1640 medium containing 10% FCS
/ Well, and cultured at 37 ° C. for 4.5 hours. That
Thereafter, the supernatant was removed, and the cells were washed with a serum-free medium.
150 μM chloroquine (Sigma) and 10% FCS
RPMI-1640 medium containing 2 ml / well
And further cultured at 37 ° C. for 3 hours. Remove supernatant and remove serum
After washing the cells with a medium containing no RP, RP containing 10% FCS
Add 3 ml / well of MI-1640 medium, and add
Incubated for 72 hours. After collecting the supernatant, 10% FCS
Containing 2 ml / well of RPMI-1640 medium and freeze
The freeze-thaw was repeated twice, and the cell extract was collected. This culture
GIF activity was measured for the supernatant and the cell extract.
Group showing GIF activity was 10 clones / group
, And perform the same operation as described above.
IF activity was measured, and the group showing the activity was updated.
Perform the same operation as above for each clone in the group.
A clone showing GIF activity was identified. Scratch
Then, of pcD-GIF-16 and pcD-GIF-207
Two clones were obtained. GIF activity of these clones
(GIF units / ml) are shown in Table 4.(5) Analysis of clones Next, differences in GIF activity from both clones as substances
PcD-GIF showing constant GIF activity to clarify
-16 or pcD-GIF-207 culture supernatant and cell extraction
GIF activity of polypeptide I for each of the excretions
To each of the above supernatants.
And its effect on cell extracts. Fig.
Fig. 3-a (pcD-GIF-16 culture supernatant) of Fig. 3, Fig. 3
Fig. 3-b (pcD-GIF-16 cell extract), Fig. 3
Fig. 3-c (pcD-GIF-207 culture supernatant) and figure
Fig. 3-d (pcD-GIF-207 cell extract)
Show. In each figure, the horizontal axis represents the serum dilution ratio, and the vertical axis represents GI
F activity (%) is shown. In each figure, (1) indicates the anti-polypeptide.
Peptide I serum and (2) normal serum. No.
As shown in FIG. 3-a and FIG. 3-b, pcD-GIF-1
GIF activity derived from No. 6
As a result, it was completely neutralized in a concentration-dependent manner.
And from pcD-GIF-207 as shown in FIG.
GIF activity has no effect on anti-polypeptide I serum
Was not. Therefore, GI derived from pcD-GIF-207
The F activity was determined by polypeptide I and pcD-GIF-16.
Is found to be immunologically different from the original GIF active.
Was. In addition, plasmids pcD-GIF-16 and pcD-G
FIG. 4 shows a restriction map of cDNA of IF-207.
Base-specific chemical modification of the base sequence of cDNA
[Methods in Enzymology, Vol. 65, p. 499 (1
980)] and the phage M13 vector [Gene, Vol.
19, p. 269 (1982)].
Chain Termination [Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA, Vol. 74, p 5463 (1977)]
Decided. As a result, pcD-GIF-16 has
cDNA is a translation region of IL-1β reported by March et al.
 It is the same as the cDNA sequence and has pcD-GIF-207.
The cDNA to be translated is also a translation region cDNA of IL-1α.
Sequence was confirmed to be identical [Carl J. et al. March
 et al., Nature, Vol. 315, p 641 (198
5)]. (6) Production of polypeptide XXXIV I close to the full length obtained in (5) above
The cDNA clone pcD-GIF-16 of L-1β was
Cleavage with restriction enzyme PvuII and partial cleavage with restriction enzyme NcoI
And a 380 bp NcoI-PvuII DNA fragment
Was isolated and purified by allose gel electrophoresis. This
DNA fragment of mung bean nuclease
(Mung bean nuclease) to act on the restriction enzyme NcoI
The cohesive ends generated by the cutting were blunt ends. Next,
Synthetic oligonucleotides [5'-GATAATG-3 'and
And 5'-CATTAT-3 '] at the 5' end.
Phosphorylation by nucleotide kinase
Ligation to NA fragment using T4 DNA ligase
Thereafter, the digestion was carried out with restriction enzymes ClaI and HindIII and agarose was used.
