JP2582327B2 - 哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法 - Google Patents
哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法Info
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- JP2582327B2 JP2582327B2 JP31402992A JP31402992A JP2582327B2 JP 2582327 B2 JP2582327 B2 JP 2582327B2 JP 31402992 A JP31402992 A JP 31402992A JP 31402992 A JP31402992 A JP 31402992A JP 2582327 B2 JP2582327 B2 JP 2582327B2
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、凍結胚の移植に際し
て、融解後、直接移植できるようにした哺乳動物胚の凍
結保護物質の簡易除去法に関するものである。
て、融解後、直接移植できるようにした哺乳動物胚の凍
結保護物質の簡易除去法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】胚の凍結保存時には、従来より凍結保護
物質(グリセリン等)が添加されており、融解移植時に
は、この凍結保護物質を除去して移植する方法がとられ
ている。この保護物質除去には、浸透圧の関係等により
段階的に希釈する方法が一般的に行われている。
物質(グリセリン等)が添加されており、融解移植時に
は、この凍結保護物質を除去して移植する方法がとられ
ている。この保護物質除去には、浸透圧の関係等により
段階的に希釈する方法が一般的に行われている。
【0003】また一方、細胞外保護物質であるシューク
ロースを用いて1ステップ(ストロ一内)で、保護物質
を除去する方法も行われている。その結果、凍結、融解
胚からの保護物質除去は、著しく簡単になり、融解後に
直接胚を子宮内に移植することが可能となった。
ロースを用いて1ステップ(ストロ一内)で、保護物質
を除去する方法も行われている。その結果、凍結、融解
胚からの保護物質除去は、著しく簡単になり、融解後に
直接胚を子宮内に移植することが可能となった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
1ステップ法では、 融解後、ストローを指ではじいて(振って)空気層
を除去し、グリセリン層とシュークロース層を混合させ
るという人為的作業が必要である。 上記での作業において、ストロ一内での空気層の
上昇に伴って、時として胚がー緒に上部についていくこ
とがあり、手技の違いによって個人差が出現しやすい。 上記の予防策として、肉眼または拡大鏡によりス
トロ一内の胚の確認作業を行っているところもある。 などの問題点が存在し、これらの問題点のすべてを解決
できる方法は、現在のところまだ開発されていない。
1ステップ法では、 融解後、ストローを指ではじいて(振って)空気層
を除去し、グリセリン層とシュークロース層を混合させ
るという人為的作業が必要である。 上記での作業において、ストロ一内での空気層の
上昇に伴って、時として胚がー緒に上部についていくこ
とがあり、手技の違いによって個人差が出現しやすい。 上記の予防策として、肉眼または拡大鏡によりス
トロ一内の胚の確認作業を行っているところもある。 などの問題点が存在し、これらの問題点のすべてを解決
できる方法は、現在のところまだ開発されていない。
【0005】本発明は、上記の各問題点を解決するため
の方策で、凍結処理時に胚を含む凍結保護物質液(グリ
セリン)層と希釈液(シュークロース)層の間の空気層
を除去するようにした哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易
除去法を提供することを目的とする。
の方策で、凍結処理時に胚を含む凍結保護物質液(グリ
セリン)層と希釈液(シュークロース)層の間の空気層
を除去するようにした哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易
