JP2577743B2 - Stable granulocyte colony-stimulating factor containing preparation - Google Patents
Stable granulocyte colony-stimulating factor containing preparationInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤
に関し、特に容器壁上への吸着または会合、重合、酸化
等による活性成分の損失、不活性化を有利に防止し、安
定化させたヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤
に関するものである。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a preparation containing human recombinant granulocyte colony-stimulating factor, and in particular, loss or inactivation of an active ingredient due to adsorption or association on a container wall, polymerization, oxidation and the like. And a stabilized human recombinant granulocyte colony stimulating factor-containing preparation.
従来の技術 最近では各種感染症の化学療法等においては、耐性菌
発生、原因菌の交代現象、あるいは高い副作用などが臨
床的に重大な問題となっており、そのため、例えば抗生
物質、抗菌剤等による上記の如き化学的療法とは別に、
感染菌宿主の防禦機能を活性化するような物質を用いる
ことにより、上記化学療法の根本的な問題の解決を図ろ
うとする動きがある。即ち、例えば細菌感染の初期には
宿主のもつ防禦機能のうちで白血球の貧食殺菌作用が最
も強く影響すると考えられており、そこで好中球の増
殖、分化成熟を促進することにより宿主の感染防禦機能
の亢進を図ることが重要と考えられる。このような作用
を示す極めて有用な物質の一つとして顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−CSF）があり、既にこれを用いた感染防禦
剤が本出願人によって別途特許出願されている（特願昭
60−23777号）。2. Description of the Related Art Recently, in chemotherapy for various infectious diseases, the emergence of resistant bacteria, alternation of causative bacteria, or high side effects have become clinically serious problems, and therefore, for example, antibiotics, antibacterial agents, etc. Aside from chemotherapy as described above by
There is a movement to solve the fundamental problem of the above-mentioned chemotherapy by using a substance that activates the defense function of the infecting bacterial host. That is, for example, in the early stage of bacterial infection, it is thought that the antiphagic bactericidal action of leukocytes has the strongest effect on the host's defense functions, and it promotes neutrophil proliferation and differentiation / maturation by promoting host infection. It is considered important to enhance defense functions. Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is one of the very useful substances having such an effect, and an infectious agent using the same has already been separately patented by the present applicant (Japanese Patent Application No.
No. 60-23777).
発明が解決しようとする問題点 上記の如く、各種化学療法においては、各種の回避し
得ない問題があり、そのために被感染体即ち宿主の防禦
機能を賦活化し得るように物質を薬剤として用いる試み
がなされている。Problems to be Solved by the Invention As described above, there are various unavoidable problems in various chemotherapy. Therefore, attempts to use a substance as a drug so as to activate the defense function of the infected body, that is, the host, have been made. Has been made.
Ｇ−CSFは勿論、それ自身に宿主の防禦機能を賦活化
する活性を有し、臨床上の治療効果をさらに十分に発揮
すべく、上述した薬剤との併用の場合に於ても、その目
的を遂行する上で極めて有用であることが判明した。G-CSF, of course, has an activity of activating the defense function of the host itself, and in order to exert its clinical therapeutic effect more fully, its purpose is to be improved when used in combination with the above-mentioned drug. Has proven to be extremely useful in performing
このＧ−CSFは極めて微量で使用され、通常成人一人
当たり、0.1〜500μｇ（好ましくは５〜50μｇ）のＧ−
CSFを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。
しかしながら、このＧ−CSFは、例えば注射用アンプ
ル、注射器等の器壁に対し吸着性を示すことから、特に
この薬剤を水溶液等の注射薬として利用する場合には、
アンプル等の容器、注射器等の器壁に吸着されてしま
い、Ｇ−CSFの医薬としての活性を十分有効に発揮させ
ることができず、あるいはこのような吸着に基く損失分
を予め見積って余分に医薬中に添加しておかねばならな
い。This G-CSF is used in an extremely small amount, and usually 0.1 to 500 μg (preferably 5 to 50 μg) of G-CSF per adult.
The formulation containing CSF is administered at a rate of 1 to 7 times / week.
