JP2597953B2 - Anticancer drug - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、医薬上有用なサイトカイン及び／又はレチ
ノイドとカルボスチリル誘導体とを配合した制癌剤に関
し、殊にヒト腫瘍壊死因子−αと下記一般式（１）で表
されるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩とを有効
成分として含有する制癌剤に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to an anticancer agent comprising a pharmaceutically useful cytokine and / or retinoid and a carbostyril derivative, and particularly relates to human tumor necrosis factor-α and a compound represented by the following general formula (1): A carbostyril derivative and / or a salt thereof as an active ingredient.

刺激を受けたリンパ球や単球、マクロファージが生物
学的な活性を有する様々な蛋白性因子を産生し、それら
を介して免疫系の応答の調節（開始→増殖→抑制→終
了）が修飾されることが次第に明らかとなり、之等生体
の免疫応答、炎症反応、造血反応等の生体機能の発現を
制御する蛋白生因子をサイトカインと総称するようにな
ってきた［Balkwill,F.R.,et al.,Immunol.Today,10,29
9（1989）］。更に、之等サイトカインの作用は免疫系
に限らず、生体の様々な機能に影響を及ぼし、生体の発
生、分化、恒常性維持や病体生理とも関連深いことが明
らかにされ、多数のサイトカインが見出されている。現
在、該サイトカインはその作用の類似性を基に、幾つか
のグループ、例えばインターフェロン（IFN）、インタ
ーロイキン（IL）、コロニー刺激因子（CSF）、腫瘍壊
死因子（TNF）、腫瘍増殖因子（TGF）等に分けられてお
り、之等各グループ内のサイトカインもそれらの持つ作
用により更に細分されている。之等サイトカイン中に
は、共通した作用を示すものが少なくなく、例えばIL−
１、IL−２、IFN、TNF等はいずれも発熱性や抗腫瘍活性
があるとされている。Stimulated lymphocytes, monocytes, and macrophages produce various proteinaceous factors with biological activity, through which the regulation of the immune system response (initiation → proliferation → suppression → end) is modified. It has become increasingly clear that protein factors that control the expression of biological functions such as immune response, inflammatory response, and hematopoietic response in living organisms have been collectively referred to as cytokines [Balkwill, FR, et al., Immunol. Today, 10 , 29
9 (1989)]. Furthermore, it has been revealed that the effects of these cytokines are not limited to the immune system and affect various functions of the living body, and are closely related to the development, differentiation, homeostasis and pathophysiology of the living body. Has been issued. At present, the cytokines are based on similarities in their actions, based on similarities in several groups, such as interferon (IFN), interleukin (IL), colony stimulating factor (CSF), tumor necrosis factor (TNF), tumor growth factor (TGF ), Etc., and the cytokines in each group are further subdivided by their actions. Many of these cytokines have a common effect, such as IL-
1, IL-2, IFN, TNF, etc. are all said to have pyrogenicity and antitumor activity.

之等の内でIL−４は、Ｔ細胞、NK細胞、単球・マクロ
ファージ等に作用し、IL−５、IL−６、IL−７はいずれ
も実験腫瘍系で特異的キラーＴ細胞を誘導するとされて
いる［臨床医，17（10）５（1991）］。尚、ILは、現在
IL−１〜IL−12まで知られており、その多くが糖鎖を有
し、細胞の増殖、活性化、分化誘導作用を有している。Among them, IL-4 acts on T cells, NK cells, monocytes / macrophages, etc., and IL-5, IL-6 and IL-7 all induce specific killer T cells in experimental tumor lines. [Clinician, 17 (10) 5 (1991)]. IL is currently
IL-1 to IL-12 are known, many of which have sugar chains and have cell growth, activation and differentiation inducing effects.

TNF（Tumor Necrosis Factor）は、1975年に米国のカ
ーズウェルら［Carswell,E.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.,U.S.A.,72,3666（1975）］により、予めBCGで感染
させ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血清中
より、移植したMeth A肉腫による癌を壊死させる生理活
性蛋白質として発見された。該TNFは、正常細胞を傷害
せず、癌細胞を選択的に殺傷する物質として抗腫瘍剤と
して期待された。またこれは上記抗腫瘍作用のみなら
ず、免疫・神経生理等多岐に渡る作用を有することが報
告されている。例えば、脂肪球のリポプロテインリパー
ゼ（LPL）活性を阻害して、血中トリグリセリドを高
め、これがカケクチン作用としてよく知られている［Be
utler,B.,et al.,Nature,316,552−554（1985）］。そ
の他、線維芽細胞に対する増殖作用［Peetre,C.,et a
l.,J.Clin.Invest.,78,1694−1700（1986）］や、IL−
１［Kurt−Jones,E.A.,et al.,J.Immunol.,139,2317−2
324（1987）］、IL−６［Kohase.M.,et al.,Cell,45,65
9−666（1986）］、CSF［Broudy,V.C.,et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.,U.S.A.,83,7467−7471（1986）］、コラゲ
ナーゼ、プロスタグランディン［Dayer,J,M.,et al.,J.
Exp.Med.,162,2163−2168（1985）］等の産生刺激、血
管内皮細胞におけるHLA抗原の発現促進［Collins,T.,et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,83,446−450（198
5）］、プロテオグリカンの合成抑制と吸収活性［Sakla
tvala,J.,et al.,Nature,322,547−549（1986）］等の
作用を有することが明らかにされている。TNF (Tumor Necrosis Factor) was obtained in 1975 by Carswell et al. [Carswell, EA, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 72 , 3666 (1975)], found in serum of mice previously infected with BCG and then treated with endotoxin as a bioactive protein that kills cancer caused by transplanted Meth A sarcoma. The TNF is expected as an antitumor agent as a substance that does not damage normal cells and selectively kills cancer cells. It has been reported that this has not only the above-mentioned antitumor effect but also a wide variety of effects such as immunology and neurophysiology. For example, it inhibits the lipoprotein lipase (LPL) activity of fat globules and raises blood triglycerides, which is well known as cachectin action [Be
utler, B., et al., Nature, 316 , 552-554 (1985)]. In addition, proliferation effects on fibroblasts [Peetre, C., et a
l., J. Clin. Invest., 78 , 1964-1700 (1986)] and IL-
1 [Kurt-Jones, EA, et al., J. Immunol., 139 , 2317-2
324 (1987)], IL-6 [Kohase. M., et al., Cell, 45 , 65].
9-666 (1986)], CSF [Broudy, VC, et al., Proc.
Acad. Sci., USA, 83 , 7467-7471 (1986)], collagenase, prostaglandin [Dayer, J, M., et al., J.
Exp. Med., 162 , 2163-2168 (1985)] and the promotion of HLA antigen expression on vascular endothelial cells [Collins, T., et al.
al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 , 446-450 (198
5)], inhibition of proteoglycan synthesis and absorption activity [Sakla
tvala, J., et al., Nature, 322 , 547-549 (1986)].

一方、LT（リンホトキシン;Lymphotoxin）は、リンパ
球による細胞障害作用のメディエーターとして発現され
たが、TNFと分子構造が類似し、その作用もよく似てい
ることが判り、TNF−β（TNFをTNF−αと呼ぶ）と呼ば
れるようになった。該LTはヒトＴ細胞ハイブリドーマよ
り遺伝子組換え法により作製する方法が知られている
［特開昭64−6298号、特開昭63−8398号、特開昭63−83
99号、特開昭62−151182号公報等参照］。On the other hand, LT (Lymphotoxin) was expressed as a mediator of cytotoxic action by lymphocytes, but it was found that TNF-β (TNF-TNF) -Α). It is known that the LT can be prepared from a human T cell hybridoma by a gene recombination method [Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 64-6298, 63-8398, 63-83].
No. 99, JP-A-62-151182, etc.].

TNF（TNF−α）は、アミノ酸157個からなる分子量約1
7000のポリペプチドであり、その遺伝子はシライらの方
法、即ち動物（家兎）の血中からTNF蛋白を抽出し、そ
の一次構造を決めた上で、対応するcDNAを正常ヒト細胞
遺伝子ライブラリーから選出する方法によりクローニン
グされた［Shirai,T.,et al.,Nature,313,803−806（19
85）］。TNFcDNAとクローニングは、種々の方法が知ら
れている［宗村庚修ほか、癌と化学療法，12（１）160
−162（1985）；特開昭60−185799号公報；特開昭60−2
32097号公報等参照］。更に他の方法として、ヒト単球
由来白血病細胞株（HL60,U937）の培養上清からTNF蛋白
を抽出し、その一次構造に基きDNAプローブを作製し、
同プローブから得たcDNAを選ぶ方法等［Pennica,D.,et
al.,Nature,312,724−729（1984）;Wang,A.W.,et al.,S
cience,228,149−154（1985）;Marmenout,A.,et al.,Eu
r,J.,Biochem.,152,515−522（1986）］も知られてい
る。また、遺伝子組換え技術によるヒトTNF変異体の製
造については、特開昭61−294000号公報及び特開昭63−
119692号公報に記載されている。TNF (TNF-α) has a molecular weight of about 1 consisting of 157 amino acids.
7000 polypeptides, the gene of which is obtained by the method of Shirai et al., Ie, extracting TNF protein from the blood of an animal (rabbit), determining its primary structure, and converting the corresponding cDNA to a normal human cell gene library. [Shirai, T., et al., Nature, 313 , 803-806 (19)
85)]. Various methods are known for TNF cDNA and cloning [Kosune Munemura et al., Cancer and Chemotherapy, 12 (1) 160
-162 (1985); JP-A-60-185799; JP-A-60-2
32097 publication etc.]. As still another method, TNF protein is extracted from the culture supernatant of a human monocyte-derived leukemia cell line (HL60, U937), and a DNA probe is prepared based on the primary structure thereof.
Methods for selecting cDNA obtained from the probe [Pennica, D., et.
al., Nature, 312 , 724-729 (1984); Wang, AW, et al., S.
cience, 228 , 149-154 (1985); Marmenout, A., et al., Eu
r, J., Biochem., 152 , 515-522 (1986)]. Production of human TNF variants by genetic recombination techniques is described in JP-A-61-294000 and JP-A-63-294000.
No. 119692.

上記遺伝子組換え法により、TNFの大量生産が可能と
なり、悪性腫瘍に対して臨床試験が行なわれたが、その
効果よりも多くの副作用、主として悪寒、戦慄、発熱、
血圧低下、血小板減少、肝機能障害等が問題となり、中
でも血圧低下がMTD（maximal torelance dose）を規定
する因子となった（ヒトTNF50万単位,0.25mg）。また、
効果の点でも動物実験で見られたような著効例は少な
く、全身投与では５％程度の反応例が認められるにすぎ
なかった［田口鐵男，癌と化学療法，13,3491−3497（1
986）;Blick,M.,et al.,Cancer Res.,47,2986−2989（1
987）］。之等は当初報告された副作用の影響で、投与
量が抗腫瘍効果の期待できる量をはるかに下回っている
ことが原因とされている。The above-mentioned gene recombination method enables mass production of TNF, and clinical trials have been conducted on malignant tumors, but more side effects than its effects, mainly chills, shivering, fever,
Blood pressure reduction, platelet reduction, liver dysfunction, etc. became problems, and among them, blood pressure reduction was a factor defining MTD (maximum torelance dose) (human TNF 500,000 units, 0.25 mg). Also,
In terms of efficacy, there were few remarkable cases as seen in animal experiments, and only about 5% of responders were observed with systemic administration [Tetsuo Taguchi, Cancer and Chemotherapy, 13 , 3491-3497 (1
986); Blick, M., et al., Cancer Res., 47 , 2986-2989 (1
987)]. These were attributed to the originally reported side effects, which were attributed to the fact that the dose was far below the expected antitumor effect.

TGF−β［腫瘍化増殖因子−β（transforming growth
factor−β）］は、細胞の悪性形質転換を起こす因子
として精製され、分子量12.5kdの２本の相同ペプチドが
ジスルフィド結合により架橋された、分子量25kdの蛋白
質である。該TGF−βは、また391個のアミノ酸からなる
前駆体蛋白質中の112個のアミノ酸からなるＣ末端ペプ
チドが、プロテアーゼによって切断されて生じたもので
あると報告されている［Derynck,R.,et al.,Nature,31
6,701（1985）］。最近、cDNAの解析からTGF−βには、
５つのサブタイプが存在することが明らかにされた［Ki
m,S.−J.,Experimental Medicine,７,55（1989）］。上
記TGF−βは、その後の研究により正常細胞にも存在
し、これが多くの細胞種において増殖阻害活性をもつこ
とが明らかにされ、該TGF−βは生体において広く増殖
や分化の制御因子として働いていると考えられるように
なってきた［Massague,J.,Annu.Rev.Cell Biol.,６,597
−641（1990）］。その製造方法としては、ヒト胎盤か
ら単離したcDNAに基づきTGF−βの構造を決定し、これ
よりCHO細胞を用いて組換えヒトTGF−βを製造する方法
が知られている（米国特許第4886747号公報、特開昭61
−219395号公報等参照）。TGF-β [transforming growth factor-β
factor-β)] is a protein having a molecular weight of 25 kd, which is purified as a factor causing malignant transformation of cells and is obtained by cross-linking two homologous peptides having a molecular weight of 12.5 kd by disulfide bonds. The TGF-β has also been reported to be generated by cleavage of a C-terminal peptide consisting of 112 amino acids in a precursor protein consisting of 391 amino acids by a protease [Derynck, R., et al. et al., Nature, 31
6 , 701 (1985)]. Recently, from the analysis of cDNA, TGF-β
It was revealed that five subtypes exist [Ki
m, S.-J., Experimental Medicine, 7 , 55 (1989)]. The above-mentioned TGF-β is also present in normal cells in subsequent studies, and it has been revealed that it has a growth inhibitory activity in many cell types, and this TGF-β acts widely as a regulator of growth and differentiation in living organisms. [Massague, J., Annu. Rev. Cell Biol., 6 , 597]
−641 (1990)]. As a method for producing the same, a method is known in which the structure of TGF-β is determined based on cDNA isolated from human placenta, and recombinant human TGF-β is produced therefrom using CHO cells (US Patent No. No. 4886747, Japanese Patent Laid-Open No. 61
-219395, etc.).

IFN（Interferon）は、ウイルス等の刺激を受けた細
胞がつくりだす抗ウイルス物質として発見された［Naga
no,Y.,et al.,C.R.Soc.Biol.,148,1700（1954）;Isaac
s,A.,et al.,Proc.Roy.Soc.B.,147,258（1957）］。IFN (Interferon) was discovered as an antiviral substance produced by cells stimulated by viruses etc. [Naga
no, Y., et al., CRSoc. Biol., 148 , 1700 (1954); Isaac
s, A., et al., Proc. Roy. Soc. B., 147 , 258 (1957)].

ヒトIFNには、α、β及びγ型の３つのタイプが知ら
れ、α型はセンダイウィルス誘発白血球を産生細胞とし
て得られ、分子量が約15000〜21000で166個のアミノ酸
からなっている。β型は２本鎖RNA誘発線維芽細胞を産
生細胞とし、分子量が22000の166個のアミノ酸からな
り、アミノ酸配列は上記α型と約30％一致しており、そ
のIFNレセプターもα型と共通である。γ型はマイトジ
ェン誘発Ｔ細胞が主たる産生細胞で、分子量が20000及
び25000の146個のアミノ酸からなり、そのアミノ酸配列
は前記α型、β型と全く異なり、IFNレセプターも異な
っている。当初IFNの作用は動物種特異性があり、ヒト
細胞の大量培養化も困難であったが、1980年代に入り、
ヒト細胞の大量培養技術が確率されたことにより、ヒト
α型及びβ型IFNの細胞培養法による量産も成功した。
その後遺伝子組換え技術を用いた組換え型ヒトIFNの量
産が可能となり、臨床応用化が実現した。天然型のα型
ヒトIFNの量産法としては、ヒト急性白血病細胞株中か
ら、ウイルス誘発による高力価のα型IFN産生細胞を用
いる方法が、特開昭54−98307号、特開昭55−47629号、
特開昭55−62024号公報等に記載されている。ヒトβ型I
FNの遺伝子組換え技術を用いた製造法は、欧州公開特許
出願81−28033号、欧州公開特許出願81−321134号、欧
州公開特許出願81−34307号、ベルギー特許81−837397
号等に詳述されている。ヒトγ型IFNの製造法は、グレ
イらが大腸菌及びCOS細胞に導入して発現させる方法を
報告している［Gray,P.W.,et al.Nature,295,503−508
（1982）］。また特開昭55−98118号及び特開昭61−263
929号公報には、天然型γ−IFNの製造法が記載されてい
る。Three types of human IFN are known, α, β, and γ types. The α type is obtained as a cell producing Sendai virus-induced leukocytes, and has a molecular weight of about 15,000 to 21,000 and consists of 166 amino acids. The β-type is a producer cell of double-stranded RNA-induced fibroblasts and consists of 166 amino acids with a molecular weight of 22000. The amino acid sequence is approximately 30% identical to the α-type, and its IFN receptor is also common to the α-type. It is. The γ-type is a cell producing mainly mitogen-induced T cells and is composed of 146 amino acids having a molecular weight of 20,000 and 25,000, and its amino acid sequence is completely different from the α-type and β-type, and the IFN receptor is also different. Initially, the action of IFN was species-specific, and mass culture of human cells was difficult, but in the 1980s,
The mass production of human α-type and β-type IFN by the cell culture method was also successful due to the establishment of mass culture technology for human cells.
After that, mass production of recombinant human IFN using gene recombination technology became possible, and clinical application was realized. As a method for mass-producing natural α-type human IFN, a method using virus-induced high titer α-type IFN-producing cells from human acute leukemia cell lines is disclosed in JP-A-54-98307 and JP-A-55-98307. -47629,
It is described in JP-A-55-62024. Human beta type I
The production method using FN gene recombination technology is disclosed in European Patent Application No. 81-28033, European Patent Application No. 81-321134, European Patent Application No. 81-34307, Belgian Patent 81-837397.
No., etc. As for a method for producing human γ-type IFN, Gray et al. Reported a method of introducing and expressing E. coli and COS cells [Gray, PW, et al. Nature, 295 , 503-508].
(1982)]. JP-A-55-98118 and JP-A-61-263
No. 929 describes a method for producing natural γ-IFN.

上記IFNは腎癌、多発性骨髄腫、脳腫瘍、メラノーマ
及び慢性Ｂ型肝炎等に対して臨床効果が認められ、その
有効率は当初の期待程ではないがいずれも約20％前後で
ある。γ型IFNはα型やβ型に比較して動物実験の抗腫
瘍活性が20〜100倍と強い［J.L.Crane,et al.,J.Natl.C
ancer Inst.,61,871（1987）;J.E.Blalock,et al.,Cell
Immunol.,49,390（1980）］ことから、その効果が期待
されたが、α型及びβ型と同等であった。副作用は各IF
N共多く、特に発熱、悪寒等のインフルエンザ様症状を
始め、肝機能障害、白血球の減少が現れ、該副作用によ
り、高用量の投与及び長期投与は困難とされている。The above IFN has a clinical effect on renal cancer, multiple myeloma, brain tumor, melanoma, chronic hepatitis B, etc., and the effective rate is not about the initial expectation, but all are about 20%. γ-type IFN has an antitumor activity in animal experiments of 20 to 100 times stronger than α-type and β-type [JLCrane, et al., J. Natl. C
ancer Inst., 61 , 871 (1987); JEBlalock, et al., Cell
Immunol., 49, 390 (1980)] that, although the effect was expected, it was equivalent to α-type and β-type. Side effects are each IF
Many N, especially influenza-like symptoms such as fever and chills, hepatic dysfunction, and a decrease in leukocytes appear. These side effects have made it difficult to administer high doses and long-term administration.