除去法を提供することを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに本発明は、保管容器であるストロー内に、シール側
から順に、希釈液、除去用空気層、胚の入った凍結保護
物質液層、空気層、保存液層、空気層、保存液層を充填
して綿栓を施し、これを凍結する過程で、まずストロー
を横置きのままで植氷作業を行い、ついでストロー内の
全液層を凍結した後、綿栓部を下にしてストローを立
て、希釈液層のみを空気中に出して融解し、アルコール
バス内から外に取り出さずに、除去用空気層を指ではじ
いて気泡としてストローの先端部に移動させ、胚の入っ
た凍結保護物質液層と希釈液層の間の空気層を人為的に
除去してのち凍結保存するようにし、融解後における凍
結保護物質の人為的除去作業を省略するようにしたこと
を特徴としている。
めに本発明は、保管容器であるストロー内に、シール側
から順に、希釈液、除去用空気層、胚の入った凍結保護
物質液層、空気層、保存液層、空気層、保存液層を充填
して綿栓を施し、これを凍結する過程で、まずストロー
を横置きのままで植氷作業を行い、ついでストロー内の
全液層を凍結した後、綿栓部を下にしてストローを立
て、希釈液層のみを空気中に出して融解し、アルコール
バス内から外に取り出さずに、除去用空気層を指ではじ
いて気泡としてストローの先端部に移動させ、胚の入っ
た凍結保護物質液層と希釈液層の間の空気層を人為的に
除去してのち凍結保存するようにし、融解後における凍
結保護物質の人為的除去作業を省略するようにしたこと
を特徴としている。
【0007】
【作用】上記の手段により本発明の哺乳動物胚の凍結保
護物質の簡易除去法は、液体窒素中に保存した家畜等の
哺乳動物胚を農家の庭先等において融解後、直ちに受胚
動物に移植でき、融解後の処理等(指ではじく等)の必
要がないため、移植者による個人差も出現しにくい。
護物質の簡易除去法は、液体窒素中に保存した家畜等の
哺乳動物胚を農家の庭先等において融解後、直ちに受胚
動物に移植でき、融解後の処理等(指ではじく等)の必
要がないため、移植者による個人差も出現しにくい。
【0008】
【実施例】本発明の方法の原埋として、溶解している物
質はその種類と濃度によって氷晶点が異なることを利用
して、氷晶の形成している層と未だ氷晶形成に至ってい
ない層の作成を行った。すなわち、図1のシュークロー
ス液層2は、−3℃で植氷作業(液体窒素中で過冷却し
たピンセットでストローをはさむ等の作業)を実施すれ
ば氷晶を形成するが、グリセリン液層3は未だその温度
では液体の状態にある。−3℃で綿栓部8を下にしてス
トローを立て、指でストローをはじぎ空気層6を除去し
た後、−4.8℃まで下げるとグリセリン液層3の氷晶
形成が行われる。
質はその種類と濃度によって氷晶点が異なることを利用
して、氷晶の形成している層と未だ氷晶形成に至ってい
ない層の作成を行った。すなわち、図1のシュークロー
ス液層2は、−3℃で植氷作業(液体窒素中で過冷却し
たピンセットでストローをはさむ等の作業)を実施すれ
ば氷晶を形成するが、グリセリン液層3は未だその温度
では液体の状態にある。−3℃で綿栓部8を下にしてス
トローを立て、指でストローをはじぎ空気層6を除去し
た後、−4.8℃まで下げるとグリセリン液層3の氷晶
形成が行われる。
【0009】なお、これらの作業を実施するにあたって
は、凍結機(プロダラムフリーザー)は、凍結媒体が液
体(メタノール)であって、チャンバー(庫内)がある
程度大きく、かつ、ストローの縦置き、横置きが自由に
できるストロ一架台が必要である。
は、凍結機(プロダラムフリーザー)は、凍結媒体が液
体(メタノール)であって、チャンバー(庫内)がある
程度大きく、かつ、ストローの縦置き、横置きが自由に
できるストロ一架台が必要である。
【0010】前段(ストローを立ててはじく前まで)の
作業は、ストロ一内の胚5が移動しないように横置きで
行い、また空気層6の除去も含めてすべての作業を凍結
溶媒中で行う。しかしこの方法では、空気層6の除去は
できるものの、胚5を含んだグリセリン液層3を気泡が
通過することによる胚の移動(上昇)の可能性が考えら
れる。
作業は、ストロ一内の胚5が移動しないように横置きで
行い、また空気層6の除去も含めてすべての作業を凍結
溶媒中で行う。しかしこの方法では、空気層6の除去は
できるものの、胚5を含んだグリセリン液層3を気泡が
通過することによる胚の移動(上昇)の可能性が考えら
れる。
【0011】そこで図3に示すように、胚5の入ったグ