However, since this G-CSF exhibits adsorptivity to the walls of, for example, ampoules for injection and syringes, particularly when this drug is used as an injection such as an aqueous solution,
Containers such as ampoules, adsorbed on the walls of syringes, etc., are unable to sufficiently exert the pharmaceutical activity of G-CSF, or extra estimate by extrapolating the loss due to such adsorption. It must be added to the drug.
その上、Ｇ−CSFは不安定で、外的因子の影響を受け
易く、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重
合あるいは酸化などの物理的、化学的変化を生じて、大
きな活性の低下を招く。In addition, G-CSF is unstable, easily affected by external factors, and undergoes physical and chemical changes such as association, polymerization or oxidation due to temperature, humidity, oxygen, ultraviolet rays, etc. This leads to reduced activity.
このことは、極めて微量の投与量のＧ−CSFを極めて
正確に投与しようとする治療行為の完全な遂行を困難に
する。そこでこのような問題点を解決し有効成分の活性
の低下を十分に防止できる製品を開発する必要が生じ
る。本発明の目的は、このような点にあり、即ち安定な
Ｇ−CSF含有製剤を提供することにある。This makes it difficult to completely perform a therapeutic action that seeks to very precisely administer very small doses of G-CSF. Therefore, it is necessary to solve such a problem and develop a product which can sufficiently prevent the decrease in the activity of the active ingredient. It is an object of the present invention in such a point, that is, to provide a stable G-CSF-containing preparation.
問題点を解決するための手段 本発明者等は上記目的とするＧ−CSF含有製剤の安定
性を改善すべく種々検討・研究した結果、ヒト組換えＧ
−CSFに製薬上許容される特定の糖類を添加することが
有効であることを見出し、本発明を完成した。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted various studies and studies to improve the stability of the above-mentioned G-CSF-containing preparation, and have found that human recombinant G
-It has been found that it is effective to add a specific pharmaceutically acceptable saccharide to CSF, and the present invention has been completed.
即ち、本発明の安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤
は、ヒト組換えＧ−CSFとグリセリン、キシリトール、
マンニトール、グルクロン酸、ナイラミン酸、ケトグル
コール酸、ヒアルロン酸およびその塩、ヘパリン、キチ
ンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、デキ
ストリン、平均分子量5,000〜150,000のデキストラン並
びにアルギン酸およびその塩からなる群から選ばれる少
なくとも１種の糖類とを含むことを特徴とする。That is, the stable human recombinant G-CSF-containing preparation of the present invention comprises human recombinant G-CSF and glycerin, xylitol,
Mannitol, glucuronic acid, nylamic acid, ketoglycolic acid, hyaluronic acid and its salts, heparin, chitin and its derivatives, chitosan and its derivatives, dextrin, dextran with an average molecular weight of 5,000 to 150,000 and at least selected from the group consisting of alginic acid and its salts It is characterized by containing one kind of saccharide.
本発明におけるヒト組換えＧ−CSFは、高純度に精製
されたものであって、ヒトＧ−CSFをコードする遺伝子
を用いて組換体DNAを作製し、これを適当な宿主細胞
（例えば大腸菌、C127細胞、チャイニーズハムスターの
卵胞細胞等）で発現させるなどによって得ることができ
る。すなわち、本発明におけるヒト組換えＧ−CSFは、
ヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を組み込んだ組換えベクターで宿主を形質転換して
得られる形質転換体が産生するヒトＧ−CSF活性を有す
るポリペプチドまたは糖蛋白質である。The human recombinant G-CSF in the present invention has been purified to a high degree of purity, and a recombinant DNA is prepared using a gene encoding human G-CSF, and the recombinant DNA is prepared using a suitable host cell (for example, Escherichia coli, C127 cells, Chinese hamster follicle cells, etc.). That is, the human recombinant G-CSF in the present invention is:
A polypeptide or glycoprotein having human G-CSF activity produced by a transformant obtained by transforming a host with a recombinant vector into which a gene encoding a polypeptide having human G-CSF activity has been incorporated.
