JP2584443B2 - 活性化▲ｉ▼▲ｘ▼因子の高収率産生 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、概括的にはIX因子（Factor IX）のクロー
ニングおよび高収率での発現に関するものであり、より
詳しくは、IX因子cDNAが染色体中に組込まれた哺乳類動
物細胞をビタミンＫを含む培地中で培養することによ
る、生物学的に活性なIX因子の産生に関するものであ
る。

血漿糖タンパク質である、IX因子は、血液凝固過程に
於いて重要な役割を果たす。通常、IX因子は肝臓で合成
され、アミノ末端の12個のグルタミン酸残基のγ−カル
ボキシル化には、ビタミンＫ活性を必要とする。体内に
置けるIX因子の欠乏は、血友病の１つのタイプ（Ｂ型）
として現れる。現在同疾患の治療法には、IX因子のヒト
血漿タンパク質濃縮物の静脈注射に限られる。しかしな
がら、血液凝縮物注射は時間の費用の実際的な損失に加
え、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群、あるいは
血栓塞栓症（thromboembolic diseases）の受容者への
感染の危険性を有する。従って、ヒト血漿からの抽出に
代わる、IX因子産生法が強く望まれている。

組み換えDNA技術のIX因子産生への応用により、同タ
ンパク質に関する重要な情報が明らかになった。ヒトIX
因子をコードするcDNAが、単離され、解析され、発現ベ
クターにクローン化されている。例えば、チュー（K.H.
Choo）他著、“ヒト抗肝炎IX因子遺伝子の分子的クロー
ン化",Nature,Vol.299:178−180（1982年９月）、およ
び、K.クラチ（K.Kurachi）他著，“ヒトIX因子をコー
ドするcDNAの単離および解析",Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.,Vol.79:6461−65（1982年11月）参照。

1984年２月16日に公開されたPCT特許出願WO84/00360
号は、主として診断用プローブとしての使用のためのヒ
トIX因子ヌクレオチド配列あるいはその断片の同定およ
びクローニングについて述べている。上記特許出願は、
哺乳動物組織培養細胞、好ましくは肝がん（hepatoma）
細胞株での増殖によるヒトIX因子ポリペプチド産生に関
して、予言的に述べているにすぎない。上記発明者らの
続報である、D.S.アンソン（D.S.Anson）他著、“組み
換えDNAクローン由来活性ヒト血液凝固IX因子の哺乳動
物細胞中における発現",Nature,Vol.315,683−685頁（1
985年６月20日）には、形質転換したラット肝がん（hep
atoma）細胞株からの、活性を持つと称するヒトIX因子
ポリペプチドの非常に低水準での産生が記述されている
（685頁１欄参照）。

1985年11月11日に刊行された、ヨーロッパ特許出願第
162,782号は、ヒトIX因子をコードする塩基配列を含む
組み換えウイルスベクターの構造に関するものである。
エピソーム的に組込まれた組み換えIX因子配列を含有す
る菌細胞から生物学的に活性を有するヒトIX因子が低収
率で得られると主張されている。しかしながら、宿主細
胞の増殖および上記タンパク質の糖タンパクに対するウ
イルス成分の影響により、不確定的で、バッチ毎に異な
るタンパク質が生成される可能性がある。〔H.デ・ラ・
サレ（H.de la Salle）他著、“組み換えDNA技術を用い
て発現した活性γ−カルボキシル化ヒトIX因子",Natur
e，316:268−270（1985年７月18日）も参照のこと〕 最近の別の報告、“トランスフェクションした細胞に
おける活性ヒトＸ因子の発現",Nature，316:271−273
（1985年７月18日）も、neo遺伝子マーカーとともにト
ランスフェクションしたBHK細胞での組み換えIX因子の
低水準での発現について述べている。

以上のように、これらの最近の研究でさえ、生物学的
活性を持ち、確実に一定の型のIX因子を高収率で産生す
る安定な系を得ることは依然として困難であることを示
している。