By Sgel electrophoresis, about 400 bp of ClaI-Hind
III The DNA fragment <A> was isolated and purified. other
On the other hand, the expression plasmid p trp GIF-α obtained above was
Cut with restriction enzymes ClaI and HindIII,
A fragment <B> is applied to agarose gel electrophoresis
It was isolated and purified. Fragments <A> and <B> above
And ligated using T4 DNA ligase, and
E. coli HB101 was transformed.
Of the resulting transformant by the boiling method
Extract plasmid DNA and map with restriction enzyme
Analysis was performed to select the desired transformants. Or
Target transformants (Escieri)
Here coli HB101 / ptrp GIF-α-V)
10 m of LB medium containing 0 μg / ml L-tryptophan
and shake culture at 37 ° C. overnight.
M9 containing g / ml ampicillin and 1% casamino acid
Inoculate 50 ml of small medium, shake culture at 37 ° C.
When the absorbance at nm reaches about 1.0, the cells are collected and collected.
5% sucrose-50 mM Tris HCl-50 mM
 Suspend in 5 ml of EDTA (pH 8.0) solution,
10 mg / ml lysozyme [10 mM Tris HCl
(PH 8.0)] and add 500 μl of the solution.
0.3% Triton X100-187.5M EDTA
(PH 7.0) -150 mM Tris HCl (pH 8.
Add 5 ml of the solution of 0), leave at room temperature for 15 minutes,
Perform a wave treatment and obtain a cell extract supernatant by centrifugation.
Was. For the supernatant of the obtained cell extract, measurement of GIF activity was performed.
When the measurement was performed, it was 112 units per 1 ml of the culture solution.
Was. (7) Production of Polypeptide XXXII Plasmid pGIF-α obtained above was replaced with the restriction enzyme NcoI.
And about 0.7 kb of NcoI-AccI.
The DNA fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis.
Isolated and purified. This DNA fragment is
By treatment with polymerase I (Klenow fragment)
Both ends were blunt ends. On the other hand, plasmid pTM
1 was digested with the restriction enzyme Hind III, and then DNA polymerase
Using ZeI (Klenow fragment), the cleavage site was
did. Two DNA fragments obtained above
Are ligated using T4 DNA ligase, and the ligated product is
Transformed into Erichia coli HB101 and boiled
Plasmid D from transformants by the ring method
NA is extracted and the target tiger is extracted from the restriction enzyme cleavage map.
I chose a conformant. The tiger thus isolated
Conformant (Escherichia coli HB101 / p
trp GIF-α-III) was converted to Escherichia as described in (6) above.
・ Same as in the case of coli HB101 / ptrp GIF-α-V
After culturing, a cell extract supernatant was obtained. Of this culture supernatant
GIF activity was 190 units per ml of culture.
Was. (8) Production of polypeptide XXXIII
According to the method of Pacific Miuta Genesis,
As described in detail in
More. That is, pGIF-α was replaced with the restriction enzyme PstI.
After digestion with AccI and agarose gel electrophoresis,
About 0.9 kb of PstI-AccI DNA fragment
Isolate and purify and ligate both ends with T4 DNA polymerase.
And blunt ends. This fragment can be purchased separately
Rasmid p TM1 is cut with restriction enzyme Hind III and then DN
Blunt ends with A polymerase I (Klenow fragment)
T4 DNA ligator
And ligated using Escherichia coli HB1
Transform to 01, target transformant
Of the plasmid DNA extracted by the boiling method
Selected by restriction map. Also obtained plasmid
Was also confirmed. Hereafter this plasmid
Called "pTM1-I-2". Then the plasmid pT
M1-I-2 was cut with restriction enzymes EcoRI and HindIII.
The EcoRI-HindIII DNA fragment of about 740 bp was cut.
Fragments were isolated and purified by agarose gel electrophoresis.
Made. This is Eco13 of M13mp11 Phage (RF)
T4 DNA ligator at restriction sites of RI and Hind III
And ligated. From now on, single-stranded (ss) DNA (mp
11-trp-I2 (E / M)), and
It was used as a template for Genesis. Synthetic oligonucleotide [5 '
-CACGTAAAAAGGGTATCGATAATG
AAGTGCTCCT-3 '(primer)]
Phosphorylation by polynucleotide kinase, this is ss mp
After hybridizing with 11-trp-I-2 (E / M),
After annealing, the DNA polymerase is detected in the presence of dNTPs.
