JP2579981B2 - M-CSF production method - Google Patents

M-CSF production method

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JP2579981B2 JP62502580A JP50258087A JP2579981B2 JP 2579981 B2 JP2579981 B2 JP 2579981B2 JP 62502580 A JP62502580 A JP 62502580A JP 50258087 A JP50258087 A JP 50258087A JP 2579981 B2 JP2579981 B2 JP 2579981B2
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Abstract

A novel family of primate CSF-1-like polypeptides is provided via recombinant techniques, including compositions and methods for their production and use.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なDNA配列および組換えDNA分子を用い
てヒトＭ−CSF糖タンパク質を生産する方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing human M-CSF glycoprotein using novel DNA sequences and recombinant DNA molecules.

発明の背景 Ｍ−CSFまたはCSF−１はマイクロフアージコロニーの
生存、増殖および分化を促進する能力によつて特徴づけ
られるタンパク質であり、それ故にマクロフアージコロ
ニー刺激因子〔Ｍ−CSFと略す〕と名づけられた。Ｍ−C
SFは何年もの間ネズミおよびヒト系でそれを検出するた
めのアツセイに関する多数の論文の主題であつた。同様
に、天然源からこのタンパク質を精製する方法も開示さ
れた。例えば、PCT出願WO86/04587は、イムノアフイニ
テイークロマトグラフイーおよび逆相高圧クロマトグラ
フイーを用いて天然源からヒトおよびネズミCSF−１タ
ンパク質を精製する方法を開示している。例えばスタン
レー（E.R.Stanley）ら、J.Biol.Chem.，252:4305（197
7）；ダス（S.K.Das）ら、Blood，58:630（1981）およ
びPCT出願WO86/04587に引用された文献を参照された
い。BACKGROUND OF THE INVENTION M-CSF or CSF-1 is a protein characterized by its ability to promote the survival, growth and differentiation of microphage colonies and is therefore termed macrophage colony stimulating factor (M-CSF). Was done. M-C
SF has been the subject of numerous papers on assays for detecting it in murine and human systems for many years. Similarly, methods for purifying the protein from natural sources have been disclosed. For example, PCT application WO 86/04587 discloses a method for purifying human and murine CSF-1 proteins from natural sources using immunoaffinity chromatography and reverse-phase high pressure chromatography. For example, Stanley et al . , J. Biol. Chem. , 252 : 4305 (197
7); see SKDas et al., Blood , 58 : 630 (1981) and references cited in PCT application WO86 / 04587.

ヒトCSF−１の一形態をコードするcDNA配列がカワサ
キ（E.S.Kawasaki）ら、Science，230:291−296（198
5）によつて報告された。さらに、公開PCT出願WO86/046
07は、そのcDNA配列によりコードされるタンパク質を組
換え法で生産する方法を開示している。The cDNA sequence encoding one form of human CSF-1 is described in Kawasaki et al., Science , 230 : 291-296 (198
5). In addition, published PCT application WO86 / 046
07 discloses a method for recombinantly producing a protein encoded by its cDNA sequence.

当分野では、造血系疾患を治療するために天然に存在
するヒト尿Ｍ−CSFに類似した他のヒトCSF−１またはＭ
−CSFを生産する必要性が依然として残されている。The art recognizes other human CSF-1 or M analogous to naturally occurring human urine M-CSF for treating hematopoietic disorders.
-The need to produce CSF still remains.

発明の要約 本発明の１つの面として、驚いたことに、他のヒトタ
ンパク質と実質的に会合しておらず、今までに同定され
たことのない、ヒトＭ−CSFタンパク質を生産する新規
方法が開発された。この方法は、従来技術において記載
された配列と有意に異なるＭ−CSFタンパク質をコード
する新規cDNA配列で形質転換された適当な細胞を培養す
ることから成つている。この新規配列は天然ヒトＭ−CS
Fの生物学的および生化学的特性を示し且つ表Ｉに示し
たアミノ酸＃１からアミノ酸＃223までのペプチド配列
と同じであるか又は実質的に同じペプチド配列を含むこ
とにより特徴づけられるタンパク質をコードしている。SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect of the present invention, surprisingly, a novel method for producing human M-CSF protein that has not been substantially associated with other human proteins and has never been identified. Was developed. This method consists of culturing suitable cells transformed with a novel cDNA sequence encoding a M-CSF protein that differs significantly from the sequences described in the prior art. This new sequence is native human M-CS
A protein which exhibits the biological and biochemical properties of F and is characterized by having the same or substantially the same peptide sequence from amino acid # 1 to amino acid # 223 shown in Table I Code.

表Ｉは発現の際にＭ−CSFタンパク質をコードする完
全な4KbのDNA配列を示す。この配列は1662ヌクレオチド
の長鎖翻訳オープン・リーデイング・フレームを含み、
554個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードしてい
る。３つの部分、すなわちヌクレオチド＃１〜＃415、
ヌクレオチド＃419〜＃689、およびヌクレオチド＃1584
〜＃1823はカワサキらの上記文献記載の配列にも存在し
ている。しかしながら、ヌクレオチド＃416〜＃418およ
び＃690〜＃1583はコード配列のリーデイング・フレー
ムを乱さない新規配列を表す。4Kb配列のタンパク質コ
ード領域はヌクレオチド＃146（メチオニンコドン中の
アデニン）からヌクレオチド＃1807（この後にTAG停止
コドンが続く）までの範囲である。Asn−Ｘ−Serまたは
Asn−Ｘ−Thrの特徴的配列によつて示されるアスパラギ
ン結合グリコシル化部位が４個所存在しうる。4Kb配列
の残りの2200ヌクレオチドの３′非コード配列は天然宿
主内での転写において調節的役割を有している。この配
列の３′末端はまた配列ATTTAの繰り返しを含むATに富
むセグメント（このセグメントはRNAメツセージの安定
生に関係があると考えられている）を有する〔シヨー
（G.Shaw）およびカメン（R.Kamen）、Cell．46（５）:
659−677（1986）を参照されたい〕。Table I shows the complete 4 Kb DNA sequence encoding the M-CSF protein upon expression. This sequence contains a 1662 nucleotide long translation open reading frame,
It encodes a polypeptide consisting of 554 amino acids. Three parts, namely nucleotides # 1 to # 415,
Nucleotides # 419 to # 689, and nucleotides # 1584
＃# 1823 is also present in the sequence described in Kawasaki et al. However, nucleotides # 416- # 418 and # 690- # 1583 represent new sequences that do not disturb the reading frame of the coding sequence. The protein coding region of the 4Kb sequence ranges from nucleotide # 146 (adenine in the methionine codon) to nucleotide # 1807 (followed by a TAG stop codon). Asn-X-Ser or
There may be four asparagine-linked glycosylation sites indicated by the characteristic sequence of Asn-X-Thr. The remaining 2200 nucleotide 3 'non-coding sequence of the 4Kb sequence has a regulatory role in transcription in the native host. The 3 'end of this sequence also has an AT-rich segment containing repeats of the sequence ATTTA, which is believed to be involved in the stability of RNA messages [G. Shaw and Kamen (R. .Kamen), Cell . 46 (5):
659-677 (1986)].