IL−１は、主に単球やマクロファージから産生される
蛋白性因子で分子量12000〜18000程度のポリペプチドで
ある。［S.B.Mizel,et al.,Immunol.Rev.,63,51−71（1
982）］。該IL−１は種々の細胞に働き、様々な生物活
性を示し、免疫、炎症、造血、内分泌、脳神経等の殆ど
全ての生体反応に重要な役割を果たしている。該IL−１
は、等電点によりpI5と７の２つに分けられ、前者はα
型、後者はβ型と呼ばれている［Oppenheim,J.J.,et a
l.,Immunol.Today,７,45（1986）:Dinarello,C.A.,Adv.
Immuno.,44,153（1988）］。アミノ酸配列は、同一型で
は動物種が違っても60〜70％と相同性が高いが、同一種
間でもα型とβ型では25％と相同性は低い。またIL−１
はα型、β型共細胞膜の同一レセプターに結合すると報
告されている［Lowenthal,K.,et al.,J.Exp.Med.,164,1
060（1986）］。更にIL−１は種々の腫瘍細胞に対して
直接的な増殖阻害、細胞致死活性を示し［Onozaki,K.,e
t al.,J.Immunol.,135,3962（1985）］、また抗腫瘍効
果を示すことも報告されている［Nakamura,S.,et al.,J
pn.J.Cancer Res.,77,767（1986）:North,R.J.,et al.,
J.Exp.Med.,168,2031（1988）］。IL−１の内で天然型I
L−１は特開昭62−174022号公報に記載の方法により得
ることができる。遺伝子組換えによるIL−１の製造は、
特開昭63−152398号、特開平２−167298号、欧州特許公
開第237073号、欧州特許公開第187991号公報等に記載さ
れている。IL-1 is a protein factor mainly produced from monocytes and macrophages, and is a polypeptide having a molecular weight of about 12,000 to 18,000. [SB Mizel, et al., Immunol. Rev., 63 , 51-71 (1
982)]. The IL-1 acts on various cells, exhibits various biological activities, and plays an important role in almost all biological reactions such as immunity, inflammation, hematopoiesis, endocrine and cranial nerves. The IL-1
Is divided into two, pI5 and 7, by the isoelectric point.
Type, the latter is called β type [Oppenheim, JJ, et a
l., Immunol. Today, 7 , 45 (1986): Dinarello, CA, Adv.
Immuno., 44 , 153 (1988)]. The amino acid sequence has a high homology of 60 to 70% in the same type even if the animal species is different, but has a low homology of 25% between α-type and β-type even in the same type. Also IL-1
Is reported to bind to the same receptor on α-type and β-type co-cell membranes [Lowenthal, K., et al., J. Exp. Med., 164 , 1
060 (1986)]. Furthermore, IL-1 shows direct growth inhibition and cell killing activity against various tumor cells [Onozaki, K., e
et al., J. Immunol., 135 , 3962 (1985)], and have also been reported to exhibit antitumor effects [Nakamura, S., et al., J.
pn. J. Cancer Res., 77 , 767 (1986): North, RJ, et al.,
J. Exp. Med., 168 , 2031 (1988)]. Natural I within IL-1
L-1 can be obtained by the method described in JP-A-62-174022. Production of IL-1 by genetic recombination
It is described in JP-A-63-152398, JP-A-2-167298, EP-A-237073, EP-A-187991 and the like.

IL−２は、1976年モルガン（Morgan）らによってレク
チン刺激された末梢血リンパ球培養上清中に存在するＴ
細胞増殖因子として発見された［Morgan,D.A.,et al.,S
cience,193,1007−1008（1976）］。該IL−２はＴ細胞
増殖活性以外にも、胸線細胞の***促進、細胞傷害性Ｔ
細胞の活性化、Ｂ細胞分化誘導、NK細胞活性化、LAK活
性誘導等の活性を持つ133個のアミノ酸からなる分子量1
5420の物質であることが明らかとなった［Taniguchi,
T.,et al.,Nature,302,305−310（1983）］。IL-2 is present in the peripheral blood lymphocyte culture supernatant stimulated by lectin by Morgan et al.
Discovered as a cell growth factor [Morgan, DA, et al., S
cience, 193 , 1007-1008 (1976)]. In addition to T cell proliferating activity, the IL-2 promotes mitotic stimulation of thymocytes, cytotoxic T
Molecular weight of 133 amino acids with activities such as cell activation, B cell differentiation induction, NK cell activation and LAK activity induction
5420 substance [Taniguchi,
T., et al., Nature, 302 , 305-310 (1983)].

天然型IL−２は、ヒト末梢血リンパ球又は他のIL−２
産生細胞ラインの培養により製造できる［米国特許4401
756号明細書参照］。また遺伝子組換え型IL−２は、特
開昭61−78799号公報に記載の方法により製造できる。
当初IL−２は、その抗腫瘍活性を期待して全身投与及び
局所投与されたが、発熱、全身倦怠感、血圧低下、好酸
球増多、血清ビルリビン値の上昇等の副作用に比較し
て、効果は期待した程ではなかった。Native IL-2 is derived from human peripheral blood lymphocytes or other IL-2.
It can be produced by culturing a production cell line [US Patent 4401
No. 756]. The recombinant IL-2 can be produced by the method described in JP-A-61-78799.
Initially, IL-2 was administered systemically and locally in anticipation of its antitumor activity, but compared to side effects such as fever, general malaise, decreased blood pressure, eosinophilia, and increased serum virribine level. The effect was not as good as expected.

IL−６は、Ｂ細胞を増殖せずに分化を誘導し、抗体の
産生を促進するサイトカインであり、Ｂ細胞分化因子、
Ｂ細胞刺激因子２と呼ばれ、1986年にそのcDNAがクロー
ニングされた［Hirano,T.,et al.,Nature,324,73（198
6）］。該IL−６は212個のアミノ酸からなる前駆体から
合成されるアミノ酸184個の蛋白質で分子量は21000であ
る。これはＢ細胞を始め、Ｔ細胞、マクロファージ、線
維芽細胞等の多くの細胞をマイトジェン、IL−１、TN
F、IFN−β、LPS等により刺激することにより産生され
る。その機能はＢ細胞の分化、Ｔ細胞の増殖・分化、キ
ラーＴ細胞の誘導、急性期蛋白の誘導、多能性幹細胞の
増殖、巨核球の分化等種々知られている［Hirano,T.,et
al.,治療学，24（１）49−52（1990）］。その製造法
としては遺伝子組換え法による大腸菌からの製造法が欧
州特許公開第351876号公報に記載されている。またＮ末
端がプロリンである天然型IL−６の遺伝子組換え法によ
る製造法が、特開平３−130088号公報に記載されてい
る。上記IL−６は自己免疫疾患との関連及び血小板増加
作用が注目され、また免疫賦活剤との併用による抗癌剤
としての開発も検討されている。IL-6 is a cytokine that induces differentiation without proliferating B cells and promotes the production of antibodies.
It is called B cell stimulating factor 2 and its cDNA was cloned in 1986 [Hirano, T., et al., Nature, 324 , 73 (198
6)]. The IL-6 is a protein of 184 amino acids synthesized from a precursor of 212 amino acids and has a molecular weight of 21,000. It converts many cells such as B cells, T cells, macrophages, fibroblasts, etc. into mitogen, IL-1, TN
It is produced by stimulating with F, IFN-β, LPS and the like. Its functions are known in various ways such as B cell differentiation, T cell proliferation / differentiation, induction of killer T cells, induction of acute phase protein, proliferation of pluripotent stem cells, megakaryocyte differentiation [Hirano, T., et al. et
al., Therapeutics, 24 (1) 49-52 (1990)]. As a production method thereof, a production method from Escherichia coli by a genetic recombination method is described in EP-A-351876. Also, a method for producing natural IL-6 having a proline at the N-terminus by a gene recombination method is described in JP-A-3-130088. The above-mentioned IL-6 has attracted attention for its association with autoimmune diseases and its effect on increasing platelets, and its development as an anticancer agent in combination with an immunostimulant has been studied.

IL−７は、1988年にナメン（Namen）らによりプレＢ
細胞の増殖支持能力を持つストローマ細胞が、増殖活性
を有する液性因子を産生することを見出し、その精製、
クローニングにより得られた［Namen,A.E.,et al.,Natu
re,333,571（1988）］。該IL−７は骨髄及び胸腺ストロ
ーマ細胞より産生され、72個のアミノ酸からなる分子量
8000の蛋白で、その機能としてはＢ前駆細胞の増殖・分
化、Ｔ細胞の増殖・分化、キラーＴ細胞の活性増強、LA
K細胞の誘導、単球の活性化等が報告されている。その
遺伝子組換え法による製造は米国特許第4965195号明細
書に記載されている。IL-7 was pre-B in 1988 by Namen et al.
Stromal cells having the ability to support the growth of cells have been found to produce humoral factors having proliferative activity, and their purification,
Obtained by cloning [Namen, AE, et al., Natu
re, 333 , 571 (1988)]. The IL-7 is produced from bone marrow and thymic stromal cells and has a molecular weight of 72 amino acids.
8000 proteins whose functions include proliferation and differentiation of precursor B cells, proliferation and differentiation of T cells, enhanced killer T cell activity, and LA
Induction of K cells, activation of monocytes, and the like have been reported. Its production by genetic recombination is described in US Pat. No. 4,965,195.

IL−４は、IL−６と同じく免疫系のＢ細胞を抗体産生
形質細胞に分化させる他、胸腺Ｔ細胞の分化増殖を刺激
し、肥満細胞の増殖作用をもつ因子として、ノーマ（No
ma）ら、リー（Lee）らによりほぼ同時にクローニング
されたアミノ酸153個、分子量15000〜19000のリンホカ
インである［Noma,Y.,et al.,Nature,319,640（1986）;
Lee,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,83,2061
（1986）］。該IL−４の製造法としてはCHO細胞を利用
して発現させる方法が米国特許第5034133号に記載され
ており、IL−４は感染症、癌及び自己免疫疾患への適応
が考えられている。IL-4, like IL-6, differentiates B cells of the immune system into antibody-producing plasma cells, stimulates the differentiation and proliferation of thymic T cells, and is a factor having the action of proliferating mast cells.
ma) et al., a lymphokine with 153 amino acids and a molecular weight of 15,000-19,000 cloned almost simultaneously by Lee et al. [Noma, Y., et al., Nature, 319 , 640 (1986);
Lee, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83 , 2061
(1986)]. As a method for producing IL-4, a method of expressing it using CHO cells is described in U.S. Patent No. 5034133, and IL-4 is considered to be applied to infectious diseases, cancer and autoimmune diseases. .

IL−５は、抗体を産生するリンパ球Ｂ細胞の増殖と分
化を誘導するサイトカイン（T cell−replacing facto
r:TRF）として固定され［Takatsu,K.,et al.,J.Immuno
l.,125,2646（1980）］、該TRFが活性化Ｂ細胞の増殖や
分化を促進させるのみならず、骨髄細より好酸球の増殖
分化を誘導すること等が明らかにされ［須田年生，臨床
免疫，21,521（1989）］、マウスIL−5cNDAをプローブ
にしてヒトIL−5cDNAが単離された［Azuma.C.,et al.,N
ucleic Acids Res.,14,9149（1989）］。該IL−５はア
ミノ酸115個からなり分子量が46000（23000の二量体）
のサイトカインであり、抗原（ウィルス、結核菌等の病
原微生物、アレルゲン等）により産生され、Ｂ細胞の増
殖・抗体産生細胞への分化、好酸球の増殖・分化、IL−
２レセプターの発現誘導、キラーＴ細胞の誘導補助等の
作用がある［高津聖志，治療学，24（１）45−48（199
0）］。その製造法としては、遺伝子組換え法によるCHO
細胞からの発現方法が特開平３−27295号公報に記載さ
れている。IL-5 is a cytokine (T cell-replacing facto) that induces the proliferation and differentiation of antibody-producing lymphocyte B cells.
r: TRF) [Takatsu, K., et al., J. Immuno
l., 125 , 2646 (1980)], and it has been revealed that the TRF not only promotes the proliferation and differentiation of activated B cells, but also induces the proliferation and differentiation of eosinophils from bone marrow cells. , Clinical immunity, 21 , 521 (1989)], and human IL-5 cDNA was isolated using mouse IL-5cNDA as a probe [Azuma. C., et al., N
ucleic Acids Res., 14 , 9149 (1989)]. The IL-5 consists of 115 amino acids and has a molecular weight of 46000 (23000 dimer)
It is produced by antigens (viruses, pathogenic microorganisms such as Mycobacterium tuberculosis, allergens, etc.) and proliferates B cells, differentiates into antibody-producing cells, eosinophils proliferates and differentiates, IL-
It has the effect of inducing the expression of 2 receptors and assisting the induction of killer T cells [Takashi Takatsu, Therapeutics, 24 (1) 45-48 (199
0)]. The production method is CHO by genetic recombination.
A method for expression from cells is described in JP-A-3-27295.

IL−８は、白血球の１種の好中球を活性化するサイト
カインとして、リポポリサッカライド（LPS）刺激単球
培養上清から分離された。該IL−８はLPSの他、TNF、IL
−１、IL−３、GM−CSF等により刺激されて、単球の
他、肺胞マクロファージ、線維芽細胞、上皮細胞、肝細
胞からも分泌される72個のアミノ酸からなる分子量8000
のサイトカインであり、松島らによりそのcDNAがクロー
ニングされた［Matsushima,K.,et al.,J.Exp.Med.,167,
1883（1988）］。該IL−８は好中球遊走能の亢進、好中
球活性化、Ｔ細胞遊走能の亢進、好塩基球遊走能の亢
進、好塩基球活性化等の作用を有し、リウマチ様関節炎
等の炎症性疾患との係りが注目されている［Westwick,
J.,et al.,Immunology Today,10,146（1989）;Baggioli
ni,M.,et al.,J.Clin.Invest.,84,1045（1989）；松島
綱治,Medical Immunology,18,9（1989）;B.B.R.C.,169,
165（1990）］。その大腸菌を用いた大量発現系につい
ては、フルタらの方法［Furuta,R.,et al.,J.Biochem.,
106,436（1989）］が知られ、またIL−８の誘導体ペプ
チドがPCT公開特許第9108231号公報に記載されている。IL-8 was isolated from lipopolysaccharide (LPS) -stimulated monocyte culture supernatant as a cytokine that activates one type of leukocyte neutrophil. The IL-8 is LPS, TNF, IL
1, a molecular weight of 8000 consisting of 72 amino acids that is stimulated by IL-3, GM-CSF, etc. and secreted from alveolar macrophages, fibroblasts, epithelial cells and hepatocytes in addition to monocytes.
Matsushima et al., Whose cDNA was cloned [Matsushima, K., et al., J. Exp. Med., 167 ,
1883 (1988)]. The IL-8 has actions such as enhancement of neutrophil migration ability, neutrophil activation, enhancement of T cell migration ability, enhancement of basophil migration ability, activation of basophils, and rheumatoid arthritis. In connection with inflammatory diseases, attention has been drawn [Westwick,
J., et al., Immunology Today, 10 , 146 (1989); Baggioli
ni, M., et al., J. Clin. Invest., 84 , 1045 (1989); Tsunaharu Matsushima, Medical Immunology, 18 , 9 (1989); BBRC, 169 ,
165 (1990)]. For a large-scale expression system using Escherichia coli, Furuta et al. [Furuta, R., et al., J. Biochem.,
106 , 436 (1989)], and a derivative peptide of IL-8 is described in PCT Publication No. 9108231.

IL−９は、血小板の前駆細胞である巨核芽球性細胞株
（MO7E）の増殖を刺激し、GM−CSF、IL−２とは異なる
液性因子として、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（HTLV−
Ｉ）感染Ｔ細胞株（CMJ2）の培養上清から、そのcDNAが
分離された［Yang,Y−C,et al.,Blood,74（６）1880−1
884（1989）］。これはアミノ酸144個からなる蛋白で、
マウスＴ細胞増殖刺激因子Ｐ−40と高い相同性を持つ
［Van Snick J.,et al.,J.Exp.Med.,169（１）363−368
（1989）］。該IL−９はCD4⁺T細胞よりマイトジェン刺
激により産生され、ヘルパーＴ細胞の増殖、巨核芽球性
細胞株の増殖、赤血球系幹細胞の分化促進、骨髄系細胞
株の増殖作用が報告され、上記Ｔ細胞成長因子Ｐ−40と
同一物質ではないかと言われている。そのクローニング
及び発現方法は、PCT公開特許第9014432号公報に記載さ
れている。IL-9 stimulates the proliferation of megakaryoblastic cell line (MO7E), which is a precursor cell of platelets, and as a humoral factor different from GM-CSF and IL-2, adult T-cell leukemia virus (HTLV-
I) The cDNA was isolated from the culture supernatant of the infected T cell line (CMJ2) [Yang, YC, et al., Blood, 74 (6) 1880-1
884 (1989)]. This is a protein consisting of 144 amino acids,
It has high homology to mouse T cell growth stimulating factor P-40 [Van Snick J., et al., J. Exp. Med., 169 (1) 363-368.
(1989)]. The IL-9 is produced from CD4 ⁺ T cells by mitogen stimulation, and it is reported that the proliferation of helper T cells, the proliferation of megakaryoblastic cell lines, the promotion of differentiation of erythroid stem cells, the proliferation of myeloid cell lines, It is said that it may be the same substance as T cell growth factor P-40. The cloning and expression method is described in PCT Publication No. 9014432.

IL−10は、モアー（Moore）らによりT_H1ヘルパーＴ細
胞より単離された、Ｔ細胞からのγ−IFNの産生を抑制
するサイトカイン合成阻害因子（Cytokine Synthesis I
nhibitory Factor;CSIF）として報告された。該IL−10
はアミノ酸160個からなる分子量18700のサイトカイン
で、Ｔ細胞の他、Ｂ細胞や肥満細胞株からも産性され、
その作用はγ−IFNを始め種々のサイトカインの産生を
抑制する他、Ｔ細胞や肥満細胞の増殖作用も持つとされ
ている。その製造は、上記モアーらによるcDNAのクロー
ニング及びCOS細胞からの発現による遺伝子組換え法に
従うことができる［Moore,K.W.,et al.,Science,248,12
30−1234（1990）］。IL-10 is a cytokine synthesis inhibitor (Cytokine Synthesis I) isolated from T _H1 helper T cells by Moore et al., Which suppresses the production of γ-IFN from T cells.
nhibitory Factor (CSIF). The IL-10
Is a cytokine with a molecular weight of 18700 consisting of 160 amino acids and is produced not only by T cells but also by B cells and mast cell lines,
Its action is said to suppress the production of various cytokines including γ-IFN, and also has a proliferating action on T cells and mast cells. The production can be performed according to the above-mentioned method of recombination of cDNA by cloning of cDNA and expression from COS cells [Moore, KW, et al., Science, 248 , 12].
30-1234 (1990)].

