JP2598801C - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、以後PTHrP(副甲状腺ホルモンに関連したホルモン)、ACSF（アデニ
ル酸シクラーゼ刺激因子）、又はBRF(骨放出因子)と称される悪性の液性過カル
シウム血症において活性なタンパクに関する。 さらに本発明は、ACSFのペプチド断片、並びに PTHrPの精製及び PTHrPの部分
的配列決定に関する。さらにまた本発明は、 PTHrP又はそれらの断片について向
けられる抗体及び PTHrPの同定に有用な該抗体を含有するキットに関する。〔注
：ここに記載される引用文献は、本明細書の最後に全部示される。〕 悪性の液性過カルシウム血症(HHM)は、一定の癌、特徴的には肺の扁平細胞癌
に非常に一般的な併発症があり、それにより罹病率及び死亡率に本質的に寄与す
る（１，２）。癌が誘導する液性因子は、腎による骨吸収を促進しそしてカルシ
ウム排出を制限することによって血中のカルシウム レベルを高め得る（１−３
）。これらの癌による“異所性(ectopic)”産生の副甲状腺ホルモン(PTH)が上記
HHM症候群を惹起すると多年にわたり考えられていた（４，５）にもかかわらず
、形質転換成長因子(TGF′S)を含む PTH以外の因子が原因であることが明らかに
なってきた（１−３，６−８）。そして該因子は骨吸収を促進する能力がある（
２，３，９−11）。また、 PTHから免疫学的に別個ないくつかの因子の特定の癌
による産生についての証拠があるが、その因子は直接的に PTHレセプター又は密
接に関連する膜構成要素に作用することによって、 PTH標的細胞（腎及び骨）中
でアデニル酸シクラーゼを刺激する点では PTHに似ている。かかる可能性は、臨
床的知見に基づき予想され、そしてさらに HHMを有する患者由来の抽出物中に（
12，13）、腎皮質性癌由来の条件化培地中に（14）、そして HHMモデル動物由来
の腫瘍抽出物と条件化培地培養物中で（15，16）その活性が記録されている。 初めは、気管支の扁平細胞癌を有する過カルシウム血症患者から樹立された B
EN細胞系（17）が、先に記載した PTHrPのような、感知できる量の上記 PTH様活
性を示すことを本発明者らは見い出した。 本発明者らは、ここに PTHrPの精製及び PTHrPの特徴付けに成功した。 従って、本発明の態様の１つは、後に特定されるような実質的に純粋な PTHrP
う提供するにある。 従って、本発明の次なる態様は、 PTHrP活性を具備する PTHrPの断片又は PTH
rPのサブ−ユニットを提供するにある。 PTHrPの単離及び精製は、悪性の液性過カルシウム血症におけるその役割を特
徴付けるために行われる研究を可能にするであろう。 PTHrP又はそれらのペプチド断片は、本技術分野におけるそれ自体公知の方法
によって、モノクローナル及びポリクローナル双方の抗体試薬を産生するために
使用し得る。例えば、 PTHrPもしくはそれらのペプチド断片単独で又はアジュバ
ント及び／もしくは担体タンパク質の存在下で適当な免疫感作をすることにより
、抗体試薬が調製され得る。適切な宿主の例としては、マウス、ラット、ラビッ
ト、羊、馬、山羊及び牛を包含する。モノクローナル抗体試薬が調製される場合
、一般に用いられる技術はKohler等（18）及びKennet等（19）により提示された
手法に従っている。 PTHrPに対して向けられる抗体試薬は、例えば全血液、血清、又は他の生物学
的流体中の PTHrP活性を検出するためのアッセイにおいて利用され得る。特に、
かかる試薬は、 PTH自体が原因となることが考えられる癌、慢性腎不全及び他の
骨疾患を有する患者の調査及び診断において相当な有用性があるであろう。 PTHrP及びそれらのペプチド断片に対して産生された抗体は、またさらに、免
疫組織化学的な診断薬として有用であり、そして種々の組織中で PTHrPを産生し
うる細胞の免疫的位置決定（Immunolocalisation）のために有用である。 診断の目的のための抗体試薬は、検出しうるマーカー、例えば；ローダミン、
フルオレセイン、コロイド状の金、ワサビ パーオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、アルカリ フォスファターゼ、フィコビリプロテイン(phy
cobiliproteins)、ルシフェラーゼ、フェリチン、¹²⁵Ｉ，³²Ｐ，³Ｈ又は¹⁴Ｃで
適当に標識付けされた PTHrPに対して向けられる抗体を含んでなることができる
。 本発明者らは、 PTHrPの合成ペプチドに対する抗体を調製した。これらの抗体 は、例えば放射線イムノアッセイ（50）又はウェスターン法（51）により、 PTH
rP又はそれらの断片を見い出すために使用し得る。試験管内（in vitro）培養細
胞又は生体内(in vivo)腫瘍によって産生される PTHrPは、 PTHrPに対して向け
られるこれらの抗体又は他の抗体試薬を用いて検出され得る。 本発明のさらなる態様によれば、 PTHrP及びそれらの断片に対して向けられる
抗体試薬が提供される。 本発明のさらに次なる態様によれば、 PTHrPのエピトープに結合することが出
来る１以上の抗体試薬を含んでなる PTHrP又はそれらの断片を検出するためのキ
ットが提供される。 本発明によって提供されるキットは、例えば上記に記載したようなフルオレセ
イン、放射性活性、又はタンパク性標識でラベルされた PTHrPに対して向けられ
る抗体を含有してもよい。また、キットは１以上のラベルした第二又は第三の抗
体を含有してもよい。付言すれば、キットは試薬を希釈するための緩衝液、そし
てアッセイを実施するための皿又はトレイのような種々の支持材を含有してもよ
い。 PTHrP又はそれらの断片に対して向けられる抗体は、凍結乾燥し、そして、
即ち適当な水溶液中での懸濁のために適した粉末状態であってもよい。他方、該
抗体は、貯蔵のために適切な水溶液の中に存在してもよい。 さらに本発明の態様によれば、 PTHrPのエピトープに結合し得る抗体試薬とサ
ンプルを接触するか、又は該試薬と担体上に固定化されたサンプル中のタンパク
と接触し、そしてその後抗体結合性の有無を検出することを含んでなる、所与の
タンパク含有サンプル中の PTHrP又はそれらの断片を検出するための方法が提供
される。 本発明の別の態様によれば、 PTHrPのエピトープに結合し得る抗体を担体上に
結合されたものとサンプルとを、抗体が結合することを許容するために十分な時
間を通してインキュベーションし、そしてその後 PTHrPのエピトープと結合し得
る抗体試薬と結合した PTHrPの存否を検出することを含んでなる、所与のサンプ
ル中の PTHrP又はそれらの断片を検出するための方法が提供される。 PTHrPの精製及びそれらのＮ−末端アミノ酸配列の決定は、 PTHrPのアミノ酸
配列に対応して合成オリゴヌクレオチドを製造することを可能にするだろう。次 に、これらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション プローブとして
使用でき、即ち PTHrPをコードする遺伝子又は遺伝子類の単離を容易にする。ま
た、かかるオリゴヌクレオチドは診断試薬としても使用でき、またさらに PTHrP
をコードするmRNAの発現の検出、及び PTHrPをコードする遺伝子又は遺伝子類の
発現の制御の研究において使用され得る。 ヒト腫瘍系 BENによって産生される PTHrPは２つの形態で存在し、まったく同
一の生物学的活性を有しているが、免疫交叉反応性、分子量及びHPLCによる溶出
挙動に基づき識別し得る。 PTHrPのこれらの形態のどちらのものも本発明の態様
の範囲内にある。 さらに本発明の態様によれば、 PTHrPは BEN細胞が培養された培養物から得ら
れる。さらに具体的に、 PTHrPの精製のための１の方法は次の工程： （ａ）培地中で BEN細胞を培養する； （ｂ）培養物を陽イオン交換樹脂にかける； （ｃ）上記陽イオン交換樹脂から溶出分画する； （ｄ）溶出された画分を PTHrP活性についてアッセイする； （ｅ）それらの PTHrP活性を有する画分について逆相高性能液体クロマトグラ
フィー（HPLC）を実施し、そしてその後実質的に純粋な PTHrPを単離する、 を含んでなる。 単に例示のために添付する図面を引用して、ここに本発明をより詳細に記載す
る。そしてその内容は： 第１図は、 PTHrPの最終精製工程における、 215nmにおける吸収及び生物学的
活性のHPLC挙動を示す； Ａ Vydac HPLC由来のピークＢ物質を集めた 220μｇがＣ₁₈ベイカーボンド(Bak
erbond)カラム（25×0.46cm）にかけられた。溶離は１分当たり0.66％の比率に
おける０−60％アセトニトリル／ 0.1％ TFAのグラージェントを用いて実施され
た。画分は 215nmにおいて観察されるタンパクピークに従って集められた。アデ
ニル酸シクラーゼ活性は、各々の画分から10μｌ分取したものでアッセイされそ
して画分容量に対して数値が調整された。 Ｂ 実験Ａ（画分51−55）から集められた６μｇ hPTH(１−34)同等物が、上記
実験Ａのカラムに再びかけられそして１分当たり0.33％の比率における０−６８
％アセトニトリル／ 0.9％ TFAのグラージェントで溶離された。 第２図は、第１図の画分31，32及び33の SDSポリアクリルアミド ゲルを示す
； 第３図は、インタクト(intact)UMR 106細胞においてウシPTH(１−34)に対して
アッセイされた（○）第１図の画分31の生化学的活性のプロット（●）を示す； 第４図は、SPセファデックス カラムクロマトグラフィー、及び２回の Baker
bondクロマトグラフィー工程の後に得られた逆相HPLCカラム（Bakerbond C18 wi
de pore 25×0.46cm）でクロマト処理された精製 PTHrPのHPLC挙動を示す。挿入
は画分47の SPSPAGE銀染色法（silver-stain）ゲル挙動及び分子量標準を示す。 第５図は、トリプシンによる消化後のPTHrP（100pMoles）のHPLC挙動を示す。
トリプシン消化物は、 C8 Brownleeカートリッジ、10cm×2.1mm 、流速 250μｌ
／分、及び 0.1％ TFA中の０−50％アセトニトリルのグラージェント（１％／分
）が用いられクロマト処理された。 第６図は、ブラウンリー(Brownlee)C8（2.1mm）マイクロボアー(microbore)カ
ラム上でクロマト処理された第４図の画分46及び48を集めた物質を示す。挿入は
、主要ピークのダイオード アレー(diode array)検出を示す。第７図は、トレーサーとして種々のラベルしていないペプチド及びＩ¹²⁵でラ
ベルした〔Asn¹⁰，Tyr¹⁷〕PTHrP(１−17)及び合成PTHrP(１−17)ペプチドに対す