本発明に従えば、意外にも、染色体中に組入れたIX因
子cDNAを含むCHO細胞系を培養し、ポリペプチドの回収
に先立ち、あらかじめ決められた時間に、培地中に異種
のビタミンＫを加えることにより、生物学的活性IX因子
タンパク質が高収率で産生可能であることが発見され
た。γ−カルボキシル化を行なうことが前もって示され
ていなかった細胞でさえも、本方法によって活性IX因子
を産生することが示される。

ビタミンＫは、K1あるいはK3の形で培地中に添加す
る。K3をビタミンとして選択した場合には、1mlあたり
約0.1ngから10μｇの濃度のビタミンを添加することが
可能であり、推奨される濃度は5ngから10μｇの間の範
囲である。上記の代わりとして、ビタミンK1は、培地1m
lあたり約10ngから50μｇの要求濃度範囲で添加するこ
とが可能であり、培地1mlあたり100ngから100μｇのビ
タミンを添加することが好ましい。

活性IX因子の最大量を産生するのに要する時間の長さ
は、簡単な実験、すなわち、異なる種々の間隔で調質し
た培地の分割部分を存在する活性IX因子の量について、
その最大濃度が決定されるまで分析することにより、容
易に決定し得る。

本発明の、異なる態様においては、別のガンマ−カル
ボキシグルタミン酸を含む、生物学的活性を有する血液
凝固タンパク質および血漿タンパク質を、細胞培地にビ
タミンＫを添加することにより、染色体的に組入れた上
記タンパク質をコードするcDNAで形質転換した細胞から
産生する。本発明によれば、cDNAから生物学的に活性を
有する形で産生される上記血液凝固タンパク質および血
漿タンパク質の例には、プロトロンビン（prothrombi
n）、Ｘ因子、VII因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓな
どが含まれる。

本発明に従ってクローン化したIX因子遺伝子の真核生
物での発現によって産生された生物学的活性を持つIX因
子は、医師によりin vivoでヒトの治療に使用可能であ
る。当然のことながら、活性成分量は、被治療状態の重
度、選択された投与経路、および活性IX因子の比活性に
依存する。

本発明により産生された活性IX因子は、天然血清由来
IX因子で典型的に使用される、あらゆる経路およびあら
ゆる薬剤処方および投薬量によって投与することが可能
である。経路、処方および投薬療法は、天然IX因子とこ
こで述べるように産生されたタンパク質の間に活性の差
違がもしもあるならば、その差違を考慮に入れることが
望ましい。

以下の実施例は、IX因子cDNA因子の最初の単離および
クローニング、その塩基配列決定、および活性IX因子を
発現できる発現ベクター系の造製に関するものである。
第１図は発現プラスミドp91023−IXおよびpAaD26SVpA3
の構造を示している。

実施例 １ ヒトIX因子cDNAクローンの単離 IX因子RNAの開始コドンから約475bp下流と相同である
塩基配列５′−pGTACAGGAGCAAACACC−３′OHから成る単
一のオリゴヌクレオチドを合成した（クラチ（Kurachi
他、1982、前出；チュー（Choo）他,1982,前出）。上記
オリゴヌクレオチドの５′未満をポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ社）および
γ−³²P−ATP（ニュー・イングランド・ニュークリアー
社）を用いて標識を施した。ヒト肝臓二本鎖cDNAを調製
し（マニアティス（Maniatis）他、Molecular Cloning,
A Laboratory Manual,コールド・スプリング・ハーバ
ー,1982）、テュール（Toole）他、Nature，313:342−3
47,（1984）に記述されているように、GT10ベクターに
挿入した。ウォー（Woo）他、Proc.Nat'l.Acad.Sci.US
A, 75:3688−3692,（1978）の方法により、約100,000の
組み換えファージプラークを標識オリゴヌクレオチドプ
ローブを用いて重複フイルター（duplicate filter）上
でスクリーニングを行なった。ハイブリッド形成は、５
×SSK、５×デンハルト溶液（Denhardt's）、0.5重量％
SDSおよび10mMEDTA中、42℃で40時間行ない、42℃にお
いて２×SSCで十分に洗浄した。二本鎖を形成したプラ
ークは精製し、DNAをプレート・ストックから調製し
〔マニアティス（Maniatis）他、（1982）、前出〕、制
限酵素分解によって分析した。