具体的には、次の（ｉ）及び（ii）で示すヒトＧ−CS
Fが特に好ましく用いられる。Specifically, human G-CS shown in the following (i) and (ii)
F is particularly preferably used.
（ｉ）次の理化学的性質を有するヒトＧ−CSF。(I) Human G-CSF having the following physicochemical properties.
分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で約19,000±1,000。Molecular weight: about 19,000 ± 1,000 as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.
等電点:pI＝5.5±0.1、pI＝5.8±0.1、pI＝6.1±0.1
の三つの等電点のうち少なくとも１つを有する。Isoelectric point: pI = 5.5 ± 0.1, pI = 5.8 ± 0.1, pI = 6.1 ± 0.1
Has at least one of the three isoelectric points.
紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し、250nmに極小値
を持つ。Ultraviolet absorption: having a maximum absorption at 280 nm and a minimum at 250 nm.
Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くであ
る。The amino acid sequence from the N-terminal to the 21st residue is as follows.
H2N−Thr−Pro−Leu−Gly−Pro−Ala−Ser−Ser−Leu−Pro− Gln−Ser−Phe−Leu−Leu−Lys−Cys−Leu−Glu−Gln−Val− （ii）下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされる
ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド
又はこれと糖鎖部を有する糖蛋白質を含有するヒトＧ−
CSF。 H 2 N-Thr-Pro- Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro- Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-Val- (ii) below Or a polypeptide having a human granulocyte colony stimulating factor activity represented by the amino acid sequence of
CSF.
（Met）n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu （Val Ser Glu）m Gys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala AsP Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gun Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro（但しｍは０又は１を表わし、ｎは０
又は１を表わす）。(Met) n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu (Val Ser Glu) m Gys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala AsP Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gun Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro (where m represents 0 or 1, and n represents 0)
Or 1).
なおこれらのＧ−CSFの詳細な製造方法については、
本出願人が先に出願した特願昭59−153273号、特願昭60
−269455号、特願昭60−269456号、特願昭60−270838
号、特願昭60−270839号明細書を参照されたい。In addition, about the detailed manufacturing method of these G-CSF,
Japanese Patent Application Nos. 59-153273 and 60 filed earlier by the present applicant.
No. -269455, Japanese Patent Application No. 60-269456, Japanese Patent Application No. 60-270838
No., Japanese Patent Application No. 60-270839.
これ等の方法で得られたヒト組換えＧ−CSF含有液は
必要により公知の手段でさらに精製、濃縮した後凍結保
存とするかまたは凍結乾燥などの手段により水分を除去
して保存することができる。The human recombinant G-CSF-containing solution obtained by these methods may be further purified and concentrated by known means as necessary, and then frozen or preserved by removing water by means such as freeze-drying. it can.
このようにして得たヒト組換えＧ−CSFは本発明によ
って安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤とすることがで
きる。The human recombinant G-CSF thus obtained can be made into a stable human recombinant G-CSF-containing preparation according to the present invention.
本発明の安定なヒト組換えＧ−CSF含有製剤を得るの
に使用する糖類としては、グリセリン、キシリトール、
マンニトール、グルクロン酸、ナイラミン酸、ケトグル
コール酸、ヒアルロン酸およびその塩、ヘパリン、キチ
ンおよびその誘導体、キトサンおよびその誘導体、デキ
ストリン、平均分子量5,000〜150,000のデキストラン並
びにアルギン酸およびその塩があり、いずれも有利に使
用でき、これらは単独であるいは２種以上の混合物とし
て添加できる。The saccharide used to obtain the stable human recombinant G-CSF-containing preparation of the present invention includes glycerin, xylitol,
There are mannitol, glucuronic acid, nylamic acid, ketoglycolic acid, hyaluronic acid and its salts, heparin, chitin and its derivatives, chitosan and its derivatives, dextrin, dextran with an average molecular weight of 5,000 to 150,000, and alginic acid and its salts. These can be used alone or as a mixture of two or more.
これらの糖類は一般にヒト組換えＧ−CSF1重量部に対
し１重量部〜10,000重量部の範囲内で使用することが好
ましい。Generally, it is preferable to use these saccharides in the range of 1 part by weight to 10,000 parts by weight based on 1 part by weight of human recombinant G-CSF.