るラビット抗血清を用いるラジオイムノアッセイを示す。結合したペプチド／遊
離ペプチドがペプチド／mlの量に対してプロットされた。 Ａ ラベルされていないペプチドは：〔Glu⁸，Asn¹⁰，Cys¹¹〕PTHrP(１−11)(○
)、hPTH(１−34)(■)、ラット カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）、ヒ
ト副腎皮質刺激ホルモン及びウシ インシュリン（全て、10μｇ／ml、△）、サ
ケ カルシトニン（10μｇ／ml、▲）であった。 Ｂ ラベルされていないペプチドは：〔Glu⁸，Asn¹⁰，Cys¹¹〕PTHrP(１−11)(○
)、ラットPTH(１−34)(□)、ウシPTH(１−34)(■)、ヒトPTH(１−34)(●)、 ラットCGR(10μｇ／ml、△)、サケ カルシトニン（10μｇ／ml、▲）。 第８図は、SP−セファデックス部分精製 PTHrPのHPLCに由来する画分の生物学
的なアッセイ及びラジオイムノアッセイの比較を示す。 第９図は： Ａ UMR 106−01細胞における増加するサイクリック AMP産生についての合成PTH
rP(１−34)の生物学的活性（●）を、標準としてのウシPTH(１−34)(○)と比較
して示す。 Ｂ ¹²⁵Ｉ−フィブリン上で培養された UMR 106−01細胞におけるプラスミノ−
ゲン アクチベーター活性に対する合成PTHrP(１−34)の効果（●）及びウシPTH
(１−34)の効果（○）を示す。このアッセイは既に Allanらに記載された方法に
より実施された（52）。 第10図は、実施例３のピークＡの１つのサンプル（Ａ１及びＡ２、レーン２及
び３）、高度に精製したウシ副甲状腺ホルモン（レーン１）、及び高度に精製し
た実施例３のピークＢから誘導されたPTHrP(レーン４)のウェスターン ブロッ
ト分析を示す。サンプルは SDS−PAGEで分離され、ニトロセルロースに移され；
PTHrP(１−16)に対して生じるラビット抗血清によりプローブし；洗浄しそして
山羊の抗−ラビットIgG1の¹²⁵Ｉ−ラベルした Fab断片とインキュベートし、そ
してオートラジオグラフ化した。分子量標準は水平線で示される。定義 ： “PTHrP”とは、SDSポリアクリルアミド ゲル電気泳動により測定される場合
に、15,000〜25,000ダルトンの分子量を有し、そして副甲状腺ホルモンと同様の
態様で、適当な標的細胞（例えば、 UMR 106−01細胞）中でアデニル酸シクラー
ゼ活性を刺激する活性を有する悪性の液性過カルシウム血症において活性なタン
パクを称する。 既に記載したように、 BEN細胞から精製される PTHrPは多型性でありそして実
質的に同一の生物学的活性を有する２つの識別されうる産生物として存在する。
これらの産生物の１つは、 SDS−PAGEにより測定される場合に15−18Ｋ間の分子
量を有し、そしてＮ−末端配列は第１表に示される。別の産生物は、18Ｋ−25Ｋ
間の分子量を有する。この第２の産生物は第１に記載した産生物の PTHrPに対し て産生される抗血清と交叉反応する。 PTHrPの両産生物とも本発明の態様に含ま
れそして“PTHrP”の語により包含される。 さらに、 PTHrP活性を有する PTHrPの対立遺伝子的変形体（Variants）も本発
明の態様内のものでありそしてまたさらに“PTHrP”の語により包含される。こ
のような変形体は、 PTHrPの配列に対するアミノ酸（類）の削除、置換又は付加
により提供され、そしてこれらは第１表に示される（一部）。第１表により示さ
れるようなもともと存在するアミノ酸が削除されそして／もしくは他のアミノ酸
に置換されるか、又は本来的な配列の PTHrPに対しさらにアミノ酸が加えられる
場合の変形体は、通常のタンパク合成技術（41）又は組換え DNA技術（53）によ
って調製され得る。これらの変種で PTHrP活性を具備するものは本発明の態様内
のものであり、そしてまた“PTHrP”の語により包含される。 PTHrPに関連して使用される場合の“実質的に純粋”とは、 PTHrPと通常会合
しているタンパク性の又は他の汚染物質が実質的に存在しない場合の PTHrPを意
味する；一般に SDS−PAGE上で単一バンドを生じせしめ；そして全タンパクの一
般に約95重量％− 100重量％、通常約97重量％が PTHrPである場合をいう。本発
明の実施に従う“PTHrP”は、先行技術文献に記載されたような PTH様の活性を
有する物質の粗製の特徴付けられていない生産物から識別出来る。先行技術文献
の生産物（54及び55）は、多数のタンパクから成り、活性因子はタンパク及び他
の物質の合計量に比べて非常に少量である。これらの生産物は、タンパク配列分
析又は PTHrPに対して特異的な抗体の調製のためには適していなかった。 本明細書の“サブユニット(sub-unit)”又は“断片”の語は、 PTHrPに特有で
あるところの PTHrPタンパクの一部を意味するために用いられる。予想されるよ
うに、これは単一のアミノ酸を特に除去する。一般に、長さとして５個以下のア
ミノ酸のペプチドは特異的なものにはならないだろう。 “エピトープ”とは免疫応答を引き出すことができる PTHrP又はそれらの断片
もしくはサブユニットの任意の抗原部位を意味する。略語 ： HPLC 高性能液体クロマトグラフィー SDS −PAGE ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PTH 副甲状腺ホルモン hPTH ヒト副甲状腺ホルモン PTHrP(１−11) 第１表のアミノ酸１から11に対応する PTHrPの合成ペプチド PTHrP(１−16) 第１表のアミノ酸１から16に対応する PTHrPの合成ペプチド PTHrP(１−17) 第１表のアミノ酸１から17に対応する PTHrPの合成ペプチド PTHrP(１−34) 第２表のアミノ酸１から34に対応する PTHrPの合成ペプチド CGRP ラット カルシトシン遺伝子関連ペプチド TFA トリフルオロ酢酸実施例１ PTHrP活性に対する生物学的なアッセイ 生物学的アッセイは、 PTHに応答して、骨芽細胞様の細胞、例えば広範囲な種
々の UMR 106−01細胞系（20−40）におけるサイクリック AMPの量依存性産生を
利用する。上記アッセイが実施し得る種々の方法は骨芽細胞様の細胞の膜ホモジ
ネート中のアデニル酸シクラーゼの直接的な測定、そして無処理（intact）細胞
によって産生されるサイクリック AMPのアッセイを包含するものである。簡単に
、都合よくそして非常に多量のサンプルの迅速なアッセイを可能にするために、
本発明者らは、12−ウェルプラスチック皿中で UMR 106−06細胞をレプリカ培養
として増殖せしめ、³Ｈ−アデニンと共に２時間にわたり前−インキュベーショ
ンすることにより細胞 ATPプールを³Ｈによりラベルし、細胞を短時間洗浄し、
次にホスホジエステラーゼ インヒビターとして１mMイソブチルメチルキサンチ
ンを添加することにより応答を測定した。10分間後に反応を止めそしてDowex(登
録商標)及び中性アルミナ上での連続的なクロマトグラフィーにより培養物から³
Ｈ−サイクリック AMPを精製した。上記細胞は、サイクリック AMP産生において
投与量依存性増加を伴って、 PTHそしてＥシリーズのプロスタグランジン（主に
PGE₂）に対して応答する。これは PTH又は PTH様活性についての簡単な再現性あ
る生物学的なアッセイに改良されている（34，40）。この系において、PTH(40)
の拮抗ペプチド又は合成ヒトPTH(１−34)(40)に対して産生した PTHに対する他
の抗血清と共にサンプルを事前にインキュベートすることにより PTHに対する応
答は抑制されたが、PGE₂に対してはそうでなかった。 実施例２ BEN細胞によって誘導される PTHrP活性 実施例１に記載された生物学的アッセイにより BEN細胞培養液が直接アッセイ
された場合に、それはサイクリック AMP産生を刺激する能力を示す。活性は培地
の連続的な希釈物、しばしばほぼ１：100 の希釈物中で測定できる。粗培養液の
希釈物は PTHにより誘導されるそれと平行して活性を刺激し；山羊抗−ヒトPTH(
１−34)と培地との事前のインキュベーションは、 PTHrP活性に対していかなる
効果ももたらさないが、同じ抗血清はhPTH（１−34）それ自体（40）の活性を完
全に不活化する。合成ペプチド、〔³⁴Tyr〕hPTH（３−34）アミド及び〔³⁴Tyr〕
hPTH（５−34）アミドは、上記 UMR 106−01細胞中の PTHrP及びhPTH（１−34）
に対するサイクリック AMP応答をそれぞれ抑制するが、これらの拮抗剤は同じ細
胞中のPGE₂に対する応答についてなんらの効果ももたない（40）。 BEN細胞培地とトリプシンとのインキュベーションは、 PTHrPの生物学的な活
性の欠失をもたらし、それがタンパクであることと一致する。それは２分間 100
℃の温度に耐えうるから適度な熱安定性を有する。 0.1Ｍ酢酸中Biogel P60上で
の無血清 BEN細胞条件化培地のゲルの濾過は、流出物チューブの生物学的なアッ
セイにより、活性が約40,000の分子量の巨大分子に基づくことを示した。これは
おそらく、未精製段階にある間、上記活性物質が他のタンパクを伴う結果として
過大に算定されるためであることが後になってわかった。 PTHラジオイムノアッセイは多数の相違する抗血清具体的にはカルボキシ末端
について２つ、分子の中間について１つ、そしてアミノ末端について１つ、につ
いて実施された。どの場合でも、 BEN細胞培養物中で免疫反応性 PTHは検出され
なかった。 BEN細胞をコンフルエンスに増殖せしめ、洗浄して血清を除去し、そ
して無血清培地(50％ Dulbeco's Modified Eagles’Midium，50％メデウム199)
中で24時間インキュベートすることにより、実質的な量の PTHrP活性（１／100
までの希釈で検出可能）の生産を行うことが可能であることが見い出された。従
って、これは活性物質を大量に含む培地を蓄積する標準方法として使用され、そ
して該培地は精製が始められるまで−２０℃で貯蔵された。実施例３ BEN細胞培養物からの PTHrPの精製 BEN細胞培養物（24時間、無血清インキュベーション）が蓄積され、そして UM
R 106−01サイクリック AMP応答アッセイにおいて、標準としてヒトPTH(１−34)
に対する生物学的なアッセイにより PTHrP活性が測定された。培養物の蓄積した
バッチ−１回に５ｌ−が、１Ｍの酢酸でpH 4.8に酸性にした後、SPセファデック
スカラム（35ml容積）上に注がれた。そのカラムがpH 4.8の 0.1Ｍ酢酸ナトリウ
ムで十分に洗浄された後、個々の試験管についてＥ₂₈₀の存在を測定しながら、
