JP2588596B2 - Aujeszky's disease subunit vaccine and production method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ブタヘルペス１ウイルス（以下ADVと略称
する）により引き起こされるオーエスキー病のワクチン
として有効なサブユニットワクチン、このサブユニット
ワクチンの製造方法に関するものである。The present invention relates to a subunit vaccine effective as a vaccine for Aujeszky's disease caused by porcine herpes 1 virus (hereinafter abbreviated as ADV), and production of this subunit vaccine. It is about the method.

（発明の背景及び従来の技術） オーエスキー病は、ヘルペスウイルス科のアルファヘ
ルペス亜科に属する上記ADVにより引き起こされる伝染
病であり、ブタをはじめとして、ウシ，ヒツジ，ネコ，
イヌなど多種のホ乳動物が感染する疾病として知られ、
経済的には特に養豚業において、このような疾病に対す
る有効な対策が望まれている。すなわち特に生後20日ま
での子豚は本病に感染すると死亡率が高く、また妊娠豚
が感染すると流産したり生れた子豚の死亡率が高いため
である。BACKGROUND OF THE INVENTION AND PRIOR ART Aujeszky's disease is an infectious disease caused by the above ADV belonging to the subfamily Alphaherpes of the family Herpesviridae, and includes pigs, cattle, sheep, cats,
Known as a disease that infects various mammals such as dogs,
Economically, there is a demand for an effective countermeasure against such diseases, particularly in the pig farming industry. In particular, piglets up to 20 days after birth have a high mortality rate when infected with this disease, and a high rate of mortality of aborted or born piglets when pregnant piglets are infected.

従来より、家畜等の種々の疾病に対する対策として、
免疫学的に有効なワクチンは種々開発されその使用が行
なわれてきており、上記されるオーエスキー病に対する
予防についても、不活化ワクチンや弱毒生ワクチンが提
案されている。しかしながら本病に対するこれら従来の
ワクチン投与によって免疫性の付与について必ずしも充
分な効果が得られていないのが実情である。Conventionally, as a measure against various diseases such as livestock,
Various immunologically effective vaccines have been developed and used, and in order to prevent the above-mentioned Aujeszky's disease, inactivated vaccines and live attenuated vaccines have been proposed. However, the fact is that the administration of these conventional vaccines against this disease has not always yielded a sufficient effect on immunity.

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者等は従来において有効な対策が確立さ
れていないオーエスキー病の予防について鋭意研究を重
ねて本病の予防に有効なワクチンを開発するに至ったも
のであり、その目的とするところは、ヘルペスウイルス
科のアルファヘルペス亜科に属するADVによって引き起
こされるオーエスキー病の予防に有効なサブユニットワ
クチンを提供するところにある。(Problems to be Solved by the Invention) Therefore, the present inventors have conducted intensive studies on the prevention of Aujeszky's disease for which no effective countermeasures have been established so far, and have developed a vaccine effective for the prevention of this disease. It is an object of the present invention to provide a subunit vaccine which is effective in preventing Aujeszky's disease caused by ADV belonging to the alphaherpes subfamily of the herpesviridae family.

また本発明の他の目的は、かかるサブユニットワクチ
ンを効率よく精製して製造することができる方法を提供
するところにある。Another object of the present invention is to provide a method capable of efficiently purifying and producing such a subunit vaccine.

本発明者等が上記目的を達成するに有効な本発明を創
成するに至ったのは次のことによる。すなわち、従来、
ADVの感染防御や中和に係わる構成抗原としては、このA
DVの膜糖蛋白であるg IIIあるいはg p50が重要と考えら
れており、他方これらに比べ、同じくADVの膜糖蛋白と
して知られるg IIは感染防御や中和に係わる抗体を誘導
する能力が低いと考えられていた。The present inventors have created the present invention which is effective for achieving the above-described object, based on the following. That is,
As a component antigen related to protection and neutralization of ADV infection, this A
G III or gp50, a membrane glycoprotein of DV, is considered important, whereas g II, also known as a membrane glycoprotein of ADV, has an ability to induce antibodies involved in protection and neutralization of infection. Was considered low.