Treated with zein I (Klenow fragment) and T4 DNA ligase, respectively.
And incubated at 15 ° C. for 2 nights. Obtained DN
A into JM105 competent cells
The resulting colony was placed on an agar plate for 200 colonies.
-Inoculated and cultured at 37 ° C for 18 hours. Growing colonies
Filter containing sodium chloride by an ordinary method.
After drying, it was baked at 80 ° C. for 2 hours. This
After hybridizing this filter,
The 5 'end of the primer³²Labeled with P-γ-ATP
Was³²P-probe was hybridized at room temperature.
6x SSC buffer for hybridized filter
For 10 minutes at room temperature, then 0.25 x SSC
Each was washed at 60 ° C. for 5 minutes using a buffer, dried,
Autoradiography was performed at 70 ° C. for 18 hours.
From among the mutated clones, mp11-trp G
IF-α-IV (E / M) was selected and felt by JM105.
Stain and culture to prepare ssDNA and RF DNA
Was. M13 dideoxy chain of the ssDNA obtained above
Termination sequencing
The deletion of the gene was confirmed. In addition, we multiply in JM105
EcoRI-Hind III of about 630 bp from the RF DNA
The DNA fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis.
Isolated and purified. On the other hand, plasmid pTM1-I-2
And about 4.2 kb EcoRI-HindIII DN
The A fragment was isolated, purified and combined with about 630
bp of EcoRI-HindIII DNA fragment
4 Ligated using DNA ligase, and ligated
The transformant was transformed into H. coli HB101. Purpose
Transformants follow the boiling law and
Extract the brassmid from the conformant and
Selected by elementary map analysis. The tran thus isolated
Sformant (Escherichia coli HB101 / p tr
p GIF-α-IV) was converted to Escherichia
E. coli HB101 / ptrp GIF-α-V
After culturing, a supernatant of the cell extract was obtained. G of this culture supernatant
IF activity was 336 units / ml of culture. (9) Production of polypeptide XXXI In the same manner as in the above (8), the desired polypeptide expression plus
Transformer possessing midp trp GIF-α-II
Created the event. As a template, the single-stranded DNA mp1
1-trp-I-2 (E / M) was used. Also primer
As synthetic oligonucleotides [5'-CACGT
AAAAAGGGGATCGATAATGCTGGGTT
CCCT-3 '] was used. Carry the above plasmid
Transformant (Escherichia coli HB101)
/ P trp GIF-α-II is cultured in the same manner, and then the cells are extracted.
A product supernatant was obtained. The GIF activity of this culture supernatant was 1 m of culture solution.
It was 112 units per liter. The present invention IL-1β itself
GIF activity of (Polypeptide I) and its derivative of the present invention
Has already been described, but in addition
Was. The antiserum against polypeptide I was used.
And the polypeptide I-equivalent protein measured by the RIA method.
The LAF activity (U) per amount (mg) is shown in Table 5 below.
That's right.Pharmacological Test Example 1: Effect of polypeptide I on promoting CSF production
(1) Promotion effect test CS on human lung cell CSF production
As an F-producing strain, a human lung cell-derived strain HFL-1 (Human
 Embronic lung Fibroblasts, ATCC registered cell line
No. CCL-153), the following test was conducted.
First, the HFL-1 cells were transferred to 2 × 10^FiveCells / ml cells
Hamster 1 with 10% fetal bovine serum
2K culture [Ham, R .; G., Proc. Natl. Acad. Sci.,
53, 288 (1965)]. Then the above
In the cell suspension, obtained in the above Reference Example prepared at various concentrations.
Polypeptide I was added and the mixture was added at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator.
Incubate for 24 hours, 48 hours and 72 hours, respectively.
Amount of CSF produced and accumulated in the culture supernatant
Was determined using mouse bone marrow cells [Lewis, I .;
C. et al., J. Amer. Immunol,128, 168 (198
2)]. Each culture time (h) obtained using polypeptide I
The result of r) is shown in FIG. In the figure, the horizontal axis is polypep
The concentration of Pide I (GIF unit / ml) is plotted on the vertical axis.
