JP2584924B2

JP2584924B2 - 免疫学的凝集反応粒子の製造方法

Info

Publication number: JP2584924B2
Application number: JP3321823A
Authority: JP
Inventors: 久彦岩本; 義久櫻井; 喬前原
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1991-12-05
Filing date: 1991-12-05
Publication date: 1997-02-26
Anticipated expiration: 2012-02-26
Also published as: JPH05157748A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、保存安定性に富む免疫
学的凝集反応粒子の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、近年種々の疾患を
血清学的に検査することが重要視されている。そして、
この検査のためには、抗原又は抗体を正確、迅速且つ簡
便に定量することが極めて重要な課題となっている。そ
こで、抗原又は抗体を不溶性担体に感作して抗体又は抗
原を検出する凝集反応を利用する方法が、操作が簡単で
あることに加え、反応が肉眼的に観察し易いことから臨
床検査や研究分野で広く採用されている。

【０００３】この凝集反応を利用する方法は原理的には
一種類のみであるが、前記の不溶性担体の種類によって
分類される。即ち、不溶性担体として、ラテックス、カ
オリン、炭末、有機無機複合粒子などの非生物学的粒子
を使用する場合と、動物赤血球、細菌菌体などの生物学
的粒子を使用する場合とに分類される。

【０００４】前記の生物学的粒子は、それぞれの大きさ
が一定であるという利点はあるものの生物の種類によっ
て粒子の大きさは決まっており、目的に応じた任意の大
きさの粒子を得ることはできない。例えば、動物赤血球
は大きさの一定した担体であるが、該動物赤血球はその
表面に固有の抗原を有しているため、非特異的反応を起
こして目的とする凝集反応に誤りを与える可能性が大き
い。

【０００５】従って、最近では化学的に安定で、それ自
身抗原活性を有しないなどの利点のある前記の非生物学
的粒子を使用する傾向がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
非生物学的粒子には、抗原又は抗体が密に吸着されにく
いという欠点がある。例えば、抗原又は抗体が感作して
なる非生物学的粒子を保存のために凍結乾燥し、乾燥状
態で長期保存した後、該粒子を分散液状態に復元する
と、抗原又は抗体が非生物学的粒子から遊離し易くな
り、分散液中での復元状態で長期間保存することが困難
であった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
問題を解決すること、特に抗原又は抗体が感作してなる
担体の感度を維持しながら長期的に保存することを目的
として鋭意研究を重ねた結果、前記の担体をタンニン酸
で処理することにより、前記の目的を達成できることを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は、抗原又は抗体が感作して
なる担体をタンニン酸で処理することを特徴とする免疫
学的凝集反応粒子の製造方法である。

【０００９】本発明においては、抗原又は抗体の感作を
担体に行って得られる、抗原又は抗体が感作してなる担
体を使用する。

【００１０】本発明において、抗原とは、抗体を産生さ
せて体液性免疫や細胞性免疫を誘発するものであれば特
に限定されず、例えば蛋白、糖蛋白、脂質蛋白、脂質、
核酸などが挙げられる。

【００１１】抗体は、抗原と特異的に結合する活性を持
つものであれば特に限定されず、例えば免疫グロブリン
のＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＤ等が挙げら
れる。

【００１２】本発明において用いられる担体とは、通常
免疫学的凝集反応粒子を得るに際して用いられるもので
あれば特に限定されず、例えば、ラテックス、カオリ
ン、炭末、ゼラチン粒子、シリカ、アルミナ、チタニ
ア、ジルコニアあるいはこれらを主成分とする複合酸化
物などの無機粒子、前記シリカなどの無機粒子表面を有
機化合物で処理して該有機化合物が無機粒子表面に化学
的又は物理的に結合した有機無機複合粒子などの非生物
学的粒子、あるいは動物赤血球、細菌菌体などの生物学
的粒子等が挙げられる。ここに例示した各種担体のう
ち、非生物学的粒子が、化学的に安定で、それ自身抗原
活性を有しない等の利点を有するために、好ましい。特
に、前記した非生物学的粒子の一種である有機無機複合
粒子は、人工担体であるため、該担体表面を目的に応じ
て処理でき、また極めて非特異的反応が起こりにくいの
で好適に用いられる。