しかしながら、上記g IIは、単純ヘルペスウイルス１
型（HSV−１）の構成抗原である膜糖蛋白のg Bとの相同
性が指摘され、またこのg IIは抗原変異が少ないことが
知られていることから、このg IIを適当なアジュバント
と組み合わせることで有効なサブユニットワクチンを提
供できる可能性があると本発明者等は考えた。特に上記
g Bが、HSV−１に対する補体依存性の中和活性を誘導し
やすい抗原であることは注目された。However, the above gII is a herpes simplex virus 1
It has been pointed out that the homology with gB of the membrane glycoprotein, which is a constituent antigen of type (HSV-1), and that gII is known to have few antigenic mutations. The present inventors have considered that there is a possibility that an effective subunit vaccine can be provided by combining with. Especially above
It was noted that gB is an antigen that is likely to induce complement-dependent neutralizing activity on HSV-1.

このような意図の下で、本発明者等が補体依存でADV
の中和活性をもつものとして見出した単クローン抗体に
対する生体の免疫応答性を鋭意研究したところ、その認
識する抗原が上記g IIであり、したがってg IIとg Bと
はその構造的な相同性のみならず機能的な面でも相同性
をもつことが示唆されること、また精製したg IIを接種
した動物の免疫応答によってその免疫原性が大変強いこ
とが実験的に確認されることなどから、本発明をなすに
至ったのである。With this in mind, we have found that complement dependent ADV
After extensive studies on the immunological responsiveness of a living body to a monoclonal antibody found to have neutralizing activity, the antigen recognized was gII, and g II and gB were structurally homologous. This suggests that the protein has homology not only in terms of function, but also that it is experimentally confirmed that the immunogenicity of the animal inoculated with the purified g II is very strong. Thus, the present invention has been accomplished.

（課題を解決するための手段） 上記目的を実現する本発明の特徴の一つは、ADVの構
成抗原であるウイルス膜糖蛋白のg IIを抗原とするオー
エスキー病のサブユニットワクチンを提供するところに
ある。(Means for Solving the Problems) One of the features of the present invention that achieves the above object is to provide a subunit vaccine for Aujeszky's disease that uses gII of a viral membrane glycoprotein that is a constituent antigen of ADV as an antigen. There.

また本発明の他の特徴は、ADV感染細胞を可溶化さ
せ、これを還元あるいは非還元のg II蛋白に特異的な単
クローン抗体を固定したゲルを充填したカラムを用いて
アフィニティクロマトグラフィーにより該g IIを精製す
ることで、上記サブユニットワクチンを効率よく製造す
る方法にある。Another feature of the present invention is that ADV-infected cells are solubilized and subjected to affinity chromatography using a column packed with a gel on which a monoclonal antibody specific for reduced or non-reduced gII protein is immobilized. There is a method for efficiently producing the above subunit vaccine by purifying gII.

本発明の上記サブユニットワクチンは、例えばフロイ
ントのアジュバント、水酸化アルミニウムゲル、リン酸
アルミニウムゲル等のアジュバントと共に対象動物に接
種して免疫させることで、効果的な免疫応答を当該対象
動物に獲得させることができる。The above-described subunit vaccine of the present invention allows an effective immune response to be obtained by inoculating a subject animal with an adjuvant such as Freund's adjuvant, aluminum hydroxide gel, or aluminum phosphate gel and immunizing the subject animal. be able to.

本発明のサブユニットワクチンは、代表的には次の
，の方法により製造することができる。The subunit vaccine of the present invention can be typically produced by the following methods.

：ローラボトル等で単層培養した培養細胞、例えば公
知のハムスター胎児腎由来の株化細胞であるBHK21細胞
にADV（インディアナ株）を感染させ、細胞変性のピー
クで細胞及び培養上清を集めて、細胞を超音波処理した
後、低速遠心分離し、その上清を超遠心分離して集めた
沈殿を例えばデキストランＴ−10等の密度勾配遠心分離
にかけて精製ウイルスを得る。: ADV (Indiana strain) was infected to cultured cells monocultured in a roller bottle or the like, for example, BHK21 cells, a known hamster embryonic kidney-derived cell line, and cells and culture supernatant were collected at the peak of cytopathicity. After sonication of the cells, the cells are subjected to low-speed centrifugation, the supernatant is subjected to ultracentrifugation, and the collected precipitate is subjected to a density gradient centrifugation such as dextran T-10 to obtain a purified virus.