0.1， 0.2及び 0.3Ｍ NaCｌの各 250ml、そしてさらに 0.5Ｍ NaCｌ 500mlを加
えることによりタンパクの回分的な溶出が実施された。生物活性は個々のカラム
試験管のサンプル 100μｌについてアッセイされ、そして生物活性のバルク（bu
lk）は、 0.5Ｍ NaCｌ画分を集めることにより得られた。この段階での生物活性
の回収率は90−100 ％であり、そして10倍の精製を達成する。それは本質的な精
製手段というよりは、むしろ有用な濃縮方法として役立つ。 かかる５ｌ段階から蓄積した活性物質は、SP１，SP２、等のように称される。
上記活性プール(0.5Ｍ NaCｌ）は TFAにより 0.1％の濃度に酸性にされ、そして
逆相HPLC（RP 300）カラム上に注がれ、そのカラムから１分当り0.66％のアセト
ニトリル グラージェントを用いて活性物質は溶出された。RP 300カラム溶出物
からの個々のカラム画分（１ml画分当たり10μｌ）は、バイオアッセイされそし
てロータリー エバポレーターにより処理される。この段階での回収率は60％で
ある。６つのかかるSPプールが次の段階の精製のために一緒にされた。すなわち
、これは培養物の30ｌ分に相当する。 タンパクの評価は、標準として BSAを用いてブラッドフォード法(Bradford me
thod)(56)により行われ、そしてその物質は２mgづつ分けてHPLC Vydac C18カラ
ム（10μ、2.54×22cm）にかけられ、そしてカラムから１分当たり 0.5％アセト
ニトリル グラージェントでそれは溶離される。該 Vydacカラムから生物活性の
２つのピーク、すなわち32％アセトニトリルにおいてピークＡそして37％におい
てピークＢが首尾よく得られる。ピークＢはピークＡより他のタンパクによる汚
染がより少なく、そして次の精製のために機械的に選ばれる。活性の合計回収率
は30％である。ピークＡ：ピークＢの割合はバッチ間で２：１から 0.5：１ま で変化する。 ピークＢ物質が集められ、そしてwide pore（300Å）Bakerbond C18 逆相カラ
ムにかけられ、そしてさらにアセトニトリル グラージェントで溶離される（第
１Ａ図）。 215nmにおける吸収がモニターされる。個々のカラム画分がバイオア
ッセイされ、そして最高の活性を有する画分（画分50−55）が集められる。該活
性物質は第１Ｂ図に示されるように改良した溶出条件を用いる逆相HPLCによりさ
らに精製される〔１分当たり0.33％のシャロウワー(shallower)アセトニトリル
グラージェント〕。第１図の細かい平行線の領域は、生物学的アッセイデータを
ヒトPTH(１−34)のμｇ相当量として示し、そして試験管番号28−38のカラム画
分が示される。生物活性ピークは画分31において観察され、それは４つの近似す
る位置のタンパクピークの１つに一致する。画分31の内容物はアミノ酸配列決定
のために用いられそして SDS−PAGE分析のために用いられた。まず最初のこの物
質の配列決定は、第１表のアミノ酸１−24を同定した。 上記ピーク画分は、銀染色法(silver-staining)によるタンパク バンドを検
出するために使用されたゲルの一部を用いて SDS−PAGEにより分析された。上記
ゲルの残りをスライスしてはぎとり、そして生物活性についてアッセイされたゲ
ル スライスから活性物質を溶離した。 17％ポリアクリルアミド ゲルへの画分31の20％の使用(約６pMoles、又は120
ng)は、分子量標準により決定した場合18−19Ｋの分子量に一致する銀染色する
物質の主要バンドをもたらす（第２図）。２つの不明瞭なバンドが35Ｋ及び67Ｋ
に観察された。これらは PTHrPの２量体及び３量体の可能性がある。再度試験し
たゲルが３mm幅の切片にスライスされそして 0.1％ SDSで溶離された場合、溶離
した活性は18−19Ｋにおける銀染色ピークに一致する単一バンドのみ観察された
（第３図）。ゲルに適用された量は生物学的アッセイによりhPTH（１−34）の 1
.4μｇと等価であった。直接的にタンパクの定量は行わなかったが、アミノ酸配
列データから計算された。 配列決定のために用いられた純粋物質の比活性は、μｇ PTHrPタンパク当たり
ウシPTH(１−34)の６μｇと等価であることが推定された（第３図）。 別々の精製バッチにおいて、HPLC工程Ｂから回収された生物活性物質（第１図 、画分31−32）は一緒にされそして１分当たり0.33％の割合でアセトニトリルグ
ラージェントによりwide pore（300Å）Bakerbond C18 逆相カラム上で再クロマ
ト処理された。第４図に見られるような、単一の鮮明に限定されたピーク、すな
わちピーク47は、分子量18Ｋ−19Ｋのタンパクを含む。この画分中には、 SDS−
PAGEで測定されるような他のいかなる夾雑タンパクも検出されなかった。この物
質は実施例１に示すアッセイによれば生物活性があり、そしてバイオシステム
ガス フェーズ マイクロシークエンサー器(Applied Biosystems Gas Phase Mi
crosequencer)を使用してアミノ酸配列決定のために使用された。この物質の配
列決定は、次の実施例中に示すように41個のアミノ酸を同定した。実施例４ PTHrPの部分的配列決定 実施例３により調製された精製 PTHrPが一連のエドマン分解にかけられ、そし
てApplied Biosystems gas phase sequentator（57）を用いて分析された。配列
決定は３度行われ、得られる結果を第１表に示す。精製 PTHrPのＮ−末端配列分
析により41個のアミノ酸が同定される。 PTHrPのアミノ酸配列は PTHrPのトリプ
シン分解断片を用いて50残基まで拡張された。第１表のアミノ酸は、レター コ
ード(letter code)を使用して指定される（58）。 精製 PTHrPのトリプシン分解は、75μｇの PTH様生物活性物（合成 PTH標準に
対して、 UMR−106 細胞生物学的アッセイによって PTHrPの調製物をアッセイす
ることにより PTH様生物活性物は測定される）を37℃で24時間トリプシン（１：
10Ｗ／Ｗ）とインキュベートすることにより実施された。このトリプシン分解物
はHPLCにより18個のピークに分離された（第５図）。これらのピークの数個のア
ミノ酸配列が決定され、そしてピーク７に含まれる配列は、残基38において始ま
る PTHrPの NH₂−末端配列と重なることがわかった。このペプチドが PTHrPのア
ミノ酸配列を残基50まで伸張した。 PTHrPの最初の24個のアミノ酸が、コンピュータープログラムを使用してNBRF
データ ベース（59）中のタンパク配列と比較された。45−80％の重複配列の相
同性を伴って、ヒト及びラット PTHの最初の24個のアミノ酸との実質的な同質性
が明らかにされた。構造的同一性は、ヒト PTHの最初の13個のアミノ酸とで特に 示され、そしてそれ以降ではずっとより少ない。 PTHの最初の10個のアミノ酸を
含有する配列は、非常に弱い免疫原であり、そして実際にこれは現実の配列、そ
してコンピューター化した予測法から予測され得る。 PTHrP配列が同様な方法で
分析される場合、 PTHよりも感知できるほどより一層免疫原性であることがわか
った。 実施例５ 精製 PTHrPのアミノ酸分析 高度に精製した PTHrPのサンプル（第４図のカラム溶出由来の46−48試験管；
合計 PTH様生物活性物７μｇ）が、第６図に示されるように Brownlee C8カラム
(2.1mm)によりクロマト処理された。主要ピークのダイオード・アレイ(Diode ar
ray)検出（第６図の挿入部）は、ピークの肩に芳香族アミノ酸内容物の夾雑を示
した。主要ピークの中心部は 110℃で25時間加水分解され、そしてベックマン63
00アミノ酸分析器（Beckman 6300 Amino Acid Analyser）で分析された。その結
果は第２表に示される。分析された量は20pmolesで、そして 8.8μｇのウシPTH(
１−34)と生物活性において等価であることがわかった。この精製調製物の比活
性は PTHのそれよりも約20倍大きいことを示した。上記アミノ酸分析は、 PTHrP
が 154個のアミノ酸を含有することを示す。 実施例６ PTHrPペプチドのペプチド合成及びこれらのペプチドに対する抗血清の調製 PTHrPのアミノ末端配列に対応して合成ペプチドが、 Applied Biosystems Mod
el 430A自動ペプチド合成装置を用いてメリフィールド法（41）により合成され
た。合成ペプチドは無水HFを用いて担体樹脂から開裂され（42）、60％アセトニ
トリル及び 0.1％トリフルオロ酢酸で抽出され、ロータリー エバポレートされ
、さらに凍結乾燥された後、０−60％アセトニトリルのグラージェント（合計容
量1000ml）により低圧逆相カラム(2.5×30cm、Amicon C₁₈逆相、15−17μ 250Ａ
pore size)でクロマト処理された。精製されたペプチドは凍結乾燥された。ペ
プチドの組成を確認するためにアミノ酸分析が用いられた。カルボキシ末端シス
テインを介して大豆トリプシン インヒビターに接合された合成ペプチドにより
、ラビットが免疫感作された。 第１表における配列情報に基づき次のペプチド類似化合物が合成された： Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Glu-His-Asn-Cys(〔Glu⁸，Asn¹⁰，Cys¹¹〕PTHr
P(１−11)，Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-G
ln(〔Asn¹⁰〕PTHrP(１−16))，〔Asn¹⁰，Tyr¹⁷〕PTHrP(１−17)、及びPTHrP(１
−34)．該類似化合物〔Glu⁸，Asn¹⁰，Cys¹¹〕PTHrP(1−11)及び〔Asn¹⁰〕PTHrP(
１−16)はアデニル酸シクラーゼ アッセイ中で不活性であり、そして PTHそれ
自体の又は BEN細胞由来の条件化培地の活性に拮抗しなかった。大豆トリプシン
インヒビターに接合された〔Glu⁸，Asn¹⁰，Cys¹¹〕PTHrP(１−11)が、ラビット
を免疫感作するために使用され、そして抗血清が調製され、これがラジオイムノ
アッセイで使用された。また、〔Asn¹⁰〕PTHrP(１−16)に対する抗血清は同様な
態様でラビットに生じた。実施例７ PTHrPに対して向けられた抗血清を用いるアッセイ ラジオイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイのためのトレーサーとしてＩ
¹²⁵−ラベル化〔Asn¹⁰，Tyr¹⁷〕PTHrP(１−17)を用いて実施され、そしてラビッ