【００１３】抗原又は抗体を担体へ感作する方法は何ら
限定されないが、一般に、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、グリシン緩衝液、生理食塩水などの緩衝液中で、前
記の担体と、該担体１ｇ当たり０．０１〜５０mgの抗原
又は抗体とを配合して感作する方法が採用される。ま
た、抗原を担体へ感作するにあたり、その抗原を産生し
ている菌体をそのまま使用する場合もある。このような
場合、菌体の使用個数は特に限定されないが、通常担体
１ｇ当たり１×１０⁶〜１×１０¹³個である。抗原又は
抗体を担体へ感作する際の感作温度は特に限定されない
が、通常４〜５６℃の範囲内であり、普通取扱いの容易
さから室温がより好ましい。

【００１４】上記の抗原又は抗体が感作してなる担体を
タンニン酸で処理することにより、得られる免疫学的凝
集反応粒子は、液体中で長期にわたり性能安定性よく保
存することができる。該タンニン酸は特に限定されず、
例えば植物中に分布する多数のフェノール性水酸基を持
つ芳香族化合物であるタンニン酸等が挙げられる。より
具体的には、縮合型タンニン酸、加水分解型タンニン酸
等が例示されるが、そのうち加水分解型タンニン酸がよ
り好ましい。

【００１５】本発明において、タンニン酸による処理を
行う場合に、抗原又は抗体の感作を担体に行って得られ
る、抗原又は抗体が感作してなる担体を、該感作のとき
から湿潤状態に保ったまま、タンニン酸で処理すること
が好ましい。このように湿潤状態に保ったままタンニン
酸で処理すると、得られる免疫学的凝集反応粒子の液中
での保存安定性がより高まる。

【００１６】前記したタンニン酸による処理の方法は、
特に限定されない、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液、グリシン緩衝液等の緩衝液、生理食塩水、蒸留水等
の水性溶媒にタンニン酸を溶解してタンニン酸が溶解し
てなる溶液を調製し、このタンニン酸が溶解してなる溶
液と抗原又は抗体が感作してなる担体とを配合する方法
等が挙げられる。

【００１７】本発明におけるタンニン酸による処理にお
いて、タンニン酸の使用量は特に限定されないが、前記
の抗原又は抗体が感作してなる担体１ｇあたり１〜２０
００mgとすることが、タンニン酸による処理の効果がよ
り高まり、非特異的反応の防止をより確実に行うことが
できるために、好ましい。また、前記したようにタンニ
ン酸が溶解してなる溶液を使用する場合、該溶液中のタ
ンニン酸の濃度は特に限定されないが、好ましくは１×
１０^-4〜１重量％が好適である。タンニン酸の濃度が前
記範囲内にあると、取扱う液の量が適当となりうる上
に、タンニン酸による処理の効果がより速やかに現れう
る。

【００１８】上記のタンニン酸による処理をして得られ
る免疫学的凝集反応粒子は、液中で保存することもでき
るが、より長期にわたって保存しようとする場合は乾燥
状態で保存することができる。免疫学的凝集反応粒子の
乾燥方法は、公知の乾燥方法を限定なく採用しうるが、
例えば凍結乾燥による方法等がある。

【００１９】本発明の製法により得られた免疫学的凝集
反応粒子を乾燥した場合、その乾燥した免疫学的凝集反
応粒子は、臨床検査に用いる前に、水性媒体に分散し復
元される。この水性媒体には、蛋白質が含まれていても
よい。

【００２０】

【作用】抗原又は抗体が感作してなる担体を処理するに
際して用いられるタンニン酸には、蛋白質を収れんする
作用がある。このタンニン酸の作用により、担体に感作
した抗原又は抗体は、収れんし、担体から遊離しにくく
なっているものと推測される。