実施例 ２ ヒトIX因子ゲノムクローンの単離 ３種のヒトゲノムライブラリを、ベントン（Benton）
他、Science, 196:180−182（1977）の方法により、ヒト
IX因子cDNAのニックトランスレーションを行なったプロ
ーブを用いてスクリーニングを行なった。スクリーニン
グされた第１のライブラリは、シャロン4A（Charon4A）
中の増幅Hae III/Alu I部分分解ライブラリである〔ロ
ーン（Lawn）他、Cell，15;1157−1174,（1978）〕。第
２のライブラリは、シャロン28（Charon28）中にクロー
ン化されたSau3A部分分解産物を用いて、マニアティス
（Maniatis）ら、（1982）前出に示された方法により調
製した。第３のライブラリは、四本のＸ染色体を含むヒ
トリンパ芽球細胞株（human lymphoblastoid line）GM1
202A（NIGMSミュータント・セル・レボジトリー）から
調製した。この場合、Sau3A部分分解DNAは、L47.1〔レ
ーニン（Loenen）ら、Gene10:249（1980）の誘導体であ
り、２つの小さなEcoR I−BamH Iフラグメントの代わり
にポリリンカーを挿入した。J1（J.ムリンズ（J.Mullin
s）の好意により得た）中に、上記のようにクローン化
した。ポジティブにハイブリッド形成したプラークは精
製し、１リットルの液体分解物（liquid lysate）の塩
化セシウム密度勾配精製を行うことによりファージDNA
を調製した〔マニアティス（Maniatis）ら、（1982）、
前出〕。

実施例 ３ DNA塩化配列分析 DNA塩化配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマー
を用いる、ジデオキシチェインターミネーション法〔サ
ンガー（Sanger）ら、Proc.Natl.3Acad.Sci.USA，74546
3−5467（1977）〕により、M13ファージベクター〔１ラ
ンダー（Norrander）ら、Gene，26:101−106（1983）〕
にサブクローン化することにより解析した。IX因子cDNA
は、以下の方法によってExo IIIにより一連の欠損群を
作製した後、M13ベクターにサブクローン化した。

塩化配列決定を行なう領域を含むプラスミドを、塩化
配列決定を行なう領域の一方の側の固有の箇所で切断す
る制限酵素で切断した。上記DNA（約20μｇ）をエタノ
ール沈殿を行ない、50mM トリス、pH8.0、1mM MgC
l₂、1mM ２−メルカプトエタノールを含む溶液（Exo I
II緩衝液）100μに溶解した。チューブを30℃に暖
め、200ユニットのExo III（ファルマシアＰ−Ｌバイオ
ケミカルズ社）を加える。本条件下で予想される分解速
度である約200塩基対／分／末端に基づき、30秒間隔で
分注液の反応を停止させ、塩基配列決定を行なう領域全
体にわたって末端を生成させる。分注液は、500mM NaC
lおよび20mM EDTA、pH8.0と含む溶液（Exo停止液）300
μが入っているチューブに加えることにより反応を停
止させる。欠失させたDNAは、エタノール沈殿を行な
い、80μのH₂Oに溶解する。60mM酢酸ナトリウム、2mM
ZnSO₄、500mM NaCl、10重量％グリセロール、pH4.6
および50ユニットのS1ヌクレアーゼ（シグマ社）を含む
溶液80μを添加することにより、穏かなS1分解を開始
する。20℃で15分間反応後、40μの500mM トリス−H
Cl、1M NaCl、pH8.0により反応を停止させ、エタノー
ル沈殿を行なった。続いて、10mM トリス−HCl、10mM
MgCl₂、10mM ２−メルカプトエタノール、100μMdXT
P′ｓ（dATP,dCTP,dGTP,dTTPを含む）、pH7.5を含有す
る溶液100μ中に於いて、DNAポ リメラーゼのクレノ
ーフラグメント（klenow fragment）（BRL社）５ユニッ
トで37℃15分間処理することにより、ブラント末端を生
成する。反応液はフェノール抽出を行ない、同溶液を1m
lG50スピンカラム（10mM トリス、pH8.0中の1mlシリジ
ン中で調製）を通して遠心し、100μを回収する。

