JP2577091C - - Google Patents
Info
- Publication number
- JP2577091C JP2577091C JP2577091C JP 2577091 C JP2577091 C JP 2577091C JP 2577091 C JP2577091 C JP 2577091C
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hhgf
- gene
- sequence
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 16
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 25
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 13
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 239000002609 media Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 6
- 102100000579 HGF Human genes 0.000 description 6
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 102100019126 HBB Human genes 0.000 description 4
- 108091005902 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 4
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 240000008371 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 229940075615 Bacillus subtilis Drugs 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 4H-1,2,4-triazol-3-amine Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000013009 EC 2.7.1.40 Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 EC 2.7.1.40 Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 2
- 210000002826 Placenta Anatomy 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- -1 for example Polymers 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2R,3R,4R,5R)-2-[(1S,2S,3R,4S,6R)-4,6-diamino-3-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100007877 APOE Human genes 0.000 description 1
- 101700025839 APOE Proteins 0.000 description 1
- 101710006647 APRT Proteins 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 241000701922 Bovine parvovirus Species 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710007887 DHFR Proteins 0.000 description 1
- 102100005838 DHFR Human genes 0.000 description 1
- 101710006640 DIT33 Proteins 0.000 description 1
- 101710034658 DNASE1 Proteins 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N Deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 102000008422 EC 2.7.1.78 Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 EC 2.7.1.78 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001522296 Erithacus rubecula Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 101710039302 MIMI_R420 Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710017500 MitHPPK/DHPS Proteins 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene (PE) Substances 0.000 description 1
- 241000282941 Rangifer tarandus Species 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 229910052776 Thorium Inorganic materials 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Tris Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010075344 Tryptophan Synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940029983 VITAMINS Drugs 0.000 description 1
- 229940021016 Vitamin IV solution additives Drugs 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 101700043128 est Proteins 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000020664 human HGF protein Human genes 0.000 description 1
- 108091002800 human HGF protein Proteins 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 101710030587 ligN Proteins 0.000 description 1
- 101700077585 ligd Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000004044 liver cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 201000009673 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 108010053229 lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 101700015794 pro Proteins 0.000 description 1
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- ZSLUVFAKFWKJRC-UHFFFAOYSA-N thorium Chemical compound [Th] ZSLUVFAKFWKJRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamins Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、遺伝子組換えによって得られた肝実質細胞増殖因子及びそれをコード
する遺伝子に関する。 (従来の技術) 肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の器官である。これは主に各種栄
養素(糖質、タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等)の処理(代謝)、貯蔵
、解毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えており、なかでも生体内
中間代謝の中心的な役割を果たすことが知られている。これらの機能を担ってい
る肝実質細胞は生体内において各種のホルモンによる制御下に置かれ、ある場合
にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、ラットの肝臓のほぼ2/3を切除して
も、約10日後には元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌患者等
において、部分肝切除とその後の再生による治療法が行われている。肝実質細胞
の増殖による肝再生の機構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細
胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明者らの一部は、ヒト劇症
肝炎患者血漿中には、肝実質細胞増殖活性が極めて高いことを見いだし(Biomed.