IL−11は、IL−３依存性造血幹細胞芽球コロニーを増
加する因子として、骨髄ストローマ細胞より産生される
分子量約20000の199個のアミノ酸からなるサイトカイン
として報告され、形質細胞株の増殖、Ｂ細胞の分化、造
血幹細胞芽球コロニーの増殖、マクロファージの分化誘
導、巨核球の分化等の作用が報告されている［押味和
夫，臨床医，17（10）５−９（1991）;Paul,S.R.,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.,87（19）7512−7516（1
990）］。該IL−11のcDNA及び製造法については、COS細
胞で発現させる方法等がPCT公開特許第9107495号公報に
記載されている。IL-11 has been reported as a factor that increases IL-3-dependent hematopoietic stem cell blast colonies, and is reported as a cytokine consisting of 199 amino acids with a molecular weight of about 20,000 produced by bone marrow stromal cells. Effects such as cell differentiation, proliferation of hematopoietic stem cell blast colonies, induction of macrophage differentiation, and megakaryocyte differentiation have been reported [Oshimi Kazuo, clinician, 17 (10) 5-9 (1991); Paul, SR , et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87 (19) 7512-7516 (1
990)]. Regarding the cDNA and production method of the IL-11, a method of expressing it in COS cells and the like are described in PCT Publication No. 9107495.

IL−12は、細胞障害性リンパ球成熟因子（cytotoxic
lymphocyte maturation factor;CLMF）として、PHA刺激
ヒト末梢血リンパ球の増殖やLAK細胞の誘導する低濃度
のIL−２で相互作用増加を刺激するサイトカインとして
報告され、分子量約75000で40000分子と35000分子とが
ジスルフィド結合した活性蛋白である。該IL−12はリン
パ芽球様Ｂ細胞株NC−37からそのcDNAがクローニングさ
れ、COS細胞中に発現されたサイトカインである［Chizz
onte,R.,et al.,J.Immunology,147（５）1548−1556（1
991）;Gubler,U.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,
88（10）4143−4147（1991）］。IL-12 is a cytotoxic lymphocyte maturation factor (cytotoxic
It has been reported as a lymphocyte maturation factor (CLMF) as a cytokine that stimulates the proliferation of PHA-stimulated human peripheral blood lymphocytes and increases the interaction with low concentrations of IL-2 induced by LAK cells. Are active proteins with disulfide bonds. The IL-12 is a cytokine whose cDNA was cloned from the lymphoblastoid B cell line NC-37 and expressed in COS cells [Chizz
onte, R., et al., J. Immunology, 147 (5) 1548-1556 (1
991); Gubler, U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
88 (10) 4143-4147 (1991)].

上記各種サイトカインの内、TNFは前記したように悪
寒、戦慄、発熱、血圧低下等の副作用が強く、抗腫瘍効
果が期待できる量の投与が不可能な現状にあり、またIF
Nも臨床の有効率が約20％と低く、適応となる疾患も特
定の疾患に限られ、各IFN共発熱、悪寒等のインフルエ
ンザ様症状が見られ、之等副作用より高用量の投与は困
難で、当初期待された程の満足度は得られていない現状
にある。Among the above-mentioned various cytokines, TNF has strong side effects such as chills, shivering, fever, and a decrease in blood pressure as described above, and at present it is impossible to administer an antitumor effect in an expected amount.
N also has a low clinical efficacy rate of about 20%, and indications are limited to specific diseases, and IFN-like flu-like symptoms such as fever and chills are observed, and it is difficult to administer a higher dose than these side effects At present, the degree of satisfaction as initially expected has not been obtained.

IL−１及びIL−２は両者共腫瘍細胞に対し増殖抑制効
果を有しているが、IL−１を有効成分とする抗腫瘍剤を
投与した臨床試験では、発熱、胃腸症状、全身倦怠、低
血圧、筋肉痛等の副作用を示すことが報告されている
［H.A.Aarvey,et al.,Proc.,ASCO.,24,46（1983）］。
このためIL−１は癌の治療に対し期待されていたもの
の、上記副作用より大量投与等の試みを断念せざるを得
ない現状にある。またIL−２はそれ単独では効果が殆ど
なく、現在LAK療法での利用が主流となっているが、該L
AK療法では、LAK細胞の材料として通常、患者自身の末
梢血リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、癌性胸膜腹水中の
リンパ球等を予め採取した後、IL−２と共に培養する必
要があり、またその培養には大量の培養液と培養スペー
スが必要で培養期間は材料にもよるが１〜２週間を要
し、目的の細胞数まで増殖するのに更に１〜２週間培養
し続けなければならず、治療前の時間や治療設備の点等
で多くの問題がある。しかもLAK療法においても高頻度
に発熱、胃腸症状、体液貯留による体重増加、好酸球増
加、貧血等の副作用が出現するなど様々な問題がある。Both IL-1 and IL-2 have a growth inhibitory effect on tumor cells, but in clinical trials administered with an antitumor agent containing IL-1 as an active ingredient, fever, gastrointestinal symptoms, general malaise, It has been reported to exhibit side effects such as hypotension and muscle pain [HAAarvey, et al., Proc., ASCO., 24 , 46 (1983)].
For this reason, although IL-1 has been expected for the treatment of cancer, the current situation is that it is necessary to abandon attempts to administer large amounts due to the above-mentioned side effects. In addition, IL-2 alone has almost no effect, and its use in LAK therapy is currently mainstream.
In the AK therapy, it is usually necessary to collect in advance the peripheral blood lymphocytes of the patient itself, infiltrating lymphocytes in the tumor, lymphocytes in the cancerous pleural ascites, and the like, as a material of the LAK cells, and then to culture them with IL-2. In addition, a large amount of culture solution and culture space are required for the culture, and the culture period depends on the material, but it takes 1 to 2 weeks. Unless the culture is continued for another 1 to 2 weeks to grow to the target cell number, In addition, there are many problems in terms of time before treatment and treatment equipment. In addition, there are various problems in LAK therapy, such as side effects such as fever, gastrointestinal symptoms, weight gain due to fluid retention, eosinophilia, and anemia.

また、他のILは各種細胞の分化・増殖作用を持ちなが
ら、癌の補助療法や血小板、顆粒球等の増加剤として、
また好中球や好酸球等炎症と関連のあるILは自己免疫疾
患、特にリウマチ、血管炎等の治療剤としての検討がな
されているにすぎない現状にある。In addition, other ILs have the effect of differentiating and proliferating various cells, and are used as adjuvant therapy for cancer and as agents for increasing platelets, granulocytes, etc.
In addition, IL associated with inflammation, such as neutrophils and eosinophils, is currently being studied only as a therapeutic agent for autoimmune diseases, particularly rheumatism and vasculitis.

上記のようにサイトカイン単独では、現在の臨床用量
（副作用による投与スケジュールの限界）では、癌治療
に対して満足する効果が得られないため、その副作用の
軽減と効果の増大を企てるために様々な併用療法が試み
られつつある。例えば、上記IL−２とLAK細胞の併用療
法やIFN−αやIFN−βとの併用療法、IFNと抗癌剤のビ
ンブラスチンとの併用療法等が報告されているが、之等
併用により飛躍的に効果が増大したという報告はなく、
むしろ副作用が相加・相乗的に増大するという報告がな
されている［梅田隆、他、治療学、24（１）75−79（19
90）］。As described above, cytokines alone cannot provide a satisfactory effect on cancer treatment at the current clinical dose (limit of administration schedule due to side effects). Therefore, various measures have been taken to reduce the side effects and increase the effects. Combination therapy is being attempted. For example, the combination therapy of IL-2 and LAK cells, the combination therapy of IFN-α or IFN-β, and the combination therapy of IFN and vinblastine as an anticancer agent have been reported. There has been no report that
Rather, it has been reported that side effects increase additively and synergistically [Takashi Umeda et al., Therapeutics, 24 (1) 75-79 (19
90)].

TNFについては、TNFと各種抗癌剤、IFN−γ、IL−
２、温熱療法、Ｇ−CSF等との併用で、抗腫瘍性の相乗
効果が報告されている［Watanabe,N.,et al.,Cancer Re
s.,48,650−653（1988）;Niitsu,Y.,et al.,Cancer Re
s.,48,654−657（1988）;Watanabe,N.,et al.,Immunoph
armacol.Immunotoxicol.,10,117−127（1988）;Winkelh
ake,J.L.,et al.,Cancer Res.,47,3948−3953（198
7）］。About TNF, TNF and various anticancer agents, IFN-γ, IL-
2. Antitumor synergistic effects have been reported in combination with hyperthermia, G-CSF, etc. [Watanabe, N., et al., Cancer Re.
s., 48 , 650-653 (1988); Niitsu, Y., et al., Cancer Re.
s., 48 , 654-657 (1988); Watanabe, N., et al., Immunoph.
armacol. Immunotoxicol., 10 , 117-127 (1988); Winkelh
ake, JL, et al., Cancer Res., 47 , 3948-3953 (198
7)].

一方、後記一般式（１）で表されるカルボスチリル誘
導体は、例えば特公平１−43747号公報に記載される通
り、強心剤として有用であることが既に公知であるが、
本願人らは上記誘導体につき研究を重ねた結果、先に該
誘導体が強心作用からは予測困難な制癌作用及び細胞の
分化誘導能を有することを見出し、この知見に基づく発
明を完成し特許出願した（特願平３−162587号）。On the other hand, the carbostyril derivative represented by the following general formula (1) is already known to be useful as a cardiotonic agent, as described in, for example, Japanese Patent Publication No. 43747/1989.
As a result of repeated studies on the above-mentioned derivatives, the present inventors have found that the derivative has an anticancer effect and a cell differentiation-inducing ability which are difficult to predict from a cardiotonic effect, and completed an invention based on this finding and filed a patent application. (Japanese Patent Application No. 3-162587).

本発明者らは、上記誘導体の制癌効果及び細胞の分化
誘導能につき更に研究を重ねた結果、該誘導体とTNF−
α及びその他の前記した各種サイトカイン、特にTNF、I
FN、IL、TGF−β等との併用によれば、実に驚くべきこ
とに、TNF単独、IFN単独、IL単独或いはTGF−β単独で
はその抗腫瘍活性が出現しない低用量においても、腫瘍
の増殖抑制効果や細胞の分化誘導促進効果が得られ、そ
の結果、上記TNF、IFN、IL、TGF−β等のサイトカイン
の投与量を大幅に低減させ得、しかも早期に強力な制癌
効果及び細胞の分化誘導効果が現れることを見出した。The present inventors have conducted further studies on the anticancer effect and the ability to induce cell differentiation of the above derivative.
α and various other cytokines mentioned above, especially TNF, I
According to the combination with FN, IL, TGF-β, etc., it is surprisingly surprising that even at a low dose where TNF alone, IFN alone, IL alone or TGF-β alone does not show its antitumor activity, tumor growth An inhibitory effect and an effect of promoting differentiation induction of cells can be obtained, and as a result, the dose of cytokines such as TNF, IFN, IL, and TGF-β can be significantly reduced. It was found that a differentiation-inducing effect appeared.

本発明者らはまた、上記一般式（１）で表わされるカ
ルボスチリル誘導体が、これをレチノイン酸等のレチノ
イドと併用することによっても、上記サイトカインとの
併用と同様に、制癌作用及び細胞の分化誘導作用が奏さ
れ、所望の制癌剤が提供されることを見出した。The present inventors have also found that the carbostyril derivative represented by the above general formula (1) can be used in combination with a retinoid such as retinoic acid, as well as in combination with the above-mentioned cytokine, to exert an anti-cancer effect and cell arrest. It has been found that a differentiation-inducing effect is exerted and a desired anticancer agent is provided.

発明の開示 本発明によれば、抗腫瘍作用を持つサイトカイン、特
にTNF、IFN、TGF−β及びILから選ばれるサイトカイン
と、下記一般式（１）で表されるカルボスチリル誘導体
及び／又はその塩とを有効成分として含有することを特
徴とする制癌剤が提供される。DISCLOSURE OF THE INVENTION According to the present invention, a cytokine having an antitumor effect, particularly a cytokine selected from TNF, IFN, TGF-β and IL, and a carbostyril derivative represented by the following general formula (1) and / or a salt thereof And a carcinostatic agent characterized by comprising:

［式中Ｒはフェニル環上に低級アルコキシ基及び低級ア
ルキル基から選ばれる基の１〜３個を有することのある
ベンゾイル基を示す。カルボスチリル骨格の３位と４位
との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。］ また、本発明によればレチノイドと上記一般式（１）
で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩と
を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤が提
供される。 [In the formula, R represents a benzoyl group which may have 1 to 3 groups selected from a lower alkoxy group and a lower alkyl group on a phenyl ring. The carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyril skeleton indicates a single bond or a double bond. Further, according to the present invention, a retinoid and the above general formula (1)
And a carbostyril derivative represented by the formula (1) and / or a salt thereof as an active ingredient.

特に本発明によれば、カルボスチリル誘導体が６−
［４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジ
ニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル、７−［４−
（3,4,5−トリメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニ
ル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル、７−［４−（3,4
−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル］−3,4
−ジヒドロカルボスチリル及び６−［４−（４−エトキ
シベンゾイル）−１−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロ
カルボスチリルから選ばれる少なくとも１種である上記
制癌剤、サイトカインがヒトTNFである上記制癌剤、ヒ
トTNFが天然型ヒトTNF−α、遺伝子組換え型ヒトTNF−
αもしくはヒトTNF−α活性を有するヒトTNF−α誘導体
である上記制癌剤、サイトカインが天然型ヒトIFN−
γ、組換え型ヒトIFN−γ又はヒトIFN−γ活性を有する
ヒトIFN−γ誘導体である上記制癌剤、サイトカインが
天然型ヒトIL−１β、組換え型ヒトIL−１β又はヒトIL
−１β活性を有するヒトIL−１β誘導体である上記制癌
剤、サイトカインが天然型ヒトTGF−β、組換え型ヒトT
GF−β又はヒトTGF−β活性を有するヒトTGF−β誘導体
である上記制癌剤、及びレチノイドがレチノイン酸であ
る上記制癌剤が提供される。In particular, according to the present invention, the carbostyril derivative is 6-
[4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 7- [4-
(3,4,5-trimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 7- [4- (3,4
-Dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4
The above-mentioned anticancer agent, which is at least one selected from dihydrocarbostyril and 6- [4- (4-ethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, the above-mentioned anticancer agent, wherein the cytokine is human TNF, TNF is natural human TNF-α, recombinant human TNF-
The above-described anticancer agent which is a human TNF-α derivative having α or human TNF-α activity, wherein the cytokine is natural human IFN-
γ, the above-mentioned anticancer agent which is recombinant human IFN-γ or a human IFN-γ derivative having human IFN-γ activity, wherein the cytokine is natural human IL-1β, recombinant human IL-1β or human IL
The above-mentioned anticancer agent which is a human IL-1β derivative having -1β activity, the cytokine is natural human TGF-β, and the recombinant human T
The anticancer agent, which is GF-β or a human TGF-β derivative having human TGF-β activity, and the above anticancer agent, wherein the retinoid is retinoic acid.

更に本発明によれば、上記一般式（１）で表わされる
カルボスチリル誘導体及び／又はその医薬として許容さ
れる塩と、上記サイトカイン及び／又はレチノイドとを
有効成分として含有する制癌剤の薬理有効量を患者に投
与して癌を治療する方法が提供される。Furthermore, according to the present invention, a pharmacologically effective amount of an anticancer drug containing the carbostyril derivative represented by the above general formula (1) and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the above cytokine and / or retinoid as active ingredients is provided. Methods for administering to a patient to treat cancer are provided.

本発明制癌剤の有効成分の一つとするカルボスチリル
誘導体を表わす上記一般式（１）において、定義される
低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ、エトキ
シ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、tert−ブ
トキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基等の炭素数
１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルコキシ基を、また低級ア
ルキル基しては、例えばメチル、エチル、プロピル、イ
ソプロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシ
ル基等の炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状アルキル基を
例示できる。In the above general formula (1) representing a carbostyryl derivative as one of the active ingredients of the anticancer agent of the present invention, the lower alkoxy group defined includes, for example, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, tert-butoxy, pentyloxy , A hexyloxy group or other linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or a lower alkyl group such as a methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl group And a straight-chain or branched-chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.

フェニル環上に低級アルコキシ基及び低級アルキル基
から選ばれる基の１〜３個を有することのあるベンゾイ
ル基としては、例えばベンゾイル、２−メトキシベンゾ
イル、３−メトキシベンゾイル、４−メトキシベンゾイ
ル、２−エトキシベンゾイル、３−エトキシベンゾイ
ル、４−エトキシベンゾイル、３−イソプロポキシベン
ゾイル、４−ブトキシベンゾイル、２−ペンチルオキシ
ベンゾイル、３−ヘキシルオキシベンゾイル、3,4−ジ
メトキシベンゾイル、2,5−ジメトキシベンゾイル、3,
4,5−トリメトキシベンゾイル、２−メチルベンゾイ
ル、３−メチルベンゾイル、４−メチルベンゾイル、２
−エチルベンゾイル、３−エチルベンゾイル、４−エチ
ルベンゾイル、３−イソプロピルベンゾイル、４−ブチ
ルベンゾイル、２−ペンチルベンゾイル、３−ヘキシル
ベンゾイル、3,4−ジメチルベンゾイル、2,5−ジメチル
ベンゾイル、3,4,5−トリメチルベンゾイル基等の、フ
ェニル環上に置換基として上記低級アルコキシ基及び低
級アルキル基から選ばれる基を１〜３個有することのあ
るベンゾイル基を例示できる。Examples of the benzoyl group which may have 1 to 3 groups selected from a lower alkoxy group and a lower alkyl group on the phenyl ring include, for example, benzoyl, 2-methoxybenzoyl, 3-methoxybenzoyl, 4-methoxybenzoyl, Ethoxybenzoyl, 3-ethoxybenzoyl, 4-ethoxybenzoyl, 3-isopropoxybenzoyl, 4-butoxybenzoyl, 2-pentyloxybenzoyl, 3-hexyloxybenzoyl, 3,4-dimethoxybenzoyl, 2,5-dimethoxybenzoyl, 3,
4,5-trimethoxybenzoyl, 2-methylbenzoyl, 3-methylbenzoyl, 4-methylbenzoyl,
-Ethylbenzoyl, 3-ethylbenzoyl, 4-ethylbenzoyl, 3-isopropylbenzoyl, 4-butylbenzoyl, 2-pentylbenzoyl, 3-hexylbenzoyl, 3,4-dimethylbenzoyl, 2,5-dimethylbenzoyl, 3, A benzoyl group which may have 1 to 3 groups selected from the above lower alkoxy groups and lower alkyl groups as substituents on the phenyl ring, such as a 4,5-trimethylbenzoyl group, can be exemplified.

上記カルボスチリル誘導体の内で特に好ましいものと
しては、例えば６−［４−（3,4−ジメトキシベンゾイ
ル）−１−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチ
リル、７−［４−（3,4,5−トリメトキシベンゾイル）
−１−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリ
ル、７−［４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル、６−
［４−（４−エトキシベンゾイル）−１−ピペラジニ
ル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル及びそれらの塩を
例示できる。Among the above carbostyril derivatives, particularly preferred are, for example, 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 7- [4- (3,4 , 5-trimethoxybenzoyl)
-1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 7- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 6-
[4- (4-ethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril and salts thereof can be exemplified.