Property (unit / ml). From the above results, the polypeptide
According to the addition of I, the amount of CSF produced by the HFL-1 cell line
Is hundreds of times higher than without the polypeptide.
It is clear that it will be advanced. (2) Polypeptide against CSF production of human skin-derived cells
Test for promoting effect of deI CRL-1445 (AT
CC. No.), the following tests were conducted. Fine above
2 × 10 cells^Five10% to give a cell concentration of cells / ml
Dulbecco MEM culture supplemented with fetal bovine serum [Dulbeco,
R. and Freeman, G., Virology,8, 396 (19
59)]. Various concentrations of the above cell suspension
The polypeptide I obtained in Reference Example 1 was added, and a carbon dioxide incubator was added.
After culturing at 37 ° C. for 24, 48 and 72 hours,
Collect the supernatant and determine the amount of CSF produced using mouse bone marrow cells.
And measured in the same manner as in the above test (1). The obtained knot
The result is shown in FIG. 6, similarly to FIG. According to FIG.
1 unit / ml or more of polypeptide I
By adding to fibroblasts derived from normal skin,
It is clear that the CSF-producing ability of
You. (3) Test for promoting effect on CSF production in vivo When polypeptide I is administered in vivo, C
The following animal experiments show that SF production enhancing action is generated
More tested. That is, a normal mouse (BALB / C mouse)
, Purchased from Shizuoka Experimental Animal Cooperative)
Polypeptide I obtained in Reference Example (10% as GIF activity)^Five
-10^Five(Unit / individual) was administered intravenously. After the above administration
Blood is collected from each experimental animal at 2, 4, 8, 12 and 24 hours
And measure CSF concentration in serum using mouse bone marrow cells
did. FIG. 7 shows the results. In the figure, the horizontal axis is various concentrations
Time after administration of (GIF units / individual) polypeptide I
(Hr) and the vertical axis indicates CSF activity (unit / ml serum), respectively.
Show. (1) in the figure is 100,000 GIF of polypeptide I.
Unit / individual administration group, (2) 10,000 GIF units / individual
(3) 1000 GIF units / individual administration group
And (4) a control group (HSA 10 μg / individual administration)
Group) are shown. FIG. 7 shows that polypeptide I was given to animals.
The CSF concentration in the serum of the animal increases significantly
Turned out to be. That is, polypeptide I is injected
Significantly increases CSF production in vivo in proportion to the amount
Pharmacological test example 2 in which an anti-arthritic effect was observed. (1) Pearson [Pearson, C .; M., Proc. Soc. Exp.
 Biol. Med.,91, 95 (1956)] and the word
Jones [Ward, JR, Jones, R .; S., Arthrit
is Rheumatism,5, 557 (1962)].
First, an adjuvant arthritis rat was prepared. That is, female
Sex S. D. Mycobacterium in the skin of the ridge of the rat
・ Flow dead bacteria (Mycobacterium butyricum)
0.05 ml of adjuvant suspended in paraffin
Fired. On day 14, the animals were divided into groups based on foot swelling (n =
6) From the next day, for 5 days, the poly
Peptide I or its solvent (saline; control group)
Was administered internally. By measuring foot volume over time,
The effects on arthritis were evaluated. FIG. 8 shows the results. In the figure
The horizontal axis represents the number of days (days) after adjuvant administration, and the vertical axis represents
The paw volume (× 0.01 ml) is indicated. Also in the figure (1)
Represents 100,000 GIF units / individual administration group of polypeptide I,
(2) shows 10,000 GIF units / individual administration group, and (3) shows the same.
1000 GIF units / individual administration group, (4) 100
GIF unit / individual administration group, (5) control group (physiological saline)
(Water administration group) and (6) a normal rat group.
From FIG. 8, the foot swelling of the control group (graph (5)) was 23 days.