Res.,6,231(1985)及びExp.Cell.Res.166,139(1986))、その活性を有する因子を
世界で初めて単一のタンパク質として精製することに成功した(特開昭63-22526
号公報及びJ.Clin.Invest.,81,414(1988))。 このヒト肝細胞増殖因子(以下「hHGF」と略す)は非還元条件下のSDS−
PAGEによる推定分子量が約76000-92000 であり、還元条件下のSDS−PA
GEでは分子量56000-65000 及び32000-35000 の2つのバンドに分かれた。中村
らは、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告しており(Biochem.Bio
phys.Res.Commun.122,1450(1984))、SDS−PAGEにより、その推定分子量
は約27000であるとしていたが(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6489(1986))、
その後、単一のタンパク質として精製し、分子量69000 と34000 との2つのポリ
ペプチドからなる分子量82000 のタンパク質であると報告された(FEBS Letters
,224,311(1987))。これらhHGF及びラットHGF以外には単一のタンパク質
として精製された肝細胞増殖因子は今までに報告されていないし、hHGF及 びラットHGFに関しても、その一次構造及び該当するcDNAの塩基配列につ
いては、なんの報告もなされていない。 (発明の解決すべき問題点) hHGFの生体における詳細な機能あるいは肝障害時における肝再生に対する効
果等を生体外で調べるには、多量のhHGFを必要とするが、劇症肝炎患者血漿
から多量のhHGFを精製することは人的、時間的、経費的に必ずしも容易では
なく、また感染源の存在する血漿中からhHGFのみを安定に取り出すことは困
難を極める。かかる理由からhHGFの劇症肝炎患者血漿からの安定かつ大量の
精製は行われていなかった。 (問題点を解決するための手段) そこで、本発明者らは、hHGFを組換えDNA技術により大量に取得するべく
種々検討した結果、かかる目的に有用なhHGFをコードする遺伝子を初めてク
ローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の
要旨は、第1図に示すアミノ酸配列で表される、シグナル配列を含むhHGF、
第1図に示すアミノ酸配列のうち30番目のグルタミン酸残基(Glu)から最
後のセリン残基(Ser)までの配列で表されるhHGF、第1図に示すアミノ
酸配列のうち32番目のグルタミン(Gln)から最後のセリン残基(Ser)
までの配列で表されるhHGF、該アミノ酸配列で表される各hHGFをコード
する遺伝子、第2図に示す塩基配列で表される、シグナル配列を含むhHGFを
コードする遺伝子、第2図に示す塩基配列のうち88番目のGから最後のGまで
の配列で表される遺伝子及び第2図に示す塩基配列のうち94番目のCから最後
のGまでの配列で表される遺伝子に存する。 以下に本発明を説明するに、本発明のhHGFをコードする遺伝子(cDNA)
は例えば第2図に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な
塩基配列を省略し1本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換えDNA技術によ
り例えば第1図に示すアミノ酸配列を有するhHGFを発現させることができる
。この時、hHGFをコードするmRNAから翻訳される蛋白はシグナル配列を
含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、30番目
のグルタミン酸残基(Glu)または32番目のグルタミン残基(Gln)以後 のアミノ酸配列を有するhHGFが産生される。シグナル配列として、他の蛋白
のシグナル配列を利用する事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない
成熟hHGFを発現させる場合は、hHGFをコードする遺伝子として第2図に
示す塩基配列のうち88番目のGまたは94番目のCから以後の塩基配列を有す
る遺伝子を、ベクターのATGコドンにつなげて使用すればよい。さらに、本発
明においては、肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸
または核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明に含ま
れる。 本発明のhHGFをコードする遺伝子のDNA断片は例えば次の様な方法によっ
て得られる。劇症肝炎患者血漿より、例えばJ.Clin.Invest.81,414(1988)に記載
された方法によって精製されたhHGFは、還元条件下では、ジスルフィド結合
が切断されて2本のポリペプチドに分かれる。分子量56000-65000 のポリペプチ
ドをH鎖、分子量32000-35000 のポリペプチドをL鎖とする。hHGFを還元処
理し生成したシステイン残基のチオール基をカルボキシメチル化したのち、逆相
高速液体クロマトグラフィーでH鎖とL鎖を分離するか、あるいはhHGFを還
元条件下で電気泳動し、そのゲルからH鎖、L鎖のそれぞれを抽出したのち、例
えばアプライド・バイオシステムズ社製気相プロテインシーケンサーで分析する
ことにより、両鎖のアミノ末端アミノ酸配列を調べることができる。さらに、h
HGF自体を、またはH鎖、L鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロモ
バクタープロテアーゼI(リジルエンドペプチダーゼ)で分解し、生成するペプ
チド断片を例えば逆相高速液体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチド
を上記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内部のアミノ酸配列を
知ることができる。これらのアミノ酸配列からDNA塩基配列を推定しオリゴヌ
クレオチドを作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチド、例えば、