そしてこの精製ウイルスを、例えば５％トリトンＸ
（Triton X）−100等の界面活性剤及び必要に応じて更
に超音波処理で可溶化し、上記g II蛋白に特異的な抗体
を固定したゲル充填カラムを用いたアフィニテイクロマ
トグラフィーにより該g IIを精製する。Then, this purified virus is, for example,
(Triton X) -100 or the like and, if necessary, further solubilized by sonication, and the resulting gII protein was subjected to affinity chromatography using a gel-packed column on which an antibody specific to the gII protein was immobilized. Purify II.

：上記と同様に、ADVを感染させたBHK21細胞の細胞
変性が現われる頃に集め、この細胞を例えば５％トリト
ンＸや１％NP40等の界面活性剤で可溶化し、これを超音
波処理したものを上記と同様のアンフィニテイクロマト
グラフィーでg II蛋白を精製する。: In the same manner as described above, BHK21 cells infected with ADV were collected when cytopathy appeared, and the cells were solubilized with a surfactant such as 5% Triton X or 1% NP40, and sonicated. The gII protein is purified by the same affinity chromatography as described above.

このによる方法の操作手順の代表的一例は模式的に
は次のように示される。A typical example of the operating procedure of the method according to this is schematically shown as follows.

この方法による操作は、上記の操作に比べてより
多くのg II蛋白が得られる特徴がある。 The operation by this method is characterized in that more gII protein can be obtained than in the above operation.

（発明の効果） 以上のような本発明のg II蛋白を抗原とするサブユニ
ットワクチンによれば、このg II蛋白が、補体存在下で
の中和活性が高い抗体を誘導しやすい抗原であることか
ら、オーエスキー病に対する効果的な感染防御を確立す
ることができるという効果がある。(Effect of the Invention) According to the subunit vaccine using the gII protein of the present invention as an antigen as described above, this gII protein is an antigen which can easily induce an antibody having a high neutralizing activity in the presence of complement. As a result, there is an effect that an effective infection defense against Aujeszky's disease can be established.

また特に、適当なアジュバントと組み合わせて対象動
物にこれを接種する場合には、微量のワクチンを１回接
種するだけの場合にも、このg II蛋白がもつ高い免疫原
性によって優れた防御効果の獲得が得られ、オーエスキ
ー病の予防ワクチンとしてその効果は極めて大きいもの
がある。In particular, when the target animal is inoculated with an appropriate adjuvant in combination, the high immunogenicity of the gII protein provides excellent protection even when only a single dose of the vaccine is administered. Acquisition has been obtained, and the effect is extremely large as a preventive vaccine for Aujeszky's disease.

（実施例） 以下本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明が
この実施例に限定されるものではないことは言うまでも
ない。(Examples) Hereinafter, the present invention will be described based on examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to these examples.

［サブユニットワクチンの製造］ 抗原材料の調製 培養面積1100cm²のローラボトル３本に、BHK21細胞
（ハムスター胎児腎由来の株化細胞）を単層培養し、こ
れにADVのインディアナ株を感染させ、37℃で48時間培
養した。培養後ラバーポリスマンで感染細胞をガラス壁
より剥離し、４℃、1500rpmで10分間遠心し、遠心後、
上清を除去して沈殿の細胞を回収し、この細胞に体積で
３倍量の非イオン性界面活性剤の１％NP40を含む50mMト
リス塩酸（pH 8.6）を（約3ml/1本）加えて可溶化し、
氷中で２分間超音波をかけ、更に1000rpmで20分間遠心
して上清を得た。[Manufacture of Subunit Vaccine] Preparation of Antigen Material BHK21 cells (cell lines derived from hamster fetal kidney) were monolayer cultured on three roller bottles having a culture area of 1100 cm ² , and infected with the ADV Indiana strain. The cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours. After the culture, the infected cells are separated from the glass wall with a rubber policeman, and centrifuged at 4 ° C. and 1500 rpm for 10 minutes.
The supernatant is removed to collect the precipitated cells, and 50% Tris-HCl (pH 8.6) containing 3% by volume of a nonionic surfactant 1% NP40 (about 3 ml / line) is added to the cells. Solubilize,
Ultrasonic wave was applied for 2 minutes on ice, and the mixture was further centrifuged at 1000 rpm for 20 minutes to obtain a supernatant.

この上清を抗原材料とした。 This supernatant was used as antigen material.