リセリン液層3とシュークロース液層2の充填の順序を
入れ替え、ストローは横置きのまま−4.8℃で植氷作
業を行い、ストロ一内の全液層を凍結した後、綿栓部8
を下にしてストローを立て、シュークロース液層2のみ
を空気中に出して再度融解する。次いで、シュークロー
ス液層2とグリセリン液層3の間の空気層6を指ではじ
いて除去し、気泡が先端部に達したことを確認した後、
再度シュークロース液層2も凍結溶媒中に沈め凍結す
る。
リセリン液層3とシュークロース液層2の充填の順序を
入れ替え、ストローは横置きのまま−4.8℃で植氷作
業を行い、ストロ一内の全液層を凍結した後、綿栓部8
を下にしてストローを立て、シュークロース液層2のみ
を空気中に出して再度融解する。次いで、シュークロー
ス液層2とグリセリン液層3の間の空気層6を指ではじ
いて除去し、気泡が先端部に達したことを確認した後、
再度シュークロース液層2も凍結溶媒中に沈め凍結す
る。
【0012】この凍結胚の融解は、液体窒素中に保存し
てあるストローを取り出し、透明帯の破損を少なくする
ため空気中に5〜10秒間保持した後、約30℃の温湯
中に5〜10分間ストローを横置きで静置する。この横
置きで静置する理由は、胚5が空気層7等に移動しない
ようにすることと、シュークロース液層2とグリセリン
液層3の溶液を徐々にかつ完全に混合させるためであ
る。このようにして融解したストローを胚移植器にセッ
トして移植を行うのである。
てあるストローを取り出し、透明帯の破損を少なくする
ため空気中に5〜10秒間保持した後、約30℃の温湯
中に5〜10分間ストローを横置きで静置する。この横
置きで静置する理由は、胚5が空気層7等に移動しない
ようにすることと、シュークロース液層2とグリセリン
液層3の溶液を徐々にかつ完全に混合させるためであ
る。このようにして融解したストローを胚移植器にセッ
トして移植を行うのである。
【0013】上記のプロセスをさらに詳しく,具体的に
説明する。まずはじめに、図1の充填方法により凍結,
融解後の胚の生存性について検討した。この試験の状況
を図1,図2,第1表を参照して説明する。
説明する。まずはじめに、図1の充填方法により凍結,
融解後の胚の生存性について検討した。この試験の状況
を図1,図2,第1表を参照して説明する。
【0014】この試験には、黒毛和種雌牛から採取した
B′〜Cランクの胚を供試した。凍結容器には、現在、
胚の凍結保存に広く使われているプラスチックス卜ロー
を用い、このストロ一内に保存液層1(0.3%ウシ血
清アルブミンを含む修正リン酸緩衝液)、保存液1に1
0%シュークロースを添加したシュークロース液層2、
保存液1に10%グリセリンを添加し胚の入ったグリセ
リン液層3の順に、それぞれ5:2:1の割合で各液層
間を空気層6,7により隔てて充填し、凍結はプログラ
ムフリーザーを用い、0℃から−3℃まで1℃/分で冷
却後、−3℃の5分間にシュークロース液層2を手動で
植氷し、シュークロース液層2の凍結終了後、綿栓部8
を下にしてストローを立て、シュークロース液層2とグ
リセリン液層3の間の空気層6を除去した。その後、−
3℃から−4.8℃まで1℃/分で冷却、−4.8℃で
10分間保持し、この間にグリセリン液層3は自動的に
植氷された後、−32℃まで0.5℃/分で冷却し、−
32℃で液体窒素中に浸潰保存した。
B′〜Cランクの胚を供試した。凍結容器には、現在、
胚の凍結保存に広く使われているプラスチックス卜ロー
を用い、このストロ一内に保存液層1(0.3%ウシ血
清アルブミンを含む修正リン酸緩衝液)、保存液1に1
0%シュークロースを添加したシュークロース液層2、
保存液1に10%グリセリンを添加し胚の入ったグリセ
リン液層3の順に、それぞれ5:2:1の割合で各液層
間を空気層6,7により隔てて充填し、凍結はプログラ
ムフリーザーを用い、0℃から−3℃まで1℃/分で冷
却後、−3℃の5分間にシュークロース液層2を手動で
植氷し、シュークロース液層2の凍結終了後、綿栓部8
を下にしてストローを立て、シュークロース液層2とグ
リセリン液層3の間の空気層6を除去した。その後、−
3℃から−4.8℃まで1℃/分で冷却、−4.8℃で
10分間保持し、この間にグリセリン液層3は自動的に
植氷された後、−32℃まで0.5℃/分で冷却し、−
32℃で液体窒素中に浸潰保存した。
【0015】このストローを空気中に約5〜10秒間保
持後、30℃の温湯中に20分間静置することにより、