In the group treated with polypeptide I (G
In rough (1) to (4)), on the fourth day of the administration
(18 days after administration of adjuvant)
4 days after the last administration (23 days after the administration of adjuvant)
Day) also confirmed that the progression of arthritis could be stopped
Was done. Pharmacological Test Example 3: CSF production promoting effect test of the derivative of the present invention Cell line U-373MG [ATCC HTB17, Gliob
lastoma, Astrocytoma, Human]
Was performed. The cells were 2 × 10^FiveCells / ml cell concentration
10% FCS (GIBCO), MEM
Non-essential amino acids (from Flow) and MEM pyruvate
Eagle MEM medium supplemented with thorium (Flow)
(Manufactured by Nissui) and tested at various concentrations
Add substance and incubate at 37 ° C for 24 hours in carbon dioxide incubator.
Nourished. Collect each culture supernatant and produce and accumulate in each culture supernatant
The amount of CSF was measured using mouse bone marrow cells
[Lewis, I .; C. et al., J. Amer. Immunol,128, 1
68 (1982)]. FIG. 9 shows the results. In the figure,
The horizontal axis represents the concentration of the test substance (ng / ml), and the vertical axis represents CSF.
Activity (U / ml) is shown. Also, in the figure, curves (1) to
(7) shows the case where the following polypeptides were used as test substances.
The results are shown. Curve (1) ... polypeptide VI curve (2) ... polypeptide II curve (3) ... polypeptide VIII curve (4) ... polypeptide V curve (5) ... polypeptide IV curve (6) ... polypeptide III curve ( 7) Polypeptide XXX Pharmacological Test Example 4: Anti-inflammatory test of the derivative of the present invention The method of Winter et al. [Proc. Soc. Expt
l. Biol. Med.,111, 544-547 (196)
This test was performed according to 2)]. That is, 6-8 weeks
Male Rat (Spraque Dawley strain, Charles Japan)
River) on the day before the experiment, 6-8 animals per group based on body weight
Were used in each group. Carrageenan (Mar
ine Colloid) in physiological saline to 1%
Using the suspension, subcutaneously in the right hind footpad of the rat
Paw edema was induced by a 0.1 ml injection. Assess foot edema
At the right hind footpad at a certain time before and after
The volume is measured using a plethysmometer (Ugo-V).
asile). Inflammator injection to previous value
Express the volume increase rate after firing as edema rate (swelling%)
Was. The test substance was Dulbecco's phosphate buffered saline (D
ulbeco s phosphate buffered saline)
One hour of injection of an anti-inflammatory agent in the back of the rat
Injected before. In addition, a vehicle administration group was prepared as a control group.
And subjected to the same experiment. The results are shown in FIG. Figure smell
The horizontal axis is the time (hr) after administration of the inflammatory agent, and the vertical axis is the edema rate.
(%). In the figure, the curve (1) represents the control group,
The line (2) shows the group administered with 0.1 μg of the polypeptide VI and the curve
(3) shows the group administered with 1 μg of the polypeptide VI and the curve (4)
Indicates a group administered with 10 μg of the polypeptide VI. Pharmacological Test Example 5: Radiation damage prevention effect test of the derivative of the present invention A BALB / c mouse (9 weeks old) was irradiated with a lethal dose of X-rays.
20 hours before the injection, 1 μg of polypeptide VI / mouse or
Injected 0.3 μg / mouse intraperitoneally. X-ray irradiation device
(MBR-1505R, Hitachi Medical Corporation)
The above mice were irradiated with 50 radiographs of X-rays from the whole body.
Later, its survival was confirmed daily. As a control
Then, a PBS administration group was set. The results are shown in FIG. In the figure
The horizontal axis is the number of days (days) after X-ray irradiation, and the vertical axis is the test operation.
And the curve (1) shows the polypeptide VI.
, And the curve (2) shows the 0.1 mg of the polypeptide VI.
3 μg administration group and curve (3) the control group.
Shown respectively. From FIG. 11, X-ray irradiation was performed in the control group.
All patients died on the 18th day after firing, whereas polypeptide VI
In the treatment group, depending on the dose, prevention of radiation damage
In the 1 μg group, about 80%
Avoided death from harm and confirmed survival
Was. Pharmacological Test Example 6: Opportunistic Infection Protective Effect Test of the Derivative of the Present Invention The following test was carried out using an easily infected model mouse.
Test animals (7 animals per group) using ICR male mice (6 weeks old)
On the first day, 5-fluorouracil (5-Fu,
100 mg / kg (manufactured by Kyowa Hakko) was administered intravenously. No.