サブユニットワクチンの精製 まず精製したADVでBALB/cヌードマウスを免疫し、そ
こから、常法により得られたいくつかのADVに特異的な
単クローン抗体のなかで、補対依存で中和活性を有する
単クローン抗体の一つを選び出した。以下この単クロー
ン抗体を便宜的に１−21−17mAbと称する。Purification of subunit vaccine First, BALB / c nude mice were immunized with purified ADV, and then complementation-dependent neutralizing activity among several ADV-specific monoclonal antibodies obtained by standard methods Was selected. Hereinafter, this monoclonal antibody is referred to as 1-21-17 mAb for convenience.

ADVのg II蛋白に特異的に結合する上記単クローン抗
体（１−21−17mAb）を産生するハイブリドーマ細胞
（１×10⁷個）を、BALB/cヌードマウスの腹腔に注射
し、２〜３週間後に腹水を回収し、該腹水中の抗体を、
プロテインＡを結合したセファローズ（ファルマシア社
製）の充填カラムを用いて精製し、これを精製抗体とし
た。Hybridoma cells (1 × 10 ⁷ ) producing the monoclonal antibody (1-21-17 mAb) that specifically binds to the gV protein of ADV were injected into the abdominal cavity of BALB / c nude mice, and 2-3 After a week, the ascites is collected, and the antibody in the ascites is collected.
Purification was performed using a packed column of Sepharose (manufactured by Pharmacia) to which protein A was bound, and this was used as a purified antibody.

次にこの精製抗体を、シアノーゲンブロマイドで活性
化したセファローズ（前出）に共有結合させてカラムに
充填し、上記により調製した抗原材料を該カラムに通し
て行なうアフィニティクロマトグラフィーにより、抗原
材料中のg II蛋白を精製した。蛋白量はローラボトル当
たり約0.3mgであった。Next, the purified antibody is covalently bonded to Sepharose (described above) activated with cyanogen bromide and packed in a column, and the antigen material prepared as described above is passed through the column to perform affinity chromatography. The gII protein in was purified. The amount of protein was about 0.3 mg per roller bottle.

この操作により得られたg II蛋白を試料とし、還元剤
である２−メルカプトエタノール（2ME）を加えて分離
し、クマーシー蛋白染色により可視化した（第１図のＣ
参照）。Using the gII protein obtained by this operation as a sample, 2-mercaptoethanol (2ME) as a reducing agent was added and separated, and visualized by Coomassie protein staining (C in FIG. 1).
reference).

なお比較のために、上記の方法で精製した精製ウイ
ルスをトリトンＸ−100で可溶化したもの（第１図のＡ
参照）、及び同様に上記の方法で精製したg II蛋白蛋
白を可溶化したもの（第１図のＢ参照）についても同様
の電気永動の操作を行いその結果を第１図に併記した。
分子量測定の目安には市販（ファルマシア社製）の分子
量マーカーキットを用いて、これを第１図のＭで示し
た。For comparison, the purified virus purified by the above method was solubilized with Triton X-100 (A in FIG. 1).
Similarly, the same electrophoretic operation was performed on the solubilized gII protein (see FIG. 1B) purified by the above method, and the results are also shown in FIG.
As a standard for measuring the molecular weight, a commercially available (manufactured by Pharmacia) molecular weight marker kit was used, and this is indicated by M in FIG.

この第１図の電気泳動の結果から次のことが分かる。
すなわちg II蛋白は、分子量約60、70、130キロダルト
ンの三つの蛋白が結合したものであり、この精製により
他のウイルス蛋白（第１図のＡに示される）は殆ど混入
せず、g II蛋白の精製度が極めて高く得られた。The following can be seen from the results of the electrophoresis in FIG.
That is, the gII protein is a protein in which three proteins having a molecular weight of about 60, 70, and 130 kilodaltons are bound, and by this purification, almost no other viral proteins (shown in FIG. 1A) are mixed. The purification of II protein was very high.

［精製g IIの評価試験］ 次に上記により精製したg II蛋白を抗原とするサブユ
ニットワクチンの有効性を評価するために免疫試験を行
なった。免疫試験はウサギ（約4kg）（免疫試験１）、
マウス（６〜８週齢）（免疫試験２）、ブタ（約80kg）
（免疫試験３）を夫々用いた。[Evaluation Test of Purified gII] Next, an immune test was performed to evaluate the effectiveness of the subunit vaccine using the gII protein purified as described above as an antigen. The immunity test was a rabbit (about 4 kg) (immunity test 1),
Mouse (6-8 weeks old) (immunity test 2), pig (about 80kg)
(Immunity test 3) was used for each.