更に本発明のヒト組換えＧ−CSF含有製剤は、その製
剤化の目的に応じて希釈剤、溶解補助剤、等張化剤、賦
形剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化
防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤として
は、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステ
イン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノール
アミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグ
リコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタ
チオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸など
のスルフヒドリル基を有するものなどを例示できる。Further, the human recombinant G-CSF-containing preparation of the present invention may contain a diluent, a solubilizing agent, an isotonic agent, an excipient, a pH adjuster, a soothing agent, a buffering agent, depending on the purpose of the preparation. It may contain a sulfur reducing agent, an antioxidant and the like. For example, as the sulfur-containing reducing agent, N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione, Examples thereof include those having a sulfhydryl group such as a thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
また、酸化防止剤としてはエリソルビン酸、ジブチル
ヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α
−トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、
Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸
ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウ
ム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエ
チレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、ピロリン
酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムの如きキレート剤
などを例示できる。As antioxidants, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, α
-Tocopherol, L-ascorbic acid and its salts,
Chelating agents such as L-ascorbic acid palmitate, L-ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate and sodium metaphosphate; Can be illustrated.
あるいはまた賦形剤として、グリシン、システイン、
スレオニン、シスチン、トリプトファン、メチオニン、
リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニンな
どのアミノ酸を添加してもよい。Alternatively, glycine, cysteine,
Threonine, cystine, tryptophan, methionine,
Amino acids such as lysine, hydroxylysine, histidine and arginine may be added.
本発明の安定化されたＧ−CSF含有製剤は経口、各種
注射などの非経口等各種の投与形式で使用でき、該投与
形式に応じた様々な剤形で実現できる。例えば、投与形
としては錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤等の
経口投与剤、あるいは静注、筋注、皮下注、皮内注用等
の溶液、懸濁注射剤、凍結乾燥剤あるいは、坐剤、経鼻
剤、膣剤等の経粘膜投与剤形を典型的なものとして例示
できる。The stabilized G-CSF-containing preparation of the present invention can be used in various administration forms such as oral and parenteral such as various injections, and can be realized in various dosage forms according to the administration form. For example, dosage forms include oral preparations such as tablets, pills, capsules, granules, and suspensions, or solutions for intravenous, intramuscular, subcutaneous, and intradermal injections, suspension injections, and freezes. Typical examples include dosage forms for transmucosal administration such as desiccants, suppositories, nasal preparations, and vaginal preparations.
作用 上記の如く、感染症等の化学的療法においては、抗生
物質、抗菌剤等の薬剤の他、患者の抵抗力、活性などと
いった免疫応答力にもとずいた防禦機能自体をも同時に
改善するために、この目的で有効な成分を添加併用する
ことが臨床上極めて有用な手段であることが判明してき
た。As described above, in chemotherapy for infectious diseases and the like, in addition to drugs such as antibiotics and antibacterial agents, the defense function itself based on immune response such as resistance and activity of the patient is simultaneously improved. Therefore, it has been found that the addition and use of a component effective for this purpose is a very useful means clinically.
この種の成分の一つであるＧ−CSFは極めて微量で使
用される。従って、Ｇ−CSFを極低濃度の水溶液等とし
て取扱う場合には、例えば注射器等に入れたり、アンプ
ル等の容器に収容して使用されることが多いが、このよ
うな場合に、上記の如く成分の容器、注射器等の器壁に
対する吸着性が高いことから、これらの器壁等に吸着し
てしまい、薬液中での有効濃度を、あるいは所定単位用
量中の成分の目的とする活性を維持することが困難であ
るといった問題がみられた。従って、有効量以上の量
を、吸着により失われる量を考慮して、予め添加してお
く必要があった。G-CSF, one of these components, is used in very small amounts. Therefore, when G-CSF is handled as an extremely low-concentration aqueous solution or the like, it is often used, for example, by putting it in a syringe or the like or storing it in a container such as an ampoule. In such a case, as described above, Due to the high adsorptivity of the components to the vessel walls such as containers and syringes, they are adsorbed to these vessel walls, etc., and maintain the effective concentration in the drug solution or the desired activity of the components in a predetermined unit dose. There was a problem that it was difficult to do. Therefore, it is necessary to add an effective amount or more in advance in consideration of the amount lost by adsorption.