本発明方法で用いるcDNA配列は発現制御配列と操作可
能な状態で結合している。このcDNA配列は以前に同定さ
れたことのない新規配列−−表Ｉに示すヌクレオチド＃
242ないしヌクレオチド＃910、またはヌクレオチド＃24
2ないしヌクレオチド＃1583と同じヌクレオチド配列、
もしくは実質的に同じヌクレオチド配列を含む。１つの
このような新規かつ好適なcDNA配列は表Ｉの完全なヌク
レオチド配列を含む。さらに、表Ｉのヌクレオチドおよ
び対応するペプチド配列の対立遺伝子変異型（またはア
イソザイム）、並びに遺伝暗号の同義性（degeneracy）
により生ずるヌクレオチド配列の変異型も、それらがＭ
−CSF活性をもつポリペプチドをコードする限り本発明
に包含される。The cDNA sequence used in the method of the present invention is operably linked to an expression control sequence. This cDNA sequence is a novel sequence that has not been previously identified--nucleotide # shown in Table I.
242 to nucleotide # 910, or nucleotide # 24
2 to the same nucleotide sequence as nucleotides # 1583,
Alternatively, they comprise substantially the same nucleotide sequence. One such novel and preferred cDNA sequence comprises the complete nucleotide sequence of Table I. In addition, allelic variants (or isozymes) of the nucleotides and corresponding peptide sequences of Table I, and the degeneracy of the genetic code
Mutated versions of the nucleotide sequences produced by
-Included in the present invention as long as they encode a polypeptide having CSF activity.

また、アミノ酸＃150ないしアミノ酸＃223の配列と同
じ又は実質質に同じペプチド配列を含むことにより特徴
づけられるＭ−CSFタンパク質をコードするcDNA配列を
用いて、培養すべき細胞を形質転換することを含むＭ−
CSFの生産方法は本発明の一部を構成する。この方法で
用いるcDNA配列は、表Ｉに示したヌクレオチド＃689か
らヌクレオチド＃910までのヌクレオチド配列と同じ又
は実質的に同じヌクレオチド配列を含む。本発明は、こ
の新規ヌクレオチド配列によつてコードされる同じ又は
実質的に同じ部分ペプチド配列により特徴づけられるＭ
−CSF活性をもつすべてのタンパク質の生産を包含す
る。Also, transforming cells to be cultured with a cDNA sequence encoding an M-CSF protein characterized by including the same or substantially the same peptide sequence as the sequence of amino acids # 150 to # 223. Including M-
The method of producing the CSF forms part of the present invention. The cDNA sequence used in this method includes the same or substantially the same nucleotide sequence from nucleotide # 689 to nucleotide # 910 shown in Table I. The present invention relates to an M nucleotide sequence characterized by the same or substantially the same partial peptide sequence encoded by this novel nucleotide sequence.
-Includes the production of all proteins with CSF activity.

本発明方法で用いる形質転換細胞は、Ｍ−CSF DNAコ
ード配列と操作可能な状態で連結された適当な発現制御
配列を含む。適当な細胞または細胞株はチヤイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞のような哺乳動物細胞であり
うる。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、および形質転
換、培養、増幅、スクリーニングおよび生産物の製造・
精製の諸方法は当分野で知られている。例えば、ゲツシ
ング（Gething）およびサムブロツク（Sambrook）、Nat
ure，293:620−625（1981）、またはカウフマン（Kaufm
an）ら、Mol.Cell.Biol.,５（７）:1750−1759（198
5）、あるいはハウレイ（Howley）ら、米国特許第44194
46号を参照されたい。本実施例に記載されるその他の適
当な哺乳動物細胞株はサルCOS−１細胞株である。同じ
く有用な哺乳動物細胞株はCV−１細胞株である。The transformed cells used in the method of the present invention contain an appropriate expression control sequence operably linked to the M-CSF DNA coding sequence. Suitable cells or cell lines can be mammalian cells, such as Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Selection of appropriate mammalian host cells, and transformation, culture, amplification, screening and production of products.
Methods of purification are known in the art. For example, Gething and Sambrook, Nat
ure , 293 : 620-625 (1981) or Kaufman (Kaufm
an) et al., Mol . Cell . Biol ., 5 (7): 1750-1759 (198
5) Alternatively, Howley et al., US Pat.
See issue 46. Another suitable mammalian cell line described in this example is the monkey COS-1 cell line. Another useful mammalian cell line is the CV-1 cell line.

また、細菌細胞も本発明で用いるのに適している。例
えば、種々の大腸菌株がバイオテクノロジーの分野で宿
主細胞としてよく知られている。枯草菌（B.subtilis）
のいろいろな菌株も本方法で用いられる。また、当業者
に知られた酵母細胞の多くの菌株も本発明ポリペプチド
の発現用宿主細胞として利用できる。さらに、所望の場
合は、昆虫細胞も本発明方法で宿主細胞として使用でき
る。例えば、ミラー（Miller）ら、Genetic Engineerin
g，８:277−298（Plenum Press 1986）およびそこに引
用された文献を参照されたい。Bacterial cells are also suitable for use in the present invention. For example, various E. coli strains are well known as host cells in the field of biotechnology. B. subtilis
Are also used in this method. Many strains of yeast cells known to those skilled in the art can also be used as host cells for expressing the polypeptide of the present invention. In addition, if desired, insect cells can also be used as host cells in the methods of the present invention. For example, Miller et al., Genetic Engineerin
g , 8 : 277-298 (Plenum Press 1986) and the references cited therein.

本発明の別の面は、表Ｉに示したヌクレオチド＃242
ないしヌクレオチド＃910、または＃689ないし＃910、
または＃242ないし＃1583、もしくは＃689ないし＃1583
の配列、あるいは全ヌクレオチド配列と同じ又は実質的
に同じヌクレオチド配列を含む、Ｍ−CSFタンパク質の
発現方法において用いるためのベクターを提供する。好
ましくは、そのベクターは表Ｉに記載の全DNA配列を含
む。また、ベクターはＭ−CSF DNA配列の発現を可能に
する適当な発現制御配列を含む。さらに、本明細書に記
載されるような修飾された又は自然界に存在する対立遺
伝子配列を組み込んだベクターも本発明の実施態様であ
り、Ｍ−CSFの生産に有用である。そのベクターは細胞
株の形質転換方法において使用され、そして所定の宿主
細胞内でのその複製および発現を導き得る所定の調節配
列（本発明のDNAコード配列と操作可能な状態で結合さ
れている）を含有する。このようなベクターにとつて有
用な調節配列は当分野で知られており、所定の宿主細胞
に応じて選ばれる。このような選択は日常的な事であ
り、本発明の一部を構成するものではない。Another aspect of the invention relates to nucleotides # 242 shown in Table I.
Or nucleotides # 910, or # 689 through # 910,
Or # 242 through # 1583, or # 689 through # 1583
Or a vector comprising the same or substantially the same nucleotide sequence as the entire nucleotide sequence for use in a method for expressing an M-CSF protein. Preferably, the vector contains the entire DNA sequence set forth in Table I. The vector also contains appropriate expression control sequences that allow expression of the M-CSF DNA sequence. Further, vectors incorporating modified or naturally occurring allelic sequences as described herein are also embodiments of the invention and are useful for producing M-CSF. The vector is used in a method of transforming a cell line, and has certain regulatory sequences (operably linked to a DNA coding sequence of the present invention) capable of directing its replication and expression in a given host cell. It contains. The regulatory sequences useful for such vectors are known in the art and will be selected according to the given host cell. Such selections are routine and do not form a part of the present invention.