免疫試験１ 上記精製したサブユニットワクチン（g II）の10μｇ
を抗原として、フロイントの完全アジュバント（Comple
te Freund's Adjuvant;CFA;ディフコ（DIFCO）社製）と
共にウサギに免疫し、更に８週間後にサブユニットワク
チンの10μｇをフロイントの不完全アジュバント（Inco
mplete Freund's Adjuvant;IFA;同）と共にウサギに追
加免疫した。Immunity test 1 10 μg of the purified subunit vaccine (g II)
Complete Freund's adjuvant (Comple
Rabbits were immunized with te Freund's Adjuvant (CFA; manufactured by DIFCO), and 8 weeks later, 10 μg of the subunit vaccine was added to Freund's incomplete adjuvant (Inco
Rabbits were boosted with mplete Freund's Adjuvant; IFA;

上記２回の免疫を行なったウサギから、４週間後に採
血してg II抗原吸着プレートに対するELISA、及び中和
における抗体価を測定してその結果を下記表１に示し
た。Blood was collected from the rabbits that had been subjected to the above two immunizations four weeks later, and ELISA was performed on the gII antigen-adsorbed plate, and the antibody titer in neutralization was measured. The results are shown in Table 1 below.

抗体価の判定は、ELISAにおいては免疫前の血清の吸
光度との差が0.1以上の最高稀釈倍率を示した。中和に
おいてはウサギ血清を補体として添加し、あるいは熱処
理で失活させた同補体を添加したときウイルス感染によ
る細胞変性を起こさなかった最高稀釈倍率で示した。The determination of the antibody titer showed the highest dilution ratio in ELISA at which the difference from the absorbance of the serum before immunization was 0.1 or more. In the neutralization, the highest dilution rate at which cytoplasmic degeneration due to virus infection did not occur when rabbit serum was added as a complement or the same complement inactivated by heat treatment was added.

上記表から分かるように、熱処理で補体を失活させた
VNT^b（C^-）^ｃでは中和活性が低かったが、本例では抗原
量が少なかったにもかかわらず、非熱処理の補体を添加
した場合には高い中和活性を示していることが分かる。
また中和価はELISA価がその指標になることが分かる。
すなわちg II蛋白に対する抗体の殆どが中和に係ってい
ると推測される。 As can be seen from the above table, complement was inactivated by heat treatment
VNT ^b (C ^-) but the ^c neutralizing activity was low, even though were less antigen quantity in this example, it can indicate a high neutralizing activity when adding the complement of the non-heat-treated I understand.
Also, it can be seen that the neutralization value is based on the ELISA value.
That is, it is assumed that most of the antibodies against the gII protein are involved in neutralization.

免疫試験２ 上記精製したサブユニットワクチン（g II）の１μg,
10μｇを上記したCFAと共にマウスに免疫し、また10μ
g,100μｇの精製ウイルスを同様にCFAと共に別のマウス
に免疫し、更に２週間後に同じ量のサブユニットワクチ
ン及び精製ウイルスを上記IFAと共に対応するマウスに
追加免疫した。Immunity test 2 1 μg of the purified subunit vaccine (g II)
The mice were immunized with 10 μg together with the CFA described above, and
g, 100 μg of purified virus was also immunized to another mouse with CFA, and two weeks later, the same amount of subunit vaccine and purified virus was boosted to the corresponding mouse together with the IFA.

上記２回の免疫を行なったマウスから、１週間後に夫
々のマウスから採血してg II抗原吸着プレートに対する
ELISA、及び中和における抗体価を測定して、その結果
を下記表２に示した。抗体価の判定はELISAにおいては
免疫前の血清の吸光度との差が0.1以上の最高稀釈倍率
を示した。中和においてはウサギの補体添加あるいは熱
処理補体添加のときのウイルス感染による50％ブラック
リダクションの最高稀釈倍率で示した。One week later, blood was collected from each of the two immunized mice, and the blood was collected on the gII antigen-adsorbed plate.
The antibody titer in ELISA and neutralization was measured, and the results are shown in Table 2 below. Judgment of the antibody titer showed the highest dilution ratio in ELISA with a difference from the absorbance of the serum before immunization of 0.1 or more. In the neutralization, the highest dilution ratio of 50% black reduction due to virus infection at the time of complement addition or heat-treated complement addition of rabbits was shown.