【００２１】

【発明の効果】本発明の方法により製造された免疫学的
凝集反応粒子は、長期間水性媒体中でその性能を低下さ
せることなく保存することが可能なものである。

【００２２】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明はその実施例により何ら限定されな
い。

【００２３】実施例１凝集反応試薬として、免疫学的梅毒診断薬を作成するた
めに、まず梅毒の病原菌であるトレポネーマ・パリダム
１×１０⁹個を１mlの０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
分散させた。次いで、このトレポネーマ・パリダムが分
散した塩化ナトリウム水溶液を超音波破砕器により２０
０Ｗで３０分間破砕した。これとは別に、０．１Ｍの塩
化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）に、ラテックス粒子であるブロモスチレン粒子（日
本合成ゴム株式会社製）２．５重量％（分散液に対する
粒子の濃度）を分散させ、ブロモスチレン粒子が分散し
たリン酸緩衝液を調製した。そして、前記のトレポネー
マ・パリダムが分散した塩化ナトリウム水溶液１mlに、
前記のブロモスチレン粒子が分散したリン酸緩衝液を等
量配合し１時間室温で放置し、次いで、１５０００ｒｐ
ｍで２０分の遠心を行い、該ブロモスチレン粒子を回収
した後、上記粒子１ｇ当たり５０mg量になるように、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１mlにタンニン
酸（和光純薬製）を２ｇ溶解し、該タンニン酸溶液に上
記回収したブロモスチレン粒子を添加して３７℃で１５
分静置した。その後、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で２回遠心洗浄し、凍結乾燥してトレポネーマ
・パリダム由来の抗原が感作されたブロモスチレン粒子
からなる凝集反応粒子を調製した。その後、６ケ月間、
４℃で放置した。０．０２Ｍリン酸緩衝液に、５重量％
になるように牛血アルブミンを加えて粒子溶解液を調製
した。この粒子溶解液に、前記期間保存した凝集反応粒
子を凝集反応試薬基準で０．５重量％濃度となるように
溶解して凝集反応試薬を調合した。

【００２４】次に、この免疫学的梅毒診断薬の性能を以
下に示すように測定した。

【００２５】被検液として梅毒患者血清を用い、該血清
の１０倍希釈液を原液として、倍数希釈法に従って上記
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を行い、各希
釈液をマイクロタイタープレートのウェル中に２５μｌ
ずつ加えた。次いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウ
ェル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後、
室温で放置した。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、
被検液で粒子リングが明らかに大きく、且つリング内に
凝集粒子が一様に広がっているのが認められるウェルに
於ける希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評価した。同
様に、上記の方法に従って、凝集反応試薬を調合して７
日目のもの、及び３０日目のものを用い、感度を評価し
た。表１にこれらの結果を示した。

【００２６】

【表１】

【００２７】比較例１実施例１で、トレポネーマ・パリダム由来の抗原が感作
されたブロモスチレン粒子をタンニン酸で処理しなかっ
たこと以外はすべて実施例１と同様に行った。また、感
度の評価のための梅毒患者血清は、実施例１で用いたも
のを使用した。表１にこれらの結果を示す。

【００２８】実施例２免疫学的凝集反応試薬として成人Ｔ細胞白血病診断薬を
作成するために、成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原
を０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムを含む生理食
塩水１ml当たり１００μｇ溶解し、成人Ｔ細胞白血病ウ
イルス由来の抗原を含んでなる生理食塩水を調製した。
これとは別に、０．０２Ｍリン酸緩衝液に、有機無機複
合粒子（徳山曹達株式会社製）２．５重量％を分散させ
て、有機無機複合粒子が分散したリン酸緩衝液を調製し
た。そして、前記の成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗
原を含んでなる生理食塩水と、前記の有機無機複合粒子
が分散したリン酸緩衝液とを等量配合し１時間室温で放
置し、次いで上清を取り除いた後、該抗原感作粒子１ｇ
に対して０．０８ｇ量になるようにタンニン酸を加えた
０．０２Ｍリン酸緩衝液１mlを上記感作粒子に加え、４
℃で１時間ゆっくりと攪拌した。その後、０．０２Ｍの
リン酸緩衝液で２回洗浄し、０．５％ウサギ血清を含ん
でなる０．０２Ｍリン酸緩衝液を用いて、該抗原感作粒
子濃度が０．５重量％となるように調製し、凝集反応試
薬とした。