本発明のさらに別の面は表ＩのDNA配列およびその対
立遺伝子変異型である。表Ｉの約4KbのDNA配列は大腸菌
HB101中のプラスミドp3ACSF−69に保持され、この大腸
菌は1986年４月16日にメリーランド州ロツクビル、パー
クローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託され、寄託番号ATCC 67092
を与えられた。その後、この形質転大腸菌はブダペスト
条約に基づく国際寄託に変更された（ATCC 67092,1987
年３月30日）。適当な宿主細胞にトランスフエクシヨン
されたこの配列は、発現の際に、マウスおよびヒトin v
itro骨髄検定においてマクロフアージコロニー刺激作用
を示すＭ−CSFタンパク質をコードする。Yet another aspect of the invention is the DNA sequence of Table I and allelic variants thereof. The DNA sequence of about 4 Kb in Table I is
Carried on plasmid p3ACSF-69 in HB101, this E. coli was deposited on April 16, 1986, with American Type Culture Collection, 12301 Parklone Drive, Rockville, MD, under accession number ATCC 67092.
Was given. Subsequently, the transformed E. coli was changed to an international deposit under the Budapest Treaty (ATCC 67092, 1987).
March 30). This sequence, transfected into a suitable host cell, is transformed into a mouse and human inv.
Encodes an M-CSF protein that exhibits macrophage colony stimulating activity in the itro bone marrow assay.

点突然変異などによつて起こる表Ｉの4Kb配列のわず
かな変異は、その配列がコードする機能タンパク質を変
化させないであろう。従つて、このような小さい配列変
異は遺伝暗号の同義性によるものを含めて、本発明に包
含される。また、ヌクレオチドの修飾は本方法で用いる
DNA配列に遺伝子工学的に故意に組み入れることがで
き、その修飾は既知技法を用いて当業者により行われ
る。このような修飾はアミノ酸の欠失、挿入または置換
をもたらす。例えば、コード配列中のシステイン残基を
１個以上取り換えると、対応するジスルフイド結合を排
除することができる。また、１つ以上のトリペプチドア
スパラギン結合グリコシル化認識部位のアミノ酸を置
換、挿入または欠失させると、その部位で非グリコシル
化が起こるであろう。このような置換または欠失のため
の突然変異誘発法は当分野でよく知られている。〔米国
特許第4518584号を参照されたい。〕これらの修飾配列
を組み込んだベクターも本発明の実施態様であり、ここ
に記載のＭ−CSFタンパク質の生産に有用である。Small variations in the 4 Kb sequence of Table I, such as those caused by point mutations, will not alter the functional protein encoded by that sequence. Thus, such small sequence variations, including those due to the synonym of the genetic code, are encompassed by the present invention. In addition, nucleotide modification is used in the present method.
It can be deliberately engineered into the DNA sequence and modifications are made by those skilled in the art using known techniques. Such modifications result in amino acid deletions, insertions or substitutions. For example, replacing one or more cysteine residues in a coding sequence can eliminate the corresponding disulfide bond. Also, substitution, insertion or deletion of an amino acid at one or more of the tripeptide asparagine-linked glycosylation recognition sites will result in non-glycosylation at that site. Mutagenesis for such substitutions or deletions is well known in the art. [See U.S. Patent No. 4,518,584. A vector incorporating these modified sequences is also an embodiment of the present invention, and is useful for producing the M-CSF protein described herein.

本発明方法によつて生産されるＭ−CSFは、非還元条
件下でポリアクリルアミドSDSゲル電気泳動により分析
したとき、約70〜90Kdの見掛け分子量をもつことによつ
て特徴づけられる。しかしながら、この分析をＭ−CSF
の還元後に行うと、このタンパク質は35〜45Kdの分子量
を有し、このことはＭ−CSFが35〜45Kdのサブユニツト
のジスルフイド結合ホモダイマーであることを示唆して
いる。The M-CSF produced by the method of the present invention is characterized by having an apparent molecular weight of about 70-90 Kd when analyzed by polyacrylamide SDS gel electrophoresis under non-reducing conditions. However, this analysis was performed using M-CSF
Performed after reduction of this protein, the protein has a molecular weight of 35-45 Kd, suggesting that M-CSF is a 35-45 Kd subunit disulfide-linked homodimer.

表Ｉの配列によつてコードされる約61Kdの前駆物質
は、32個のアミノ酸残基から成るシグナルペプチドの除
去によりアミノ末端で、そして約229個の残基の除去に
よりカルボキシ末端領域で処理されると、推定分子量21
Kdの223個または224個のアミノ酸から成るサブユニツト
を生ずる。従つて、成熟Ｍ−CSFモノマーはそのアミノ
末端にGlwを有し、そして少なくとも表Ｉで示した223位
のアミノ酸Argまで伸長している。このタンパク質はま
たそのカルボキシ末端に表Ｉで示した224位のアミノ酸S
erを含有しうる。このサブユニツトは表Ｉの配列中に存
在する４つのアスパラギン結合炭水化物付加部位のうち
２つを保有している。これらの２つの部位および多数の
Ｏ−結合グリコシル化部位での21Kdポリペプチドのグリ
コシル化は、35〜45KdのＭ−CSFサブユニツトの残りの
質量の大部分を占めている。The approximately 61 Kd precursor encoded by the sequence of Table I is treated at the amino terminus by removal of a signal peptide consisting of 32 amino acid residues and at the carboxy terminal region by removal of about 229 residues. Gives an estimated molecular weight of 21
This produces a subunit consisting of 223 or 224 amino acids of Kd. Thus, the mature M-CSF monomer has Glw at its amino terminus and extends at least to the amino acid Arg at position 223 shown in Table I. This protein also has the amino acid S at position 224 shown in Table I at its carboxy terminus.
er. This subunit carries two of the four asparagine-linked carbohydrate addition sites present in the sequence of Table I. Glycosylation of the 21 Kd polypeptide at these two sites and numerous O-linked glycosylation sites accounts for the majority of the remaining mass of the 35-45 Kd M-CSF subunit.

本発明のさらに別の面として、造血細胞（特に単球お
よびマクロフアージを含めた骨髄系の細胞）の欠損症を
治療するための方法および治療用組成物が提供される。
Ｍ−CSFは単球やマクロフアージの生産を直接刺激する
ために使用され、また他の造血細胞系列を間接的に刺激
することができる。本発明ポリペプチドを用いて治療し
やすい症状は、特に末梢血中の循環性白血球の数が減少
する白血球減少症である。白血球減少症はウイルスまた
は放射線への暴露によつて誘発され、そして往々にして
種々のがん治療および化学療法剤により起こる副作用で
ある。Ｍ−CSFによる白血球減少症の治療はこの種の副
作用を避けることができる。さらに、Ｍ−CSFは重症の
感染症の場合に成熟白血球を活性化することができ、し
かも単球にGM−CSFを生産させることができる。Ｍ−CSF
はまた細胞内寄生虫感染症、細菌感染症などを治療する
ために用いられる。さらに、Ｍ−CSF単独あるいはIL−
１、IL−２、IL−３、IL−４、IL−５、Ｂ細胞分化因
子、BSF−２およびインターフエロンのような他の造血
素との組み合わせは、活性化マクロフアージが腫瘍細胞
を死滅させるマクロフアージの機能を増強させ、α−イ
ンターフエロンを放出させ、寄生虫を殺し、また他のCS
Fを放出および促進させることができる。 In yet another aspect of the present invention, there are provided methods and therapeutic compositions for treating deficiencies in hematopoietic cells, particularly cells of the myeloid lineage including monocytes and macrophages.
M-CSF is used to directly stimulate monocyte and macrophage production, and can also indirectly stimulate other hematopoietic cell lineages. Symptoms that can be easily treated with the polypeptide of the present invention are leukopenia in which the number of circulating leukocytes in peripheral blood is reduced. Leukopenia is induced by exposure to viruses or radiation and is a side effect often caused by various cancer treatments and chemotherapeutic agents. Treatment of leukopenia with M-CSF can avoid this type of side effect. In addition, M-CSF can activate mature leukocytes in severe infections and can cause monocytes to produce GM-CSF. M-CSF
Is also used to treat intracellular parasitic infections, bacterial infections and the like. Furthermore, M-CSF alone or IL-
1, In combination with other hematopoiesis such as IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, B cell differentiation factor, BSF-2 and interferon, activated macrophages kill tumor cells Increases macrophage function, releases α-interferon, kills parasites, and reduces other CS
F can be released and promoted.