融解並びに約3%までのグリセリン除去を行った。その
後、直ちにシャーレ内のミネラルオイルで覆った100
μlの20%ウシ胎児血清添加25mMヘペス緩衝TC
M−199培地に胚を1個ずつ入れ、5%炭酸ガス,9
5%空気の気相からなる39℃の炭酸ガス培養装置内で
培養した。培養24〜48時間後に拡張胚盤胞から脱殻
した胚盤胞まで発育したものを生存胚として判定した。
その結果、表1に示したとおり、15個中6個(40
%)が生存していたことからこの方法の有効性が認めら
れた。
持後、30℃の温湯中に20分間静置することにより、
融解並びに約3%までのグリセリン除去を行った。その
後、直ちにシャーレ内のミネラルオイルで覆った100
μlの20%ウシ胎児血清添加25mMヘペス緩衝TC
M−199培地に胚を1個ずつ入れ、5%炭酸ガス,9
5%空気の気相からなる39℃の炭酸ガス培養装置内で
培養した。培養24〜48時間後に拡張胚盤胞から脱殻
した胚盤胞まで発育したものを生存胚として判定した。
その結果、表1に示したとおり、15個中6個(40
%)が生存していたことからこの方法の有効性が認めら
れた。
【0016】
【表1】 注)A法:10%シュークロースを用いた従来の4ステ
ップ除去法 B法:10%シュークロースを用いたシャーレ内1ステ
ップ除去法 C法:初期の方法による除去法
ップ除去法 B法:10%シュークロースを用いたシャーレ内1ステ
ップ除去法 C法:初期の方法による除去法
【0017】しかしながら、この方法では、前述のとお
りシュークロース液層2とグリセリン液層3の間の空気
層6を除去する際に、時として胚が上昇することが起こ
り得るので、シュークロース液層2とグリセリン液層3
の充填の順序を逆にした図3の方法で封入し、移植試験
を行ったのでその状況を説明する。
りシュークロース液層2とグリセリン液層3の間の空気
層6を除去する際に、時として胚が上昇することが起こ
り得るので、シュークロース液層2とグリセリン液層3
の充填の順序を逆にした図3の方法で封入し、移植試験
を行ったのでその状況を説明する。
【0018】この方法では、保存液層1,胚の入ったグ
リセリン液層3,10%または20%シュークロース添
加のシュークロース液層2の順に、それぞれ4:1:2
の割合で各液層間を空気層6,7により隔ててストロ一
内に充填した。凍結は、前述のプログラムフリーザーを
用い、ストローは横置きで、図4のとおり0℃から−
4.8℃まで1℃/分で冷却して後、保存液層1液を手
動で植氷し、−4.8℃で10分間保持後−32℃まで
0.5℃/分で冷却し、液体窒素中に浸漬した。この−
4.8〜−15℃までの冷却中に、ストローは綿栓部を
下にして立て胚5の入ったグリセリン液層3までは凍結
溶媒中に残し、シュークロース液層2を空気中に出し融
解したら、シュークロース液層2とグリセリン液層3の
間の空気層6を指ではじくことにより除去した後、シュ
ークロース液層2も再度凍結溶媒中に沈め凍結した。
リセリン液層3,10%または20%シュークロース添
加のシュークロース液層2の順に、それぞれ4:1:2
の割合で各液層間を空気層6,7により隔ててストロ一
内に充填した。凍結は、前述のプログラムフリーザーを
用い、ストローは横置きで、図4のとおり0℃から−
4.8℃まで1℃/分で冷却して後、保存液層1液を手
動で植氷し、−4.8℃で10分間保持後−32℃まで
0.5℃/分で冷却し、液体窒素中に浸漬した。この−
4.8〜−15℃までの冷却中に、ストローは綿栓部を
下にして立て胚5の入ったグリセリン液層3までは凍結
溶媒中に残し、シュークロース液層2を空気中に出し融
解したら、シュークロース液層2とグリセリン液層3の
間の空気層6を指ではじくことにより除去した後、シュ
ークロース液層2も再度凍結溶媒中に沈め凍結した。
【0019】
【表2】 注)黒毛和種胚は、Aランクのみ ホルスタイン種胚は、A,Bランク
【0020】この方法で凍結保存した胚を、空気中に5
〜10秒間保持後、30℃の温湯中で5〜10分間スト
ローを横置きで静置することにより融解並びにグリセリ
ン除去し、直ちに胚移植器にセットして移植した。この
野外移植試験の結果、受胎率は表2のとおり、黒毛和種
胚が45.3%、ホルスタイン種胚が60.0%であっ
た。
〜10秒間保持後、30℃の温湯中で5〜10分間スト
ローを横置きで静置することにより融解並びにグリセリ
ン除去し、直ちに胚移植器にセットして移植した。この