【００２９】次に、この免疫学的梅毒診断薬の性能を以
下に示すように測定した。

【００３０】被検液として成人Ｔ細胞白血病患者血清を
用い、該血清の２倍希釈液を原液として、倍数希釈法に
従って上記リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて希釈を
行い、各希釈液をマイクロタイタープレートのウェル中
に２５μｌずつ加えた。次いで、前記調合した凝集反応
試薬を該ウェル中に２５μｌずつ加えて行き、１分間の
攪拌の後、室温で放置した。３０分後、粒子の凝集状態
を観察し、被検液で粒子リングが明らかに大きく、且つ
リング内に凝集粒子が一様に広がっているのが認められ
るウェルに於ける希釈液の最高希釈倍数を求め感度を評
価した。同様に、上記の方法に従って、凝集反応試薬を
調合して７日目のもの、及び３０日目のものを用い、感
度を評価した。表１にこれらの結果を示した。

【００３１】比較例２実施例２で、成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原が感
作された有機無機複合粒子をタンニン酸で処理しなかっ
たこと以外はすべて実施例２と同様に行った。また、感
度の評価のための成人Ｔ細胞白血病患者血清は、実施例
２で用いたものを使用した。表１にこれらの結果を示
す。

【００３２】実施例３実施例２において、抗原をＢ型肝炎ウイルス由来のもの
にかえ、凝集反応粒子１ｇに対して０．０２ｇ量になる
ようにタンニン酸を加えたリン酸緩衝液を用いて室温で
３０分放置し、更に被検液としてＢ型肝炎患者血清を用
いたこと以外はすべて実施例２と同様に行った。表１に
これらの結果を示す。

【００３３】比較例３実施例３において、タンニン酸処理をしなかったこと以
外はすべて実施例３と同様に行った。表１にこれらの結
果を示す。

【００３４】実施例４凝集反応試薬として、免疫学的大腸癌診断薬を作成する
ために、ウサギ由来の抗ヒトヘモグロビン抗体（カッペ
ル社製）を０．１mg／mlの濃度になるように０．０５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液１mlに溶解し、抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を含んでなる塩化ナトリウム水溶液を調製した。
これとは別に、０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．
０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、有機無機複合粒
子（徳山曹達株式会社製、商品名：イムノティクルスＨ
ＤＰ）０．５重量％を分散させ、有機無機複合粒子が分
散したリン酸緩衝液を調製した。そして、前記の抗ヒト
ヘモグロビン抗体を含んでなる塩化ナトリウム水溶液１
mlと、前記の有機無機複合粒子が分散したリン酸緩衝液
１mlとを配合し、１時間室温で放置し、次いで、０．０
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回遠心洗浄し、３
０００ｒｐｍで３分の遠心にて上清を取り除いた後、上
記リン酸緩衝液に０．０１重量％となるようにタンニン
酸を溶解した溶液１mlを該担体に加えた。４℃で３０分
放置した後、遠心洗浄を１回行った。更に、凍結乾燥し
て、抗ヒトヘモグロビン抗体が感作された有機無機複合
粒子からなる凝集反応粒子を調製した。その後、３か月
間、４℃で放置した。前記期間保存した凝集反応粒子を
凝集反応試薬基準で０．５重量％濃度となるように蒸留
水で溶解して凝集反応試薬を調合した。

【００３５】次に、この免疫学的大腸癌診断薬の性能を
以下に示すように測定した。

【００３６】被検液として大腸癌患者便３mgを０．０１
重量％のデオキシコール酸ナトリウムを含む０．０１Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させたものを用
い、該被検液を原液として、倍数希釈法に従って上記グ
リシン緩衝液を用いて希釈を行い、各希釈液をマイクロ
タイタープレートのウェル中に２５μｌずつ加えた。次
いで、前記調合した凝集反応試薬を該ウェル中に２５μ
ｌずつ加えて行き、１分間の攪拌の後、室温で放置し
た。３０分後、粒子の凝集状態を観察し、被検液で粒子
リングが明らかに大きく、且つリング内に凝集粒子が一
様に広がっているのが認められるウェルにおける希釈液
の最高希釈倍数を求め感度を評価した。同様に、上記の
方法に従って、凝集反応試薬を調合して７日目のもの、
及び３０日目のものを用い、感度を評価した。表１にこ
れらの結果を示す。

【００３７】比較例４実施例４において、タンニン酸処理しなかったこと以外
は、すべて実施例４と同様に行った。表１にこれらの結
果を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原又は抗体が感作してなる担体をタン
ニン酸で処理することを特徴とする免疫学的凝集反応粒
子の製造方法。