本発明制癌剤において他方の有効成分とするサイトカ
インの内で、TNFとしては、TNF活性を有する限り特に限
定はなく、天然型或いは遺伝子組換えにより産生された
組換え型TNFのいずれでもよい。即ち該TNFは、TNF−
α、TNF−β及びLTのいずれでもよく、之等の天然型或
いは組換え型が包含される。上記TNFは既に公知のイン
ビトロで誘導されたヒトTNFを含有する培養上清及びそ
の精製品、遺伝子組換え技術に従い製造された組換え型
ヒトTNF及び之等の一部のアミノ酸配列を有する合成ペ
プチド等の同効物のいずれでもよい。上記組換え型TNF
は通常の方法、例えばヒトTNF乃至その同対物をコード
する遺伝子を含むベクターを作製し、該ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養して発現
物を得、この発現物を精製することにより製造できる。
上記宿主として利用される微生物としては、例えば大腸
菌等を例示できる。上記遺伝子組替え技術において、微
生物の替わりに動物細胞を用いて、該動物細胞を形質転
換し、その培養により発現させてもTNFを得ることがで
きる。ここで動物細胞としては、例えばCOS細胞を例示
できる。また、上記遺伝子組換え技術において、使用す
る遺伝子は、ヒトTNF産生能を有する各種のヒト細胞で
あれば特に限定はなく、例えばHL−60細胞株より分離さ
れたmRNAから、オカヤマ−バーグ法［Okayama H.and Be
rg,P.,Molecular and Cellular Biology,２,161（198
2）］やグブラー−ホフマン法［Gubler,V.and Hoffman,
B.J.,Gene,25,263（1983）］等に従い調整されるものを
使用できる。上記遺伝子組換え技術において大腸菌を用
いる方法としては、ペニカ（Pennica）らの方法［Penni
ca,D.,Nature,312,724（1984）］を例示できる。更にヒ
トTNF乃至ヒトTNFの一部の改変或いはヒトTNF誘導体の
製造は、既に公知の遺伝子組換え技術に従い、前記した
文献及び公報に従い実施することができる。Among the cytokines used as the other active ingredient in the anticancer agent of the present invention, TNF is not particularly limited as long as it has TNF activity, and may be either natural TNF or recombinant TNF produced by genetic recombination. That is, the TNF is TNF-
Any of α, TNF-β and LT may be used, and natural or recombinant forms thereof are included. The TNF is a known culture supernatant containing human TNF induced in vitro and a purified product thereof, a recombinant human TNF produced according to a gene recombination technique, and a synthetic peptide having a partial amino acid sequence thereof. And the like. The above recombinant TNF
Are prepared by a conventional method, for example, preparing a vector containing a gene encoding human TNF or its objective, transforming a host cell with the vector, and culturing the resulting transformant to obtain an expression product. Can be produced by purifying
Examples of the microorganism used as the host include Escherichia coli. In the above-described genetic recombination technique, TNF can be obtained by transforming the animal cells using animal cells instead of microorganisms and expressing the cells by culture. Here, as animal cells, for example, COS cells can be exemplified. In the gene recombination technique, the gene to be used is not particularly limited as long as it is various human cells having human TNF-producing ability. For example, mRNA isolated from the HL-60 cell line is subjected to the Okayama-berg method [ Okayama H.and Be
rg, P., Molecular and Cellular Biology, 2 , 161 (198
2)] and the Gubler-Hoffman method [Gubler, V. and Hoffman,
BJ, Gene, 25 , 263 (1983)]. As a method of using Escherichia coli in the above-mentioned gene recombination technology, a method of Pennica et al. [Penni
ca, D., Nature, 312 , 724 (1984)]. Further, human TNF or a partial modification of human TNF or production of a human TNF derivative can be carried out according to already known gene recombination techniques and according to the above-mentioned literature and publications.

また、本発明制癌剤において他方の有効成分とするサ
イトカインの内でTGF−β及びIFNとしては、上記TNFと
同様に、TGF−β活性及びIFN活性を有するそれぞれの各
種の天然型或いは遺伝子組換えにより産生される組換え
型TGF−β及びIFNを利用できる。また、IFNは、α型、
β型、γ型のいずれでもよい。之等も前記TNFと同様に
既に公知のインビトロで誘導されたヒトTGF−β又はIFN
を含有する培養上清及びその精製品、遺伝子組換え技術
に従い製造されたヒトTGF−β又はINF及び之等の一部の
アミノ酸配列を有する合成ペプチド等のすべてを包含
し、上記遺伝子組換え技術は、前記TNFと同様に、通常
の方法、例えばヒトTGF−β又はIFN乃至その同効物をコ
ードする遺伝子を含むベクターを作製し、該ベクターで
宿主細胞の形質転換し、得られる形質転換体を培養して
発現物を得、これを精製することにより実施できる。ヒ
トTGF−β又はIFN乃至ヒトTGF−β又はIFNの一部の改変
乃至ヒトTGF−β又はIFN誘導体の製造も既に公知の遺伝
子組換え技術に従い、前記した文献及び公報に従い実施
できる。In addition, as the TGF-β and IFN among the cytokines as the other active ingredients in the anticancer agent of the present invention, similarly to the above-mentioned TNF, various natural or genetic recombinants having TGF-β activity and IFN activity are used. Recombinant TGF-β and IFN produced can be used. IFN is α-type,
Both β-type and γ-type may be used. Similar to the above-mentioned TNF, human TGF-β or IFN induced in vitro already known
And a purified product thereof, including human TGF-β or INF produced according to the genetic recombination technique and all synthetic peptides having a partial amino acid sequence such as those described above. In the same manner as in the above-mentioned TNF, a vector containing a gene encoding human TGF-β or IFN or its equivalent is prepared by a usual method, and a host cell is transformed with the vector, and the resulting transformant is obtained. Is cultured to obtain an expression product, which is purified. Human TGF-β or IFN or partial modification of human TGF-β or IFN or production of human TGF-β or IFN derivative can be carried out according to the already known gene recombination technique and according to the above-mentioned literature and publication.

更にサイトカインの内で、IL−１、IL−２等の各種の
ILも、上記TNF、IFNと同様に、各IL活性を有する限り特
に限定はなく、天然型或いは遺伝子組換えにより産生さ
れる組換え型の各ILでよい。更にIL−１はIL−１α及び
IL−βのどちらでもよい。之等も前記TNF、IFNと同様に
既に公知のインビトロで誘導されたヒトILを包含する培
養上清及びその精製品、遺伝子組換え技術に従い製造さ
れたヒトIL及び之等の一部のアミノ酸配列を有する合成
ペプチド等の同効物のいずれでもよく、上記遺伝子組換
え技術に従う製造法も、例えばヒトIL乃至その同効物を
コードする遺伝子を含むベクターを作製し、該ベクター
で宿主細胞を形質転換し、得られる形質転換体を培養
し、培養により発現物を得、これを精製することにより
実施できる。ヒトIL乃至ヒトILの一部の改変、ヒトIL誘
導体の製造法も、既に公知の遺伝子組換え技術に従い、
前記した文献及び公報に従い実施できる。Further, among the cytokines, various types such as IL-1 and IL-2 are used.
The IL is not particularly limited as long as it has each IL activity, similarly to the above-mentioned TNF and IFN, and may be a natural IL or a recombinant IL produced by genetic recombination. Further, IL-1 is IL-1α and
Any of IL-β may be used. Similar to the above-mentioned TNF and IFN, the culture supernatant containing human IL induced in vitro already known and its purified product, human IL produced according to the genetic recombination technique, and a part of the amino acid sequence thereof Any of the same compounds such as synthetic peptides having the same structure may be used, and the production method according to the above-described gene recombination technique may also be, for example, to prepare a vector containing human IL or a gene encoding the same, and transform a host cell with the vector. After transformation, the resulting transformant is cultured, and an expression product is obtained by culturing, and this is purified. Human IL to a partial modification of human IL, a method for producing a human IL derivative also according to the already known gene recombination technology,
It can be carried out according to the above-mentioned documents and publications.

本発明制癌剤は、サイトカインと一般式（１）で表さ
れるカルボスチリル誘導体及び／又はその塩、特に、TN
F、TGF−β、IFN、各ILから選ばれるサイトカインと上
記カルボスチリル誘導体及び／又はその塩とが、単一の
製剤中に含まれるように調整されて投与されもよく、上
記サイトカインとカルボスチリル誘導体及び／又はその
塩とのそれぞれが別個の製剤として調整され、之等２つ
の製剤を投与してもよい。いずれの場合も、サイトカイ
ンとカルボスチリル誘導体及び／又はその塩は、後述す
る実施例に記載の薬理試験結果からも明らかなように、
相互に一方が他方の腫瘍細胞増殖抑制作用を始めとする
制癌作用を増強するため、両者の割合は広範囲から適宜
選択できる。The anticancer agent of the present invention comprises a cytokine and a carbostyril derivative represented by the general formula (1) and / or a salt thereof, particularly TN
The cytokine selected from F, TGF-β, IFN and each IL and the above-mentioned carbostyril derivative and / or salt thereof may be adjusted and administered so as to be contained in a single preparation, and the above-mentioned cytokine and carbostyril may be administered. Each of the derivative and / or its salt may be prepared as a separate formulation, and the two formulations may be administered. In any case, the cytokine and the carbostyril derivative and / or the salt thereof were, as apparent from the pharmacological test results described in Examples described later,
Since one of the two enhances the anticancer effect including the other's tumor cell growth inhibitory effect, the ratio of the two can be appropriately selected from a wide range.

本発明制癌剤を臨床使用するに際し、有効成分とする
サイトカインの使用量は、通常成人一日当り蛋白量とし
て0.1〜1000μs/body程度、好ましくは１〜100μg/body
程度の範囲から選択されるのがよく、また一般式（１）
の化合物は、通常一日当り3mg/body〜1800mg/body程
度、好ましくは10mg/body〜300mg/body程度の範囲から
選択されるのがよい。When clinically using the anticancer agent of the present invention, the amount of cytokine used as an active ingredient is usually about 0.1 to 1000 μs / body as an amount of protein per adult per day, preferably 1 to 100 μg / body.
It is preferable to select from the range of the degree and the general formula (1)
The compound is usually selected from the range of about 3 mg / body to 1800 mg / body, preferably about 10 mg / body to 300 mg / body per day.

より詳しくは、上記サイトカインの内でTNF−αは、
一日当り１×10²単位/body〜１×10⁷単位/body程度、好
ましくは１×10³単位/body〜１×10⁶単位/body程度の範
囲で用いられるのが望ましい。LTの場合、その臨床使用
時の成人に対する一日当りの有効成分量は、一般に１×
10²単位/body〜１×10⁷単位/body程度、好ましくは１×
10³単位/body〜１×10⁶単位/body程度の範囲から選択さ
れるのが望ましい。IFN（IFN−α、IFN−β又はIFN−
γ）の場合、成人に対する一日当りの有効成分量は、一
般に１×10⁵単位/body〜１×10⁹単位/body程度、好まし
くは１×10⁶単位/body〜５×10⁷単位/body程度の範囲と
するのが望ましい。IL−１の場合、成人に対する一日当
りの有効成分量は、一般に0.01μg/body〜100μg/body
程度、好ましくは0.1μg/body〜10μg/body程度の範囲
とするのが望ましい。IL−２の場合、成人に対する一日
当りの有効成分量は、一般に0.028μg/body〜280μg/bo
dy程度、好ましくは0.28μg/body〜28μg/body程度の範
囲とするのが望ましい。IL−３、IL−４、IL−５、IL−
６、IL−７、IL−８、IL−９、IL−10、IL−11、IL−12
の場合、成人に対する一日当りの有効成分量は、一般に
0.1μg/body〜1000μg/body程度、好ましくは１μg/bod
y〜100μg/body程度の範囲とするのが望ましい。More specifically, among the above cytokines, TNF-α is
It is desirably used in a range of about 1 × 10 ² units / body to 1 × 10 ⁷ units / body, preferably about 1 × 10 ³ units / body to 1 × 10 ⁶ units / body per day. In the case of LT, the amount of active ingredient per day for adults at the time of clinical use is generally 1 ×
10 ² units / body to about 1 × 10 ⁷ units / body, preferably 1 ×
It is desirable to select from a range of about 10 ³ units / body to 1 × 10 ⁶ units / body. IFN (IFN-α, IFN-β or IFN-
In the case of γ), the amount of the active ingredient per day for an adult is generally about 1 × 10 ⁵ units / body to 1 × 10 ⁹ units / body, preferably 1 × 10 ⁶ units / body to 5 × 10 ⁷ units / body. It is desirable to set the range. In the case of IL-1, the amount of the active ingredient per day for an adult is generally 0.01 μg / body to 100 μg / body.
The concentration is preferably in the range of about 0.1 μg / body to about 10 μg / body. In the case of IL-2, the daily amount of the active ingredient for adults is generally 0.028 μg / body to 280 μg / bo.
It is desirably about dy, preferably in the range of about 0.28 μg / body to about 28 μg / body. IL-3, IL-4, IL-5, IL-
6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12
In general, the amount of active ingredient per day for adults is generally
0.1 μg / body to about 1000 μg / body, preferably 1 μg / bod
It is desirable to set the range of y to about 100 μg / body.

またTGF−βの場合、成人に対する一日当りの有効成
分量は、一般に0.4μg/body〜400μg/body程度、好まし
くは４μg/body〜40μg/body程度の範囲とするのが望ま
しい。In the case of TGF-β, the amount of the active ingredient per adult per day is generally in the range of about 0.4 μg / body to 400 μg / body, preferably about 4 μg / body to 40 μg / body.

上記TNF−α、TGF−β、LT、IFN、IL−１〜IL−12
は、いずれも前述した如く、一般式（１）の化合物と相
互に、腫瘍細胞増殖抑制作用及び細胞の分化誘導作用を
増強するため、該一般式（１）の化合物をこの分野で通
常採用されている臨床投与量で使用する場合は、之等各
サイトカインの通常採用されている臨床投与量を1/100
倍〜9/10倍程度に減少させることができる。TNF-α, TGF-β, LT, IFN, IL-1 to IL-12
As described above, all of the compounds of the general formula (1) are usually employed in this field in order to mutually enhance the inhibitory effect on tumor cell growth and the effect of inducing cell differentiation as described above. If used in clinical doses, the normally used clinical dose of each cytokine is 1/100.
It can be reduced to about 9/10 times.

また、TNF−α、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IL−
１、IL−２等は、前記副作用を回避する観点から、上記
有効量範囲内のできるだけ低容量で投与するのが好まし
い。In addition, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-
1, From the viewpoint of avoiding the side effects, it is preferable to administer IL-2 and the like in a dose as low as possible within the above-mentioned effective dose range.

本発明の一般式（１）の化合物とTNF−αとを有効成
分とする制癌剤における一般式（１）の化合物とTNF−
αとの投与比率は、両者をそれぞれの上記有効成分量範
囲内で使用する限り特に制限はなく、広い範囲から適宜
選択すればよいが、一般には一般式（１）の化合物（mg
/body）/TNF−α（単位/body）が５×10^-6〜５程度、好
ましくは５×10^-5〜５×10^-1程度、更に好ましくは５×
10^-4〜５×10^-2程度とするのが望ましい。一般式（１）
の化合物とTGF−βとの場合の投与比率は、一般に一般
式（１）の化合物（mg/body）/TGF−β（μg/body）が
0.015〜1500程度、好ましくは0.15〜150程度、更に好ま
しくは1.5〜15程度とするのが望ましい。一般式（１）
の化合物とIFN（IFN−α、IFN−β、又はIFN−γ）との
場合の投与比率は、一般に一般式（１）の化合物（mg/b
ody）/IFN（単位/body）が10^-1〜10^-7程度、好ましくは
10^-2〜10^-6程度、更に好ましくは10^-3〜10^-5程度とする
のが望ましい。一般式（１）の化合物とLTとの場合の投
与比率は、上記TNF−αの場合と同様の比率とするのが
望ましい。一般式（１）の化合物とIL−１との場合の投
与比率は、一般に一般式（１）の化合物（mg/body）/IL
−１（mg/body）が５×10¹〜５×10⁷程度、好ましくは
５×10²〜５×10⁶程度、更に好ましくは５×10³〜５×1
0⁵程度とするのが望ましい。一般式（１）の化合物とIL
−２との場合の投与比率は、一般に一般式（１）の化合
物（mg/body）/IL−２（mg/body）が1.8×10¹〜1.8×10
⁷程度、好ましくは1.8×10²〜1.8×10⁶程度、更に好ま
しくは1.8×10³〜1.8×10⁵程度とするのが望ましい。The compound of the general formula (1) and TNF- in an anticancer drug comprising the compound of the general formula (1) of the present invention and TNF-α as active ingredients
The administration ratio to α is not particularly limited as long as both are used within the respective ranges of the amounts of the active ingredients, and may be appropriately selected from a wide range. Generally, the compound of the general formula (1) (mg
/ body) / TNF-α (unit / body) is about 5 × 10 ^{−6 to} 5, preferably about 5 × 10 ^{−5 to} 5 × 10 ⁻¹ , and more preferably 5 × 10 ^−5.
It is desirable to set it to about 10 ^{−4 to} 5 × 10 ⁻² . General formula (1)
The administration ratio of the compound of formula (1) to TGF-β is generally the compound of formula (1) (mg / body) / TGF-β (μg / body).
It is desirably about 0.015 to 1500, preferably about 0.15 to 150, and more preferably about 1.5 to 15. General formula (1)
Of the compound of the formula (1) and IFN (IFN-α, IFN-β or IFN-γ) is generally the same as the compound of the formula (1) (mg / b
ody) / IFN (unit / body) is about 10 ^-1 to 10 ^-7 , preferably
It is desirable to be about 10 ^-2 to 10 ^-6 , more preferably about 10 ^-3 to 10 ^-5 . The administration ratio of the compound of the formula (1) to LT is desirably the same as that of TNF-α. The administration ratio of the compound of the general formula (1) to IL-1 is generally the compound of the general formula (1) (mg / body) / IL
-1 (mg / body) is about 5 × 10 ^{1 to} 5 × 10 ⁷ , preferably about 5 × 10 ^{2 to} 5 × 10 ⁶ , more preferably 5 × 10 ^{3 to} 5 × 1
0 it is desirable to about ^5. Compound of general formula (1) and IL
In general, the dose ratio of the compound of formula (1) (mg / body) / IL-2 (mg / body) is 1.8 × 10 ¹ to 1.8 × 10 ^2.
It is desirably about ⁷ , preferably about 1.8 × 10 ^{2 to} 1.8 × 10 ⁶ , more preferably about 1.8 × 10 ^{3 to} 1.8 × 10 ⁵ .

更に一般式（１）の化合物とIL−３、IL−４、IL−
５、IL−６、IL−７、IL−８、IL−９、IL−10、IL−11
及びIL−12のそれぞれとの場合の投与比率は、一般に一
般式（１）の化合物（mg/body）／各IL（mg/body）が10
¹〜10⁷程度、好ましくは10²〜10⁶程度、更に好ましくは
10³〜10⁵程度とするのが望ましい。Further, the compound of the general formula (1) and IL-3, IL-4, IL-
5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11
In general, the administration ratio of the compound (mg / body) / each IL (mg / body) of the compound of the general formula (1) is 10%.
^{About 1} to 10 ⁷ , preferably about 10 ² to 10 ⁶ , more preferably
It is desirable to be about 10 ³ to 10 ⁵ .

また本発明制癌剤には、一般式（１）のカルボスチリ
ル誘導体とレチノイドとを有効成分とするものも包含さ
れる。ここで一般式（１）のカルボスチリル誘導体と併
用されるレチノイドには、体内でビタミンＡから生産さ
れるレチノイン酸を含む各種のビタミンＡ（レチノー
ル）の誘導体が包含される。The anticancer agents of the present invention also include those containing a carbostyril derivative of the general formula (1) and a retinoid as active ingredients. Here, the retinoid used in combination with the carbostyril derivative of the general formula (1) includes various vitamin A (retinol) derivatives including retinoic acid produced from vitamin A in the body.