上記DNAはエタノール沈殿を行ない、塩基配列決定を
する領域の、Exo IIIに先立つ始めの制限酵素切断部位
と反対側の末端を切断する制限酵素（“粘着”端を残す
もの）によって切断する。切断に続いて、DNA断片をト
リス−酢酸アガロースゲルで解析する。要求されるサイ
ズ範囲中約200bpの大きさの部分に対応するゲル切片を
切り出す、DNA断片の一方の末端は塩基配列決定を行な
う領域内のExo III由来ブラント末端であり、他方の末
端は再切断部位由来である。DNA断片はNa Iへ溶解後、
ガラスパウダーアフィニティー〔ヴォルゲルスタイン
（Volgelstein）とギレシュピー（Gillespie），Proc.N
at'l.Acad.Sci.USA, 76:615−619（1979）〕により精製
する。

上記DNA断片は、次に、ブラント末端がユニバーサル
プライマー結合部位に最も近接するような非対称的な方
法でM13クローニングベクターに連結される。決定する
塩基配列を含む領域に特異的に作製されたプローブとハ
イブリッド形成を行なうM13組み換えプラークは、次の
単鎖鋳型DNAの調製のために選択した〔サンガー（Sange
r）ら、（1977）、前出〕。一般的に、4kbまで塩基配列
決定を行う全領域にわたる塩基配列を得るために、各サ
イズ群から１種類あるいは２種のみの単離断片をユニバ
ーサルプライマーを用いて塩基配列決定を行なうことが
必要である。第２の鎖の塩基配列は、塩基配列決定を行
なう領域の反対側の末端から欠失させ、上記の方法を繰
り返すことにより、得られる。

実施例 ４ IX因子エクソン１を有するIX因子cDNAの組み換え IX因子プロモーターおよび５′コード領域を含む4.5k
bHind IIIフラグメントをシャロン21A（Charon21A）に
クローン化した。シグナル配列の第11番目のコドンか
ら、ポリＡテイルから66bpのXba I切断部位までの全IX
因子コード配列を含む、IX因子cDNAの2.5kbフラグメン
トをAN7プラスミド（VXの誘導体）にサブクローン化し
た。〔マニアティス（Maniatis）他、（1982）、前出、
参照〕。IX因子cDNA内には57bpのエクソン１配列が存在
する。エクソン１を含むシャロン21Aファージを組み換
えAN7プラスミドを含有する細菌上にプレーティング
し、続いてプレート・ストックとして回収した。supFを
含むAN7プラスミドと組み換えたファージは、supF^-細菌
系W3110上にプレーティングすることにより選択するこ
とが可能となった〔マニアティス（Maniatis）ら、（19
82）、前出〕。約２×10⁴ファージあたり１個がsupF⁺で
あった。単離した１つのファージを選んで大規模にDNA
を調製し、制限酵素マッピングおよび続いて、塩基配列
分析を行なうことにより、上記ファージがAN7プラスミ
ドの57pb相同領域中に正しく組み換えられ、IX因子“ミ
ニ遺伝子”を得たことを示した。

実施例 ５ ５′非コード配列のエキソヌクレアーゼによる除去 2.3kb Xbaフラグメントを含むIX因子“ミニ遺伝子”
をガラスパウダーアフィニティーによりAN7から精製し
た。約５μｇの上記フラグメントを40μのExo III緩
衝液中50ユニットのExo IIIで切断した。１分後、８μ
の分注液を120μのExo停止液に15秒間隔で移した。
DNAは上述のようにエキソヌクレアーゼS1ヌクレアーゼ
およびポリメラーゼ１のクレノーフラグメント（Klenow
fragment）で処理し、次にPstアダプター ５′ｐ−CTAGAGGCCTCTGCAGATCTCCGGAG−OH ５′ に連結した。