後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして使用す
る。hHGFをコードする遺伝子をスクリーニングするcDNAライブラリーと
しては、人由来の肝臓cDNAライブラリー、脾臓cDNAライブラリー、胎盤
cDNAライブラリー、等が利用できる。これらのライブラリーはクローンテッ
ク社より販売されている。特に胎盤cDNAライブラリーが望ましい。その他h HGFを発現している細胞株、及び組織材料から常法に従ってcDNAライブラ
リーを作成してもよい。このようなcDNAが組み込まれたλファージをManiat
isらの方法(「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、56頁−73頁(1982))により大腸菌に感染させ培養する。形
成されたプラークをhHGFの一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から
作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション
法(「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー
、320頁−328頁(1982))に従って選択することにより、容易に目的
とするhHGFのアミノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおかつhHG
Fのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異なる
λファージクローンをいくつか得ることができる。さらに上記スクリーニング陽
性のプラークからManiatisらの方法(「モレキュラークローニング」、コールド
スプリングハーバーラボラトリー、76頁−79頁(1982))によりファー
ジを増殖させ、そのものからグリセロールグラヂエント法にしたがってDNAを
精製し適切な制限酵素例えばEcoRI等で切断後、pUC18,pUC19等
のプラスミドベクターあるいはM13mp18,M13mp19などの一本鎖フ
ァージベクターにcDNAをサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ
法(プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)745463(1977))
に従って目的cDNAセグメントの塩基配列を決定することができる。得られた
クローンの塩基配列を解析しそれらを統合することにより(第3図)hHGFの
一部をコードするcDNAクローン群によって、第1図に示すhHGFの全アミ
ノ酸配列の全てに対応する遺伝子を得ることができる。かくして得られるcDN
Aの発現は、例えば、該DNA群をその塩基配列の順番がhHGFのアミノ酸配
列に従う形でつないでそれらhHGFの全領域を含むDNA断片としこれをpC
DL−SRα296等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンAT
Gとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラスミドを形成し、該プラスミ
ドで形質転換された動物細胞の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従
い発現された蛋白質を回収することにより本発明のHGFを得ることができる。 上記発現用プラスミドとしては、工業的生産のためには、安定した宿主−ベクタ
ー系を構築することが望ましい。例えば、特願平1−115831号に記載されている
ようなものが挙げられる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とする
ときは、プロモーター、リボゾーム結合配列、hHGF遺伝子、転写終結因子、
及びプロモーターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。プロモーターとし
ては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン(trp),ラクトースオペロン
(lac)、リボプロテインのプロモーター(lpp)等が挙げられ、また、t
ac(trp:lac),trc(trp:lac),pac(ファージ:大腸
菌)等のハイブリッドプロモーターでもよい。hHGF遺伝子としてはシグナル
配列に相当する部分を除去したものが好ましいが、シグナル配列に相当する部分
を含むものでも産生されるプレ体からシグナル配列を除くことによってhHGF
を得ることが出来る。使用するプラスミドとしては、大腸菌や枯草菌で多コピー
数になるプラスミド、例えばpBR322系プラスミド、pUB110系プラス
ミド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸菌、枯草菌などは、通
常の培地を用いて15−42℃で培養すればよい。酵母を宿主とする場合は、酵
母由来のプロモーター、例えばピルビン酸キナーゼ(pYK),ホスホグリセロ
キナーゼ(pGK)等の配列の支配下にhHGF遺伝子を接続し、酵母内に導入
して30℃前後で培養すればよい。 しかしながら、天然のhHGFは糖蛋白であることを考慮すると、宿主としては
動物細胞が望ましい。また、動物細胞を宿主とする場合はシグナル配列に相当す
る部分を含むhHGF遺伝子を導入することにより、シグナル配列が除かれたh
HGFが分泌生産されるという利点が期待される。シグナル配列としてはhHG
Fの本来のシグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒト
・アミラーゼ等のシグナル配列を利用してもよく、その場合は本来のシグナル配
列をコードするDNA断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩基配列
のDNA断片を5’側に置換すればよい。動物細胞を宿主とする場合、プロモー
ターとしては、SV40後期プロモーター、アポリポプロテインE遺伝子のプロ
モーター、アポリポプロテインA1遺伝子のプロモーター、熱ショック蛋白遺伝
子のプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、HSVTKプロモ ーター、アデノウイルスのプロモーター、レトロウイルスのLTR等が挙げられ