Ｍ−CSFはまた血小板減少症や貧血を含めた他の血球
欠損症を治療；骨髄移植から回復しつつある患者の治
療；および外科手術中および熱傷患者における生体防御
の促進に使用することができる。Ｍ−CSFは、抗体と共
に〔例えば、抗体依存性細胞障害法；ロペツ（A.F.Lope
z）ら、J.Immunol.,131（６）:2983−2988（1983）を参
照〕、ヒト単球による腫瘍細胞の撲滅を活性化すること
ができ、それによりある種のがんにとつて有効な処置で
ある。M-CSF can also be used to treat other blood cell deficiencies, including thrombocytopenia and anemia; to treat patients recovering from bone marrow transplantation; and to promote host defense during surgery and in burn patients . M-CSF can be used together with an antibody [for example, in an antibody-dependent cytotoxicity method;
z) et al., J. Immunol., 131 (6): 2983-2988 (1983)], which is able to activate the eradication of tumor cells by human monocytes, thereby treating certain cancers. This is an effective treatment.

本発明の治療用組成物および方法は、治療上有効な量
のＭ−CSFタンパク質を製剤上許容されるキヤリヤーと
共に投与することを含む。この組成物は非経口的、静脈
内あるいは皮下に、全身的に投与される。全身的に投与
する場合、本発明で用いる治療用組成物は、もちろん発
熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形で
ある。pHに関連して等張性および安定性等を有するこの
種の非経口的に許容されるタンパク質溶液の調製は、等
分野の技術の範囲内である。Therapeutic compositions and methods of the present invention comprise administering a therapeutically effective amount of a M-CSF protein together with a pharmaceutically acceptable carrier. The composition is administered parenterally, intravenously or subcutaneously, systemically. When administered systemically, the therapeutic composition used in the present invention is in the form of a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution. The preparation of such parenterally acceptable protein solutions having isotonicity, stability, etc. in relation to pH is within the skill of the art.

投与量は薬物の作用を変更する種々の要因、例えば患
者の健康状態、体重、性別および食事療法、感染症の程
度、投与回数ならびに他の臨床的要因を考慮しつつ主治
医によつて決定されるであろう。一般に、一日分の投与
量は体重1kg当たり１〜1000μｇのタンパク質、あるい
は50〜5000単位のタンパク質（１単位は標準ネズミ骨髄
検定において最大刺激の1/2へ導くポリペプチドの濃
度）である。経過は血液学的形態の定期的な評価（例え
ば白血球の計数など）により監視することができる。The dosage is determined by the attending physician, taking into account various factors that modify the action of the drug, such as the patient's health, weight, gender and diet, degree of infection, frequency of administration, and other clinical factors. Will. In general, the daily dose will be from 1 to 1000 μg of protein per kg of body weight, or from 50 to 5000 units of protein (1 unit is the concentration of polypeptide which leads to half the maximal stimulation in a standard murine bone marrow assay). Progress can be monitored by periodic assessment of hematological morphology (eg, white blood cell counting, etc.).

治療用組成物および方法はまたＭ−CSFと一緒に他の
ヒト因子を同時投与することを含む。本発明のＭ−CSF
と相互作用する他の適当の造血素、CSFおよびインター
ロイキンの非限定的な例には、先に挙げた諸因子、GM−
CSF、Ｇ−CSF、Meg−CSF、エリトロポイエチンおよび好
酸球分化因子が含まれる。上記の投与量は治療用組成物
または方法においてこの種の追加成分を補償すべく調整
されるであろう。Ｍ−CSFはまたモノクローナル抗体を
用いる療法においても投与することができる。Therapeutic compositions and methods also include co-administering other human factors with M-CSF. M-CSF of the present invention
Non-limiting examples of other suitable hematopoietins, CSFs and interleukins that interact with GM- include the factors listed above, GM-
Includes CSF, G-CSF, Meg-CSF, erythropoietin and eosinophil differentiation factor. The above dosages will be adjusted to compensate for such additional ingredients in the therapeutic composition or method. M-CSF can also be administered in therapy with monoclonal antibodies.

発明の詳細な説明 以下の実施例は、表ＩのDNA配列を用いてＭ−CSFまた
はその自然界に存在する対立遺伝子変異型（アイソザイ
ム）、もしくは故意に修飾されたＭ−CSFタンパク質を
生産する本発明方法を例示するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The following examples illustrate the use of the DNA sequences of Table I to produce M-CSF or its naturally occurring allelic variants (isozymes), or deliberately modified M-CSF proteins. 1 illustrates the inventive method.

実施例Ｉ CSF−１の異なる幾つかの供給源細胞からのmRNAを分
析することにより、ヒトまたはネズミ細胞のいずれかか
らのmRNAの最も多量に存在する形態は約4kbサイズのも
のであった。異なるサイズのCSF−１関連配列も検出さ
れた。特に、ネズミ間質細胞からのRNA単離物中に2kbの
mRNAが顕著に検出された。これらの研究から、SV40形質
転換栄養膜細胞ライン（TPA30−１）が、CSF−１をコー
ドする4kbのmRNAの特に多量の供給源であった。発明者
等は、TPA30−１細胞の見いだされる4kb転写に対応する
CSF−１のcDNAを単離し、２つのmRNAにおけるサイズの
差の理由を解明した。これらのCSF−１のcDNA配列をTPA
30−1mRNAから調製されたCDNAクローンのライブラリー
から、ファージクローニングベクターλgt IIを使用し
て、またはプラスミドクローニングベクターpXMを使用
して単離した。多数のオーバーラップクローンを、pcCS
F−17に聞づく合成オリゴヌクレオチドとのフィルター
ハイブリダイゼーションによって同定した。このpcCSF
−17はヒトCSF−１をコードするヌクレオチド配列であ
る。これらのcDNAクローンから導かれた4kbmRNAにおけ
るヌクレオチド配列は前記表Ｉに示されている。この配
列は、554個のアミノ酸ポリペプチドをコードする1662
ヌクレオチドを持つ長いオープン翻訳読枠を含んでい
る。この4kb配列のコード領域は、pcCSF−17のコード領
域と異なっている。後者の配列の721と722番目とのヌク
レオチドの間に894塩基対が挿入されている点で異なっ
ている。894bpの挿入により読み枠が保持されるから、
得られる4kbmRNAのコード領域は61kDのCSF−１前駆体を
コードする。この前駆体はpcCSF−17おける配列から予
測される26kD前駆体よりも十分に大きい。２つの異なる
cDNAのヌクレオチド配列は、それぞれの停止コドン直後
から異なっている。Example I By analyzing mRNA from several different source cells of CSF-1, the most abundant form of mRNA from either human or murine cells was of the order of 4kb in size. Different sizes of CSF-1 related sequences were also detected. In particular, 2 kb in RNA isolates from murine stromal cells.
mRNA was significantly detected. From these studies, the SV40 transformed trophoblast cell line (TPA30-1) was a particularly large source of 4 kb mRNA encoding CSF-1. We correspond to the 4 kb transcript found in TPA30-1 cells.
CSF-1 cDNA was isolated and the reason for the size difference between the two mRNAs was clarified. These cDNA sequences of CSF-1 were converted to TPA
It was isolated from a library of cDNA clones prepared from 30-1 mRNA using the phage cloning vector λgtII or using the plasmid cloning vector pXM. A large number of overlapping clones are transferred to pcCS
Identified by filter hybridization with synthetic oligonucleotides listening to F-17. This pcCSF
-17 is the nucleotide sequence encoding human CSF-1. The nucleotide sequence of the 4 kb mRNA derived from these cDNA clones is shown in Table I above. This sequence encodes a 1554 amino acid polypeptide encoding 1662
Contains a long open translation reading frame with nucleotides. The coding region of this 4 kb sequence is different from the coding region of pcCSF-17. The difference is that 894 base pairs are inserted between nucleotides 721 and 722 of the latter sequence. Since the reading frame is retained by inserting 894 bp,
The coding region of the resulting 4 kb mRNA encodes a 61 kD CSF-1 precursor. This precursor is much larger than the 26 kD precursor predicted from the sequence in pcCSF-17. Two different
The nucleotide sequence of the cDNA differs immediately after each stop codon.