アダプターを連結したDNAを次にトリス−酢酸アガロ
ースゲルにかけ、約2.3kbのDNAをガラスパウダーアフィ
ニティーにより精製し、M13mp11 Pstベクターに連結し
た。組み換えを起こしたプラークを、IX因子コード配列
のRNAの開始部分17bpに相同なオリゴヌクレオチドを用
いてスクリーニングを行なった。ポジティブにハイブリ
ッド形成を行なったプラークは、遺伝子５′末端におけ
る欠失末端を確認するために上記と同じオリゴヌクレオ
チドを用いて塩基配列を決定した。ユニバーサルプライ
マー塩基配列決定により、３′欠失末端を決定した。生
物学的に活性を有する組み換えIX因子cDNAの全塩基配列
を、下の表Ｉに示す。

〔開始コドンおよび終始コドンは下線で示す。コード領
域は３′および５′非翻訳領域から空白により分離され
ている。〕 実施例 ６ IX因子発現の確認 以下のIX因子アッセイに使用する試料を調製するため
に、約４×10⁶の対数増殖細胞を示されたような添加物
を含む無血清培地で４回すすいだ（各5ml）。37℃で24
時間試料を置いた後、ドライアイス／エタノール バス
中で凍結され、アッセイするまで、−70℃で保存した。

A.IX因子イライザ（Elisa） マイクロタイタープレートをヒトIX因子マウスモノク
ローナル抗体（ハイブリテック社）でコーティングし
た。プレートを洗浄し、試料あるいは標準IX因子調製液
をアルファ培地に希釈後プレートに加えた。IX因子標準
液は、4.0μｇから1.0ngに希釈した、精製IX因子を使用
した。二次抗体（ウサギ抗区因子、カルバイオケム社）
を添加し、洗浄し、アルカリホスファターゼと結合した
ヤギ抗ウサギIg G（ツィメア社）を作用させた。基質は
ジエタノールアミンに希釈したアルカリ性リン酸表（シ
グマ社＃104）のものを用い、結果は410nmで測定した。

B.IX因子凝結アッセイ R.ビックス（R.Biggs）、ヒト血液凝固血流停止およ
び血栓症（Human Blood Coagulation Haemostasis and
Thrombosis）（第１版）、オックスフォード、ブラック
ウェル、サイエンティフィック、614頁（1972）に述べ
られた一段階活性化部分的トロンボプラスチン時間的ア
ッセイを、等容の:1）活性化部分的トロンボプラスチン
試薬（一般的診断法）２）IX因子欠損血漿（ジョージB.
キングバイオメディカル社）および３）標準として正常
保存血漿、あるいは試料に対して行なった。１ユニット
の活性を、1mlの正常保存血漿中の存在量として定義し
た。

実施例 ７ 哺乳動物細胞中におけるIX因子の発現 1983年12月４日出願の米国特許出願第677,813号に対
応する、1986年１月20日に刊行された日本国特許広告公
報第12288/86号の実施例３で述べられているプラスミド
p91023（Ａ）のPst I部位にIX因子コード配列を挿入し
た。得られたクローンを、IX因子の適当な向きに関し
て、p91023−IXとして選択された適当な向きを有するク
ローンでスクリーニングした。IX因子発現ベクターp910
23−IXは、AdMLPの上流にSV40エンハンサー、アデノウ
イルス３分節リーダー（TPL）のcDNAコピー、アデノウ
イルスVA遺伝子、〔カウフマン（Kaufman）,PNAS,82:68
9−693（1985）〕、およびDHFRコード領域の上流に挿入
されたIX因子cDNAコード領域を含む。EcoR I（R1）、Ba
mH1（bam）およびXho I（Ｘ）制限酵素切断部位が示さ
れる。DHFR発現ベクターpAdD26SVpA（３）〔カウフマン
（Kaufman）他、Mol.Cell.Bio., ２:1304−1309（198
2）〕は、第１番目の後期リーダー部位および５′スプ
ライシング部位を含むアデノウイルス主要後期プロモー
ターを含む。RNAトランスクリプト由来リーダーエクソ
ンは導入された３′スプライシング部位と適切にプライ
シングを行なう。上記ベクターは、ColE1複製開始起
点、哺乳動物細胞の複製に有害な塩基配列を欠いたpBR3
22由来配列、テトラサイクリン耐性、およびSV40複製起
点を含む、pSVOa〔メロン（Mellon）ら、Cell，27:279
−288（1981）〕由来2.7KBのSV40初期ポリアデニル化部
位を含んでいる。