その例としては、レチノイン酸の他、レチノール、レ
チナール、レチニルエステル並びにビタミンＡの既知の
合成同族体が包含される。該同族体における環は芳香環
及びヘテロ芳香環であることができ、側鎖、末端基は随
時置換、酸化、還元されていてもよく、またレチノイン
酸のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩も上記レチノ
イドに包含される。それらの具体例としては、エトレチ
ネート（etretinate）、イソトレチノイン（isotretino
in、13−cis retinoic acid）、ポリプレイン酸、ポリ
プレイン酸誘導体（Ｅ−5116）、オール−トランス−レ
チノイン酸（トレチノイン）等を例示できる。上記レチ
ノイドの製法は既知であり、例えばレチノイド誘導体
は、特開昭61−275265号公報、特開昭61−275266号公
報、特開昭64−500190号公報等を参考にして製造でき
る。Examples include retinoic acid, as well as retinol, retinal, retinyl esters, and known synthetic homologs of vitamin A. The ring in the homologue may be an aromatic ring or a heteroaromatic ring, and the side chain and terminal group may be optionally substituted, oxidized and reduced.Alkali metal and alkaline earth metal salts of retinoic acid may also be used as described above. Included in retinoids. Specific examples thereof include etretinate, isotretinoin and isotretinoin.
in, 13-cis retinoic acid), polyprenic acid, polyprenic acid derivative (E-5116), all-trans-retinoic acid (tretinoin) and the like. The method for producing the above retinoid is known. For example, a retinoid derivative can be produced with reference to JP-A-61-275265, JP-A-61-275266, JP-A-64-500190, and the like.

ビタミンＡはその欠乏により分化の異常が引き起こさ
れることが、1925年に既にワルバとホウェ（Wolbach ＆
Howe）により見出されている。ボォラグ（Bollag）
は、ビタミンＡの誘導体を幾つか作成して、レチノイン
酸がマウス皮膚における化学発癌を抑える効果を明らか
にした［Bollag,W.,Eur.J.Cancer.,８,689（1972）］。
上記レチノイドは、ビタミンＡの経口投与のように中毒
症状を起こすことなく、ビタミンＡ様作用を示し、各種
の皮膚疾患や癌等への効果が期待され、レチノイン酸に
よって多くの癌細胞、例えばHeLa細胞、悪性黒色腫細胞
等に対してある程度の分化能をもち、制癌効果をもつこ
とが報告された。上記のように癌細胞を分化させ得る能
力をもつレチノイン酸は、発生を抑制する分子のひとつ
であり、癌治療の研究とレチノイン酸との関係の研究は
注目に値するものとなり多くの研究がなされ、更に臨床
に応用する試みもなされた［平塚巌他、川久保病院医
報，12（３）109−112（1989）；三井宣夫，中部日本整
形外科災害外科学会雑誌，33（１）26−27（1990）；二
ノ宮三生，岐阜大学医学部紀要，35（６）836−848（19
87）］。その結果、レチノイン酸のみであっても、ある
程度癌の治療効果が認められた［Menger,H.,et al.,Blo
od,12（２）567−572（1988）;Castaigne,S.,et al.,Bl
ood,76（８）1704−1709（1990）等参照］が、これはそ
の大量投与に伴う催奇形成やビタミンＡ過剰症、骨異常
等の副作用の問題が認められ、その使用基準が検討され
ている［沢田海彦，現代医療，22（増３）428−432（19
90）］。Vitamin A deficiency can lead to abnormalities in differentiation, and in 1925 Wolbach and Howe (Wolbach &
Howe). Bollag
Made several derivatives of vitamin A and demonstrated the effect of retinoic acid on chemical carcinogenesis in mouse skin [Bollag, W., Eur. J. Cancer., 8 , 689 (1972)].
The retinoids exhibit vitamin A-like effects without causing toxic symptoms as in the case of oral administration of vitamin A, and are expected to have effects on various skin diseases, cancers, and the like. It has been reported that it has a certain degree of differentiation potential against cells, malignant melanoma cells and the like, and has an anticancer effect. As described above, retinoic acid, which has the ability to differentiate cancer cells, is one of the molecules that suppresses the development.Research on cancer treatment and research on the relationship with retinoic acid are noteworthy, and much research has been done. [Iwao Hiratsuka et al., Kawakubo Hospital Medical Journal, 12 (3) 109-112 (1989); Nobuo Mitsui, Journal of Central Japan Orthopedic Disaster Surgery Society, 33 (1) 26-27. (1990); Mitsui Ninomiya, Bulletin of School of Medicine, Gifu University, 35 (6) 836-848 (19)
87)]. As a result, even with retinoic acid alone, a therapeutic effect on cancer was recognized to some extent [Menger, H., et al., Blo
od, 12 (2) 567-572 (1988); Castaigne, S., et al., Bl.
ood, 76 (8) 1704-1709 (1990), etc.], which have been associated with problems of side effects such as teratogenesis, hypervitaminosis A, and bone abnormalities associated with large doses. [Sawada U, Modern Medicine, 22 (M3) 428-432 (19
90)].

上記レチノイドを利用した本発明制癌剤は、前記サイ
トカインを利用したそれと同様に、カルボスチリル誘導
体及びその塩類の少なくとも一種とレチノイドとが単一
製剤中に含まれるように調製されてもよく、之等のそれ
ぞれを別個に製剤化して両製剤を利用することもでき
る。いずれの場合も、両者の併用割合（配合割合）は、
広範囲から適宜選択できる。例えば、本発明制癌剤の臨
床利用に際して、有効成分とするレチノイドは、通常一
日当り約0.01〜10mg/kg程度が投与される量から選択さ
れ、これと併用される一般式（１）のカルボスチリル誘
導体（及び之等の塩）は、通常成人一人一人当り約３〜
1800mg/体重程度、好ましくは約10〜300mg/体重程度の
範囲から選択される量とされるのがよい。The anticancer agent of the present invention utilizing the above retinoid may be prepared such that at least one of the carbostyril derivative and salts thereof and the retinoid are contained in a single preparation, as in the case of utilizing the cytokine. It is also possible to formulate each separately and utilize both formulations. In any case, the combination ratio (mixing ratio) of both is
It can be appropriately selected from a wide range. For example, in clinical use of the anticancer agent of the present invention, the retinoid as an active ingredient is usually selected from the amount of about 0.01 to 10 mg / kg per day, and used in combination with the carbostyril derivative of the general formula (1). (And their salts) are usually about 3 to 3 per adult
The amount may be selected from the range of about 1800 mg / body weight, preferably about 10 to 300 mg / body weight.

上記レチノイン酸等のレチノイドは、いずれも前述し
た如く、一般式（１）の化合物と相互に、腫瘍細胞増殖
抑制作用及び細胞の分化誘導作用を増強するため、該一
般式（１）の化合物をこの分野で通常採用されている臨
床投与量で使用する場合は、レチノイドの通常採用され
ている臨床投与量を1/100倍〜9/10倍程度に減少させる
ことができる。尚、レチノイドは、前記副作用を回避す
る観点から、上記有効量範囲内のできるだけ低容量で投
与するのが好ましい。As described above, any of the retinoids such as retinoic acid and the compound of the general formula (1) reciprocally enhance the tumor cell growth inhibitory action and the cell differentiation inducing action. When used in the clinical dose normally used in this field, the normally used clinical dose of retinoid can be reduced to about 1/100 to 9/10 times. From the viewpoint of avoiding the above-mentioned side effects, it is preferable to administer the retinoid in the lowest possible dose within the above-mentioned effective dose range.

本発明の一般式（１）の化合物とレチノイドとを有効
成分とする制癌剤における一般式（１）の化合物とレチ
ノイドとの投与比率は、両者をぞれぞれの上記有効成分
量範囲内で使用する限り特に制限はなく、広い範囲から
適宜選択すればよいが、一般には一般式（１）の化合物
（mg/body）／レチノイド（mg/body）が0.1〜1000程
度、好ましくは１〜100程度、更に好ましくは10程度と
するのが望ましい。The administration ratio of the compound of the general formula (1) and the retinoid in the anticancer drug containing the compound of the general formula (1) and the retinoid of the present invention as the active ingredients is used within the above-mentioned range of the amount of the active ingredient. There is no particular limitation as long as it is selected, and it may be appropriately selected from a wide range. Generally, the compound (mg / body) / retinoid (mg / body) of the general formula (1) is about 0.1 to 1000, preferably about 1 to 100 And more preferably about 10.

本発明制癌剤は、その使用目的に応じ、この分野で慣
用されている各種の投与形態で使用される。例えば注射
剤として調整される場合には、液剤、乳剤及び懸濁剤は
殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましい。The anticancer agent of the present invention is used in various administration forms commonly used in this field according to the purpose of use. For example, when prepared as an injection, the solutions, emulsions, and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood.

本発明製剤の製造に際しては、人血清アルブミンや通
常のＬ−型アミノ酸及び／又は糖類と界面活性剤を使用
することにより、有効成分、就中サイトカイン、例えば
TNF−α、TGF−β、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IL−
１、LT、IL−２、IL−３、IL−４、IL−５、IL−６、IL
−７、IL−８、IL−９、IL−10、IL−11及びIL−12の安
定性を向上させ得る。In the preparation of the preparation of the present invention, the use of human serum albumin or ordinary L-type amino acids and / or saccharides and a surfactant makes it possible to use an active ingredient, especially a cytokine, for example, a cytokine.
TNF-α, TGF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-
1, LT, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL
-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 and IL-12 can be improved in stability.

上記アミノ酸としては、通常の注射剤等に慣用されて
いるもの、例えば、グリシン、システイン等をいずれも
使用できる。上記糖としては、特に限定はなく、例えば
グルコース、マルノース、ガラクトース、果糖等の単糖
類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖
アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デ
キストラン、ヒドロキシプロピルスターチ糖の多糖類等
を使用でき、之等は一種単独でも、二種以上混合しても
用い得る。之等の中で特にショ糖、マントース、マンニ
トール、イノシトール、デキストラン等は好ましい。ま
た、界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び
非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、就中、ポリ
オキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル
系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタ
ンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面
活性剤を好ましく利用できる。As the amino acid, any of those commonly used in ordinary injections and the like, for example, glycine, cysteine and the like can be used. The sugar is not particularly limited and includes, for example, monosaccharides such as glucose, malnose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, sucrose, maltose, disaccharides such as lactose, dextran, and hydroxypropyl starch sugar. Can be used alone or in combination of two or more. Among them, sucrose, mantoose, mannitol, inositol, dextran and the like are particularly preferable. The surfactant is not particularly limited, and any of ionic and nonionic surfactants can be used. Among them, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester type, polyoxyethylene alkyl ether type, sorbitan monoacyl ester Surfactants and fatty acid glyceride surfactants can be preferably used.

上記糖類の添加量は、TNF−αそのもの又はその前記
誘導体（TNF−α活性物）、TGF−βそのもの又はその前
記誘導体（TGF−β活性物）、LTそのもの又はその前記
誘導体（LT活性物）、IFN（IFN−α、IFN−β又はIFN−
γ）そのもの又はその前記誘導体（IFN活性物）、IL−
１そのもの又はその前記誘導体（IL−１活性物）、IL−
２そのもの又はその前記誘導体（IL−２活性物）、IL−
３そのもの又はその前記誘導体（IL−３活性物）、IL−
４そのもの又はその前記誘導体（IL−４活性物）、IL−
５そのもの又はその前記誘導体（IL−５活性物）、IL−
６そのもの又はその前記誘導体（IL−６活性物）、IL−
７そのもの又はその前記誘導体（IL−７活性物）、IL−
８そのもの又はその前記誘導体（IL−８活性物）、IL−
９そのもの又はその前記誘導体（IL−９活性物）、IL−
10そのもの又はその前記誘導体（IL−10活性物）、IL−
11そのもの又はその前記誘導体（IL−11活性物）及びIL
−12そのもの又はその前記誘導体（IL−12活性物）のい
ずれの場合でも、之等各活性物の１μｇ当り約0.01mg程
度以上、好ましくは約0.1〜10mg程度の範囲とするのが
適当である。界面活性剤の添加量は、上記各活性物１μ
ｇ当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001〜0.0
1mg程度の範囲とするのが適当である。また人血清アル
ブミンの添加量は上記各活性物１μｇ当り約0.0001mg程
度以上、好ましくは約0.001〜1mg程度の範囲とするのが
適当である。アミノ酸では上記各活性物１μｇ当り約0.
001〜10mg程度（２種以上配合する場合はそれらの合計
量）とするのが適当である。The amount of the saccharide to be added is TNF-α itself or its derivative (TNF-α active), TGF-β itself or its derivative (TGF-β active), LT itself or its derivative (LT active). , IFN (IFN-α, IFN-β or IFN-
γ) itself or its derivative (IFN active), IL-
1 itself or the derivative thereof (IL-1 active substance), IL-
2 itself or a derivative thereof (IL-2 active substance), IL-
3 itself or its derivative (IL-3 active substance), IL-
4 itself or the derivative thereof (IL-4 active substance), IL-
5 itself or a derivative thereof (IL-5 active substance), IL-
6 itself or the derivative thereof (IL-6 active substance), IL-
7 itself or a derivative thereof (IL-7 active substance), IL-
8 itself or a derivative thereof (IL-8 active substance), IL-
9 itself or the derivative thereof (IL-9 active substance), IL-
10 itself or the derivative thereof (IL-10 active substance), IL-
11 itself or its derivative (IL-11 active substance) and IL
In the case of -12 itself or its derivative (IL-12 active substance), it is appropriate that the amount is about 0.01 mg or more, preferably about 0.1 to 10 mg, per 1 μg of each active substance. . The amount of surfactant added was 1 μm for each of the above active substances.
About 0.00001 mg per g or more, preferably about 0.0001 to 0.0
It is appropriate to use a range of about 1 mg. The amount of human serum albumin to be added is about 0.0001 mg or more, preferably about 0.001-1 mg per 1 μg of each of the above-mentioned active substances. For amino acids, about 0.
It is appropriate to use about 001 to 10 mg (when two or more kinds are mixed, the total amount thereof).

本発明の医薬製剤中に有効成分として含まれる一般式
（１）の化合物及びサイトカイン又はレチノイドの量
は、それぞれ特に限定されず広い範囲に適宜選択される
が、通常全組成物中有効成分総量として約１〜70重量
％、好ましくは約１〜30重量％程度の範囲とするのが適
当である。The amounts of the compound of general formula (1) and cytokines or retinoids contained as active ingredients in the pharmaceutical preparation of the present invention are not particularly limited, and are appropriately selected in a wide range. Suitably, it is in the range of about 1 to 70% by weight, preferably about 1 to 30% by weight.

本発明の制癌剤は、通常のこの種医薬組成物と同様の
ものとすることができ、他の薬理的有効成分や製剤上の
慣用成分等を任意に配合してもよい。The anticancer agent of the present invention can be the same as a usual pharmaceutical composition of this kind, and may optionally contain other pharmacologically active ingredients and conventional ingredients in pharmaceutical preparations.

特に、本発明制癌剤に配合できる他の成分としては、
例えばTNF−α活性物等のサイトカインの安定化を更に
増加させる面より、通常の含硫還元剤が好ましい。該含
硫還としては、具体的にはシステイン、Ｎ−アセチルホ
モシステイン、チオクト酸、チオグリコール酸及び之等
の塩類、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チ
オ硫酸ナトリウム、チオ乳酸、ジチオスレイトール、グ
ルタチオン等の比較的温和な還元剤等を好ましく例示で
き、之等は一種単独でも利用でき、２種以上併用するこ
ともできる。之等の添加量は特に制限されないが、サイ
トカイン活性物１μｇ当り約0.001mg程度以上、好まし
くは0.01〜10mg程度（２種以上併用する場合はそれらの
合計量）とするのが適当である。In particular, as other components that can be added to the anticancer agent of the present invention,
For example, a normal sulfur-containing reducing agent is preferable from the viewpoint of further increasing the stabilization of a cytokine such as a TNF-α active substance. Examples of the sulfur-containing sulfonate include cysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thioglycolic acid and salts thereof, thioethanolamine, thioglycerol, sodium thiosulfate, thiolactic acid, dithiothreitol, glutathione And the like. Relatively mild reducing agents and the like can be preferably exemplified, and these can be used alone or in combination of two or more. Although the amount of these additives is not particularly limited, it is suitably about 0.001 mg or more, preferably about 0.01 to 10 mg per 1 μg of the cytokine active substance (the total amount thereof when two or more kinds are used in combination).

本発明の制癌剤は、また、緩衝剤で等張化して安定な
等張化製剤とされるのが適当である。ここで用いられる
緩衝液としては、例えば代表的には、クエン酸−クエン
酸ナトリウム、クエン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−酢
酸ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のpH4〜８程度、好
ましくはpH5〜６程度の各種緩衝液を例示できる。The anticancer agent of the present invention is suitably made isotonic with a buffer to form a stable isotonic preparation. As the buffer used here, for example, typically, citric acid-sodium citrate, citric acid-sodium phosphate, acetic acid-sodium acetate, citric acid-borax, etc., have a pH of about 4 to 8, preferably pH 5 to 8. About 6 various buffers can be exemplified.

本発明制癌剤は、例えば通常薬理有効量のTNF−α活
性物、TGF−β活性物、IFN（IFN−α、IFN−β又はIFN
−γ）活性物、LT活性物、IL−１活性物、IL−２活性
物、IL−３活性物、IL−４活性物、IL−５活性物、IL−
６活性物、IL−７活性物、IL−８活性物、IL−９活性
物、IL−10活性物、IL−11活性物又はIL−12活性物及び
／又はレチノイド、一般式（１）で表される化合物及び
前記特定の配合成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合
して製剤組成物の形態に調整される。該製剤担体として
は使用形態に応じた製剤の調整に通常慣用される充填
剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至希
釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形態は、これ
が有効成分を効果的に含有する状態であれば特に限定は
なく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固型剤であって
もよく、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態であっても
よい。また、これらは使用前に適当な担体の添加により
液状となし得る乾燥品とすることもできる。之等の製剤
組成物はいずれも常法に従い調整され得る。The anticancer agent of the present invention is, for example, usually a pharmacologically effective amount of TNF-α active substance, TGF-β active substance, IFN (IFN-α, IFN-β or IFN
-Γ) active, LT active, IL-1 active, IL-2 active, IL-3 active, IL-4 active, IL-5 active, IL-
6 actives, IL-7 actives, IL-8 actives, IL-9 actives, IL-10 actives, IL-11 actives or IL-12 actives and / or retinoids, with the general formula (1) A suitable pharmaceutical preparation carrier is compounded together with the compound to be represented and the above-mentioned specific compounding ingredients to prepare a pharmaceutical composition. As the pharmaceutical carrier, any excipient or diluent such as a filler, a bulking agent, a binder, a humectant, a disintegrant and the like which are usually used for adjusting the pharmaceutical preparation according to the use form can be used. The form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it contains the active ingredient effectively, and may be in the form of tablets, powders, granules, solids such as pills, liquids, suspensions, and the like. Preparations, emulsions and the like. These can also be dried before use to make them liquid by adding an appropriate carrier. Any of these pharmaceutical compositions can be prepared according to a conventional method.

本発明の制癌剤の有効成分とするサイトカイン、例え
ばTNF−αと、一般式（１）で表わされるカルボスチリ
ル誘導体又はその塩からなる医薬製剤は、之等各有効成
分をそれぞれ単独の成分として含有する２剤の形態でそ
れぞれ別個に投与しても、また両者を同一製剤に配合し
て一剤で投与してもよい。特に例えばサイトカインは、
これ有効成分とする注射剤形態の医薬製剤として用いら
れるのが好ましい。また、本発明の一方の有効成分であ
る一般式（１）で表されるカルボスチリル誘導体又はそ
の塩は、従来公知の投与ルートのいずれかによって、例
えば経口的又は非経口的に投与することができる。目下
のところ好ましいのは経口投与であり、上記経口及び非
経口の医薬製造の製造は特公平１−41128号公報の記載
を参考にして実施することができる。Pharmaceutical preparations comprising a cytokine as an active ingredient of the anticancer agent of the present invention, for example, TNF-α, and a carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof contain each of the active ingredients as a single component. They may be administered separately in the form of two agents, or may be administered as a single agent by combining them in the same formulation. In particular, for example, cytokines
It is preferably used as a pharmaceutical preparation in the form of an injection containing the active ingredient. In addition, the carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, which is one of the active ingredients of the present invention, can be administered, for example, orally or parenterally by any of the conventionally known administration routes. it can. At present, oral administration is preferred, and the production of the above oral and parenteral pharmaceutical preparations can be carried out with reference to the description of Japanese Patent Publication No. 1-41282.