るが、SV40プロモーター及びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ま
しい。発現ベクターには、hHGF遺伝子の下流にポリアデニル化部位が含まれ
る。ポリアデニル化部位の具体例としては、SV40 DNA,β−グロビン遺
伝子またはメタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。また、β−グ
ロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びSV40 DNAのポリアデニル化部位
が連結したものであってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マーカーを
有していてもよい。発現ベクター中に選択マーカーがなくても、二重形質転換に
より、形質転換された動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとしては
、メトトレキセート耐性を与えるDHFR遺伝子、HAT培地中での形質転換t
k-株の選択を可能とするヘルペス・シンプレックスウイルス(HSV)のtk
遺伝子、3’−デオキシストレプタミン抗生物質G418に対する耐性を付与す
る大腸菌のトランスポゾンTn5からのアミノグリコシド3’−ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、重層増殖によるウシパピローマウイルス遺伝子、aprt遺
伝子等が挙げられる。また、二重形質転換法により、発現ベクターで形質転換し
た動物細胞を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を含有するプラ
スミドその他のDNAを発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカーの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択出来る。発現ベクターは、
大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラスミド断片を有すると、細菌中で
のクローニングも可能となり有利である。このようなプラスミド断片としてはp
BR322、pBR327、pML等のプラスミド断片が挙げられる。発現ベク
ターに使用されるプラスミドベクターの具体例としては、SV40初期プロモー
ター、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列DNA,ウサギの
β−グロビン遺伝子からのポリアデニル化部位、SV40初期領域からのポリア
デニル化部位並びにpBR322からの複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子
を含有するpKCR,pKCRのpBR322部分をpBR327で置換し、ウ
サギβ−グロビン遺伝子のエクソン3中に存在するEco R1部位をHind
III 部位に変えたpKCR H2、BPV遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を
含有するpBPV MT1等が挙げられる。発現ベクターで形質転換される動物 細胞としては、CHO細胞、COS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、
マウスFM3A細胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入はトラン
スフェクション法、マイクロインジェクション法等により行われるが、その中で
は、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移入により形質転換された動物細
胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、MEM,RPMI1640などが一般的である。 産生されたhHGFの分離精製は、劇症肝炎患者血漿からの精製と同様に、ヘパ
リン・セファローズやハイドロキシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフ
ィーにより行うことが出来る。 (発明の効果) 本発明に係わるhHGFをコードする遺伝子は常法により発現ベクターに導入す
ることによって、これを鋳型とする発現によりhHGFまたはhHGF様物質あ
るいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換えhHGF,hH
GF様物質あるいはhHGFを含む融合蛋白は肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝
炎治療剤あるいは肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。 (実施例) 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限
り、以下の実施例に限定されるものではない。 実施例1 〔1〕hHGFの部分アミノ酸配列決定及びプローブの作製 劇症肝炎患者血漿より、J.Clin.Invest.,81,414(1988)に記載された方法に従っ
てhHGFを精製した。これをSDS−PAGEにかけたところ、非還元条件下
では、分子量76000-92000 の位置にややブロードな単一バンドが現れ、還元条件
下では、分子量56000-65000 のややブロードなバンドと分子量32000-35000 のバ
ンドの2つのバンドが現れた。この精製hHGF50μgを5モル濃度の尿素を
含有するpH9の50ミリモル濃度のトリス塩酸緩衝液100μlに溶解し、こ
れに、hHGFに対しモル比で1/200 に相当するアクロモバクタープロテアー
ゼIを加えて37℃で6時間反応させた。生成したペプチド混合物は常法により
還元カルボキシメチル化したのち、J.T.Baker 社製Bakerbond WP Octyl Colum n を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離して、各ペプチドを分取