IX因子発現ベクターp91023−IXを、pAdD26SVpA3とと
もに、リン酸カルシウムを媒介とするDNAトランスフェ
クションにより、DHFR欠損チャイニーズ・ハムスター卵
巣細胞に導入した。（第１図参照）DHFR陽性表現型で選
択した細胞はIX因子を低水準で発現した。次に、形質転
換体をプールし、以下の連続的にメトトレキセート（MT
X）の濃度を増加させた培地、すなわち、0.02,0.1,0.5,
1.0,5.0および20μＭ、での増殖により選択した。本方
法によって選択した細胞は、増幅されたIX因子遺伝子お
よび導入されたDHFR遺伝子の増幅されたコピーを含む。
上記増幅された遺伝子は、一般的に、１本あるいは２本
の特異的な染色体に局在する〔カウフマン（Kaufman）
ら、Mol.Cell.Bio．３,699−711（1983）〕。DUKX B11
DHFR欠損CHO細胞（ウルラウブ（Urlaub）ら、Proc.Na
t'l.Acad.Sci. 77:4210−4220,1980;カウフマン（Kaufma
n）ら、J.Mol.Biol.,159:601−621,1982）をリン酸カル
シウムにより、25μｇのp91023−IXおよび2.5μｇのpAd
D26SVpA3〔カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sha
rp）、前掲〕の混合物で形質転換を行なった。形質転換
体を、記述されているように（カウフマンおよびシャー
プ、前掲）ヌクレオシドを欠損している培地で選択し
た。同じ結果が得られた同様形質転換は、2.5μｇのpSV
2Neo〔サザン（Southern）ら、J.Mol.Appl.Genet.，１:
327−341（1982）〕の添加を含む。後者の形質転換で
は、DHFR⁺形質転換体は、pSV2neoマーカーで選択するた
めに、抗生物質G418（1mg/ml）を添加したヌクレオチド
欠損培地でまず選択した。G418耐性マーカーの添加は、
増幅されたDHFR遺伝子コピーの直接的選択が不可能な他
の細胞に形質転換されたDNAを含む染色体の転移の促進
に有用となる。

最初の形質転換体をプールし（約25形質転換体／プー
ル）、MTX濃度を増大させて増殖させた。上記プールのI
X因子発現は、³⁵S−メチオニン標識および、調製した培
地および細胞抽出液の、ヒトIX因子を認識するモノクロ
ーナル抗体を用いた免疫沈降によって分析した。細胞抽
出物中に55kダルトンのバンドが見られ、その水準はMTX
耐性の高濃度で選択された細胞ほど高くなった。調製培
地を同様に分析した場合、72kダルトンから55kダルトン
にわたる不均一なスミア（Smear）が見られた。スミア
の不均一性は、分泌された物質のグルコシル化の不均一
性によるものと思われる。さらに、イライザ（Elisa）
によって決定された、分泌されたIX因子抗原の水準は20
μＭ MTXまでの選択で約3000倍に増加した。（表II参
照。）細胞群５α３中のIX因子抗原の水準（すなわち、
生物学的活性ではない）は43.4μg/mlと決定された。

表 II MTX濃度の増加における増殖で選択した細胞の調製倍地
中のIX因子抗原 〔MTX〕 μg/ml プール ５α３ 0 0.015 ５α３ 0.02 0.15 ５α３ 0.1 6.9 ５α３ 0.5 29.4 ５α３ 5.0 36.0 ５α３ 20.0 43.4 実施例 ８ CHO細胞におけるIX因子活性の発現 IX因子を産正するCHO細胞由来のならし倍地（MTXの様
々な濃度における５α３）をIX因子活性について分析す
ると、バックグラウンドを越える活性は検出されなかっ
た。ビタミンＫを、IX因子抗原を産生するCHO細胞を含
む倍地に加えた。表３はCHO IX因子産生細胞（５α３、
20μＭ MTX）にビタミンK₁（３−フェチルメナジオ
ン、シグマ社）濃度を増加させながら添加し、24時間後
のIX因子活性を検定した結果を示す。明らかに、ビタミ
ンK₁濃度を５μg/mlまで増加させるのに従って、ならし
倍地中のIX因子活性も増大する。ビタミンK₁はアッセイ
の直前にならし倍地に加えた場合には、活性に影響を及
ぼさない。以上のように、ビタミンK₁の存在下では、CH
O細胞は、0.275ユニットの活性IX因子/ml/日/10⁶細胞ま
で産生した。