この表２の結果から分かるように、免疫期間が異なる
ためウサギで見られるほど中和活性は高くないが、上記
サブユニットワクチンが補体存在化で高い中和活性を示
し、かつELISA価がその指標となることがこの例からも
分かる。 As can be seen from the results in Table 2, the neutralization activity is not as high as that seen in rabbits due to different immunization periods, but the above-mentioned subunit vaccine shows high neutralization activity in the presence of complement, and the ELISA titer is It can be seen from this example that it is an index.

免疫試験３ 上記精製抗原１μg,10μｇのサブユニットワクチン
（g II）を上記したCFA又は水酸化アルミニウムゲルと
共にブタに免疫した。更に４週間後に同じ量のサブユニ
ットワクチンを、IFA又は水酸化アルミニウムゲルと共
に、対応するブタに追加免疫した。Immunity test 3 Pigs were immunized with 1 μg of the purified antigen and 10 μg of the subunit vaccine (g II) together with the above-mentioned CFA or aluminum hydroxide gel. Four additional weeks later, the same pigs were boosted with the same amount of subunit vaccine, together with IFA or aluminum hydroxide gel.

上記２回の免疫を行なったブタから、２週間後に夫々
採血してg II抗原吸着プレートに対するELISAおよび中
和における抗体価を測定し、その結果を下記表３に示し
た。抗体価の判定はELISAにおいては免疫前の血清の吸
光度との差が0.1以上の最高稀釈倍率を、中和において
はウサギの補体添加あるいは熱処理補体添加のときのウ
イルス感染による細胞変性を起こさなかった最高稀釈倍
率で示した。Blood was collected from the pigs that had been subjected to the two immunizations two weeks later, and the antibody titer in ELISA and neutralization of the gII antigen-adsorbed plate was measured. The results are shown in Table 3 below. The antibody titer was determined by ELISA at the highest dilution ratio with a difference of 0.1 or more from the absorbance of the serum before immunization, and neutralization was caused by cell infection due to virus infection during the addition of complement or heat-treated complement to rabbits. The highest dilution ratio was not shown.

この表３の結果から分かるように、フロイントのアジ
ュバントを用いた場合にはELISA価の大きさと相関して
補体存在下で高い中和活性が観察されたが、水酸化アル
ミニウムゲルを用いた場合にはウサギの補体添加では中
和活性は殆どなかった。 As can be seen from the results in Table 3, when Freund's adjuvant was used, a high neutralizing activity was observed in the presence of complement in correlation with the magnitude of the ELISA titer. Had almost no neutralizing activity when supplemented with rabbits.

また上記試験においては、100μｇのg II抗原で免疫
された個体より、抗原接種後１週間毎に採血してELISA
価を調べ、その結果を第２図に示した。In the above test, blood was collected from an individual immunized with 100 μg of the gII antigen every week after the antigen inoculation and ELISA.
The results were checked and the results are shown in FIG.

この第２図の結果から、１回免疫でも４週後には10³
〜10⁵の高い抗体価が得られること、いずれのアジュバ
ントを用いた場合にも２回免疫後さらに抗体価が上昇す
ること、が分かる。From the results shown in FIG. 2, even after a single immunization, 10 ³
It can be seen that a high antibody titer of 1010 ⁵ is obtained, and that the antibody titer further increases after two immunizations using any adjuvant.

［感染防御］ 次に上記サブユニットワクチンで免疫した動物の感染
防御を評価するために、ADVの攻撃試験を行なった。[Protection of Infection] Next, an ADV challenge test was performed to evaluate the protection of the animals immunized with the subunit vaccine.

マウスに対する攻撃試験 １群５匹のマウスを、下記表４に示した抗原，量，ア
ジュバントで１回又は２回免疫し、最終免疫後１週目
に、ADVにより攻撃した（2500倍TCID₅₀＝15倍LD₅₀のAD
V）。なお２回免疫の場合はその間隔を６週間とした。Challenge test on mice Five mice per group were immunized once or twice with the antigen, amount, and adjuvant shown in Table 4 below, and challenged with ADV one week after the final immunization (2500-fold TCID ₅₀ = 15x LD ₅₀ AD
V). In the case of two immunizations, the interval was 6 weeks.