野外移植試験の結果、受胎率は表2のとおり、黒毛和種
胚が45.3%、ホルスタイン種胚が60.0%であっ
た。
【0021】本試験で用いたシュークロース液層2とグ
リセリン液層3の充填割合では、ストローを横置きにし
て融解した場合、約1分間で平均的に混和し、グリセリ
ン濃度は約3%に、また、シュークロース濃度はシュー
クロース液層2が10%の場合約7%に、20%の場合
約13%となる。このシュークロース濃度割合別移植成
績を表3に示した。
リセリン液層3の充填割合では、ストローを横置きにし
て融解した場合、約1分間で平均的に混和し、グリセリ
ン濃度は約3%に、また、シュークロース濃度はシュー
クロース液層2が10%の場合約7%に、20%の場合
約13%となる。このシュークロース濃度割合別移植成
績を表3に示した。
【0022】
【発明の効果】以上説明したように、本発明による哺乳
動物胚の凍結保護物質の簡易除去法によれば、保管容器
であるストロー内に、シール側から順に、希釈液、除去
用空気層、胚の入った凍結保護物質液層、空気層、保存
液層、空気層、保存液層を充填して綿栓を施し、これを
凍結する過程で、まずストローを横置きのままで植氷作
業を行い、ついでストロー内の全液層を凍結した後、綿
栓部を下にしてストローを立て、希釈液層のみを空気中
に出して融解し、アルコールバス内から外に取り出さず
に、除去用空気層を指ではじいて気泡としてストローの
先端部に移動させ、胚の入った凍結保護物質液層と希釈
液層の間の空気層を人為的に除去してのち凍結保存する
ようにし、融解後における凍結保護物質の人為的除去作
業を省略するようにしたので、胚が下方に移動して綿栓
側の空気層等に移動することがなく、凍結時における胚
の損傷を防止することができる。その結果、液体窒素中
に保存した家畜等の哺乳動物胚を農家の庭先等において
融解後、直ちに受胚動物に移植することで受胎率を高め
ることができる。
動物胚の凍結保護物質の簡易除去法によれば、保管容器
であるストロー内に、シール側から順に、希釈液、除去
用空気層、胚の入った凍結保護物質液層、空気層、保存
液層、空気層、保存液層を充填して綿栓を施し、これを
凍結する過程で、まずストローを横置きのままで植氷作
業を行い、ついでストロー内の全液層を凍結した後、綿
栓部を下にしてストローを立て、希釈液層のみを空気中
に出して融解し、アルコールバス内から外に取り出さず
に、除去用空気層を指ではじいて気泡としてストローの
先端部に移動させ、胚の入った凍結保護物質液層と希釈
液層の間の空気層を人為的に除去してのち凍結保存する
ようにし、融解後における凍結保護物質の人為的除去作
業を省略するようにしたので、胚が下方に移動して綿栓
側の空気層等に移動することがなく、凍結時における胚
の損傷を防止することができる。その結果、液体窒素中
に保存した家畜等の哺乳動物胚を農家の庭先等において
融解後、直ちに受胚動物に移植することで受胎率を高め
ることができる。
【0023】
【表3】
【0024】これを浸透圧に直して考えると、凍結時、
胚の入った10%グリセリン液層3は1,950〜2,
000mOsm/kgの状態にあり、融解後、シューク
ロース+グリセリン液層4中の胚は、10%シュークロ
ースの場合約1,250mOsm/kg、20%シュー
クロースの場合約1,400mOsm/kgの状態に5
〜10分間程度置かれることとなる。その後、胚は子宮
内において約300mOsm/kgという体液の浸透圧
にさらされることとなる。
胚の入った10%グリセリン液層3は1,950〜2,
000mOsm/kgの状態にあり、融解後、シューク
ロース+グリセリン液層4中の胚は、10%シュークロ
ースの場合約1,250mOsm/kg、20%シュー
クロースの場合約1,400mOsm/kgの状態に5
〜10分間程度置かれることとなる。その後、胚は子宮
内において約300mOsm/kgという体液の浸透圧
にさらされることとなる。
【0025】
【発明の効果】以上説明したように、本発明による哺乳
動物胚の凍結保護物質の簡易除去法によれば、液体窒素
中に保存した家畜等の哺乳動物胚を農家の庭先等におい
て融解後、直ちに受胚動物に移植することができる。し
かも、融解後の処理等(指ではじく等)の必要がないた
め、移植者による個人差も出現しにくい利点がある。
動物胚の凍結保護物質の簡易除去法によれば、液体窒素
中に保存した家畜等の哺乳動物胚を農家の庭先等におい
て融解後、直ちに受胚動物に移植することができる。し