ト抗血清が、１／1000の最終希釈物として実施例５により調製された。最初のイ
ンキュベーションは、 0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（pH 7.5）中で４℃で夜通し行われた。遊離ペプチドからの結合ペプチド
の分離は、固相第二抗体（Sac Cell-Wellcome，Australia）を用いて達成された
。合成ペプチドのヨウ素化は、既にカルシトニンについて開示されているように
（44）、約 150μCi／μｇの比活性になるように実施された。 第７Ａ図に示したように、上記アッセイはPTHrP(１−10)及び（１−16）を同
等に確認した。hPTH（１−10）及びhPTH（１−34）の交叉反応性は、それぞれ 0
.5及び 0.3％であった。ラットPTH(１−34)、ウシPTH(１−34）及びヒトPTH(１
−34)の交叉反応性は、それぞれ７％，５％及び 0.4％であった（第７Ｂ図）。
PTHrPは、 PTHrPのエピトープに結合することができる抗体を用いる免疫アフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製することができる。この技術において、
PTHrPに結合することができる抗体が担体マトリックスに付着される。 PTHrP含
有材料は、担体マトリックスがクロマトグラフィー カラム中にある場合にはそ れを通して濾過され、また別法としてバッチ的法を用いるならば該マトリックス
と混合される。上記材料中に存在するすべての PTHrPが該マトリックスに結合し
、そしてそれはすべての夾雑物質を除去するため洗浄することができる。その後
、精製 PTHrPは、抗体結合を開裂する条件、例えば高いか又は低いpH条件を用い
てマトリックスから溶出され得る。同様な技術が PTHrPに結合することができる
抗体を精製するために使用し得る。これに関しては、実施される工程は PTHrPが
担体マトリックスに付着されることを除いては、上記の概要のものと同じである
。 第８図は、部分的に精製された PTHrPのHPLC画分（即ち、SP-セファデックス
クロマトグラフィー溶出物）へのラジオイムノアッセイの結果を示す。 部分的に精製されたPTHrP(35μｇ hPTH に等価)は、Ｃ₁₈逆相監視(guard)カラ
ム(RP 300、７μ 0.3×4.0cm)によりクロマト処理された。溶離は90分以上１ml
／min の流速で０−60％アセトニトリル／ 0.1％ TEAのグラージェントにおいて
実施された。生物学的アッセイはあいている円（○）を表わし、閉じた円（●）
としてラジオイムノアッセイが表わされる。第８図は、生物学的活性及び免疫学
的活性の同時的溶出を示す。 PTHrP(１−34)ペプチドは、 UMR 106−01細胞中のサイクリック AMP応答につ
いて牛PTH(１−34)に対してアッセイされ、そして等価な能力が存在することが
わかった（第９Ａ図）。同様に、 UMR 106−01細胞中のプラスミノーゲン アク
チベーター活性を増加する能力においてもウシPTH(１−34)に対して等価であっ
た（第９Ｂ図）。これは、本発明者らが報告してきた PTH応答系であり、そして
十分に特徴付けられている（52）。ウェスターン ブロット（Western Blot）分析 実施例３のピークＡの２つのサンプル由来のタンパク、実施例３のピークＢか
ら誘導される高度に精製した PTHrP、及び純粋なウシ副甲状腺ホルモンが SDS−
PAGEにかけられ、ニトロセルロースに移され、１時間低界面活性剤“ブロット(B
lotto)”でブロックされ、１：200 希釈における〔Asn¹⁰〕PTHrP(１−16)に対す
るラビット抗血清とインキュベートされ（実施例５参照）、山羊抗−ラビット血
清の¹²⁵Ｉでラベルした Fab断片と１時間インキュベートし、そしてその後オ ートラジオグラフ処理された（第10図）。 予期されたように、高度に精製した PTHrPを含有したレーン４は、 PTHrPの分
子量と一致する18Kdのバンドを示す。これに対して、実施例３のピークＡ由来の
タンパクを含有するレーン２及び３は約22Kdのバンドを示す。このことは、 PTH
rPが少なくとも２つの形態で存在し、両方とも同じ生物学的な能力を有するが、
分子量及び逆相HPLC上の溶離挙動において相違することを強く示唆する。純粋な
ウシ副甲状腺ホルモン（レーン１）は、これらの条件下ではいかなるバンドも示
さなかった。 PTHrPに対して向けられる抗体は、生物学的サンプル中に上記タンパクが存在
するか否かを検出するために使用され得る。 該生物学的サンプルは固相担体、例えばニトロセルロース又は PVCに結合され
、そして抗−PTHrP 抗体と反応され得る。抗体の結合性は、その後抗体に付着す
る検出可能なラベルを用いることにより検出され得るか、又はむしろ結合した抗
体に対して特異的な第２のラベルした試薬を用いることにより検出されるであろ
う。試薬としては、例えばプロテインＡ、又は抗−Fab もしくは抗−Fc抗体が使
用され得る。 他方、抗−−PTHrP 抗体が固相担体、例えば PVCプレート、ポリスチレン ビ
ーズ等に結合され得るだろう。その後、アッセイされるための物質が上記担体に
添加され、そしてそれが抗体と結合することを可能にするため十分な時間インキ
ュベートされ、次いで結合していない物質が洗浄除去される。その後、第２のラ
ベルした PTHrP抗体が抗体結合性を検出するために上記担体に加えられるであろ
う。第２の抗体がラベルされていないなら、抗体結合性を検出するために改めて
ラベルした試薬が該担体に加えられるだろう。容易に予期され得るように、これ
らの手段は、 PTHrPが少なくとも２つのエピトープ、その１つは固相担体に結合
した抗体に結合するものであり、そして他は第２の抗体に結合するもの、を含有
することを想定している。 好適な検出可能なラベルは、¹²⁵Ｉ，³²Ｐ，³Ｈ，¹⁴Ｃ、ビオチン、アビジン、
プロテインＡ、コロイド状の金もしくは銀、ウレアーゼ、アルカリ ホスファタ
ーゼ、ワサビ パーオキシダーゼ又はフィコビリプロテインを包含する。 実施例７ 遺伝分析 PTHrPタンパクは PTHに対し実質的に相同性を持つため、それが特有の非対立
遺伝子によってコードされたものか、又は PTH遺伝子それ自体の変異形であるか
を決定することが必要だと思われた。 実験は、³²Ｐでラベルされた単一コピー PTH遺伝子及びその３′フランキング
(flanking region)に特異的なプローブ（45）を用いて実施された。ノザン（Nor
thern）ゲル分析は、 BEN細胞に由来するか又は外科的に切除されたヒト上皮小
体腺腫から調製されるトラック(track)当たり５mgのPoly A⁺mRNAを用い、既に開
示されているように（46）実施された。サザーン（Southern）ゲル分析は、 BEN
細胞に由来するか又はヒト白血球から調製されるトラック当たり10mgの制限酵素
消化されたゲノム DNAを用い標準法（47）を改良したものである。ヒト PTHプロ
ーブは、³²Ｐ−ヌクレオチドにより10⁸dpm／mg以上の比活性にまでランダムにプ
ライムされた（26）。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は開示されたところ
のものであった（46）。 Poly A⁺メッセンジャー RNAのノザン ゲル分析は、 BEN細胞が上皮小体腺腫
組織に比し検知可能なレベルにおいて PTH遺伝子を発現しなかったことを示した
（例示しなかった）。 BEN細胞に由来するか又はヒト白血球に由来する制限酵素
消化したゲノム DNAのサザーン ゲル分析は、同一の PTH−含有制限断片、例え
ば 4.2及び 3.8KbのEcoRＩ断片を示した。従って、 BENは、非発現性 PTH遺伝子
、及び指示したタンパク配列を備えている PTHrPの発現から推論すると、 PTH−
関連遺伝子をコードする相同の遺伝子の両方を含有する。実施例８ 様々な組織による PTHrPの産生 PTHrP産生は腫瘍細胞に限られるとは思われない。この点を明らかにするため
に羊の胎児、雌羊の組織及び胎盤の抽出物に関連する実験が遂行された。抗−PT
H 抗血清又は PTH拮抗物質と前もってインキュベーションした後にアッセイを行
うことによって、本発明者らは生物活性が単独の PTHもしくは PTHrPに帰すべき
か、又はそれらの２つの混合物に帰すべきかを決定することが出来た。 羊の胎児上皮小体は50％だけが PTHにより説明でき、残りは PTHrPに帰する可
能性があるところの生物活性を含有することがわかった。いくらかのPTHrP(約20
％)は母性上皮小体中に見い出された。 しかしながら、最も著しいことは胎盤に感知しうる程度の活性を含むことが見
い出され、そしてそれは PTHrPとして完全に説明することができ、そしてまたそ
れは BEN細胞培養物由来の PTHrPと同じ態様においてHPLC上で挙動した。さらに
また、胎盤中で検出できる PTHrPの量は、上記上皮小体が胎児から切除された雌
羊由来の胎盤の中では減少されなかった。このことは、胎盤が PTHrPの重要な源
泉でありうることを示唆する。 本発明者らは、悪性の液性過カルシウム血症を有する患者の尿から PTHrPを精
製した（データは示さない）。これらの結果に基づけば、本発明の抗体試薬を用
いて血清、尿又は他の生物学的な流体中の PTHrPの存在が検出され得る。従って
、本発明の抗体試薬は悪性腫瘍の識別における診断薬として有用性を有する。 本発明の他の態様、それらに対する改良そしてそれらに対する変形は、本明細
書を読むことにより当業者にとって明らかになるであろうし、そしてかかる全て
の他の態様、改良及び変形は本発明の態様の中に包含されるように考えられる。 引用文献 １．Martin，T．J．及びAtkins，D.(1979)Essays in Med．Biochem．4，49-82． ２．Mundy，G．R.及びMartin，T．J.(1982)Metabolism 31，1274-1277． ３．Mundy，G．R.，Ibbotson，K．J.，D'Suoza，S．M.，Simpson，E．L.，Jacob
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Malignant humoral hypercalcium called lurate cyclase stimulating factor) or BRF (bone release factor)
It relates to a protein that is active in shimemia.   Further, the present invention relates to peptide fragments of ACSF, purification of PTHrP and partial PTHrP.