かくして得られる医薬製剤の投与方法は特に制限はな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、
疾患の程度に応じて決定される。The administration method of the pharmaceutical preparation thus obtained is not particularly limited, various preparation forms, patient age, gender, other conditions,
It is determined according to the degree of the disease.

該製剤組成物の形態に応じた適当な投与経路、例え
ば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、
皮内、腹腔内投与等により投与され、固剤形態の医薬製
剤は、経口又は径腸投与され得る。該投与方法は、例え
ば本発明の一方の有効成分である一般式（１）で表され
るカルボスチリル誘導体又はその塩を経口的に投与し、
或いは注射剤形態の医薬製剤を静脈内、筋肉内、皮下、
皮内、腹腔内投与等に投与し、一方のサイトカイン、例
えばTNF−α、TGF−β、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、L
T、LT−１、LT−６等を含有する上記注射剤形態の医薬
製剤を静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔投与等により
投与することもできる。また、本発明制癌剤の有効成分
である一般式（１）で表わされるカルボスチリル誘導体
又はその塩とレチノイドとの両者を、同一製剤に配合し
て一剤として経口的に投与することもできる。該投与
は、一日１回又は一日３〜４回に分けることもでき、そ
れぞれ有効成分を含有する医薬製剤を同時に、或いは別
々に時間をかえて投与することもできる。また、本発明
の有効成分の配合剤を一日１回又一日は３〜４回に分け
て投与することもできる。A suitable administration route depending on the form of the pharmaceutical composition, for example, a pharmaceutical preparation in the form of an injection can be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously,
Pharmaceutical preparations administered by intradermal or intraperitoneal administration and the like can be administered orally or enterally. The administration method includes, for example, orally administering a carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, which is one of the active ingredients of the present invention,
Alternatively, a pharmaceutical preparation in the form of an injection is intravenously, intramuscularly, subcutaneously,
Administered intradermally, intraperitoneally, etc., one cytokine such as TNF-α, TGF-β, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, L
The above-mentioned pharmaceutical preparation in the form of an injection containing T, LT-1, LT-6 and the like can also be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, intraperitoneally, or the like. In addition, both the carbostyril derivative represented by the general formula (1) or a salt thereof, which is an active ingredient of the anticancer agent of the present invention, and a retinoid can be blended into the same preparation and administered orally as a single preparation. The administration may be performed once a day or three to four times a day, and the pharmaceutical preparations containing the active ingredients may be administered simultaneously or separately at different times. Also, the combination of the active ingredient of the present invention can be administered once a day or divided into three to four times a day.

更に、本発明制癌剤又はその一方の有効成分である一
般式（１）のカルボスチリル誘導体及び／又はその塩
は、之等の製剤形態や投与経路によることなく、之等を
癌の化学療法剤として従来より知られている各種の抗癌
剤乃至その有効成分化合物と併用することもでき、また
従来公知の放射線療法や温熱療法等と併用することもで
きる。かかる併用によれば、本発明制癌剤自体が、前述
したように一般式（１）のカルボスチリル誘導体及び／
又はその塩とサイトカイン及び／又はレチノイドとの相
乗作用によって、優れた制癌効果を奏し得るに加えて、
上記併用される化学療法剤や放射線療法等の効果を一層
助長して、之等との併用による相乗効果をも発揮させ得
る。従って、之等の併用される化学療法剤を通常用いら
れている有効量よりもかなり少量とする場合でも充分な
癌治療効果が得られ、これによって公知の制癌剤等の化
学療法剤乃至各種治療法の実施にみられる副作用の軽減
化をはかることができ、非常に有利である。上記併用で
きる化学療法剤としては、例えば５−フルオロラウシル
（５−FU、協和発酵工業株式会社製）、マイトマイシン
（Mitomycin−Ｃ、大鵬薬品工業株式会社製）、エンド
キサン（Endoxan、塩野義製薬株式会社製）、トヨマイ
シン（Toyomicin、武田薬品工業株式会社製）等を例示
できる。Furthermore, the carbostyril derivative of the general formula (1) and / or a salt thereof, which is an anticancer agent of the present invention or one of the active ingredients, can be used as a chemotherapeutic agent for cancer without depending on the preparation form or administration route. It can be used in combination with conventionally known various anticancer agents or active ingredient compounds thereof, and can also be used in combination with conventionally known radiation therapy or hyperthermia. According to such a combination, the carcinostatic agent of the present invention itself contains the carbostyril derivative of the general formula (1) and / or
Or by synergistic action of a salt thereof and a cytokine and / or retinoid, in addition to being able to exert an excellent anticancer effect,
The effects of the above-mentioned chemotherapeutic agents and radiotherapy combined with each other can be further promoted, and the synergistic effect of the combined use with them can be exhibited. Therefore, even when the chemotherapeutic agent used in combination is considerably smaller than the usual effective amount, a sufficient cancer therapeutic effect can be obtained, whereby the known chemotherapeutic agent such as an anticancer agent or various therapeutic methods can be obtained. This is very advantageous because it can reduce the side effects seen in the implementation of the method. Examples of the chemotherapeutic agents that can be used in combination include 5-fluorolausyl (5-FU, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), mitomycin (Mitomycin-C, manufactured by Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.), endoxan (Endoxan, Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) And Toyomycin (Toyomicin, manufactured by Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.).

本発明によれば、サイトカイン、特にTNF−α、TGF−
β、IFN（IFN−α、IFN−β又はIFN−γ）、LT、IL−
１、IL−２、IL−３、IL−４、IL−５、IL−６、IL−
７、IL−８、IL−９、IL−10、IL−11、IL−12及び／又
はレチノイドと、一般式（１）で表されるカルボスチリ
ル誘導体及び／又はその塩とを併用することにより、そ
れぞれの抗腫瘍活性が相互に著しく増強され、また細胞
の分化誘導促進効果が発揮され、TNF−α、TGF−β、IF
N（IFN−α、IFN−β、又はIFN−γ）、LT、IL−１、IL
−２、IL−３、IL−４、IL−５、IL−６、IL−７、IL−
８、IL−９、IL−10、IL−11、IL−12、レチノイドのそ
れぞれ単独では抗腫瘍効果が発揮されないような低い投
与量においても、腫瘍細胞の増殖抑制効果や細胞の分化
誘導促進効果等の制癌効果が得られる。その結果、之等
各種のサイトカインやレチノイドの投与量の大幅な低減
及び前記副作用の軽減が可能となる。According to the present invention, cytokines, especially TNF-α, TGF-
β, IFN (IFN-α, IFN-β or IFN-γ), LT, IL-
1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-
7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 and / or a retinoid in combination with a carbostyril derivative represented by the general formula (1) and / or a salt thereof. , The respective antitumor activities are remarkably enhanced, and the effect of promoting cell differentiation is exhibited, and TNF-α, TGF-β, IF
N (IFN-α, IFN-β, or IFN-γ), LT, IL-1, IL
-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-
8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, and retinoid alone, even at such a low dose that the antitumor effect is not exerted, the effect of suppressing the growth of tumor cells and promoting the induction of cell differentiation. And other anticancer effects. As a result, it becomes possible to drastically reduce the doses of these various cytokines and retinoids and to reduce the side effects.

図面の簡単な説明 図１は薬理試験例３に従うヒト前骨髄性白血病細胞
（HL−60細胞）に対する本発明制癌剤の細胞増殖抑制効
果を試験した結果を示すグラフである。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the results of testing the antiproliferative effect of the anticancer agent of the present invention on human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) according to Pharmacological Test Example 3.

図２乃至図５は薬理試験例４に従い行なわれたHL−60
細胞の形態学的変化（マクロファージ系への分化誘導）
に及ぼす本発明制癌剤の効果試験の結果としての、生物
の形態（ギムザ染色後の上記細胞の顕微鏡観察結果）を
示す図面に代わる写真である。FIGS. 2 to 5 show HL-60 tests performed in accordance with Pharmacological Test Example 4.
Morphological changes of cells (induction of differentiation into macrophage system)
7 is a photograph instead of a drawing, showing the morphology of a living organism (the result of microscopic observation of the above cells after Giemsa staining) as a result of an effect test of the anticancer agent of the present invention.

発明を実施するための最良の形態 以下に、本発明制癌剤の薬理試験例を挙げる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, pharmacological test examples of the anticancer agent of the present invention will be described.

薬理試験例１ カルボスチリル誘導体として以下に示す供試化合物N
o.I〜IVを、レチノイドとして下記レチノイン酸を、ま
たサイトカインとして下記TNF−αをそれぞれ用いて、
次の薬理試験を行なった。Pharmacological Test Example 1 Test compound N shown below as a carbostyril derivative
oI to IV, using the following retinoic acid as a retinoid, and using the following TNF-α as a cytokine,
The following pharmacological tests were performed.

I. ６−［４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−
ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル II. ７−［４−（3,4,5−トリトキシベンゾイル）−１
−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル III. ７−［４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１
−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル IV. ６−［４−（４−エトキシベンゾイル）−１−ピ
ペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル 本試験例１においては、上記各供試化合物を1N塩酸に
溶解後、FCS（牛胎児血清、ギブコ社製）で希釈して、1
mg/ml溶解を調整し、同溶液を10％FCS添加RPMI−1640培
地（フロー社製）に添加して、1N NaOHで中和後、培地
のみ、10及び30μg/mlの各濃度に調製して利用した。I. 6- [4- (3,4-Dimethoxybenzoyl) -1-
Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril II. 7- [4- (3,4,5-triethoxybenzoyl) -1
-Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril III. 7- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1
-Piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril IV. 6- [4- (4-Ethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril In Test Example 1, each of the above test compounds was used. After dissolving in 1N hydrochloric acid, dilute with FCS (fetal calf serum, Gibco)
After adjusting the dissolution to mg / ml, the same solution was added to RPMI-1640 medium (manufactured by Flow) supplemented with 10% FCS, neutralized with 1N NaOH, and the medium alone was adjusted to concentrations of 10 and 30 μg / ml. Used.

また後記薬理試験例２においては、上記各供試化合物
をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して10mg/ml溶
液を調製し、同溶液を10％FCS添加RPMI−1640培地（フ
ロー社製）に添加して、1.88、7.5及び30μg/mlの各濃
度に調製して利用した。In the pharmacological test example 2 described below, each of the above test compounds was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a 10 mg / ml solution, and the solution was added to RPMI-1640 medium (manufactured by Flow) supplemented with 10% FCS. Then, they were prepared and used at concentrations of 1.88, 7.5 and 30 μg / ml, respectively.

レチノイド レチノイドとしては、レチノイン酸（オールトランス
・レチノイン酸、シグマ社製）を10％FCS添加RPMI−164
0培地で希釈して、10^-6及び10^-7M濃度に調製して利用し
た。Retinoid As a retinoid, retinoic acid (all-trans retinoic acid, manufactured by Sigma) is added to 10% FCS-added RPMI-164.
The medium was diluted with 0 medium and adjusted to 10 ⁻⁶ and 10 ⁻⁷ M for use.

サイトカイン サイトカインとしては、TNF−α（大腸菌に発現させ
て得られた組換え体ヒトTNF−α、比活性:2×10⁷単位/m
g、ゼンザイム社製）を、10％FCS添加RPMI−1640培地で
希釈して、1000単位/ml濃度に調製して利用した。Cytokines As cytokines, TNF-α (recombinant human TNF-α obtained by expression in E. coli, specific activity: 2 × 10 ⁷ units / m 2)
g, Zenzyme) was diluted with RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS and adjusted to a concentration of 1000 units / ml for use.

本薬理試験例において、ヒト前骨髄性白血病細胞（HL
−60）は、ガロ（Robert Gallo）らにより樹立されたヒ
ト白血病細胞株で、その細胞の性質は文献［Gallo,R.
C.,et al.,Blood,54,713（1979）］に記載されており、
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に
「ATCC No.CCL−240」なる寄託番号で受託されてい
る。In this pharmacological study, human promyelocytic leukemia cells (HL
-60) is a human leukemia cell line established by Robert Gallo et al.
C., et al., Blood, 54 , 713 (1979)].
Deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under the deposit number "ATCC No. CCL-240".

上記HL−60を10％FCS添加RPMI−1640培地（ギブコ社
製）にて、37℃、５％CO₂下で培養して、細胞数が１×1
0⁵個/mlの濃度となるように調製した。The above HL-60 was cultured in RPMI-1640 medium (manufactured by Gibco) supplemented with 10% FCS at 37 ° C. under 5% CO ₂ , and the cell number was 1 × 1.
0 ⁵ was prepared at a concentration of / ml.

次に、６穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に、上記で調製した培地のみを添加（対照群）、培
地中に供試化合物No.Iを10又は30μg/ml含めて添加（AZ
群）及びオールトランス・レチノイン酸（ATRA）を10^-7
M又は10^-6M添加（ATRA群）し、プレートを37℃、５％CO
₂下に５日間培養した。培養後、各穴の細胞浮遊液を取
り、エッペンドルフチューブに取り出し、生細胞数をコ
ールターカウンター（コールタール社製）にて測定し
た。Next, only the medium prepared above was added to each well of a 6-well microplate (manufactured by Coaster) (control group), and 10 or 30 μg / ml of test compound No. I was added to the medium ( AZ
Group) and all-trans retinoic acid (ATRA) at 10 ^-7
Add M or 10 ^-6 M (ATRA group) and plate at 37 ° C, 5% CO
Cultured under ₂ for 5 days. After the culture, the cell suspension in each well was removed, taken out into an Eppendorf tube, and the number of viable cells was measured with a Coulter counter (manufactured by Coal Tar).

上記細胞を１×10⁶個/mlに調製し、フルオレセインイ
ソチアネート（FITC）標識抗ヒトCD11抗体（Mo1、コー
ルター社製）にて染色後、フローサイトメトリー法によ
る、プロファイルII（コールター社製）にて、蛍光強度
を測定した。The above cells were prepared at 1 × 10 ⁶ cells / ml, stained with a fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-human CD11 antibody (Mo1, manufactured by Coulter), and then subjected to flow cytometry to obtain a profile II (produced by Coulter) ), The fluorescence intensity was measured.

上記で得られたAZ群、ATRA群及び両者の併用群の各群
における細胞増殖に対する抑制効果を、対照群の結果を
基準として、該基準値（０）に対する細胞増殖抑制増減
百分率（％）にて表１に示す。The inhibitory effect on cell proliferation in each of the AZ group, ATRA group and the combination thereof obtained above was expressed as a percentage (%) of increase / decrease in cell proliferation inhibition relative to the reference value (0) based on the result of the control group. The results are shown in Table 1.

またCD11発現量について得られた結果は、対照群のCD
11発現量を100％として、これに対する相対値にて表２
に示す。The results obtained for the CD11 expression level were
11 Assuming that the expression level is 100%, Table 2
Shown in

上記表１及び表２より、本発明制癌剤（即ち上記AZと
レチノイン酸との併用）によれば、レチノイン酸（ATRA
群）の癌細胞増殖抑制能及び分化誘導能がいずれも更に
高められることが明らかである。 According to Tables 1 and 2, according to the anticancer agent of the present invention (that is, the combination of AZ and retinoic acid), retinoic acid (ATRA
It is clear that both the ability to inhibit cancer cell growth and the ability to induce differentiation of group (2) are further enhanced.

薬理試験例２ HL−60を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、10％FC
S添加RPMI−1640培地にて、37℃、５％CO₂下で培養し、
細胞濃度を１×10⁵個/mlになるように調製した。Pharmacological Test Example 2 HL-60 was placed in each well of a 96-well plate, and 10% FC was added.
Cultured in S-added RPMI-1640 medium at 37 ° C. under 5% CO ₂ ,
The cell concentration was adjusted to 1 × 10 ⁵ cells / ml.

次に、各ウェルに各供試化合物を所定濃度で加え、更
にTNF−α1000単位/mlを含む10％FCS添加RPMI−1640培
地を加える（＋と表示）か又は加えることなく（−と表
示）、37℃、５％CO₂下で３日間培養した。尚、対照群
として、DMSO（供試化合物無添加）を添加し、更にTNF
−αの1000単位/mlを加えるか（＋）又は加えることな
く（−）、同様に培養する群を設けた。Next, each test compound is added to each well at a predetermined concentration, and RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS containing 1000 units / ml of TNF-α is added (indicated by +) or without (indicated by-) The cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 3 days. As a control, DMSO (without addition of the test compound) was added, and TNF was further added.
A group was similarly cultured with or without (−) or without (−) 1000 units / ml of −α.

上記培養後、各ウェルにMTT試薬［３−（4,5−ジメチ
ル−２−チアゾイル）−2,5−ジフェニル−2H・テラゾ
リウムブロマイド（和光純薬社製）を2.5mg/ml濃度とな
るようにダルベッコの培地（PBS^(-)、日本製薬社製）に
溶解し、濾過滅菌したもの］10μｌを添加し、37℃、５
％CO₂存在下に３時間培養し、次いで10％SDS含有0.01N
HCl溶液を各ウェルに100μｌずつ加え、更に37℃、５
％CO₂存在下で一晩培養した。After the above culture, the MTT reagent [3- (4,5-dimethyl-2-thiazoyl) -2,5-diphenyl-2H.terazolium bromide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) has a concentration of 2.5 mg / ml in each well. Was dissolved in a Dulbecco's medium (PBS ^(-) , manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and sterilized by filtration].
Culture for 3 hours in the presence of% CO ₂ , then 0.01N containing 10% SDS
Add 100 μl of HCl solution to each well.
The cells were cultured overnight in the presence of% CO ₂ .

培養後、タイターテックマルチスキャン（タイターテ
ック社製）を用いて、各ウェルの吸光度（OD580nm）を
測定した。After the culture, the absorbance (OD580 nm) of each well was measured using Titertec Multiscan (manufactured by Titertec).

得られた結果を表３に示す。 Table 3 shows the obtained results.

尚、上記結果（各供試化合物の各濃度における値）
は、TNF−α非存在下（−）におけるDMSO添加群（対
照）の値を基準（０）として、これに対する増殖抑制の
増減百分率（％）にて示したものである。 The above results (values at each concentration of each test compound)
Shows the percentage of increase / decrease in growth inhibition (%) with respect to the value of the DMSO-added group (control) in the absence of TNF-α (−) as a reference (0).

之等各表より、各供試化合物をTNF−αと併用した場
合は、いずれもTNF−α単独の場合より一層強い癌細胞
増殖抑制作用が認められ、このことから、上記各供試化
合物がTNF−αの癌細胞増殖抑制効果を一層助長するこ
とが明らかとなった。From each table, when each test compound was used in combination with TNF-α, a stronger inhibitory effect on cancer cell growth was observed in each case than in the case of using TNF-α alone. It has been clarified that TNF-α further promotes the cancer cell growth inhibitory effect.