On days 2, 4 and 6, one of the polypeptides VI
μg / mouse was administered subcutaneously, and on day 7, Pseudomonas aeruginosa (Pse
a predetermined amount of udomonas aeruginosa E-2)
Infected. On day 10, the number of surviving test animals was counted.
And the survival rate (%) was determined. The results are shown in FIGS.
It is shown in (3). FIG. 12A shows the results of the experimental group.
(2) received no administration of polypeptide VI (5-Fu
(3) is 5-F
control group to which neither u nor polypeptide VI was administered
Are shown. In FIG. 12, the ordinate is the survival rate
(%), And the horizontal axis represents groups A to A, each of which employed the following P. aeruginosa doses.
E is shown. Group A: 19000 bacteria / mouse administered group B: 3800 bacteria / mouse administered group C: 750 bacteria / mouse administered group D: 150 bacteria / mouse administered group E: 30 bacteria / mouse administered group Group F: 6 bacteria / mouse administration group Formulation Example 1 1 × 10 as GIF activity⁷Units / ml of polypeptide V
Human serum albumin (HSA) in saline I
Was added to a concentration of 0.5%, followed by filtration (0.22 μm
Then, aseptically remove 1 ml each
Dispense into vials and freeze-dry to prepare injectable formulations
Was. The preparation thus obtained is used as a distilled water for injection at the time of use.
It is used after dissolving in 1 ml. <Method for producing cytokine from animal cells> (1) Various concentrations of polypeptides XXXVII and 0.0
HBS-2C5B2 cells in the presence of 1% PHA-P
[J. Immunol.,1311682-1689 (198).
5)] is 2 × 10^FiveThe cells were cultured in cells / well. Culture 2
After 4 hours, the supernatant was collected and its IL-2 activity was determined by Smith.
(K.A. Smith) et al.
Was measured using mouse T cells (CTLL2) [J. Imm
unol.,120, 2027 (1978)). The results below
It is shown in Table 6.(2) U-373MG cells were transformed with 10% FCS-added RPMI
Culture to confluence in -1640 medium, and further add 20 ng / m
1 with or without the polypeptide XXXVII (con
Troll) Incubated for 18 hours in the above medium.
After removing the medium, guar according to Example 3- (2) above.
Extract RNA by Niidinium / Cesium Chloride Method
Out, oligo (dT) -cellulose chromatography
By the poly (A)⁺ RNA (mRNA) was obtained.
According to Northern blotting
No, the above poly (A)⁺ 10 μg of RNA is agarose
(1.2%) electrophoresis and fractionation.
Transferred to a filter. Baking at 80 ° C under reduced pressure
100 mM in 20 mM Tris HCl (pH 8.0).
After treatment for 5 minutes at 50 ° C, 50% formamide, 5xss
c, 50 mM sodium phosphate (pH 6.5),
4x Denhardt's solution and 200
42 ° C. in μg / ml denatured Salmon Speram DNA
Prehybridization was performed below. After 5 hours,
GM-CS radiolabeled by Nick Translation
F cDNA [Science,228, 810 (198
5)] PstI-NcoI DNA fragment or BSF-2cD
NA [Nature,324, 73 (1986)]
-Hybridization with BamHI DNA fragment at 42 ° C for 20 hours
Distillation was performed. Filter with 0.1% SD
S + 2 × ssc at room temperature for 15 minutes, 0.1% SD
The plate was washed with S × 0.1 × ssc at 50 ° C. for 1 hour. Oh
The triogram was performed overnight at -70 ° C using an intensifying screen.
went. The results when using the DNA fragment of GM-CSF
As shown in FIG. Lane A used the polypeptide of the present invention.
The results show that Lane B shows the control without the polypeptide of the present invention.
The result of the troll is shown. Also, a DNA fragment of BSF-2
14 is shown in FIG. 14 according to FIG. that's all
From the results shown in the above, it was found that
Production of natural cytokines from animal cells
It can be understood that it can be done well. Further, of the polypeptide of the present invention,
When applied to such a method, a very small amount, usually 10
Use of about ng / ml is sufficient and induced sites
It also facilitates the purification process of Caines. (3) Production of cytokines from animal cells
That the polypeptide of the present invention used for attraction is
Is structurally stable and binds to the IL-1 receptor on the cell surface.