For dynamic sequencing. Furthermore, the present invention is directed to PTHrP or fragments thereof.
And a kit containing the antibody useful for the identification of PTHrP. 〔note
: All references cited herein are set forth at the end of the specification. ]   Malignant humoral hypercalcemia (HHM) is a type of cancer that is characteristically squamous cell carcinoma of the lung
Are very common complications, which inherently contribute to morbidity and mortality
(1, 2). Humoral factors induced by cancer promote bone resorption by the kidneys and
Calcium levels in the blood can be increased by limiting calcium elimination (1-3
). "Ectopic" production of parathyroid hormone (PTH) by these cancers
 Despite many years thought to cause HHM syndrome (4,5)
Revealed that factors other than PTH, including transforming growth factor (TGF'S), are the cause
(1-3, 6-8). And the factor has the ability to promote bone resorption (
2, 3, 9-11). Also, some cancers that are immunologically distinct from PTH
Although there is evidence for production by
By acting on membrane components related to contact, PTH target cells (kidney and bone)
Is similar to PTH in that it stimulates adenylate cyclase. Such a possibility is
In extracts from patients with additional HHM,
12,13), in conditioned medium from renal cortical carcinoma (14), and from HHM model animals
Its activity has been documented in (15,16) tumor extracts and conditioned medium cultures.   Initially, B was established from a hypercalcemic patient with squamous cell carcinoma of the bronchi.
The EN cell line (17) produces a detectable amount of the above PTH-like activity, such as PTHrP described above.
The present inventors have found that they exhibit sex.   The inventors have now successfully purified and characterized PTHrP.   Accordingly, one aspect of the invention is a substantially pure PTHrP as specified below.
To provide.   Accordingly, a next aspect of the invention is a fragment of PTHrP or PTHrP having PTHrP activity.
in providing sub-units of rP.   The isolation and purification of PTHrP characterizes its role in malignant humoral hypercalcemia.
It will allow research to be done to mark up.   PTHrP or peptide fragments thereof can be prepared by methods known per se in the art.
To produce both monoclonal and polyclonal antibody reagents
Can be used. For example, PTHrP or a peptide fragment thereof alone or adjuvant
Appropriate immunization in the presence of the antibody and / or carrier protein
An antibody reagent can be prepared. Examples of suitable hosts include mice, rats, rabbits
And sheep, horses, goats and cattle. When a monoclonal antibody reagent is prepared
Commonly used techniques were presented by Kohler et al. (18) and Kennet et al. (19)
Follow the method.   Antibody reagents directed against PTHrP can be, for example, whole blood, serum, or other biological
Can be utilized in assays to detect PTHrP activity in target fluids. Especially,
Such reagents may be used in cancer, chronic renal failure and other
There will be considerable utility in investigating and diagnosing patients with bone disease.   Antibodies raised against PTHrP and their peptide fragments are still further
It is useful as an immunohistochemical diagnostic and produces PTHrP in various tissues.
Useful for immunolocalisation of the cells that can be obtained.   Antibody reagents for diagnostic purposes comprise a detectable marker, for example; rhodamine,
Fluorescein, colloidal gold, horseradish peroxidase, β-galactos
ASE, urease, alkaline phosphatase, phycobiliprotein (phy
cobiliproteins), luciferase, ferritin,¹²⁵I,³²P,^ThreeH or¹⁴In C
May comprise an appropriately labeled antibody directed against PTHrP
.   The present inventors have prepared antibodies against a synthetic peptide of PTHrP. These antibodies Can be determined by, for example, radiation immunoassay (50) or Western method (51).
It can be used to find rP or fragments thereof. In a test tube (in in vitro) Culture
Cell or in vivo (in vivoPTHrP produced by the tumor is directed against PTHrP
Detected using these antibodies or other antibody reagents.   According to a further aspect of the present invention, directed to PTHrP and fragments thereof
An antibody reagent is provided.   According to a further aspect of the invention, binding to an epitope of PTHrP is detected.
Key for detecting PTHrP or fragments thereof comprising one or more antibody reagents
Is provided.   The kit provided by the present invention may comprise, for example, a fluorescein as described above.
Directed against PTHrP labeled with in, radioactive, or protein labels
Antibodies. The kit may also include one or more labeled second or third antibodies.
It may contain body. In addition, the kit contains buffers for diluting the reagents, and
And various supports such as dishes or trays for performing the assays.
No. Antibodies directed against PTHrP or fragments thereof are lyophilized, and
That is, it may be in a powder state suitable for suspension in an appropriate aqueous solution. On the other hand,
The antibodies may be in an aqueous solution suitable for storage.   Furthermore, according to an embodiment of the present invention, an antibody reagent capable of binding to an epitope of PTHrP
Sample or the protein in the sample immobilized on the carrier with the reagent.
And then detecting the presence or absence of antibody binding,
Provides methods for detecting PTHrP or fragments thereof in protein-containing samples
Is done.   According to another aspect of the invention, an antibody capable of binding to an epitope of PTHrP is provided on a carrier.
When the bound and sample are sufficient to allow the antibody to bind
And then bind to PTHrP epitopes
A sample comprising detecting the presence or absence of PTHrP bound to an antibody reagent
A method is provided for detecting PTHrP or a fragment thereof in a nucleic acid.   Purification of PTHrP and determination of their N-terminal amino acid sequence is based on the amino acid sequence of PTHrP.
It will be possible to produce a synthetic oligonucleotide corresponding to the sequence. Next In addition, these oligonucleotides are used as hybridization probes.
Can be used, ie, to facilitate the isolation of the gene or genes encoding PTHrP. Ma
In addition, such oligonucleotides can be used as diagnostic reagents, and furthermore PTHrP
The expression of mRNA encoding PTHrP and the gene or genes encoding PTHrP
It can be used in studies of regulation of expression.   PTHrP produced by the human tumor line BEN exists in two forms and is identical.
One biological activity, but immunocross-reactivity, molecular weight and elution by HPLC
Can be identified based on behavior. Both of these forms of PTHrP are embodiments of the present invention.
Within the range.   Further according to an embodiment of the present invention, PTHrP is obtained from a culture in which BEN cells have been cultured.
It is. More specifically, one method for the purification of PTHrP comprises the following steps:   (A) culturing BEN cells in a medium;   (B) applying the culture to a cation exchange resin;   (C) elution fractionation from the cation exchange resin;   (D) assay the eluted fractions for PTHrP activity;   (E) Reversed-phase high-performance liquid chromatography of those fractions having PTHrP activity.
Run a HPLC (HPLC) and then isolate substantially pure PTHrP Comprising.   The present invention will now be described in more detail by way of example only with reference to the accompanying drawings.
You. And its contents are:   Fig. 1The absorbance at 215 nm and the biological
Shows the HPLC behavior of the activity; A 220 μg of the collected peak B substance from A Vydac HPLC₁₈Bay Carbond (Bak
erbond) column (25 × 0.46 cm). Elution at a rate of 0.66% per minute
Performed with a gradient of 0-60% acetonitrile / 0.1% TFA in
Was. Fractions were collected according to the protein peak observed at 215 nm. Ade
Nylate cyclase activity was assayed in 10 μl aliquots from each fraction.
The value was adjusted for the fraction volume. B The 6 μg hPTH (1-34) equivalent collected from Experiment A (fractions 51-55) was
0-68 at a rate of 0.33% per minute was reapplied to the column of experiment A.