薬理試験例３ ヒト前骨髄性白血病細胞（HL−60細胞）に対する効果試
験 供試化合物として６−［４−（3,4−ジメトキシベン
ゾイル）−１−ピペラジニル］−3,4−ジヒドロカルボ
スチリル（以下、「AZ」という）を1N塩酸に溶解後、FC
S（牛胎児血清、ギブコ社製）で希釈し、1mg/ml溶液を
調整した。同溶液を10％FCS添加RPMI−1640培地（フロ
ー社製）に添加し、1N−NaOHで中和した後、30μg/mlの
濃度に調整して利用し、これを下記の通り調整された各
種サイトカインと併用して本薬理試験を行なった。Pharmacological Test Example 3 Effect test on human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) As a test compound, 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril ( (Hereinafter referred to as “AZ”) dissolved in 1N hydrochloric acid,
It was diluted with S (fetal calf serum, manufactured by Gibco) to prepare a 1 mg / ml solution. This solution was added to 10% FCS-added RPMI-1640 medium (manufactured by Flow Inc.), neutralized with 1N-NaOH, and adjusted to a concentration of 30 μg / ml for use. This pharmacological test was performed in combination with cytokines.

サイトカインの調製 TNF−αは、大腸菌に発現させて得られた組換え体ヒ
トTNF−α（比活性２×10⁷単位/mg、ゼンザイム社製）
を用いた。該TNF−αを10％FCS添加RPMI−1640培地で希
釈して、1000単位/mlに調整した。Preparation of cytokine TNF-α is a recombinant human TNF-α obtained by expressing it in Escherichia coli (specific activity 2 × 10 ⁷ units / mg, manufactured by Zenzyme)
Was used. The TNF-α was diluted with RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS and adjusted to 1000 units / ml.

ヒト前骨髄性白血病細胞（HL−60細胞）は、前記薬理
試験例１で用いたものと同一である。The human promyelocytic leukemia cells (HL-60 cells) are the same as those used in the pharmacological test example 1.

上記HL−60細胞を10％FCS添加RPMI−1640培地にて37
℃、５％CO₂下で培養し、細胞数が１×10⁵個/mlの濃度
になるように調製した。The HL-60 cells were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS for 37 hours.
The cells were cultured at 5 ° C. under 5% CO _{2 so} that the number of cells was adjusted to 1 × 10 ⁵ cells / ml.

次に、６穴のマイクロプレート（コースター社製）の
各穴に上記１）及び２）で調整した上記培地のみの群
（コントロール群、Control）、培地中にAZを30μg/ml
含む群（AZ群）、培地中にTNF−αを1000単位/ml含む群
（TNF−α群）及び培地中にAZを30μg/ml及びTNF−αを
1000単位/ml含む群（AZ＋TNF−α群）の４群に分けそれ
ぞれ添加した後、37℃、５％CO₂下で６日間培養した。
培養後、各穴の細胞浮遊液を取り、0.2％トリパンブル
ー含有リン酸緩衝剤（和光純薬社製）と混合し、顕微鏡
下に未染色の生細胞数を計測した。Next, in each well of a 6-well microplate (manufactured by Coaster), a group of only the above-described medium (control group, Control) prepared by the above 1) and 2), and AZ in the medium was 30 μg / ml.
Group (AZ group), group containing TNF-α in the medium at 1000 units / ml (TNF-α group), and 30 μg / ml of AZ and TNF-α in the medium.
After adding to each of four groups of a group containing 1000 units / ml (AZ + TNF-α group), the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 6 days.
After the culture, the cell suspension in each well was collected, mixed with a phosphate buffer containing 0.2% trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the number of unstained viable cells was counted under a microscope.

その結果を図１に示す。該図において、細胞はカウン
トされた生細胞数（×10⁵個/ml）を示す。The result is shown in FIG. In the figure, the cells indicate the number of living cells counted (× 10 ⁵ cells / ml).

該図より、コントロール群、AZ群及びTNF−α群に比
較して、本発明のAZ＋TNF−α群は、著しい細胞の増殖
抑制効果を示した。As shown in the figure, the AZ + TNF-α group of the present invention showed a remarkable cell growth inhibitory effect as compared with the control group, the AZ group and the TNF-α group.

薬理試験例４ HL−60細胞に対するAZとTNF−αとの併用効果試験 ギムザ試薬（メルク社製）をリン酸緩衝液（pH6.4）
で、26倍に希釈してギムザ染色液とした。Pharmacological Test Example 4 Combination effect test of AZ and TNF-α on HL-60 cells Giemsa reagent (manufactured by Merck) in phosphate buffer (pH 6.4)
Then, it was diluted 26 times to obtain a Giemsa staining solution.

上記薬理試験例３と同様にして４群に分けて、同条件
下で６日間培養した後、細胞をスライドグラス上に添加
し、メタノール（和光純薬社製）固定した。風乾後、ギ
ムザ染色を行ない、顕微鏡下で形態学的観察を行なっ
た。The cells were divided into four groups in the same manner as in Pharmacological Test Example 3 and cultured for 6 days under the same conditions. Then, the cells were added to a slide glass and fixed with methanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After air drying, Giemsa staining was performed, and morphological observation was performed under a microscope.

ギムザ染色の結果を図２〜図５に示す。 The results of Giemsa staining are shown in FIGS.

該図（形態学的観察の結果）より、コントロール群
（図２）、AZ群（図３）、TNF−α群（図４）及びAZ＋T
NF−α群（図５）を比較すると、AZ＋TNF−α群は他の
３群に比較して、形態学的変化としてマクロファージ系
への分化誘導が早期に促進されていることが認められ
た。From the figure (the results of morphological observation), it can be seen that the control group (FIG. 2), the AZ group (FIG. 3), the TNF-α group (FIG.
Comparing the NF-α group (FIG. 5), it was found that the AZ + TNF-α group promoted the induction of differentiation into a macrophage system as a morphological change earlier than the other three groups.

薬理試験例５ HL−60細胞の増殖と発現マーカーに対するAZ及びTNF−
αの併用効果試験 HL−60細胞を薬理試験例３と同様にして培養し、細胞
濃度を５×10⁴個/mlに調整し、同条件下で、コントロー
ル群、AZ30μg/ml群、TNF−α1000単位/ml群及びAZ＋TN
F−α併用群の４群を３日間培養した。培養後、各培養
細胞浮遊液をエッペンドルフチューブに取り、0.2％ト
リパンブルー含有リン酸緩衝液で染色した後、生細胞数
を血球計算盤にて計測した。Pharmacological Test Example 5 AZ and TNF- for proliferation and expression markers of HL-60 cells
Combination effect test of α HL-60 cells were cultured in the same manner as in Pharmacological Test Example 3, the cell concentration was adjusted to 5 × 10 ⁴ cells / ml, and under the same conditions, the control group, the AZ30 μg / ml group, and the TNF- α1000 unit / ml group and AZ + TN
Four groups of the F-α combination group were cultured for 3 days. After culturing, each cultured cell suspension was placed in an Eppendorf tube, stained with 0.2% trypan blue-containing phosphate buffer, and the number of viable cells was counted using a hemocytometer.

上記細胞を１×10⁷個/mlに調整し、その100μｌにフ
ルオレセインイソチアネート（FITC）標識抗ヒトCD11抗
体（Mol、コールター社製）５μｌあるいはFITC標識抗
ヒトCD14抗体（LeuM13、ベクトン・ディンソン社製）20
μｌを添加し、氷上で30分間暗所にて反応させた。反応
後、0.1％BSA（牛血清アルブミン、シグマ社製）含有PB
S（リン酸緩衝液、日水製薬社製）で２回洗浄し、最終
的に500μｌに懸濁させた後、フローサイトメトリー法
による、プロファイルII（コールター社製）にて蛍光強
度を測定した。The above cells were adjusted to 1 × 10 ⁷ cells / ml, and 100 μl of the cells was added to 5 μl of a fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-human CD11 antibody (Mol, manufactured by Coulter) or FITC-labeled anti-human CD14 antibody (LeuM13, Becton Dinson) 20)
μl was added and reacted on ice for 30 minutes in the dark. After the reaction, PB containing 0.1% BSA (bovine serum albumin, manufactured by Sigma)
After washing twice with S (phosphate buffer, manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) and finally suspending in 500 μl, the fluorescence intensity was measured by flow cytometry with Profile II (manufactured by Coulter). .

その結果を表４に示す。 Table 4 shows the results.

該表より、コントロール群、AZ群、TNF−α群及びAZ
＋TNF−α群を比較すると、AZ＋TNF−α群（併用群）で
は、他の３群に比較して早期より細胞増殖抑制効果が認
められ、単球・マクロファージ系への分化誘導をより促
進していることが認められた。 From the table, the control group, AZ group, TNF-α group and AZ
Comparing the + TNF-α group, the AZ + TNF-α group (combination group) showed a cell growth inhibitory effect earlier than the other three groups, and further promoted differentiation induction into monocyte / macrophage system. Was admitted.

薬理試験例６ A375S2にヒトメラノーマ細胞に対するAZとIFN−γとの
併用効果試験 継代培養によって得られた細胞株（A375S2株:ATCC C
RL1872）、PBS^(-)溶液（日水製薬社製）で２回洗浄し、
0.05％トリプシン（フロー社製）で細胞を剥がした後、
ピペッティングにより、イーグルスMFM（Eagle′ｓ−ME
M,E−MEM）培地（日水製薬上製）＋10％FBS（ギブコ社
製）の培養液に細胞を懸濁させた。25℃、1200回転、５
分間の遠心洗浄（05PR−22型、日立製作所社製）した細
胞を再び同培養液に懸濁させた。0.2％トリパンブルー
（和光純薬社製）溶液にて染色後、生細胞数を光学顕微
鏡（BH−２、オリンパス光学工業社製）下で計測し、２
×10⁴細胞/mlに希釈調製した。Pharmacological Test Example 6 A375S2 combined effect test of AZ and IFN-γ on human melanoma cells A cell line obtained by subculture (A375S2 strain: ATCC C
RL1872), washed twice with a PBS ^(-) solution (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
After detaching the cells with 0.05% trypsin (FLOW),
Eagles MFM (Eagle's-ME
The cells were suspended in a culture solution of (M, E-MEM) medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) + 10% FBS (manufactured by Gibco). 25 ℃, 1200 rotations, 5
The cells that had been washed by centrifugation (05PR-22, manufactured by Hitachi, Ltd.) for 1 minute were suspended again in the same culture solution. After staining with 0.2% trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution, the number of viable cells was counted under an optical microscope (BH-2, manufactured by Olympus Optical Industries, Ltd.).
The dilution was adjusted to × 10 ⁴ cells / ml.

96ウェルマイクロプレート（コーニング社製）上の各
ウェルに培養液（Ｅ−MEM＋10％FBS）を0.1ml/ウェルず
つ添加した。次にマイクロプレートの１行目に120μg/m
lのAZ0.1mlずつを加え、同AZの２倍段階希釈を２行目以
降11行目まで繰り返した。このように希釈系列を作った
96ウェルマイクロプレートのすべてのウェルに、最終濃
度が０、2.5、25、250U/mlとなる量のIFN−γ（林原生
物研究所社製）を含むA375S2細胞浮遊液（２×10⁴細胞/
ml）を0.1mlずつ加えた。A culture solution (E-MEM + 10% FBS) was added to each well of a 96-well microplate (manufactured by Corning) at 0.1 ml / well. Next, in the first row of the microplate, 120 μg / m
1 ml of AZ was added, and the 2-fold serial dilution of the same AZ was repeated from the second line to the 11th line. I made a dilution series like this
A375S2 cell suspension (2 × 10 ⁴ cells /
ml) was added in 0.1 ml portions.

このマイクロプレートを37℃、５％CO₂条件下で７日
間CO₂インキュベータ−（ナプコ社製）で培養した。培
養後、0.05％ニュートラルレッド（メルク社製）を含む
Ｅ−MEM溶液を各ウェルに0.1mg/ウェルずつ加え、更に3
7℃、５％CO₂条件下に２時間培養した。The microplate was cultured in a CO ₂ incubator (manufactured by Napco) for 7 days at 37 ° C. and 5% CO ₂ . After culturing, an E-MEM solution containing 0.05% neutral red (manufactured by Merck) was added to each well at a concentration of 0.1 mg / well, and an additional 3 mg / well was added.
The cells were cultured at 7 ° C. and 5% CO ₂ for 2 hours.

その後、培地をすててPBS^(-)溶液を各ウェルに添加
し、洗浄操作を行なった。抽出後（0.1M NaH₂PO₄緩衝
液＋50％エタノール、和光純薬社製）を各ウェルに0.1m
l/ウェルずつ添加し、マイクロミキサー（MX−４、三光
純薬社製）で撹拌後、OD540nmの吸光度（タイターテッ
クマルチスキャンMMC、フロー社製）を測定した。この
吸光度から、生細胞に取り込まれた色素量を測定し、下
式に従って細胞増殖率（％）を求めた。Thereafter, the medium was discarded, and a PBS ^(-) solution was added to each well to perform a washing operation. After extraction (0.1 M NaH ₂ PO ₄ buffer + 50% ethanol, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.1 m is added to each well.
1 / well was added, and the mixture was stirred with a micromixer (MX-4, manufactured by Sanko Junyaku), and the absorbance at OD 540 nm (Titertec Multiscan MMC, manufactured by Flow) was measured. From the absorbance, the amount of the dye incorporated in the living cells was measured, and the cell growth rate (%) was determined according to the following equation.

細胞増殖率（％）＝M/C×100 ［式中Ｍは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、Ｃは
コントロール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。］ 得られた結果を下記表５に示す。Cell proliferation rate (%) = M / C × 100 [where M indicates the amount of dye taken up by cells in the treatment group, and C indicates the amount of dye taken up by cells in the control group. The results obtained are shown in Table 5 below.

上記表５より、A375S2細胞に対する増殖抑制作用にお
いて、IFN−γとAZとの併用効果が確認された。 From the above Table 5, the combined effect of IFN-γ and AZ was confirmed in the growth inhibitory effect on A375S2 cells.

薬理試験例７ A375S2にヒトメラノーマ細胞に対するAZとIL−１との併
用効果試験 継代培養によって得られた細胞株（A375S2株:ATCC C
RL1872）を、PBS^(-)溶液（日水製薬社製）で２回洗浄
し、0.05％トリプシン（フロー社製）で細胞を剥がした
後、ピペッテッングにより、Ｅ−MEM培地（日水製薬社
製）＋10％FBS（ギブコ社製）の培養液に細胞を懸濁さ
せた。25℃、1200回転、５分間の遠心洗浄（05PR−22
型、日立製作所社製）した細胞を再び同培養液に懸濁さ
せた。0.2％トリパンブルー（和光純薬社製）を溶液に
て染色後、生細胞数を光学顕微鏡（BH−２、オリンパス
光学工業社製）で下で計測し、２×10⁴細胞/mlに希釈調
製した。Pharmacological Test Example 7 Effect Test of A375S2 in Combination of AZ and IL-1 on Human Melanoma Cells Cell line obtained by subculture (A375S2 strain: ATCC C
RL1872) was washed twice with a PBS ^(-) solution (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and the cells were detached with 0.05% trypsin (manufactured by Flow Inc.). ) The cells were suspended in a culture solution of + 10% FBS (manufactured by Gibco). Centrifugal washing at 25 ° C, 1200 rotations, 5 minutes (05PR-22
(Manufactured by Hitachi, Ltd.) were suspended again in the same culture solution. After staining with 0.2% trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), the number of viable cells was counted under an optical microscope (BH-2, manufactured by Olympus Optical Industries), and diluted to 2 × 10 ⁴ cells / ml. Prepared.

96ウェルマイクロプレート（コーニング社製）上の各
ウェルに培養液（Ｅ−MEM＋10％FBS）を0.1ml/ウェルず
つ添加した。次にマイクロプレートのＡ列に0.4ng/mlの
IL−１を0.1mlずつを加え、同IL−１の２倍段階希釈を
Ｈ列まで繰り返した。このように希釈系列を作った96ウ
ェルマイクロプレートの１行目以外のすべてのウェル
に、最終濃度が０、１、３、10、30μg/mlとなる量のAZ
を含むA375S2細胞浮遊液（２×10⁴細胞/ml）を0.1mlず
つ加えた。A culture solution (E-MEM + 10% FBS) was added to each well of a 96-well microplate (manufactured by Corning) at 0.1 ml / well. Next, add 0.4 ng / ml to row A of the microplate.
IL-1 was added in 0.1 ml portions, and the 2-fold serial dilution of IL-1 was repeated up to column H. In all the wells except the first row of the 96-well microplate thus prepared, the final concentration of AZ was set to 0, 1, 3, 10, 30 μg / ml.
A375S2 cell suspension (2 × 10 ⁴ cells / ml) containing 0.1 ml was added.

このマイクロプレートを37℃、５％CO₂条件下で４日
間CO₂インキュベーター（ナプコ社製）で培養した。培
養後、0.05％ニュートラルレッド（メルク社製）を含む
Ｅ−MEM溶液を各ウェルに0.1mg/ウェルずつ加え、更に3
7℃、５％CO₂条件下に２時間培養した。This microplate was cultured in a CO ₂ incubator (manufactured by Napco) for 4 days at 37 ° C. and 5% CO ₂ . After culturing, an E-MEM solution containing 0.05% neutral red (manufactured by Merck) was added to each well at a concentration of 0.1 mg / well, and an additional 3 mg / well was added.
The cells were cultured at 7 ° C. and 5% CO ₂ for 2 hours.

その後、培地をすててPBS^(-)溶液を各ウェルに添加
し、洗浄操作を行なった。抽出後（0.1M NaH₂PO₄緩衝
液＋50％エタノール、和光純薬社製）を各ウェルに0.1m
l/ウェルずつ添加し、マイクロミキサー（MX−４、三光
純薬社製）で撹拌後、OD540nmの吸光度（タイターテッ
クマルチスキャンMMC、フロー社製）を測定した。この
吸光度から、生細胞に取り込まれた色素量を測定し、下
式に従って細胞増殖率（％）を求めた。Thereafter, the medium was discarded, and a PBS ^(-) solution was added to each well to perform a washing operation. After extraction (0.1 M NaH ₂ PO ₄ buffer + 50% ethanol, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), 0.1 m is added to each well.
1 / well was added, and the mixture was stirred with a micromixer (MX-4, manufactured by Sanko Junyaku), and the absorbance at OD 540 nm (Titertec Multiscan MMC, manufactured by Flow) was measured. From the absorbance, the amount of the dye incorporated in the living cells was measured, and the cell growth rate (%) was determined according to the following equation.

細胞増殖率（％）＝M/C×100 ［式中Ｍは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、Ｃは
コントロール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。］ 得られた結果を下記表６に示す。Cell proliferation rate (%) = M / C × 100 [where M indicates the amount of dye taken up by cells in the treatment group, and C indicates the amount of dye taken up by cells in the control group. The results obtained are shown in Table 6 below.

上記表６より、A375S2細胞に対する増殖抑制作用にお
いて、IL−１とAZとの併用効果が確認された。 From the above Table 6, the combined effect of IL-1 and AZ was confirmed in the growth inhibitory effect on A375S2 cells.