更に、特にＧ−CSFについてみると、これは不安定な
ものであり、温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子に
よって大きな影響を受け、会合、重合あるいは酸化など
の物理的、化学的変化を生じ活性の低下を招く。Furthermore, especially with regard to G-CSF, it is unstable and is greatly affected by external factors such as temperature, humidity, oxygen, ultraviolet rays, etc., and physical and chemical changes such as association, polymerization or oxidation. And lowers the activity.
そこで、本発明ではヒト組換えＧ−CSF製剤に前記糖
類を添加することにより上記諸問題点を解決した。前記
糖類の使用によるヒト組換えＧ−CSFの安定化効果並び
に容器壁等への付着損失防止効果の明確な機構は明らか
ではないが、前記糖類の存在下においては、ヒト組換え
Ｇ−CSF分子各々が添加された糖中に分散され、その結
果ヒト組換えＧ−CSFの分子間の相互作用が高度に緩和
され、会合、重合等の確率が大幅に減じられ、また同時
に、添加された糖により容器壁上の吸着表面とヒト組換
えＧ−CSFとの間に水和層が形成され、これにより吸着
が防止され、これらの総合的な効果として安定性が著し
く向上したものと考えた。Therefore, the present invention has solved the above-mentioned problems by adding the saccharide to a human recombinant G-CSF preparation. Although the clear mechanism of the stabilizing effect of human recombinant G-CSF and the effect of preventing loss of adhesion to container walls and the like by using the saccharide is not clear, in the presence of the saccharide, human recombinant G-CSF molecule Each is dispersed in the added sugar, so that the interaction between the molecules of human recombinant G-CSF is highly relaxed, the probability of association, polymerization, etc. is greatly reduced, and at the same time, the added sugar is added. As a result, a hydration layer was formed between the adsorption surface on the container wall and the human recombinant G-CSF, thereby preventing the adsorption, and as a comprehensive effect thereof, it was considered that the stability was remarkably improved.
上記の吸着による損失、会合、重合、酸化等による活
性低下の問題は、注射用溶液、懸濁剤などにおいて特に
顕著であるが、その他の錠剤、カプセル剤等の製剤過程
においてもみられる大きな問題であり、これらも本発明
に従って前記糖類を使用することによって同様に解決で
きる。The above-mentioned problems of loss due to adsorption, reduction in activity due to association, polymerization, oxidation, etc. are particularly remarkable in injection solutions, suspensions, etc., but they are also a major problem observed in the formulation process of other tablets, capsules and the like. Yes, these can be solved similarly by using the saccharides according to the present invention.
このような理由から、前記糖類の添加量は、特にその
下限は臨界的であり、ヒト組換えＧ−CSF1重量部に対し
１重量部〜10,000重量部の範囲内の量で含有することが
望ましい。For these reasons, the lower limit of the amount of the saccharide added is particularly critical, and it is preferable that the saccharide be contained in an amount of 1 part by weight to 10,000 parts by weight based on 1 part by weight of human recombinant G-CSF. .
上記の如く、効果的に器壁等への吸着が防止でき、更
に安定性を向上させ得ることは、微量成分としてのＧ−
CSFの有効利用を可能とし、更に高価な成分の浪費が防
止されることから、製品コストの低下を図ることにもつ
ながる。As described above, it is possible to effectively prevent adsorption to a vessel wall or the like and further improve stability, because G-
Since the CSF can be effectively used and waste of expensive components is prevented, the product cost can be reduced.
実施例 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明す
る。しかしながら、本発明は以下の例によって何等制限
されるものではない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited at all by the following examples.
尚、以下の実施例においてヒト組換えＧ−CSFの残存
活性の測定は以下の如く実施した。In the following Examples, the residual activity of human recombinant G-CSF was measured as follows.