It is essential to combine. That is, the polypep of the present invention
Tide binds to the IL-1 receptor and is required for cytokine production.
It is important to transmit necessary signals into cells. There
With respect to binding to the IL-1 receptor on fibroblasts,
The following tests were performed. On a 6-well plate,
Balb / 3T3 cells grown to homogeneity (clone A
31: ATCC, CCL-163, 1 × 10⁶cells / we
ll)¹²⁵I-labeled polypeptide I (IL-1
β) of 50,000 cpm / well and 10% FCS
20 ng incubated at 37 ° C in D-MEM
/ Ml of the polypeptide I was added and reacted at 4 ° C. Anti
Remove the reaction solution with a Pasteur pipette and add 10% FCS D-
1 ml of MEM was added and the mixture was washed gently and the supernatant was discarded. This
After repeating the washing operation twice, 1 ml of 1% SDS,
Solubilize cells with 0.2N NaOH, lysate and lysate
The radioactivity in the lysate (well
No.) was measured with a γ-counter. The above¹²⁵I mark
Polypeptide I, Bolton and Hunter
d Hunter) [Biochem. J.,133, 529
(1973)] and purified (specific activity; 250
μCi / μg protein or more). The obtained result is shown in the following seventh section.
It is shown in the table.A: bound release in the absence of unlabeled polypeptide I
Radioactivity B: radioactivity non-specifically adsorbed on the plate C: measured value of radioactivity bound
Indicates the binding force to the body. From Table 7 above,
Do I, ie IL-1β itself, under cytokine-inducing conditions
, Binding to the IL-1 receptor over time
It became clear that the force was reduced. So, on
Note that a 24 hour pre-incubation was
Polypeptide I, polypeptide VI or polypeptide
The same test using XXXVII was performed. The results are shown in Table 8 below
Shown inFrom the above results, it was found that cytokines were produced from animal cells.
Thus, rather than IL-1β itself, the polypeptide of the present invention
It turns out that adoption is more preferable.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】図１は、プラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの
制限酵素地図を示す。BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows a restriction map of cDNA of plasmid pGIF-α.

【図２】図２はプラスミドｐＧＩＦ−αとプラスミドｐ
ＴＭＩとからプラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−αを構築する
概略図を示す。FIG. 2 shows plasmids pGIF-α and plasmid pGIF.
FIG. 1 shows a schematic diagram for constructing plasmid ptrpGIF-α from TMI.

【図３】図３−ａ乃至図３−ｄはプラスミドｐｃＤ−Ｇ
ＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性物及びプラスミドｐｃＤ−
ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ活性物の各々に対する抗ポ
リペプチドＩ血清（中和抗体）の影響を示すグラフであ
る。FIGS. 3-a to 3-d show plasmids pcD-G.
GIF activity from IF-16 and plasmid pcD-
It is a graph which shows the effect of anti-polypeptide I serum (neutralizing antibody) with respect to each of the GIF active substances derived from GIF-207.

【図４】図４はプラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びプ
ラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素
地図を示す。FIG. 4 shows restriction maps of cDNAs of plasmid pcD-GIF-16 and plasmid pcD-GIF-207.

【図５】図５はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the test results of the promoting effect of polypeptide I on CSF production.

【図６】図６はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。FIG. 6 is a graph showing the test results of the promoting effect of polypeptide I on CSF production.

【図７】図７はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing the test results of the promoting effect of polypeptide I on CSF production.

【図８】図８はポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示
すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the results of an anti-arthritis test of polypeptide I.

【図９】図９は本発明ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促
進試験の結果を示すグラフである。FIG. 9 is a graph showing the results of a CSF production promotion test of an IL-1β derivative of the present invention.

【図１０】図１０は本発明ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試
験の結果を示すグラフである。FIG. 10 is a graph showing the results of an anti-inflammatory test of an IL-1β derivative of the present invention.

【図１１】図１１は本発明ＩＬ−１β誘導体の放射線障
害防止作用試験の結果を示すグラフである。FIG. 11 is a graph showing the results of a test to prevent radiation damage of the IL-1β derivative of the present invention.