薬理試験例８ Hep3B細胞に対するAZとTGF−βとの併用効果試験 継代培養によって得られた細胞株（Hep3B株:ATCC HB
8064）を、PBS^(-)溶液（日水製薬社製）で２回洗浄し、
0.05％トリプシン（フロー社製）で細胞を剥がした後、
ピペッティングにより、ダルベッコーMFM培地（フロー
社製）＋１％非必須アミノ酸（フロー社製）＋2mM Ｌ
−グルタミン（フロー社製）の培地に細胞を懸濁させ
た。25℃、1200回転、５分間の遠心洗浄（05PR−22型、
日立製作所社製）にて３回洗浄後、細胞を再び同培地に
懸濁させた。0.2％トリパンブルー（和光純薬社製）溶
液にて染色後、生細胞数を光学顕微鏡（BH−２、オリン
パス光学工業社製）下で計測し、１×10⁶細胞/mlに希釈
調製した。Pharmacological Test Example 8 Effect test of combination use of AZ and TGF-β on Hep3B cells Cell line obtained by subculture (Hep3B strain: ATCC HB
8064) was washed twice with a PBS ^(-) solution (Nissui Pharmaceutical),
After detaching the cells with 0.05% trypsin (FLOW),
By pipetting, Dulbecco's MFM medium (manufactured by Flow) + 1% non-essential amino acids (manufactured by Flow) + 2 mM L
-Cells were suspended in a medium of glutamine (manufactured by Flow). 25 ° C, 1200 rpm, 5 minutes centrifugal washing (05PR-22 type,
After washing three times with Hitachi, Ltd.), the cells were suspended again in the same medium. After staining with 0.2% trypan blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution, the number of viable cells was counted under an optical microscope (BH-2, manufactured by Olympus Optical Industries, Ltd.), and diluted to 1 × 10 ⁶ cells / ml. .

96ウェルマイクロプレート（コーニング社製）上の各
ウェルに、０、0.5及び1.5ng/mlのTGF−β並びに０、0.
3、１、３、10及び30μg/mlのAZを、それぞれ0.025ml/
ウェルずつ添加した。次にすべてのウェルに、Hep3B細
胞浮遊液（１×10⁶細胞/ml）を0.05mlずつ加えた。In each well of a 96-well microplate (manufactured by Corning), 0, 0.5 and 1.5 ng / ml of TGF-β and 0, 0,
3, 1, 3, 10, and 30 μg / ml of AZ were added at 0.025 ml /
Each well was added. Next, 0.05 ml of Hep3B cell suspension (1 × 10 ⁶ cells / ml) was added to all wells.

このマイクロプレートを37℃、５％CO₂条件下で24時
間CO₂インキュベーター（ナプコ社製）で培養した。培
養後、2.5mg/mlのMTT（３−（4,5−ジメチル−２−チア
ゾリル）−2,5−ジフェニル−2H テトラゾリウム、和
光純薬社製）を含むPBS^(-)溶液（日水製薬社製）を各ウ
ェルに0.01ml/ウェルずつ加え、更に37℃、５％CO₂条件
下に３時間培養した。This microplate was cultured in a CO ₂ incubator (manufactured by Napco) for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO ₂ . After the culture, a PBS ^(-) solution containing 2.5 mg / ml of MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) Was added to each well in an amount of 0.01 ml / well, and the cells were further cultured at 37 ° C. under 5% CO ₂ for 3 hours.

その後、溶出液（10％SDS＋0.01N HCl、和光純薬社
製）を各ウェルに0.1ml/ウェルずつ添加し、OD580nmの
吸光度（タイターテックマルチスキャンMMC、フロー社
製）を測定した。この吸光度から、生細胞に取り込まれ
た色素量を測定し、下式に従って細胞増殖率（％）を求
めた。Thereafter, an eluate (10% SDS + 0.01N HCl, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to each well at 0.1 ml / well, and the absorbance at OD 580 nm (Titertec Multiscan MMC, manufactured by Flow) was measured. From the absorbance, the amount of the dye incorporated in the living cells was measured, and the cell growth rate (%) was determined according to the following equation.

細胞増殖率（％）＝M/C×100 ［式中Ｍは処置群の細胞に取り込まれた色素量を、Ｃは
コントロール群の細胞に取り込まれた色素量を示す。］ また、培養した上記細胞をヘキスト33258色素（Hoech
st stain kit,フロー社製）にて核染色し、蛍光顕微鏡
（ニコン（Nikon Microphot FXA））下で観察した。Cell proliferation rate (%) = M / C × 100 [where M indicates the amount of dye taken up by cells in the treatment group, and C indicates the amount of dye taken up by cells in the control group. In addition, the cultured cells were used for Hoechst 33258 dye (Hoechst).
Nuclear staining was performed with a st stain kit (manufactured by Flow) and observed under a fluorescence microscope (Nikon Microphot FXA).

細胞増殖率の結果を下記表７に示す。 The results of the cell growth rate are shown in Table 7 below.

また核染色後の蛍光顕微鏡観察の結果より、AZ及びTG
C−βをそれぞれ単独で用いて作用させた場合、クロマ
チンの凝集、核濃縮が認められ、両者を併用した場合に
は更にその程度の増強が観察された。従って、Hep3B細
胞に対する量薬剤の細胞傷害作用がアポトーシスに基づ
くものであり、両者を併用した場合にアポトーシスが更
に増強されることが示唆された。 Also, from the results of fluorescence microscopy after nuclear staining, AZ and TG
When C-β was used alone, agglutination of chromatin and nuclear concentration were observed, and when both were used, further enhancement was observed. Therefore, it was suggested that the cytotoxic effect of the drug on Hep3B cells was based on apoptosis, and that when both were used in combination, apoptosis was further enhanced.

以上より、Hep3B細胞に対する増殖抑制作用におい
て、TGF−βとAZとの併用効果が確認された。From the above, the combined effect of TGF-β and AZ was confirmed in the growth inhibitory effect on Hep3B cells.

以下、カルボスチリル誘導体とサイトカインとの併用
による本発明制癌剤の製剤例を挙げる。Hereinafter, preparation examples of the anticancer agent of the present invention using a combination of a carbostyril derivative and a cytokine will be described.

製剤例 １ （１） ６−［４−（3,4−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペ
ラジニル］−3,4−ジヒドロカルボスチリル 5mg デンプン 132mg マグネシウムステアレート 18mg乳糖 45mg 計 200mg １錠中、上記組成物の錠剤を製造した。Formulation Example 1 (1) 6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 5 mg Starch 132 mg Magnesium stearate 18 mg Lactose 45 mg Total 200 mg The above composition in one tablet Tablets were produced.

（２） TNF−α １×10⁵単位/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(2) TNF-α 1 × 10 ⁵ units / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components have the above concentrations. Then, the mixture is added to a 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), mixed, filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate is aseptically dispensed into vials in 1 ml portions. And
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（２）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、上記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (2) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（３） TGF−β ４ μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(3) TGF-β 4 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. The mixture was added to 0.01M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0) and mixed. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（３）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、上記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (3) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（４） LT（TNF−β） １×10⁵単位/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(4) LT (TNF-β) 1 × 10 ⁵ units / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The mixture was added to a 0.01M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0) and mixed to obtain the concentration, and the mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter). Dispensed into
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（４）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、上記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (4) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（５） インターロイキン−１β 0.08μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(5) Interleukin-1β 0.08 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（５）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (5) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（６） ガンマー・インターフェロン 42 単位/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍ）メンブランフィルター
使用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注
し、凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の
有効成分の一方を含む制癌剤を調整した。(6) Gamma interferon 42 units / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. The mixture was added to a 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0) and mixed. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions. Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（６）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に、又は別々に利用され
る。When used, the preparation (6) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously with or separately from the preparation of (1).

（７） アルファー・インターフェロン 45 単位/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(7) Alpha interferon 45 units / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. The mixture was added to 0.01M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0) and mixed. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（７）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When the preparation (7) is used, it is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（８） ベーター・インターフェロン 48 単位/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(8) Beta-interferon 48 units / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. The mixture was added to 0.01M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0) and mixed. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（８）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (8) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（９） インターロイキン−２ 0.28μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(9) Interleukin-2 0.28 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（９）は、これを用時、生理食塩水lmlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (9) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously with or separately from the preparation of (1).

（10） インターロイキン−４ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(10) Interleukin-4 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（10）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When the preparation (10) is used, it is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of the above (1).

（11） インターロイキン−５ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(11) Interleukin-5 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（11）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (11) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（12） インターロイキン−６ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調整した。(12) Interleukin-6 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（12）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (12) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（13） インターロイキン−７ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(13) Interleukin-7 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（13）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (13) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（14） インターロイキン−８ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(14) Interleukin-8 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（14）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (14) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（15） インターロイキン−９ 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(15) Interleukin-9 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（15）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (15) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（16） インターロイキン−10 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(16) Interleukin-10 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（16）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (16) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（17） インターロイキン−11 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(17) Interleukin-11 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（17）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (17) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（18） インターロイキン−12 50 μg/ml ツウィーン80 0.01mg/ml デキストラン40 15 mg/ml システイン 0.1 mg/ml HSA（ヒト血清アルブミン） 1.0 mg/ml 上記各成分を、上記の濃度となるように、0.01Mクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に加えて混
合し、混合物を瀘過（0.22μｍメンブランフィルター使
用）後、瀘液を無菌的に1mlずつバイアル瓶に分注し、
凍結乾燥して、注射用製剤形態の本発明の制癌剤の有効
成分の一方を含む制癌剤を調製した。(18) Interleukin-12 50 μg / ml Tween 80 0.01 mg / ml Dextran 40 15 mg / ml cysteine 0.1 mg / ml HSA (human serum albumin) 1.0 mg / ml The above components were adjusted to the above concentrations. , 0.01 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.0), and the mixture was filtered. The mixture was filtered (using a 0.22 μm membrane filter), and the filtrate was aseptically dispensed into vials in 1 ml portions.
Lyophilized to prepare an anticancer drug containing one of the active ingredients of the anticancer drug of the present invention in the form of an injection preparation.

該製剤（18）は、これを用時、生理食塩水1mlに溶解
して、前記（１）の製剤と同時に又は別々に利用され
る。When used, the preparation (18) is dissolved in 1 ml of physiological saline and used simultaneously or separately with the preparation of (1).

（19） １−ベンジル−６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイ
ル）−１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチ
リル 150g オール・トランス・レチノイン酸 15g アビセル（商標名，旭化成（株）製） 40g コーンスターチ 30g ステアリン酸マグネシウム 2g ヒドロキシプロピルメチルセルロース 10g ポリエチレングリコール−6000 3g ヒマシ油 40g メタノール 40g 上記カルボスチリル誘導体、オール・トランス・レチ
ノイン酸、アビセル、コーンスターチ及びステアリン酸
マグネシウムを混合研磨後、糖衣R10mmのキネで打錠す
る。得られた錠剤をヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、ポリエチレングリコール−6000、ヒマシ油及びメタ
ノールからなるフィルムコーティング剤で被覆を行な
い、フィルムコーティング錠を製造する。(19) 1-benzyl-6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 150 g all-trans-retinoic acid 15 g Avicel (trade name, Asahi Kasei Corporation) 40g Corn starch 30g Magnesium stearate 2g Hydroxypropyl methylcellulose 10g Polyethylene glycol-6000 3g Castor oil 40g Methanol 40g After mixing and polishing the above carbostyril derivative, all-trans retinoic acid, Avicel, corn starch and magnesium stearate, sugar coating R10mm Tablet with kine. The obtained tablets are coated with a film coating agent consisting of hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene glycol-6000, castor oil and methanol to produce film-coated tablets.

（20） １−ベンジル−６−〔４−（3,4−ジメトキシベンゾイ
ル）−１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチ
リル 150.0g オール・トランス・レチノイン酸 15.0g クエン酸 1.0g ラクトース 33.5g リン酸二カルシウム 70.0g プルロニックＦ−68 30.0g ラウリル硫酸ナトリウム 15.0g ポリビニルピロリドン 15.0g ポリエチレングリコール（カルボワックス1500） 4.5g ポリエチレングリコール（カルボワックス6000） 45.0g コーンスターチ 30.0g 乾燥ラウリル硫酸ナトリウム 3.0g 乾燥ステアリン酸マグネシウム 3.0g エタノール 適量 上記カルボスチリル誘導体、オール・トランス・レチ
ノイン酸クエン酸、ラクトース、リン酸二カルシウム、
プルロニックＦ−68及びラウリル硫酸ナトリウムを混合
する。混合物をNo.60スクリーンにて篩別し、ポリビニ
ルピロリドン、カルボワックス1500及びカルボワックス
6000を含むアルコール性溶液で湿式粒状化する。必要に
応じてアルコールを添加し、粉末をペースト状塊にす
る。コーンスターチを添加し、均一な粒子が形成される
まで混合を続ける。No.10スクリーンを通過させ、トレ
イに入れ、100℃のオーブンで12〜14時間乾燥する。乾
燥粒子をNo.16スクリーンで篩別し、乾燥ラウリル硫酸
ナトリウム及び乾燥ステアリン酸マグネシウムを加え、
混合し、打錠機で所望の形状に圧縮成形する。(20) 1-benzyl-6- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril 150.0 g all-trans-retinoic acid 15.0 g citric acid 1.0 g lactose 33.5 g Dicalcium phosphate 70.0 g Pluronic F-68 30.0 g Sodium lauryl sulfate 15.0 g Polyvinyl pyrrolidone 15.0 g Polyethylene glycol (Carbowax 1500) 4.5 g Polyethylene glycol (Carbowax 6000) 45.0 g Corn starch 30.0 g Dry sodium lauryl sulfate 3.0 g Dry stearin Magnesium phosphate 3.0 g Ethanol Appropriate amount Carbostyril derivative, citric acid all-trans-retinoic acid, lactose, dicalcium phosphate,
Mix Pluronic F-68 and sodium lauryl sulfate. The mixture was sieved through a No. 60 screen, and polyvinylpyrrolidone, carbowax 1500 and carbowax
Wet granulation with an alcoholic solution containing 6000. If necessary, alcohol is added to make the powder into a pasty mass. Add corn starch and continue mixing until uniform particles are formed. Pass through a No. 10 screen, place in a tray and dry in an oven at 100 ° C. for 12-14 hours. The dried particles are sieved through a No. 16 screen, and dried sodium lauryl sulfate and dried magnesium stearate are added.
The mixture is mixed and compression molded into a desired shape using a tableting machine.

上記芯部をワニスで処理し、タルクを散布して湿気の
吸収を防止する。芯部の周囲に下塗り層を被覆する。内
服用のために充分な回数のワニス被覆を行なう。錠剤を
完全に丸く且つ滑らかにするために、更に下塗り層及び
平滑被覆を適用する。所望の色合が得られるまで着色被
覆を行なう。乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一な光沢の錠
剤を調整する。The core is treated with varnish and talc is sprayed to prevent moisture absorption. An undercoat layer is coated around the core. Apply varnish a sufficient number of times for internal use. An additional subbing layer and smooth coating are applied to make the tablet completely round and smooth. Color coating is carried out until the desired hue is obtained. After drying, the coated tablets are polished to prepare tablets of uniform gloss.

産業上の利用可能性 本発明の制癌剤は、その特有の抗腫瘍作用、細胞分化
誘導能に基づいて、癌の治療剤として有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The anticancer agent of the present invention is useful as a therapeutic agent for cancer based on its unique antitumor activity and cell differentiation inducing ability.

フロントページの続き (72)発明者 富永 道明 徳島県板野郡上板町高磯310―６ (72)発明者 足立 正一 群馬県高崎市石原町3493番の９Continuation of the front page (72) Inventor Michiaki Tominaga 310-6 Takaiso, Kamiita-cho, Itano-gun, Tokushima Prefecture (72) Inventor Shoichi Adachi 3493-9, Ishiharacho, Takasaki-shi, Gunma Prefecture

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】一般式 〔式中Ｒはフェニル環上に低級アルコキシ基及び低級ア
ルキル基から選ばれる基の１〜３個を有することのある
ベンゾイル基を示す。カルボスチリル骨格の３位と４位
との炭素間結合は一重結合又は二重結合を示す。〕 で表わされるカルボスチリル誘導体及び／又はその医薬
として許容される塩と、サイトカイン及び／又はレチノ
イドとを有効成分として含有することを特徴とする制癌
剤。(1) General formula [In the formula, R represents a benzoyl group which may have 1 to 3 groups selected from a lower alkoxy group and a lower alkyl group on a phenyl ring. The carbon-carbon bond between the 3-position and the 4-position of the carbostyril skeleton indicates a single bond or a double bond. ] An anti-cancer agent comprising a carbostyril derivative represented by the following formula and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a cytokine and / or a retinoid as active ingredients. 【請求項２】カルボスチリル誘導体が６−〔４−（3,4
−ジメトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル〕−3,4
−ジヒドロカルボスチリル、７−〔４−（3,4,5−トリ
メトキシベンゾイル）−１−ピペラジニル〕−3,4−ジ
ヒドロカルボスチリル、７−〔４−（3,4−ジメトキシ
ベンゾイル）−１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカ
ルボスチリル及び６−〔４−（４−エトキシベンゾイ
ル）−１−ピペラジニル〕−3,4−ジヒドロカルボスチ
リルから選ばれる少なくとも１種である請求の範囲１に
記載の制癌剤。2. The method of claim 2, wherein the carbostyril derivative is 6- [4- (3,4
-Dimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4
-Dihydrocarbostyril, 7- [4- (3,4,5-trimethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril, 7- [4- (3,4-dimethoxybenzoyl) -1 The compound according to claim 1, which is at least one member selected from -piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril and 6- [4- (4-ethoxybenzoyl) -1-piperazinyl] -3,4-dihydrocarbostyril. Anticancer agent. 【請求項３】サイトカインがヒトTNF−α、ヒトTNF−
β、ヒトIFN−α、ヒトIFN−β、ヒトIFN−γ、ヒトIL
−１α、ヒトIL−１β及びヒトTGF−βから選ばれる少
なくとも１種である請求の範囲１に記載の制癌剤。3. The method according to claim 1, wherein the cytokine is human TNF-α or human TNF-α.
β, human IFN-α, human IFN-β, human IFN-γ, human IL
The anticancer agent according to claim 1, which is at least one selected from -1α, human IL-1β and human TGF-β. 【請求項４】レチノイドがレチノイン酸、レチノール、
レチナール及びレチニルエステルから選ばれる少なくと
も１種である請求の範囲１に記載の制癌剤。4. The retinoid is retinoic acid, retinol,
The anticancer agent according to claim 1, which is at least one selected from retinal and retinyl ester. 【請求項５】サイトカインが天然型ヒトTNF−α、組換
え型ヒトTNF−α又はヒトTNF−α活性を有するヒトTNF
−α誘導体である請求の範囲３に記載の制癌剤。5. The cytokine, wherein the cytokine is natural human TNF-α, recombinant human TNF-α, or human TNF having human TNF-α activity.
The anticancer agent according to claim 3, which is an -α derivative. 【請求項６】サイトカインが天然型ヒトIFN−γ、組換
え型ヒトIFN−γ又はヒトIFN−γ活性を有するヒトIFN
−γ誘導体である請求の範囲３に記載の制癌剤。6. The human IFN whose cytokine is natural human IFN-γ, recombinant human IFN-γ or human IFN-γ activity.
The anticancer agent according to claim 3, which is a -γ derivative. 【請求項７】サイトカインが天然型ヒトIL−１β、組換
え型ヒト1L−１β又はヒトIL−１β活性を有するヒトIL
−１β誘導体である請求の範囲３に記載の制癌剤。7. A human IL having a cytokine of natural human IL-1β, recombinant human IL-1β or human IL-1β.
The anticancer agent according to claim 3, which is a -1β derivative. 【請求項８】サイトカインが天然型ヒトTGF−β、組換
え型ヒトTGF−β又はヒトTGF−β活性を有するヒトTGF
−β誘導体である請求の範囲３に記載の制癌剤。8. The cytokine, wherein the cytokine is natural human TGF-β, recombinant human TGF-β, or human TGF having human TGF-β activity.
The anticancer agent according to claim 3, which is a -β derivative.