Eluted with a gradient of% acetonitrile / 0.9% TFA.   Fig. 2Shows SDS polyacrylamide gels of fractions 31, 32 and 33 in FIG.
;   Fig. 3Is against bovine PTH (1-34) in intact UMR 106 cells.
Shown is a plot (●) of the biochemical activity of the assayed (○) fraction 31 of FIG. 1;   Fig. 4Is SP Sephadex column chromatography and two Bakers
Reversed phase HPLC column obtained after bond chromatography step (Bakerbond C18 wi
2 shows the HPLC behavior of purified PTHrP chromatographed with a de pore 25 × 0.46 cm). Insert
Shows SPSPAGE silver-stain gel behavior and molecular weight standards for fraction 47.   Fig. 5Shows the HPLC behavior of PTHrP (100 pMoles) after digestion with trypsin.
Trypsin digest, C8 Brownlee cartridge, 10cm × 2.1mm, flow rate 250μl
/ Min, and a gradient of 0-50% acetonitrile in 0.1% TFA (1% / min
) Was used and chromatographed.   Fig. 6Is a Brownlee C8 (2.1mm) microbore
4 shows the material collected from fractions 46 and 48 of FIG. 4 which were chromatographed on a ram. Insertion is
, Shows diode array detection of the main peak.Fig. 7Are various unlabeled peptides and I as tracers¹²⁵In la
Bell (Asn^Ten, Tyr¹⁷PTHrP (1-17) and synthetic PTHrP (1-17) peptides
1 shows a radioimmunoassay using a rabbit antiserum. Bound peptide / play
The released peptide was plotted against the amount of peptide / ml. A. The unlabeled peptide is: [Glu⁸, Asn^Ten, Cys¹¹PTHrP (1-11) (○
), HPTH (1-34) (■), rat calcitonin gene-related peptide (CGRP),
Adrenocorticotropic hormone and bovine insulin (all at 10 μg / ml, △)
It was calcitonin (10 μg / ml, ▲). B The unlabeled peptide is: [Glu⁸, Asn^Ten, Cys¹¹PTHrP (1-11) (○
), Rat PTH (1-34) (□), bovine PTH (1-34) (■), human PTH (1-34) (●), Rat CGR (10 μg / ml, △), salmon calcitonin (10 μg / ml, ▲).   Fig. 8Is the biology of the fraction from HPLC of SP-Sephadex partially purified PTHrP
1 shows a comparison between a typical assay and a radioimmunoassay.   Fig. 9Is: A Synthetic PTH for increased cyclic AMP production in UMR106-01 cells
Compare biological activity of rP (1-34) (●) with bovine PTH (1-34) (○) as standard
Shown. B¹²⁵Plasmino in UMR 106-01 cells cultured on I-fibrin
Effect of synthetic PTHrP (1-34) on gen activator activity (●) and bovine PTH
The effect (○) of (1-34) is shown. This assay is based on the method already described by Allan et al.
(52).   Fig. 10Shows one sample of peak A of Example 3 (A1 and A2, lane 2 and
And 3), highly purified bovine parathyroid hormone (lane 1), and highly purified bovine parathyroid hormone.
Western block of PTHrP (lane 4) derived from peak B of Example 3
2 shows the analysis. Samples were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose;
Probed with rabbit antiserum raised against PTHrP (1-16); washed and
Goat Anti-Rabbit IgG1¹²⁵Incubate with the I-labeled Fab fragment and
And made it into an autoradiograph. Molecular weight standards are indicated by horizontal lines.Definition :   “PTHrP” is measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis
Has a molecular weight of 15,000-25,000 daltons and is similar to parathyroid hormone
In an embodiment, the adenylate cycler in a suitable target cell (eg, a UMR 106-01 cell)
Active in malignant humoral hypercalcemia with activity stimulating zealase activity
Call Park.   As previously described, PTHrP purified from BEN cells is polymorphic and
It exists as two identifiable products with qualitatively identical biological activities.
One of these products contains a molecule between 15-18K as measured by SDS-PAGE.
And the N-terminal sequence is shown in Table 1. Another product is 18K-25K
It has a molecular weight between This second product is based on the PTHrP of the first product. Cross-reacts with the antiserum produced. Both products of PTHrP are included in embodiments of the present invention.
And encompassed by the term "PTHrP".   In addition, an allelic variant of PTHrP (Variants) having PTHrP activity was also developed.
Within the embodiments described above and also encompassed by the term "PTHrP". This
Variant such as deletion, substitution or addition of amino acid (s) to the PTHrP sequence
And these are shown in Table 1 (some). Shown in Table 1
The naturally occurring amino acids have been deleted and / or other amino acids
Or additional amino acids to the native sequence PTHrP
In such a case, the variant may be obtained by a conventional protein synthesis technique (41) or recombinant DNA
Can be prepared. Those variants having PTHrP activity are within the scope of the present invention.
And also encompassed by the term “PTHrP”.   "Substantially pure" when used in connection with PTHrP means that it is normally associated with PTHrP
PTHrP in the absence of any presenting proteinaceous or other contaminants.
Taste; generally gives rise to a single band on SDS-PAGE; and
Generally, about 95% to 100% by weight, usually about 97% by weight, of PTHrP. Departure
“PTHrP” according to the practice of Ming et al. Has a PTH-like activity as described in the prior art literature.
Can be distinguished from the crude, uncharacterized product of the substance. Prior art literature
Products (54 and 55) consist of a large number of proteins, the active factors of which are proteins and other
Is very small compared to the total amount of the substance. These products have a protein sequence
It was not suitable for analysis or preparation of antibodies specific for PTHrP.   The term “sub-unit” or “fragment” herein is specific to PTHrP.
Used to mean a portion of the PTHrP protein. Expected
As such, it specifically removes single amino acids. In general, no more than five
The amino acid peptide will not be specific.   "Epitope" is a PTHrP or fragment thereof capable of eliciting an immune response
Alternatively, it means any antigen site of the subunit.Abbreviation : HPLC high-performance liquid chromatography SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis PTH parathyroid hormone hPTH human parathyroid hormone PTHrP (1-11) Synthetic peptide of PTHrP corresponding to amino acids 1 to 11 in Table 1 PTHrP (1-16) PTHrP synthetic peptide corresponding to amino acids 1 to 16 in Table 1 PTHrP (1-17) Synthetic peptide of PTHrP corresponding to amino acids 1 to 17 in Table 1 PTHrP (1-34) Synthetic peptide of PTHrP corresponding to amino acids 1 to 34 in Table 2 CGRP rat calcitocin gene-related peptide TFA trifluoroacetic acidExample 1 Biological assays for PTHrP activity   Biological assays respond to PTH in response to osteoblast-like cells,
Of the amount-dependent production of cyclic AMP in various UMR 106-01 cell lines (20-40)
Use. The various ways in which the above assay can be performed are based on membrane homogenization of osteoblast-like cells.
Direct measurement of adenylate cyclase in citrate and intact cells
Includes an assay for cyclic AMP produced by the company. simply
To enable rapid assay of convenient and very large samples,
We replicate replica UMR 106-06 cells in 12-well plastic dishes
Proliferate as^ThreePre-incubation for 2 hours with H-adenine
Cell ATP pool^ThreeH, wash cells briefly,
Next, 1 mM isobutylmethylxanthine was used as a phosphodiesterase inhibitor.
The response was measured by the addition of an enzyme. Stop the reaction after 10 minutes and dowex
From the culture by continuous chromatography on^Three
H-cyclic AMP was purified. The cells are responsible for cyclic AMP production
With a dose-dependent increase, PTH and E-series prostaglandins (primarily
PGE_Two). This is a simple reproducibility of PTH or PTH-like activity.
Have been improved to biological assays (34,40). In this system, PTH (40)
PTH produced against synthetic PTH (1-34) (40)
Response to PTH by preincubating samples with
The answer was suppressed, but PGE_TwoThat was not the case. Example 2 PTHrP activity induced by BEN cells   BEN cell culture was directly assayed using the biological assay described in Example 1.
When performed, it demonstrates the ability to stimulate cyclic AMP production. Activity is medium
In serial dilutions, often of the order of 1: 100. Of crude culture
The dilution stimulates activity in parallel with that induced by PTH; goat anti-human PTH (
Pre-incubation of the medium with
Although it has no effect, the same antiserum completes the activity of hPTH (1-34) itself (40).
Completely inactivated. Synthetic peptide, [³⁴Tyr] hPTH (3-34) amide and [³⁴Tyr]
hPTH (5-34) amide can be used for the PTHrP and hPTH (1-34) in the above UMR106-01 cells.
Suppress each of the cyclic AMP responses to
PGE in the vesicle_TwoIt has no effect on the response to (40).   Incubation of BEN cell culture medium with trypsin is responsible for the biological activity of PTHrP.
Gender loss, consistent with being a protein. It is 100 for 2 minutes
It has moderate thermal stability because it can withstand the temperature of ° C. On Biogel P60 in 0.1 M acetic acid
Filtration of the gel in the serum-free BEN cell conditioned medium
Say showed that the activity was based on a macromolecule of about 40,000 molecular weight. this is
Possibly, while in the crude stage, the active substance is associated with other proteins
It was later found that this was due to overcalculation.   The PTH radioimmunoassay has a number of different antisera, specifically the carboxy terminus
Two for the molecule, one for the middle of the molecule, and one for the amino terminus.
It was carried out. In all cases, immunoreactive PTH was detected in BEN cell cultures.
Did not. BEN cells are grown to confluence, washed to remove serum, and
And serum-free medium (50% Dulbeco's Modified Eagles' Medium, 50% Medium 199)
Incubation for 24 hours in a substantial amount of PTHrP activity (1/100
(Detectable up to dilution). Obedience
Therefore, it is used as a standard method for accumulating media containing large amounts of active substance,
The medium was then stored at -20 ° C until purification began.Example 3 Purification of PTHrP from BEN cell culture   BEN cell culture (24 hours, serum-free incubation) accumulates and UM
In the R106-01 cyclic AMP response assay, human PTH (1-34)
PTHrP activity was measured by a biological assay against. Accumulated culture
Batches-5 l- once acidified to pH 4.8 with 1 M acetic acid, followed by SP Sephadex
Poured over a column (35 ml volume). The column is 0.1M sodium acetate pH 4.8.