代表的な哺乳動物発現ベクターp3ACSF−69の構築 SV40形質転換した栄養膜細胞株TPA−30−１〔ATCC
＃CRL−1583〕のポリA+mRNAから表Ｉの完全DNA配列を分
離した。MCSF発現用の哺乳動物ベクターを構築するため
に、上記の表Ｉに示した完全cDNA配列は制限エンドヌク
レアーゼ酵素Xho Iリンカー（New England Biolabs社
製）で改作し、そしてXho Iで消化後ホスフアターゼ処
理したCOS細胞発現ベクターpXMに連結させた。pXMはSV4
0エンハンサー、メジヤーアデノウイルス後期プロモー
ター、DHFRコード配列、SV40後期メツセージポリ−Ａ付
加部位およびVa I遺伝子を含む。pXMはさらにKpan I、P
st IおよびXho Iの制限エンドヌクレアーゼ部位をもつ
リンカー配列を含有する。pXMのXho I消化およびＭ−CS
Fをコードする表Ｉのリンカー/Xko I処理DNA配列の挿入
により生じたプラスミドはp3ACSF−69と名づけられた。
p3ACSF−69（ATCC ＃67092）はＭ−CSFタンパク質の発
現のために適した哺乳動物宿主細胞へ慣用技術により形
質転換しうる。代表的な宿主細胞は哺乳動物細胞および
細胞株であり、とりわけ霊長目や 歯目などの細胞株で
ある。Construction of a representative mammalian expression vector p3ACSF-69 SV40 transformed trophoblast cell line TPA-30-1 [ATCC
# To separate the complete DNA sequence of Table I from poly A + mRNA in CRL-1583]. To construct a mammalian vector for MCSF expression, the complete cDNA sequence shown in Table I above was adapted with the restriction endonuclease enzyme Xho I linker (New England Biolabs) and digested with Xho I followed by phosphatase treatment. And ligated to the expressed COS cell expression vector pXM. pXM is SV4
0 enhancer, media adenovirus late promoter, DHFR coding sequence, SV40 late message poly-A addition site and VaI gene. pXM is also Kpan I, P
Contains linker sequences with stI and XhoI restriction endonuclease sites. Xho I digestion of pXM and M-CS
The plasmid resulting from the insertion of the linker / XkoI-treated DNA sequence of Table I encoding F was named p3ACSF-69.
p3ACSF-69 (ATCC # 67092) can be transformed by conventional techniques into a mammalian host cell suitable for expression of the M-CSF protein. Representative host cells are mammalian cells and cell lines, especially cell lines such as primates and dentates.

当業者はまたp3ACSF−69に類似しているが表Ｉの完全
DNA配列よりも短い配列を含む他の哺乳動物発現ベクタ
ーを構築することができる。例えば、５′および３′フ
ランキング（flanking）配列を所望により表Ｉの配列か
ら切断することができ、また表Ｉの配列を操作すること
により表Ｉの修飾変異型あるいは対立遺伝子変異型を使
用することができる。表ＩのDNA配列はXho Iを用いて上
記プラスミドから切断され、そしてその配列を修飾し
て、それを他の既知ベクター、例えばpCD〔オカヤマ（O
kayama）ら、Mol.Cell.Biol.2:161−170（1982）を参
照〕、およびpJL3、pJL4〔ゴウ（Gough）ら、EMBO J.,
４:645−653（1985）を参照〕へ挿入するために公知の
組換え遺伝子工学的手法が用いられる。適当な宿主細胞
へのこれらのベクターの形質転換はＭ−CSFタンパク質
に発現をもたらす。One of skill in the art is also similar to p3ACSF-69, but
Other mammalian expression vectors containing sequences shorter than the DNA sequence can be constructed. For example, 5 'and 3' flanking sequences can be cleaved from the sequences of Table I if desired, and the modified or allelic variants of Table I can be used by manipulating the sequences of Table I. can do. The DNA sequence in Table I was cut from the above plasmid using Xho I and the sequence was modified to make it known in another known vector, such as pCD [Okayama (Okayama (Okayama)
Kayama) et al., Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982)], and pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J. ,
4 : 645-653 (1985)], using known recombinant genetic engineering techniques. Transformation of these vectors into a suitable host cell results in expression of the M-CSF protein.

同様に、当業者はコード配列の両側に位置する哺乳動
物調節配列を除去するか、あるいは哺乳動物以外のベク
ターを作製すべくその調節配列を酵母、細菌または昆虫
の配列と取り換えることにより、その配列を操作するこ
とができるであろう。従つて、この配列はその後酵母、
細菌または昆虫の宿主細胞内で発現可能であるだろう。
例えば、表Ｉのコード配列はXho Iを用いてp3ACSF−69
から切断した後さらに操作されるであろう（例えば他の
既知リンカーへ連結されるか、あるいはその配列から非
コード配列を欠失させたり、既知技法によりその配列中
のヌクレオチドを改変したりすることによつて修飾され
る）。修飾されたＭ−CSFコード配列はその後タニグチ
（T.Taniguchi）ら、Proc.Natl.Acad．Sci.U.S.A.，77:
5230−5233（1980）に記載されるような方法を用いて、
例えば既知の細菌ベクターへ挿入することができる。こ
の細菌ベクターはその後細菌宿主細胞へ形質転換され、
これによりＭ−CSFが発現されるであろう。Similarly, one skilled in the art could remove the mammalian regulatory sequence flanking the coding sequence, or replace that regulatory sequence with yeast, bacterial or insect sequences to create a non-mammalian vector. Will be able to operate. Thus, this sequence was subsequently transformed into yeast,
It will be expressible in bacterial or insect host cells.
For example, the coding sequence in Table I uses XhoI to generate p3ACSF-69.
Would be further manipulated after cleavage from (e.g., being linked to, or deleting a non-coding sequence from, or modifying nucleotides in the sequence by known techniques) Is modified by The modified M-CSF coding sequence was subsequently disclosed by T. Taniguchi et al., Proc . Natl . Acad . Sci.USA , 77 :
Using a method as described in 5230-5233 (1980),
For example, it can be inserted into a known bacterial vector. This bacterial vector is then transformed into a bacterial host cell,
This will result in the expression of M-CSF.