非常に少量の脂溶性ビタミンK₁が実際に細胞に分泌さ
れているという事実の有効性を決定するために、水溶性
誘導体ビタミンK₃（メナジオン、シグマ社）に関して同
様の効果を示した。ビタミンＫによる最大活性を得るに
は、より低い水準のK₃（0.005μg/ml）が必要とされ
た。IX因子活性に対するビタミンK₃依存性の特異性は、
ビタミンＫの特異的拮抗薬（antagonist）であるワルフ
ァリン（warfarin）（１μg/ml）を加えることにより、
IX因子の発現が抑えられることにより示された。

表 III ビタミンK₁に対するIX因子活性 細 胞 ビタミンＫ ｍユニット/ml/日 ５α３（20μＭ） 100ng/ml 42.5 ５α３（20μＭ） 500ng/ml 105.0 ５α３（20μＭ） １μg/ml 192.0 ５α３（20μＭ） ５μg/ml 275.0 ５α３（20μＭ） 10μg/ml 268.0 CHO ５μg/ml 17.5 以上のように、CHO細胞由来因子の比活性はIX因子16.
5mU/μｇであった。正常血漿中のIX因子水準は、IX因子
タンパク質１ユニット/ml/5μｇであるから、CHO細胞由
来IX因子タンパク質の比活性（IX因子活性のユニット数
/mg）は正常血漿由来のものの９％である。

本発明を、推奨される実施例を含む細部にわたり述べ
てきた。しかしながら、以下の請求の範囲によって定義
される本発明の本質および範囲内において、本分野に熟
達した者は変形および改良することが可能であることは
認められるであろう。

フロントページの続き (72)発明者 ウエイスリー，ルイーズ・シー アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州 02131，ウエスト・ロツクスバリー，モ ーリー・ロード ６

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ビタミンＫを含む培地中で、生物学的活性
   を有するγ−カルボキシル化タンパク質をコードする染
   色体中に組入れられたcDNAで形質転換したCHO細胞を培
   養することから成る、上記タンパク質を高収率で産生す
   る方法。
2. 【請求項２】上記タンパク質として、IX因子、Ｘ因子、
   VII因子、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓから成る群
   から選択したタンパク質を使用することから成る、請求
   の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】上記ビタミンＫをビタミンK₁、ビタミンK₃
   および水溶性ビタミンＫから成る群から選択することか
   ら成る、請求の範囲第１又は２項記載の方法。
4. 【請求項４】上記生物学的活性を有するγ−カルボキシ
   化タンパク質が生物学的活性を有するIX因子であり、該
   タンパク質をコードするcDNAがIX因子をコードするcDNA
   である、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】cDNAが下記のcDNA塩基配列から成る、請求
   の範囲第４項記載の方法。
6. 【請求項６】ビタミンＫが、ビタミンK₁およびビタミン
   K₃から成る群から選択される請求の範囲第４項記載の方
   法。
7. 【請求項７】上記培地が約0.1ngから50μg/ml培地の濃
   度のビタミンK₃から成る、請求の範囲第６項記載の方
   法。
8. 【請求項８】上記培地が約5ngから10μg/ml培地の濃度
   のビタミンK₃から成る、請求の範囲第７項記載の方法。
9. 【請求項９】上記培地が約10ngから50μg/ml培地の濃度
   のビタミンK₁から成る、請求の範囲第６項記載の方法。
10. 【請求項１０】上記培地が約100ngから100μg/ml培地の
    濃度のビタミンK₁から成る、請求の範囲第９項記載の方
    法。