After sufficient washing with the₂₈₀While measuring the presence of
Add 250 ml each of 0.1, 0.2 and 0.3 M NaCl and 500 ml 0.5 M NaCl.
Thus, batch elution of the protein was performed. Biological activity on individual columns
A 100 μl sample of the test tube is assayed and the bioactive bulk (bu
lk) was obtained by collecting 0.5M NaCl fractions. Biological activity at this stage
Recovery is 90-100% and a 10-fold purification is achieved. It is an essential spirit
It serves as a useful enrichment method rather than a production means.   Active substances accumulated from such 51 steps are referred to as SP1, SP2, etc.
The active pool (0.5 M NaCl) was acidified with TFA to a concentration of 0.1%, and
Poured over a reversed phase HPLC (RP 300) column, and 0.66%
The active substance was eluted using nitrile gradient. Eluate of RP 300 column
Individual column fractions (10 μl per ml fraction) were bioassayed and
And processed by a rotary evaporator. The recovery rate at this stage is 60%
is there. Six such SP pools were combined for the next step of purification. Ie
, Which corresponds to 30 l of culture.   The protein was evaluated by the Bradford method using BSA as a standard.
thod) (56), and the material is divided into 2 mg portions of HPLC Vydac C18 color.
(10 μ, 2.54 × 22 cm) and 0.5%
It is eluted with nitrile gradient. The bioactive column from the Vydac column
Two peaks, peak A at 32% acetonitrile and 37%
Peak B is successfully obtained. Peak B is more contaminated with other proteins than Peak A.
Less dyeing and mechanically selected for subsequent purification. Total recovery of activity
Is 30%. Peak A: Peak B ratios range from 2: 1 to 0.5: 1 between batches. To change.   Peak B material was collected and wide pore (300 mm) Bakerbond C18 reversed phase color
And eluted further with acetonitrile gradient (No.
1A). The absorption at 215 nm is monitored. Individual column fractions
And the fraction with the highest activity (fractions 50-55) is collected. The activity
Substances were analyzed by reverse phase HPLC using modified elution conditions as shown in FIG. 1B.
[0.33% shallower acetonitrile per minute
Gragent]. The area of the fine parallel lines in FIG. 1 represents the biological assay data.
Shown as μg equivalents of human PTH (1-34), and column fractions of tube numbers 28-38
Minutes are shown. The biological activity peak is observed in fraction 31, which shows four approximate
Corresponding to one of the protein peaks at Amino acid sequencing of the content of fraction 31
And used for SDS-PAGE analysis. First this thing
Quality sequencing identified amino acids 1-24 in Table 1.   The above peak fraction was analyzed for protein bands by silver-staining.
A portion of the gel used to run was analyzed by SDS-PAGE. the above
The rest of the gel is sliced, stripped, and analyzed for bioactivity.
The active substance was eluted from the slice.   Use 20% of fraction 31 on a 17% polyacrylamide gel (about 6 pMoles, or 120
ng) silver stain consistent with a molecular weight of 18-19K as determined by molecular weight standards
This results in a major band of material (FIG. 2). Two obscure bands at 35K and 67K
Was observed. These may be dimers and trimers of PTHrP. Test again
Elution when the gel was sliced into 3 mm wide sections and eluted with 0.1% SDS
Activity was observed only in a single band corresponding to the silver staining peak at 18-19K
(FIG. 3). The amount applied to the gel was determined by the biological assay as 1 hPTH (1-34).
It was equivalent to .4 μg. Although protein quantification was not performed directly,
Calculated from column data.   The specific activity of the pure substance used for sequencing was per μg PTHrP protein.
It was estimated to be equivalent to 6 μg of bovine PTH (1-34) (FIG. 3).   In a separate purification batch, the biologically active material recovered from HPLC step B (Figure 1 , Fractions 31-32) are combined and acetonitrile at a rate of 0.33% per minute.
Rechromatize on a wide pore (300Å) Bakerbond C18 reverse phase column with Largegent
Was processed. A single sharply defined peak, as seen in FIG.
The peak 47 contains a protein having a molecular weight of 18K-19K. In this fraction, SDS-
No other contaminating proteins as detected by PAGE were detected. This thing
The quality is bioactive according to the assay shown in Example 1 and the biosystem
Applied Biosystems Gas Phase Mi
crosequencer) for amino acid sequencing. Distribution of this substance
Sequence determination identified 41 amino acids as shown in the following example.Example 4 Partial sequencing of PTHrP   Purified PTHrP prepared according to Example 3 was subjected to a series of Edman degradations and
And analyzed using an Applied Biosystems gas phase sequentator (57). Array
The decision was made three times and the results obtained are shown in Table 1. N-terminal sequence of purified PTHrP
The analysis identifies 41 amino acids. The amino acid sequence of PTHrP is
It was extended to 50 residues using a syn-cleavage fragment. The amino acids in Table 1 are letter
It is specified using a letter (letter code) (58).   Tryptic digestion of purified PTHrP is achieved by 75 μg of PTH-like bioactive (compared to a synthetic PTH standard).
In contrast, a preparation of PTHrP is assayed by the UMR-106 cell biological assay.
The PTH-like bioactive is determined by adding trypsin (1:
10 W / W). This trypsin digest
Was separated into 18 peaks by HPLC (FIG. 5). Several peaks in these peaks
The amino acid sequence was determined and the sequence contained in peak 7 begins at residue 38.
PTHrP NH_Two-Found to overlap with the terminal sequence. This peptide is the PTHrP
The amino acid sequence was extended to residue 50.   The first 24 amino acids of PTHrP are converted to NBRF using a computer program.
It was compared to the protein sequence in the database (59). 45-80% overlapping sequence phase
Substantial homogeneity with the first 24 amino acids of human and rat PTH with homosexuality
Was revealed. Structural identity is particularly significant with the first 13 amino acids of human PTH. Shown, and much less thereafter. The first 10 amino acids of PTH
The containing sequence is a very weak immunogen, and in fact this is the real sequence,
And can be predicted from computerized prediction methods. PTHrP sequence in a similar way
When analyzed, proves to be appreciably more immunogenic than PTH
Was. Example 5 Amino acid analysis of purified PTHrP   Highly purified samples of PTHrP (46-48 tubes from column elution in FIG. 4;
A total of 7 μg of PTH-like bioactive) was added to a Brownlee C8 column as shown in FIG.
(2.1 mm). Diode ar
ray) detection (inset in Fig. 6) shows contamination of aromatic amino acid contents at the peak shoulder
did. The center of the main peak is hydrolyzed at 110 ° C for 25 hours, and Beckman 63
It was analyzed on a 00 amino acid analyzer (Beckman 6300 Amino Acid Analyzer). The result
The results are shown in Table 2. The amount analyzed was 20 pmoles, and 8.8 μg of bovine PTH (
1-34) was found to be equivalent in biological activity. Specific activity of this purified preparation
Gender was shown to be about 20 times greater than that of PTH. The above amino acid analysis was performed using PTHrP
Contains 154 amino acids. Example 6 PTHrP peptide synthesis and preparation of antisera to these peptides   Synthetic peptide corresponding to the amino terminal sequence of PTHrP was obtained from Applied Biosystems Mod
synthesized by the Merrifield method (41) using an el 430A automated peptide synthesizer.
Was. The synthetic peptide is cleaved from the carrier resin using anhydrous HF (42) and 60% acetonitrile
Extracted with tolyl and 0.1% trifluoroacetic acid, rotary evaporated
After further lyophilization, a gradient of 0-60% acetonitrile (total volume)
Low-pressure reversed-phase column (2.5 x 30 cm, Amicon C)₁₈Reverse phase, 15-17μ 250A
 Chromatographic treatment with a pore size). The purified peptide was lyophilized. Pe
Amino acid analysis was used to confirm the composition of the peptide. Carboxy-terminal cis
By a synthetic peptide conjugated to soybean trypsin inhibitor via tein
, The rabbit was immunized.   Based on the sequence information in Table 1, the following peptide analogs were synthesized:   Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Glu-His-Asn-Cys ((Glu⁸, Asn^Ten, Cys¹¹] PTHr
P (1-11), Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asn-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-G
ln ((Asn^Ten] PTHrP (1-16)), [Asn^Ten, Tyr¹⁷] PTHrP (1-17) and PTHrP (1
−34). The analogous compound (Glu⁸, Asn^Ten, Cys¹¹] PTHrP (1-11) and [Asn^TenPTHrP (
1-16) is inactive in the adenylate cyclase assay and
It did not antagonize the activity of conditioned media from itself or from BEN cells. Soybean trypsin
Glue conjugated to the inhibitor⁸, Asn^Ten, Cys¹¹PTHrP (1-11) is a rabbit
Used to immunize, and an antiserum is prepared, which is
Used in the assay. Also, [Asn^TenThe antiserum against PTHrP (1-16) is similar
Rabbit occurred in a manner.Example 7 Assays using antisera directed against PTHrP   Radioimmunoassay is an immunoassay that uses I as a tracer for radioimmunoassay.
¹²⁵Labeling (Asn^Ten, Tyr¹⁷Performed with PTHrP (1-17) and
G antiserum was prepared according to Example 5 as a 1/1000 final dilution. First b
Incubation was performed using 0.05M sodium phosphate containing 0.1% bovine serum albumin.
Performed overnight at 4 ° C. in buffer (pH 7.5). Binding peptide from free peptide
Was achieved using a solid phase secondary antibody (Sac Cell-Wellcome, Australia)
. Iodination of synthetic peptides is as previously described for calcitonin.
(44) was performed to achieve a specific activity of about 150 μCi / μg.   As shown in FIG. 7A, the assay described above combined PTHrP (1-10) and (1-16).