（ａ） マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法 ウマ血清0.4ml、被検体0.1ml、C3H/HeN（メス）マウ
スの骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×105有核細胞）、
寒天を0.75％含む改変マッコイ5A培養液0.4mlを混合
し、直径35mmの組織培養用プラスチックディッシュに入
れて固まらせた後、37℃、５％炭酸ガス/95％空気、100
％湿度の条件にて５日間培養し、形成されたコロニー数
（50個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を
数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Unit）
とした。(A) Soft agar method using mouse bone marrow cells 0.4 ml of horse serum, 0.1 ml of subject, 0.1 ml of bone marrow cell suspension of C3H / HeN (female) mouse (0.5 to 1 × 10 5 nucleated cells),
0.4 ml of a modified McCoy's 5A culture solution containing 0.75% of agar was mixed and set in a plastic dish for tissue culture having a diameter of 35 mm, and then allowed to harden at 37 ° C, 5% carbon dioxide / 95% air, 100%
After culturing for 5 days under the condition of% humidity, the number of colonies formed (a colony composed of 50 or more cells is defined as one colony) is counted, and the activity of forming one colony is 1 unit (Unit)
And
尚、上記（ａ）の方法において用いた「改変マッコイ
5A培養液」は次の如くして作製した。The “modified McCoy” used in the above method (a) was used.
The “5A culture solution” was prepared as follows.
「改変マッコイ5A培養液（２倍濃度）」 マッコイ5A培養液〔ギブコ（GIBCO）社製〕12g、MEM
アミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55g、重炭酸
ナトリウム2.18g、ペニシリンＧカリウム50000単位を２
回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μｍのミリポアフィルタ
ーにて濾過滅菌を行った後使用した。"Modified McCoy's 5A culture solution (2 times concentration)"McCoy's 5A culture solution (manufactured by GIBCO) 12 g, MEM
2.55 g of amino acid vitamin medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), 2.18 g of sodium bicarbonate, and 50,000 units of potassium penicillin G
After dissolving in 500 ml of distilled water, the solution was sterilized by filtration with a 0.22 μm Millipore filter before use.
（ｂ） 逆相系高速液体クロマトグラフィー法 C8逆相カラム（4.6mm×300mm,5μｍ）を用い、ｎ−プ
ロパノール、トリフルオロ酢酸を移動相に使用し、Ｇ−
CSFとして１μｇ相当量以上を注入し、以下のグラジエ
ント条件で残存活性の測定をする。(B) Reversed-phase high-performance liquid chromatography method Using a C8 reversed-phase column (4.6 mm × 300 mm, 5 μm), using n-propanol and trifluoroacetic acid as the mobile phase,
At least 1 μg equivalent of CSF is injected and the residual activity is measured under the following gradient conditions.
溶媒（Ａ）:30％ｎ−プロパノール， 0.1％トリフルオロ酢酸 溶媒（Ｂ）:60％ｎ−プロパノール、 0.1％トリフルオロ酢酸 測定波長:210nm 本法で測定されたＧ−CSFの残存量は、上記（ａ）の
マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法の測定結果と極めて高
い相関性を示した。 Solvent (A): 30% n-propanol, 0.1% trifluoroacetic acid Solvent (B): 60% n-propanol, 0.1% trifluoroacetic acid Measurement wavelength: 210 nm The residual amount of G-CSF measured by this method showed a very high correlation with the measurement result of the soft agar method using the mouse bone marrow cells described in (a) above.
実施例１ Ｇ−CSF5μｇに第１表に示す糖類を添加したＧ−CSF5
μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナトリ
ウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、次いで凍結乾製
剤を製造した。G0 CSF活性の経時変化は上記（ａ）マウ
ス骨髄細胞を用いる軟寒天法で測定した。結果は第１表
に示す。尚、表中活性（％）とは、初期単位に対する相
対的割合であり、以下の式で定義される。Example 1 G-CSF5 obtained by adding saccharides shown in Table 1 to 5 μg of G-CSF
A preparation containing μg / ml (20 mM phosphate buffer, containing 100 mM sodium chloride, pH 7.4) was aseptically prepared, and then a freeze-dried preparation was produced. The time course of the G0 CSF activity was measured by the above-mentioned (a) soft agar method using mouse bone marrow cells. The results are shown in Table 1. Incidentally, the activity (%) in the table is a relative ratio to the initial unit, and is defined by the following formula.