かも、融解後の処理等(指ではじく等)の必要がないた
め、移植者による個人差も出現しにくい利点がある。
【図1】本発明の初期段階での保管容器ス卜ロ一内充填
及び凍結,融解時の側断面図である。
及び凍結,融解時の側断面図である。
【図2】図1におけるストローの凍結方法を示したグラ
フである。
フである。
【図3】本発明の完成段階での保管容器ス卜ロ一内充填
及び凍結,融解時の側断面図である。
及び凍結,融解時の側断面図である。
【図4】図3におけるストローの凍結方法を示した図で
ある。
ある。
l 保存液(修正PBS)層 2 シュークロース液層 3 グリセリン液層 4 シュークロース+グリセリン液層 5 胚 6 空気層(除去用) 7 空気層 8 綿栓 9 シール
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 坊薗 正恒 宮崎県西諸県郡高原町大字広原5066番地 宮崎県優良家畜受精卵総合センター内 (56)参考文献 特開 平3−232441(JP,A)
Claims (1)
- 【請求項1】 保管容器であるストロー内に、シール側
から順に、希釈液、除去用空気層、胚の入った凍結保護
物質液層、空気層、保存液層、空気層、保存液層を充填
して綿栓を施し、 これを凍結する過程で、まずストローを横置きのままで
植氷作業を行い、ついでストロー内の全液層を凍結した
後、綿栓部を下にしてストローを立て、希釈液層のみを
空気中に出して融解し、アルコールバス内から外に取り
出さずに、除去用空気層を指ではじいて気泡としてスト
ローの先端部に移動させ、 胚の入った凍結保護物質液層
と希釈液層の間の空気層を人為的に除去してのち凍結保
存するようにし、融解後における凍結保護物質の人為的
除去作業を省略するようにしたことを特徴とする哺乳動
物胚の凍結保護物質の簡易除去法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP31402992A JP2582327B2 (ja) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | 哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP31402992A JP2582327B2 (ja) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | 哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06133991A JPH06133991A (ja) | 1994-05-17 |
JP2582327B2 true JP2582327B2 (ja) | 1997-02-19 |
Family
ID=18048360
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP31402992A Expired - Lifetime JP2582327B2 (ja) | 1992-10-29 | 1992-10-29 | 哺乳動物胚の凍結保護物質の簡易除去法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2582327B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2471359B1 (en) * | 2010-12-30 | 2016-03-30 | Cellulis S.L. | Method of freezing cells |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03232441A (ja) * | 1990-02-09 | 1991-10-16 | Zenkoku Nogyo Kyodo Kumiai Rengokai | 受胎率を上げた凍結受精卵およびその調製法 |
-
1992
- 1992-10-29 JP JP31402992A patent/JP2582327B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH06133991A (ja) | 1994-05-17 |
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