And so on. The cross-reactivity of hPTH (1-10) and hPTH (1-34) was 0
.5 and 0.3%. Rat PTH (1-34), bovine PTH (1-34) and human PTH (1-34)
The cross-reactivity of -34) was 7%, 5% and 0.4%, respectively (FIG. 7B).
PTHrP is an immunoaffinity antibody that uses an antibody that can bind to an epitope on PTHrP.
Purification can be performed by affinity chromatography. In this technology,
 An antibody capable of binding to PTHrP is attached to a carrier matrix. PTHrP included
The material is used if the carrier matrix is in a chromatography column. The matrix, if used batchwise as an alternative
Mixed with. Any PTHrP present in the material will bind to the matrix
, And it can be washed to remove any contaminants. afterwards
Purified PTHrP uses conditions that cleave antibody binding, such as high or low pH conditions.
Can be eluted from the matrix. Similar technology can bind to PTHrP
It can be used to purify antibodies. In this regard, the steps performed are PTHrP
Same as that outlined above, except that it is attached to a carrier matrix
.   FIG. 8 shows the HPLC fraction of partially purified PTHrP (ie, SP-Sephadex).
  2 shows the results of a radioimmunoassay for chromatographic eluates).   Partially purified PTHrP (equivalent to 35 μg hPTH)₁₈Reverse phase monitoring (guard)
The chromatographic treatment was carried out using a medium (RP 300, 7 μ 0.3 × 4.0 cm). Elution is more than 90 minutes 1ml
/ Min at a flow rate of 0-60% acetonitrile / 0.1% TEA
It was implemented. Biological assays represent open circles (○) and closed circles (●)
As a radioimmunoassay. FIG. 8 shows biological activity and immunology.
2 shows simultaneous elution of specific activity.   PTHrP (1-34) peptide is responsible for the cyclic AMP response in UMR 106-01 cells.
And assayed against bovine PTH (1-34), and that equivalent capacity exists.
OK (Fig. 9A). Similarly, plasminogen activator in UMR 106-01 cells
It is also equivalent to bovine PTH (1-34) in its ability to increase
(FIG. 9B). This is the PTH response system we have reported, and
It is well characterized (52).Western Blot analysis   Protein from two samples of peak A of Example 3, peak B of Example 3
Highly purified PTHrP derived from sulphate and pure bovine parathyroid hormone
PAGE, transfer to nitrocellulose, 1 hour low detergent "Blot (B
lotto) ”and [Asn at 1: 200 dilution^Ten] For PTHrP (1-16)
(See Example 5) and incubated with goat anti-rabbit blood.
Qing's¹²⁵Incubate with Fab fragment labeled with I for 1 hour and then Radiograph processing (Figure 10).   As expected, lane 4, which contained highly purified PTHrP, shows the PTHrP content.
The 18 Kd band corresponding to the molecular weight is shown. On the other hand, the peak A derived from Example 3
Lanes 2 and 3 containing the protein show a band of about 22 Kd. This means that PTH
rP exists in at least two forms and both have the same biological capacity,
It strongly suggests differences in molecular weight and elution behavior on reverse phase HPLC. Pure
Bovine parathyroid hormone (lane 1) shows no band under these conditions.
I didn't.   Antibodies directed against PTHrP have the above proteins in biological samples
Can be used to detect whether or not to do so.   The biological sample is bound to a solid support, such as nitrocellulose or PVC.
And with an anti-PTHrP antibody. Antibody binding then becomes
Can be detected by using a detectable label, or
Would be detected by using a second labeled reagent specific for the body.
U. As the reagent, for example, protein A or an anti-Fab or anti-Fc antibody is used.
Can be used.   On the other hand, an anti-PTHrP antibody is used as a solid support such as a PVC plate
Could be combined. Then, the substance to be assayed is placed on the carrier.
Ink added for a time sufficient to allow it to bind to the antibody
And then unbound material is washed away. Then, the second la
A labeled PTHrP antibody may be added to the carrier to detect antibody binding.
U. If the second antibody is unlabeled, repeat to detect antibody binding
A labeled reagent will be added to the carrier. This can be easily anticipated
These means are that PTHrP binds at least two epitopes, one of which is bound to a solid support.
One that binds the second antibody, and another that binds the second antibody.
It is assumed that   Suitable detectable labels are¹²⁵I,³²P,^ThreeH,¹⁴C, biotin, avidin,
Protein A, colloidal gold or silver, urease, alkaline phosphata
Sesame, horseradish peroxidase or phycobiliprotein. Example 7 Genetic analysis   Because the PTHrP protein has substantial homology to PTH, it is a unique non-conflict
Whether it is encoded by the gene or a variant of the PTH gene itself
It seemed necessary to decide.   The experiment is³²Single copy PTH gene labeled with P and its 3 'flanking
(flanking region) using a specific probe (45). Northern
thern) Gel analysis is performed on human epithelial cells derived from BEN cells or surgically excised.
5 mg Poly A per track prepared from somatic adenoma⁺already opened using mRNA
Performed (46) as shown. Southern Gel Analysis, BEN
10 mg of restriction enzyme per track derived from cells or prepared from human leukocytes
It is a modification of the standard method (47) using digested genomic DNA. Human PTH pro
Is³²10 by P-nucleotide⁸Randomly increases to a specific activity of dpm / mg or more.
Lime (26). Hybridization and washing conditions are as disclosed.
(46).   Poly A⁺Northern gel analysis of messenger RNA revealed that BEN cells were parathyroid adenoma
No expression of PTH gene at detectable levels compared to tissue
(Not illustrated). Restriction enzymes derived from BEN cells or from human leukocytes
Southern gel analysis of digested genomic DNA reveals identical PTH-containing restriction fragments, e.g.
For example, 4.2 and 3.8 Kb EcoRI fragments were shown. Therefore, BEN is a non-expressing PTH gene
And the expression of PTHrP with the indicated protein sequence,
Contains both homologous genes encoding related genes.Example 8 PTHrP production by various tissues   PTHrP production does not appear to be restricted to tumor cells. To clarify this point
Experiments involving extracts of sheep fetus, ewe tissue and placenta were performed. Anti-PT
Perform assays after pre-incubation with H antiserum or PTH antagonist.
The inventors should attribute the biological activity to PTH or PTHrP alone
Or to be attributed to a mixture of the two.   Only 50% of fetal parathyroid glands in sheep can be explained by PTH and the rest can be attributed to PTHrP
It was found to contain potential biological activity. Some PTHrP (about 20
%) Was found in maternal parathyroid glands.   However, most notably, it was found to contain appreciable activity in the placenta.
And it can be completely described as PTHrP, and
It behaved on HPLC in the same manner as PTHrP from BEN cell culture. further
In addition, the amount of PTHrP that can be detected in the placenta depends on the amount of
It was not reduced in the placenta from sheep. This suggests that the placenta is an important source of PTHrP
Suggests that it can be a spring.   The present inventors purified PTHrP from urine of patients with malignant humoral hypercalcemia.
(Data not shown). Based on these results, the antibody reagent of the present invention can be used.
And the presence of PTHrP in serum, urine or other biological fluids can be detected. Therefore
The antibody reagent of the present invention has utility as a diagnostic agent in the identification of malignant tumors.   Other aspects of the invention, improvements thereto and modifications thereto, are described in the present specification.
It will be clear to the person skilled in the art from reading the book, and all such
Other aspects, modifications and variations of the invention are contemplated to be included within the aspects of the invention. References 1. Martin, T .; J. And Atkins, D. (1979) Essays in Med. Biochem. 4, 49-82. 2. Mundy, G .; R. and Martin, T .; J. (1982) Metabolism 31, 1274-1277. 3. Mundy, G .; R., Ibbotson, K. J., D'Suoza, S.M. M., Simpson, E .; L., Jacob
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Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．（ａ）下記特徴： （ｉ）Ｎ−末端アミノ酸配列：AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSE
； （ii）還元及び非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により測定される場合、18〜19キロダルトンの分子量；及び （iii）アデニル酸シクラーゼ応答アッセイにおいて測定される場合、mgタン
パク質当たりウシ副甲状腺ホルモンのアミノ酸１〜34から構成されるペプチドの
少なくとも約６mg等価の生物学的活性； を有する実質的に純粋な、かつ、 PTHrP生物活性を有する、ヒト PTHrP；並びに （ｂ）上記(ａ)(ｉ)Ｎ末端アミノ酸配列１〜34を含んで成るヒト PTHrP免疫原
性を有する PTHrPの断片； から成る群から選ばれた、ポリペプチド。 ２．請求項１に記載の PTHrPの精製方法であって、次の工程： （ａ）培地中で BEN細胞を培養し； （ｂ）上記培養物を陽イオン交換樹脂に適用し； （ｃ）上記陽イオン交換樹脂からの画分を溶離し、そして PTHrP活性についてそ
の画分をアッセイし；及び （ｄ）PTHrP活性を有するこれらの画分について逆相高性能クロマトグラフィー
（HPLC）を行い、そして引き続き実質的に純粋な PTHrPを単離する、 ことを含んで成る方法。 [Claims] 1. (A) The following features: (i) N-terminal amino acid sequence: AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSE
(Ii) molecular weight of 18-19 kilodaltons as measured by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions; and (iii) mg protein as measured in an adenylate cyclase response assay. at least about 6mg equivalent biological activity of the peptide consisting of amino acids 1 to 34 per bovine parathyroid hormone; substantially pure with, and has a PTHrP biological activity, human PTHrP; and (b) above (a) (i) a human PTHrP immunogen comprising the N-terminal amino acid sequence 1-34
A polypeptide selected from the group consisting of: a fragment of PTHrP having sexual activity . 2. 2. The method for purifying PTHrP according to claim 1 , comprising the following steps: (a) culturing BEN cells in a medium; (b) applying the culture to a cation exchange resin; The fractions from the ion exchange resin are eluted and the fractions are assayed for PTHrP activity; and (d) reverse phase high performance chromatography (HPLC) is performed on those fractions having PTHrP activity and Isolating pure PTHrP.