凍結乾燥条件は以下の通りである： 安定化剤を添加したＧ−CSF溶液を無菌サルファ処理
ガラスバイアルに入れ、−40℃以下で４時間凍結し、−
40℃から０℃、真空度0.03から0.1Torrで、48時間一次
乾燥した。次いで０℃から20℃、真空度0.03から0.08To
rrで12時間二次乾燥し、バイアル内部を無菌乾燥窒素ガ
スで大気圧になるまで置換する。次いで凍結乾燥用ゴス
栓で打栓し、アルミニウムキャップで密封する。 The lyophilization conditions are as follows: The G-CSF solution to which the stabilizer has been added is placed in a sterile sulfur-treated glass vial and frozen at -40 ° C or lower for 4 hours.
Primary drying was performed at 40 ° C. to 0 ° C. and a degree of vacuum of 0.03 to 0.1 Torr for 48 hours. Then from 0 ° C to 20 ° C, vacuum degree from 0.03 to 0.08To
After secondary drying at rr for 12 hours, the inside of the vial is replaced with sterile dry nitrogen gas until atmospheric pressure is reached. Then, it is stoppered with a goth stopper for lyophilization and sealed with an aluminum cap.
実施例２ Ｇ−CSF10μｇに第２表に示す糖類を添加したＧ−CSF
10μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナト
リウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、サルファ処理
ガラスバイアル内に無菌的に充填、密封してＧ−CSF溶
液製剤を製造した。これらの溶液製剤について、Ｇ−CS
F活性の経過時変化を実施例１と同様の方法で測定し、
その結果を第２表に示した。 Example 2 G-CSF obtained by adding saccharides shown in Table 2 to 10 μg of G-CSF
A 10 μg / ml-containing preparation (20 mM phosphate buffer, 100 mM sodium chloride, pH 7.4) was aseptically prepared, aseptically filled in a sulfur-treated glass vial, and sealed to produce a G-CSF solution preparation. . For these solution formulations, G-CS
The change over time of F activity was measured in the same manner as in Example 1,
The results are shown in Table 2.
実施例３ Ｇ−CSF10μｇに第３表に示す糖類を添加したＧ−CSF
10μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナト
リウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、サルファ処理
シリコーンコーティングガラスバイアル中に1ml充填
し、４℃で放置し、0.5、２および24時間後の溶液中の
Ｇ−CSFの残存活性を上記（ｂ）の逆相系高速液体クロ
マトグラフィー法により測定し残存率（％）を求め、こ
れらの糖類のヒト組換えＧ−CSF吸着防止効果を評価し
た。その結果を第３表に示す。 Example 3 G-CSF obtained by adding saccharides shown in Table 3 to 10 μg of G-CSF
A 10 μg / ml formulation (20 mM phosphate buffer, 100 mM sodium chloride, pH 7.4) was aseptically prepared, filled in a 1 ml sulfa-treated silicone-coated glass vial, left at 4 ° C., After 24 hours, the residual activity of G-CSF in the solution was measured by the reversed-phase high performance liquid chromatography method (b) described above, and the residual ratio (%) was determined to prevent adsorption of these saccharides on human recombinant G-CSF. The effect was evaluated. Table 3 shows the results.