昆虫または酵母細胞によるＭ−CSFタンパク質の発現
のために、同様の操作を行つて昆虫ベクター〔公開され
た欧州特許出願第155476号に記載の方法を参照〕または
酵母ベクター〔公開されたPCT出願WO8600639号に記載の
方法を参照〕を構築することができる。For expression of the M-CSF protein by insect or yeast cells, the same procedure is followed to perform insect vector [see the method described in published European Patent Application No. 155476] or yeast vector [published PCT application WO8600639. (See the method described in the above item).

実施例 II Ｍ−CSFタンパク質の発現 マニアチス（Maniatis）ら、Molecular Cloning，A L
abobratory Manual,Cold Spring Harbor Loboratory（1
982）に記載されるようにしてp3ACSF−69を含む大腸菌H
B101から調整したプラスミドDNAは、エチジウムブロミ
ドを含む塩化セシウム勾配中での平衡遠心を伴う慣用方
法により精製した。COS細胞（ATCC CRL1650）は106個
のCOS細胞あたりプラスミドDNA約５μｇの濃度で精製DN
Aによりトランスフエクシヨンを行い、ウオン（G.G.Won
g）ら、Science，280:810−815（1985）およびカウフマ
ン（R.J.Kaufman）ら、Mol.Cell.Biol.,２:1304（198
2）に記載の方法に従つてクロロキンで処理した。トラ
ンスフエクシヨンの72時間後、以下の実施例IIIで説明
する標準骨髄検定においてＭ−CSF活性を示すタンパク
質を含むp3ACSF−69含有COS細胞からの調整培地（condi
tioned medium）を回収することができた。Example II Expression of M-CSF Protein Maniatis et al., Molecular Cloning , AL
abobratory Manual , Cold Spring Harbor Loboratory (1
E. coli H containing p3ACSF-69 as described in 982)
Plasmid DNA prepared from B101 was purified by conventional methods involving equilibrium centrifugation in a cesium chloride gradient containing ethidium bromide. COS cells (ATCC CRL 1650) is purified at a concentration of 10 6 COS cells per plasmid DNA about 5 [mu] g DN
Transformation is performed by A, and the Won (GGWon
g) et al., Science , 280 : 810-815 (1985) and RJ Kaufman et al., Mol . Cell . Biol ., 2 : 1304 (198).
It was treated with chloroquine according to the method described in 2). 72 hours after transfection, conditioned medium from p3ACSF-69-containing COS cells containing a protein exhibiting M-CSF activity in a standard bone marrow assay described in Example III below (condi
optioned medium) could be recovered.

実施例 III in vitro検定でのＭ−CSF活性 A.マウス検定 マウス骨髄検定はメツトカフ（D.Metcalf）、The Hem
opoietic Colony Stimulating Factors,Elsevier Pres
s,New York（1984）に記載の方法を次のように変更して
実施した： （ａ） この検定では２×105骨髄細胞/mlを用いた； （ｂ） 最終検定容量は100μであつた；および （ｃ） 検定は標準的な96ウエルマイクロタイタープレ
ートで行つた。Example III M-CSF Activity in In Vitro Assay A. Mouse Assay The mouse bone marrow assay was performed by M. Metcalf, The Hem.
opoietic Colony Stimulating Factors , Elsevier Pres
s, New York (1984), with the following modifications: (a) The assay used 2 × 10 5 bone marrow cells / ml; (b) the final assay volume was 100 μl. And (c) assays were performed in standard 96-well microtiter plates.

骨髄は６〜25週目の雌Balb/cマウス（Jack−son）の
大腿骨から得た。標準対照としてマウスＬ細胞調整培地
を含むWEHI ３調整培地〔リー（J.C.Lee）ら、J.Immun
ol.，128:2393−2398（1982）〕を用いて、活性の１希
釈単位はこの骨髄検定において最大応答（すなわち、２
×104マウス骨髄細胞あたり約15〜20コロニー）をもた
らすタンパク質の濃度と定められた。Bone marrow was obtained from femurs of female Balb / c mice (Jack-son) at 6-25 weeks. As a standard control, WEHI 3 conditioned medium containing mouse L cell conditioned medium [JCLee et al., J. Immunol
ol. , 128 : 2393-2398 (1982)], one dilution unit of activity is the maximum response (ie, 2
(15 × 20 colonies per × 10 4 mouse bone marrow cells).

p3ACSF−69含有COS細胞からの調整培地は、マウス骨
髄検定において少なくとも10-4希釈まで活性であること
が判明し、主として単球系列のコロニーを生じた。最大
応答における細胞の数および型は、マウス供与体の種類
や年令により変化するであろう。Conditioned media from COS cells containing p3ACSF-69 was found to be active in mouse bone marrow assays up to at least a 10 -4 dilution, giving rise to mainly monocyte lineage colonies. The number and type of cells in the maximal response will vary with the type and age of the mouse donor.

B.ヒト検定 非付着性骨髄細胞を用いるヒト骨髄検定はウオン（G.
G.Wong）ら、上記文献に記載されるように行つた。p3AC
SF−69含有COS細胞からの調整培地はヒト骨髄検定にお
いて1:50希釈まで活性であり、主として単球系列のコロ
ニーをもたらした。B. Human Assay The human bone marrow assay using non-adherent bone marrow cells
G. Wong) et al. p3AC
Conditioned medium from COS cells containing SF-69 was active up to a dilution of 1:50 in the human bone marrow assay and resulted in colonies of mainly monocyte lineage.

実施例 IV Ｍ−CSFの分子量分析 カウフマン（R.J.Kaufman）およびシヤープ（P.A.Sha
rp）、J.Mol.Biol．159:601−629（1982）の方法に従つ
て、p3ACSF−69DNAでのCOS細胞トランスフエクシヨンに
より生産されるＭ−CSFタンパク質中に、35Sメチオニン
を代謝的に組み入れることができる。35Sメチオニンで
標識したp3ACSF−69含有COS細胞由来の調整培地をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により非還元条件下で分析
すると〔レムリ（U.K.Laemmli）、Nature 227:680−68
5（1970）〕、グリコシル化を表す幅広バンドが約70Kd
の見掛分子量のところに検出される。pXMベクターDNAの
対応するトランスフエクシヨンでは同様の35Sタンパク
質バンドが現れない。Example IV Molecular Weight Analysis of M-CSF Kaufman (RJ Kaufman) and Sharp (PASha
rp), J. Mol . Biol . 159: 601-629 (1982) method follow the connexion of the M-CSF protein produced by COS cells transflector Ekushi Yeung in p3ACSF-69DNA, can incorporate 35 S-methionine metabolically. Analysis of conditioned medium from p3ACSF-69-containing COS cells labeled with 35 S methionine under non-reducing conditions by polyacrylamide gel electrophoresis [UK Laemmli, Nature 227 : 680-68.
5 (1970)], a broad band representing glycosylation is about 70 Kd
Is detected at the apparent molecular weight of The corresponding transfection of pXM vector DNA does not show a similar 35 S protein band.