その結果は下記表４、及び第３図に示した通りであ
り、対照の動物は７日目までにすべて死亡したのに対
し、水酸化アルミニウムゲルをアジュバントとして用い
て上記サブユニットワクチン（g II）を接種した個体群
については、免疫回数や抗原量に応じて生残率は上昇
し、10μｇで２回免疫した個体では完全に防御した。The results are as shown in Table 4 below and in FIG. 3, where all the control animals died by day 7, whereas the subunit vaccine (g II) was prepared using aluminum hydroxide gel as an adjuvant. ), The survival rate increased in accordance with the number of immunizations and the amount of antigen, and individuals immunized twice with 10 μg completely protected them.

またサブユニットワクチン（g II）と共にフロイント
のアジュバントを用いた個体群では、１μｇ、１回の免
疫でも完全に防御した。In addition, in the population using the Freund's adjuvant together with the subunit vaccine (gII), 1 μg of the population was completely protected even by one immunization.

なおこれら７日目生残していた個体は、全て試験を終
了した10日目までの生存が確認された。In addition, it was confirmed that all the individuals who survived on the seventh day survived until the tenth day when the test was completed.

ウサギに対する攻撃試験 上記免疫試験１で用いたウサギ２羽で攻撃試験（5000
倍TCID₅₀のADV）を行なったところ、非免疫対照２羽は
４日目で死亡したが、免疫群は12日目で試験を打ち切る
まで生存していた。 Challenge test on rabbits Challenge test with two rabbits used in immunity test 1 above (5000
(Fold TCID ₅₀ ADV), two non-immunized controls died on day 4 while the immunized group survived on day 12 until termination of the study.

また攻撃後12日目のウサギの血清中の抗体の特徴をイ
ムノブロットで調べた。すなわちまず精製ウイルスをSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ニトロセルロー
ス膜に転写し、上記ウサギ血清を反応させ、標識抗ウサ
ギ抗体を続けて反応させた。この結果によるとg II蛋白
のみが反応していることが分かった。ウサギでこのウイ
ルスが増殖していればg II蛋白以外の数十種あるウイル
ス抗原に対して抗体ができるはずである。にもかかわら
ず、またADVにおいては数十種類の蛋白があるにもかか
わらず上述の結果が得られたことは、個体に接種された
ウイルスが増殖せずに直ちに排除された可能性を示唆し
ている。The characteristics of the antibodies in the sera of the rabbits 12 days after the challenge were examined by immunoblotting. That is, first, the purified virus is SD
The resulting mixture was subjected to S polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a nitrocellulose membrane, reacted with the rabbit serum, and subsequently reacted with a labeled anti-rabbit antibody. According to this result, it was found that only the gII protein was reacting. If the virus is growing in rabbits, antibodies should be raised against dozens of viral antigens other than the gII protein. Nevertheless, these results, despite the presence of several tens of proteins in ADV, suggest that the virus inoculated into the individual may have been eliminated immediately without growth. ing.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図はアフィニティクロマトグラフィーにより得たSD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動像、第２図は本発明
抗原免疫ブタの免疫後の抗体価と時間経過の関係を示し
た図、第３図は免疫マウス攻撃後の生残率を示した図で
ある。FIG. 1 shows SD obtained by affinity chromatography.
S-polyacrylamide gel electrophoresis image, FIG. 2 shows the relationship between the antibody titer and time course of the immunized pig of the present invention after immunization, and FIG. 3 shows the survival rate after immunized mouse challenge. is there.

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】ブタヘルペス１ウイルスのウイルス膜糖蛋
白であるg IIを抗原とするオーエスキー病のサブユニッ
トワクチン。1. A subunit vaccine for Aujeszky's disease which uses gII, which is a viral membrane glycoprotein of swine herpes 1 virus, as an antigen. 【請求項２】ブタヘルペス１ウイルス感染細胞を界面活
性剤及び必要に応じて更に超音波処理で可溶化させ、こ
れをg II蛋白に特異的な単クローン抗体を固定したゲル
を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製す
ることを特徴とする上記請求項１に記載したオーエスキ
ー病のサブユニットワクチンの製造方法。2. A swine herpes 1 virus-infected cell is solubilized by a surfactant and, if necessary, further sonication, and the solubilized cell is subjected to affinity chromatography using a gel on which a monoclonal antibody specific to gII protein is immobilized. The method for producing a subunit vaccine for Aujeszky's disease according to claim 1, characterized in that the vaccine is purified by chromatography.