発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によれば、グリセリ
ン、キシリトール、マンニトール、グルクロン酸、ノイ
ラミン酸、ケトグルコール酸、ヒアルロン酸およびその
塩、ヘパリン、キチンおよびその誘導体、キトサンおよ
びその誘導体、デキストリン、平均分子量5,000〜150,0
00のデキストラン並びにアルギン酸およびその塩からな
る群から選ばれる少なくとも１種の糖類を所定濃度で用
いたことにより、製剤中に極微量で存在するヒト組換え
Ｇ−CSFの温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子にも
とずく会合、重合、あるいは酸化もしくは、容器壁等へ
の吸着の結果として生ずる、有効成分の損失、活性の低
下等に関する問題点を効果的に解決することが可能とな
った。 Effects of the Invention As described in detail above, according to the present invention, glycerin, xylitol, mannitol, glucuronic acid, neuraminic acid, ketoglycolic acid, hyaluronic acid and its salts, heparin, chitin and its derivatives, chitosan and its derivatives, dextrin , Average molecular weight 5,000-150,0
By using at least one saccharide selected from the group consisting of dextran and alginic acid and salts thereof at a predetermined concentration, the temperature, humidity, oxygen and ultraviolet light of human recombinant G-CSF present in a trace amount in the preparation It is possible to effectively solve the problems related to loss of active ingredient, decrease in activity, etc., which occur as a result of association, polymerization, oxidation, or adsorption to container walls, etc. based on external factors such as became.
従って、患者に対するヒト組換えＧ−CSFの投与量を
極めて正確に投与、管理することが可能となり、しかも
高価なヒト組換えＧ−CSFの有効利用ができ、ヒト組換
えＧ−CSF含有製剤のコスト節減を図ることも可能とな
る。Therefore, it is possible to administer and control the dose of human recombinant G-CSF to a patient extremely accurately, and furthermore, it is possible to effectively use expensive human recombinant G-CSF, and to prepare a human recombinant G-CSF-containing preparation. It is also possible to reduce costs.
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−36326（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−140707（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−81781（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−230729（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−258125（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−155136（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−59000（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−48933（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−25333（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−181223（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−59625（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−92620（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−92619（ＪＰ，Ａ)Continuation of the front page (56) References JP-A-62-36326 (JP, A) JP-A-54-140707 (JP, A) JP-A-61-81781 (JP, A) JP-A-62-230729 (JP) , A) JP-A-60-258125 (JP, A) JP-A-60-155136 (JP, A) JP-A-60-59000 (JP, A) JP-A-60-48933 (JP, A) JP-A-59-25333 (JP, A) JP-A-59-181223 (JP, A) JP-A-59-59625 (JP, A) JP-A-58-92620 (JP, A) JP-A-58-92619 (JP, A) A)
Claims (3)
セリン、キシリトール、マンニトール、グルクロン酸、
ノイラミン酸、ケトグルコール酸、ヒアルロン酸および
その塩、ヘパリン、キチンおよびその誘導体、キトサン
およびその誘導体、デキストリン、平均分子量5,000〜1
50,000のデキストラン並びにアルギン酸およびその塩か
らなる群から選ばれる少なくとも１種の糖類とを含むこ
とを特徴とする、安定なヒト組換え顆粒球コロニー刺激
因子含有製剤。1. A recombinant human granulocyte colony-stimulating factor and glycerin, xylitol, mannitol, glucuronic acid,
Neuraminic acid, ketoglycolic acid, hyaluronic acid and its salts, heparin, chitin and its derivatives, chitosan and its derivatives, dextrin, average molecular weight 5,000-1
A stable recombinant human granulocyte colony-stimulating factor-containing preparation, comprising 50,000 dextran and at least one saccharide selected from the group consisting of alginic acid and salts thereof.
その塩並びに平均分子量5,000〜150,000のデキストラン
からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項
１記載の安定なヒト組換え顆粒球コロニー刺激因子含有
製剤。2. The stable human recombinant granulocyte colony stimulating factor according to claim 1, wherein the saccharide is at least one selected from the group consisting of mannitol, hyaluronic acid and salts thereof, and dextran having an average molecular weight of 5,000 to 150,000. Formulation.
に対し１重量部〜10,000重量部の範囲内の量で含有する
ことを特徴とする、請求項１または２記載の安定なヒト
組換え顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。3. The stable human group according to claim 1, wherein said sugar is contained in an amount within a range of 1 part by weight to 10,000 parts by weight based on 1 part by weight of granulocyte colony stimulating factor. A preparation containing a recombinant granulocyte colony-stimulating factor.
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