35Sメチオニンで標識したp3ACSF−69調整培地は100mM
β−メルカプトエタノールで還元し、その後SDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析した。70Kdのバン
ドは消失し、約35Kdの幅広バンド（グリコシル化を示
す）が検出さる。還元されたp3ACSF−69含有COS細胞調
整培地はマウスとヒトの両骨髄検定において不活性であ
る。従つて、COS細胞調整培地中のＭ−CSFタンパク質は
ダイマーとして活性であるが、その構成モノマーに還元
されると不活であると思われる。100 mM p3ACSF-69 conditioned medium labeled with 35 S methionine
Reduction with β-mercaptoethanol was followed by analysis by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The 70 Kd band disappears and a broad band at approximately 35 Kd (indicating glycosylation) is detected. The reduced p3ACSF-69 containing COS cell conditioned medium is inactive in both mouse and human bone marrow assays. Thus, the M-CSF protein in the COS cell conditioned medium appears to be active as a dimer, but inactive when reduced to its constituent monomers.

35Sメチオニンで標識し、還元したp3ACSF−69含有COS
細胞調整培地は、ブラツドフオード（M.Bradford）、An
al.Biochem 72:248（1976）の方法に従つてノイラミニ
ダーゼ（Sigma社）で処理してシアル酸を除き、さらに
ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ〔Ｎ−グリカナーゼ（Ｇ
酵素）としても知られている〕で処理してＮ−結合炭水
化物を除去した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分析は、ノイラミニダーゼとＮ−グリコシダーゼ
Ｆで処理したp3ACSF−69含有COS細胞調整培地中に約18K
dの分離したバンドを明らかにし、このバンドは未処理
の還元35Sメチオニン標識調整培地には見られなかつ
た。Ｎ−グリカナーゼのみで処理した還元35S標識p3ACS
F−69含有COS細胞調整培地は、SDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動分析において約18Kdのバンドを示した。COS containing p3ACSF-69 labeled and reduced with 35 S methionine
Cell conditioned media are available from Bradford (M. Bradford), An
Biochem 72 : 248 (1976) according to the method of neuraminidase (Sigma) to remove sialic acid, and further, peptide N-glycosidase F [N-glycanase (G
(Also known as enzyme)) to remove N-linked carbohydrates. Analysis by SDS polyacrylamide gel electrophoresis shows that approximately 18K in COS cell conditioned medium containing p3ACSF-69 treated with neuraminidase and N-glycosidase F.
d revealed a separate band, which was not seen in untreated reduced 35 S methionine labeled conditioned medium. Reduced 35 S-labeled p3ACS treated with N-glycanase alone
The C-cell conditioned medium containing F-69 showed a band of about 18 Kd in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis.

Ｎ−グリコシダーゼおよびノイラミニダーゼの実験か
ら、p3ACSF−69でトランスフエクシヨンしたCOS細胞に
より生産されたＭ−CSFタンパク質は、それぞれＮ−結
合グリコシル化により十分に修飾された約18Kdのポリペ
プチドから成る２つの約35Kdグリコシル化モノマーのダ
イマーであると考えられる。From experiments with N-glycosidase and neuraminidase, the M-CSF protein produced by COS cells transfected with p3ACSF-69 was composed of two polypeptides of approximately 18 Kd, each of which was fully modified by N-linked glycosylation. It is believed to be a dimer of about 35Kd glycosylated monomer.

実施例 Ｖ Ｍ−CSFを高レベルで発現するCHO細胞株の構築 哺乳動物細胞から高レベルでＭ−CSFを生産するため
の１つの方法は、多コピー数の異種Ｍ−CSF遺伝子を含
む細胞の構築を伴う。異種遺伝子は増幅可能なマーカー
〔例えばジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子〕に結合
され、そのために増加した遺伝子コピーを含む細胞はKa
ufman ＆ Sharp,J.Mol.Biol.，同上の方法に従つて、次
第に増加する濃度のメトトレキセート（MTX）中で増殖
させることにより選択できる。この手法は多数の別の細
胞型においても利用しうる。Example V Construction of CHO Cell Lines Expressing High Levels of M-CSF One method for producing high levels of M-CSF from mammalian cells is to construct cells containing multiple copies of a heterologous M-CSF gene. Involves construction. The heterologous gene is linked to an amplifiable marker, such as the dihydrofolate reductase (DHFR) gene, so that cells containing the increased gene copy are Ka
ufman & Sharp, J. Mol . Biol. , supra, by selection for growth in increasing concentrations of methotrexate (MTX). This approach can also be used in many other cell types.

p3ACSF−69およびDHFR発現プラスミドpAdA26SV（Ａ）
３（Kaufman ＆ Sharp,Mol.Cell Biol.,同上）は、リン
酸カルシウム共沈殿およびトランスフエクシヨンにより
DHFR欠損CHO細胞、DUKX−B11へ同時トランスフエクシヨ
ンを行う。初期のDHFR発現形質転換体は透析したウシ胎
児血清を含むアルフア培地中での生育について選択さ
れ、その後次第に増加する濃度のMTX（0.2、0.2、1.0お
よび5mM MTXの段階的濃度）中での生育による増幅につ
いてカウフマン（Kaufman）ら、Mol.Cell Biol．５:175
0（1983）に記載される通りに選択される。p3ACSF-69 and DHFR expression plasmid pAdA26SV (A)
3 (Kaufman & Sharp, Mol . Cell Biol ., Supra ) was prepared by calcium phosphate coprecipitation and transfection.
Simultaneous transfection into DHFR-deficient CHO cells, DUKX-B11. Early DHFR-expressing transformants were selected for growth in alpha media containing dialyzed fetal calf serum and then grown in increasing concentrations of MTX (gradual concentrations of 0.2, 0.2, 1.0 and 5 mM MTX). For amplification by Kaufman et al., Mol . Cell Biol . 5 : 175
0 (1983).

0.25μM MTXでの生育について選択された、CHO−3ACS
F−69と名づけられた１つのクローンは生理活性Ｍ−CSF
を高レベルで発現することが分かつた。この細胞株は1:
60,000最終希釈でネズミマクロフアージコロニー形成を
促進しうる調整培地を終始一貫して生成する。これらの
細胞（１つの10cm培養皿）ならびに親CHO細胞は、最少
必須培地（MEM）4ml中37℃で４時間35S−met（NEN社）1
mCiにより標識する。得られた調整培地試料は精製した
尿Ｍ−CSFを用いてウサギ中で誘導された抗血清と共に
インキユベートする。抗原−抗体複合体は黄色ブドウ球
菌（Staphylococcus aureus）細胞（Col Biochem社）へ
の吸着により沈殿させる。この複合体はレムリ（U.K.La
emmli）、Nature，227:680−685（1970）に従つて還元
剤を含まない泳動用緩衝液に可溶化する。試料を還元す
るために、それらに２−メルカプトエタノールを加えて
100mMとなし、37℃で30分インキユベートする。10％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動後に、標識タンパク質の
パターンがKodak XARフイルムを用いたフルオログラフ
イー（エンハンス、NEN社）により可視化される。非還
元条件下でのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よるこれらの免疫沈殿物の分析は、Ｍ−CSFタンパク質
産生CHO細胞からの調整培地が70〜90Kdの親サイズと150
Kdよりも大きいサイズの２種類の異種Ｍ−CSFタンパク
質を含むことを明らかにした。観察されたこれらのタン
パク質のサイズ不均一性は多くの糖タンパク質に特徴的
である。CHO-3ACS selected for growth on 0.25 μM MTX
One clone, designated F-69, contains bioactive M-CSF
Was found to be expressed at high levels. This cell line is 1:
A conditioned medium that can promote murine macrophage colony formation at a final dilution of 60,000 is consistently produced. These cells (one 10 cm culture dish) and parental CHO cells were treated with 35 S-met (NEN) 1 in 4 ml of minimal essential medium (MEM) for 4 hours at 37 ° C.
Label with mCi. The resulting conditioned media sample is incubated with purified antiserum in rabbits using purified urine M-CSF. The antigen-antibody complex is precipitated by adsorption to Staphylococcus aureus cells (Col Biochem). This complex is called Remli (UKLa
emmli), Nature , 227 : 680-685 (1970). To reduce the samples, add 2-mercaptoethanol to them
Incubate at 37 ° C for 30 minutes at 100 mM. After 10% polyacrylamide gel electrophoresis, the pattern of the labeled protein is visualized by fluorography (Enhance, NEN) using Kodak XAR film. Analysis of these immunoprecipitates by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions indicates that the conditioned medium from M-CSF protein producing CHO cells has a parent size of 70-90 Kd and 150
It was shown to contain two heterologous M-CSF proteins of a size larger than Kd. The observed size heterogeneity of these proteins is characteristic of many glycoproteins.