【図１２】図１２は本発明ＩＬ−１β誘導体の日和見感
染症防御効果試験の結果を示すクラフである。FIG. 12 is a graph showing the results of a test for the protective effect of an IL-1β derivative of the present invention on opportunistic infections.

【図１３】図１３は本発明ＩＬ−１の誘導体のＧＭ−Ｃ
ＳＦ誘導産生効果試験の結果を示す図面である。FIG. 13 shows GM-C of a derivative of IL-1 of the present invention.
It is a drawing which shows the result of SF induction production effect test.

【図１４】図１４は本発明ＩＬ−１β誘導体のＢＳＦ−
２誘導産生効果試験の結果を示す図面である。FIG. 14 shows BSF- of the IL-1β derivative of the present invention.
2 is a drawing showing the results of a 2 induction production effect test.

【配列表】 [Sequence list]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１２９８ (72)発明者 河合 一吉 徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130 −２ ソレイユ503号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５− 49 (56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ 315，（20 ＪＵＮＥ 1985）Ｐ．641−647 ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ．81，Ｐ．7907−7911 （1984) Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．135，Ｐ．314− 320（1985) Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．135，Ｐ．3962 −（1985)──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification number Agency reference number FI Technical label C12R 1:19) Accession number of microorganism FERM BP-1296 Accession number of microorganism FERM BP-1297 Accession number of microorganism FERM BP-1298 (72) Inventor Kazuyoshi Kawai 130-2, Mitsuho, Mitsuho-machi, Matsumo-cho, Itano-gun, Tokushima Prefecture, Japan No. 503 Soleil 503 (72) Inventor Setuko Takeshaku 1090-18, Kasuno, Kawauchi-cho, Tokushima-shi (72) Inventor Kiyoshi Ishii 39-46 Sadoyoshi, Sumiyoshi, Aizumi-cho, Itano-gun, Tokushima (72) Inventor Yasuo Yanagihara 891-6, Omatsu, Kawauchi-cho, Tokushima-shi (72) Yoshikatsu Hirai 5, Ekagawa, Shinkaku, Kitajima-cho, Itano-gun, Tokushima -49 (56) References NATURE 315, (20 JUNE 1985) P.A. 641-647 PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. 81, p. 7907-7911 (1984) IMMUNOL. 135, p. 314-320 (1985) IMMUNOL. 135, p. 3962-(1985)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】インターロイキン−１βまたはそのアミノ
酸配列の１もしくは数個のアミノ酸を置換・付加・欠失
してなるインターロイキン−１β活性を有する誘導体を
有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。1. Interleukin-1β or amino acid thereof
Substitution / addition / deletion of one or several amino acids in the acid sequence
An anti-inflammatory agent comprising, as an active ingredient , a derivative having interleukin-1β activity . 【請求項２】インターロイキン−１βが、ヒトインター
ロイキン−１βである請求項１に記載の抗炎症剤。2. The anti-inflammatory agent according to claim 1, wherein the interleukin-1β is human interleukin-1β. 【請求項３】インターロイキン−１βの下記式（Ａ）で
表されるアミノ酸配列に於いて、８位ＣｙｓがＡｌａで
置換されているアミノ酸配列；７１位ＣｙｓがＳｅｒも
しくはＡｌａで置換されているアミノ酸配列；または７
１位ＣｙｓがＳｅｒもしくはＡｌａで置換され更に８位
ＣｙｓがＡｌａで置換されているアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを有効成分として含有することを特徴とす
る請求項１に記載の抗炎症剤。 3. An amino acid sequence of interleukin-1β represented by the following formula (A) wherein Cys at position 8 is substituted with Ala; Cys at position 71 is substituted with Ser or Ala. Amino acid sequence; or 7
2. The anti-inflammatory agent according to claim 1, comprising a polypeptide having an amino acid sequence in which Cys at position 1 is substituted with Ser or Ala and Cys at position 8 is substituted with Ala as an active ingredient. 【請求項４】有効成分が下記のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドである請求項１に記載の抗炎症剤。 4. The anti-inflammatory agent according to claim 1, wherein the active ingredient is a polypeptide having the following amino acid sequence.