還元後に同一試料を分析すると、Ｍ−CSFタンパク質
の70〜90Kd物質の移動度は35〜40Kdの分子量と一致する
位置にずれるが、より大きい物質（150Kd以上）の相対
移動度はこの処理により影響を受けないことが判明し
た。従つて、少なくとも２種類の異なるＭ−CSFタンパ
ク質がCHO−3ACSF−69細胞により発現される：すなわ
ち、35〜45Kdサブユニツトのジスルフイド結合ダイマー
から成る70〜90Kdタンパク質、および比較的大きいサイ
ズの物質。上記細胞株は血清を含まない完全規定培地に
適応させた。When the same sample is analyzed after reduction, the mobility of the 70-90 Kd substance of the M-CSF protein shifts to a position corresponding to the molecular weight of 35-40 Kd, but the relative mobility of the larger substance (150 Kd or more) is affected by this treatment. It turned out not to receive. Thus, at least two different M-CSF proteins are expressed by CHO-3ACSF-69 cells: a 70-90 Kd protein consisting of 35-45 Kd subunit disulfide-linked dimers, and a relatively large size material. The cell line was adapted to a completely defined medium without serum.

実施例 VI Ｍ−CSFの精製 0.5％ウシ胎児血清およびDMEM−F12を含むCHO細胞調
整培地は水で1:1に希釈する。その後、希釈した培地は4
0mMトリス（pH7.4）で平滑化したQAE“Zeta−Prep"カー
トリツジ（LKB社）に加える。未結合タンパク質を含む
流出液は捨てた。結合タンパク質は40mMトリス（pH7.
4）で洗い、40mMトリス（pH7.4）および0.75M NaClで溶
出した。この溶出液をその後水で希釈して0.5M NaClの
濃度とした。ツイーン20を加えて0.05％となし、この混
合物を20mMトリス（pH7.4）、0.5M NaClおよび0.05％ツ
イーン20中で平衡化したヒラマメレクチン−セフアロー
ス4Bカラム（Pharmacia社）に大体１カラム容量／時で
加えた。カラムは２〜５カラム容量の20mMトリス（pH7.
4）および0.5M NaClで洗つた。特異的に結合したタンパ
ク質は20mMトリス、0.2Mα−メチルマンノピラノシド、
0.5M NaClおよび0.05％ツイーン20で溶出し、その後10
％トリフルオロ酢酸（TFA）で酸性化した。この溶出液
を30％アセトニトリルおよび0.1％TFAで平衡化したカラ
ムを用いて逆相液体クロマトグラフイーにかけた。タン
パク質は0.1％TFA中のアセトニトリル上昇勾配により溶
出した。45％アセトニトリルと50％アセトニトリルの間
で集めたタンパク質は試験管中にてトリス（pH8.5）で
中和し、分析した。Example VI Purification of M-CSF CHO cell conditioned medium containing 0.5% fetal calf serum and DMEM-F12 is diluted 1: 1 with water. After that, the diluted medium
Add to QAE "Zeta-Prep" cartridges (LKB) smoothed with 0 mM Tris (pH 7.4). The effluent containing unbound protein was discarded. The binding protein was 40 mM Tris (pH 7.
Washed with 4) and eluted with 40 mM Tris (pH 7.4) and 0.75 M NaCl. The eluate was then diluted with water to a concentration of 0.5M NaCl. Tween 20 was added to make 0.05%, and the mixture was applied to a floury bean lectin-Sepharose 4B column (Pharmacia) equilibrated in 20 mM Tris (pH 7.4), 0.5 M NaCl and 0.05% Tween 20 for approximately 1 column volume. / Hour. The column is 2-5 column volumes of 20 mM Tris (pH 7.
4) and washed with 0.5M NaCl. Specifically bound proteins were 20 mM Tris, 0.2 M α-methyl mannopyranoside,
Elution with 0.5 M NaCl and 0.05% Tween 20 followed by 10
% Trifluoroacetic acid (TFA). The eluate was subjected to reverse phase liquid chromatography using a column equilibrated with 30% acetonitrile and 0.1% TFA. Protein was eluted with an increasing gradient of acetonitrile in 0.1% TFA. Protein collected between 45% acetonitrile and 50% acetonitrile was neutralized in a test tube with Tris (pH 8.5) and analyzed.

精製方法はまた高分子凝集物を除くためのサイズ排除
段階を伴う。Ｍ−CSFの予備分析は約106骨髄単位/mgの
比活性を示す（実施例IIIの骨髄検定を参照された
い）。The purification method also involves a size exclusion step to remove macromolecular aggregates. Preliminary analysis of the M-CSF exhibits a specific activity of about 10 6 bone marrow Units / mg (see bone marrow assay in Example III).

本発明を実施する際には、その好適な実施態様の前記
説明を考慮することにより、当業者には多くの修飾およ
び変更が予測できる。このような修飾および変更は添付
の請求の範囲に包含されるものである。Many modifications and variations will occur to those skilled in the art in practicing the present invention in light of the above description of the preferred embodiments. Such modifications and changes are intended to fall within the scope of the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Agency reference number FI Technical display location C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】下記のアミノ酸番号１から522の配列Ｉ及
びアミノ酸番号１から223の配列IIからなる群から選択
されるアミノ配列で表されるタンパク質をコードし、発
現制御配列に作動可能な状態で結合されているcDNA配列
で形質転換された哺乳動物細胞を培養することから成る
Ｍ−CFSの生産方法。 1. A protein encoding a protein represented by the amino acid sequence selected from the group consisting of the following sequence I of amino acids 1 to 522 and sequence II of amino acids 1 to 223, and operable as an expression control sequence. A method for producing M-CFS, comprising culturing a mammalian cell transformed with the cDNA sequence ligated in step (a). 【請求項２】前記cDNA配列が下記のヌクレオチド番号24
2から1807のヌクレオチド配列Ｉ及びヌクレオチド番号2
42から910のヌクレオチド配列IIからなる群から選択さ
れるヌクレオチド配列であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein said cDNA sequence has the following nucleotide number 24:
Nucleotide sequence I from nucleotide 2 to 1807 and nucleotide number 2
2. The method according to claim 1, wherein the nucleotide sequence is a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequence II from 42 to 910. 【請求項３】前記cDNA配列が下記の完全長ヌクレオチド
配列であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の方法。 3. The method according to claim 1, wherein said cDNA sequence is the following full-length nucleotide sequence.
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