した。 6つのペプチドについて気相プロテインシーケンサー(Applied Biosystems社Mo
del470A)を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示すような配列が
見いだされた。 〔2〕hHGFの一部をコードするcDNAのスクリーニング (1)プラークハイブリダイゼーション スクリーニングを行うλファージcDNAライブラリーとして34週齢のヒト胎
盤由来のcDNA(クローンテック社)のスクリーニングを説明書に従って行っ
た。100万クローンのファージを大腸菌Y−1090株に感染させ24.5cmx
24.5cmのシャーレ中のNZY軟寒天培地〔NZY培地;1%NZ−アミン、
0.5%イーストイクストラクト、0.5%塩化ナトリウム、pH7・5に調整し0.25
%塩化マグネシウムを加えたもの、NZY軟寒天培地;NZY培地に 0.7% になるように寒天沫を加えオートクレイブしたもの〕中で1枚あたり20万クロ
ーンの割合で5枚分を42℃で一晩培養した。次に培地中のλファージクローン
を市販のナイロン膜であるジーンスクリーニングプラス(デュポン社)上に移し
取り、以下に説明するプラークハイブリダイゼーションを行った。即ち、1枚の
シャーレあたりナイロン膜2枚の割合でファージ粒子を移し取り、その様にして
できたナイロン膜を 0.1M水酸化ナトリウム− 1.5M塩化ナトリウムが染み込ん
だろ紙上に2分間静置し別に用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、次に、同
様に2xSSCP(2倍の濃度のSSCP溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。10 x SSCP; 1.2M塩化ナトリウム、150mMクエン酸ナトリウム
、130mM燐酸二水素カリウム、1mMEDTA pH7.2)− 0.2Mトリス
−塩酸(pH7.4)を染み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上
で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理したナイロン膜は、3
xSSC(20倍の濃度のSSC溶液;3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナ
トリウム)− 0.1% SDSで60℃15分間2回洗浄し、次にナイロン膜1枚
当り5 mlのプレハイブリダイゼーション液〔3xSSC、0.1%SDS、10xD
enhardt’s(50倍の濃度のDenhardt’s溶液;1%BSA(
牛血清アルブミン)1%ポリビニルピロリドン、及び1%フィコール400)、
20μg/ml鮭***DNA〕に65℃3時間浸した。次に、表1のペプチド4、
すなわち Asn-Met-Glu-Asp-Leu-His-Arg-His-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro-Asp-Ala-Se
r-Lys のうちのAsn-Met-Glu-Asp-Leu-His およびHis-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro を基
に合成オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミノ酸配列の順に17塩
基64種類のTH23(5’−T−G−T/C/A/G −A−A/G −A/G −T−C−T/
C −T−C−C−A−T−A/G −T−T−3’)、17塩基24種類のTH24
(5’−G−G−T/C −T−C−C−C−A−A/G −A−A−A/G/T −A−T−
A/G −T−G−3’)を作成した。これらを常法に従いポリヌクレオチドキナー
ゼによりその5’末端を反応液〔50mMトリス−塩酸pH7.6、10mM塩化マ
グネシウム、10mMメルカプトエタノール、100μM〔γ32P〕ATP、基質D
NA〕中で32P標識した後、常法に従いDEAEセルロースカラムをかけて余分
なモノヌクレオチドを除いた。こうしてできあがった32P標識合成オリゴヌクレ オチドプローブを含むハイブリダイゼーション液〔3xSSC、10xDenha
rdt’s、50μg/ml鮭***DNA1M塩化ナトリウム、1%SDS、250μg
/ml鮭***DNA、合成プローブ1種類当り10万c.p.m./ml32P標識プローブ
DNA〕中で前述のフィルターをプローブに応じAまたはTを2℃に、Gまたは
Cを4℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際はプローブにより42℃
(TH23)46℃(TH24)で36時間保温した。その後、ナイロン膜を取
り出し、4xSSC溶液中で室温で30分間2回洗い、4xSSC溶液でハイブ
リダイゼーションの時と同じ温度で30分間2回洗った後2xSSC溶液で室温
で15分間2回洗い、オートラジオグラフィーをとった。 2枚1組のナイロン膜のオートラジオグラフィー上のシグナルが一致したものは
6個あった。得られたシグナルに相当するクローンを単離するために、これらシ
グナルと一致する軟寒天培地上のプラークをガラス管で打ち抜き50μlのクロ
ロフォルム存在下1mlのTMG緩衝液〔50mMトリス−塩酸pH7・5、1
00mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム及び0・01%ゼラチン〕
中でファージ粒子を一晩抽出し再び大腸菌Y−1090株に感染させ9cmシャ
ーレ中で適当量培地し前述の方法でプラークハイブリダイゼーションを行った。
この一連の操作を繰り返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離す
ることができた。その結果独立した6個のクローンを得た。そのうち2個のクロ
ーン、すなわちλhHGF21とλhHGF502について、含まれるcDNAの塩基配
列を解析した。 (2)cDNA断片のサブクローニング及び塩基配列の決定 これらのλファージクローンから以下のようにDNAを抽出しプラスミドベクタ
ーpUC18、pUC19及び一本鎖ファージベクターM13mp18,M13
mp19にサブクローニングをおこなった。即ち、500ml三角フラスコ中の 20
0mlのNZY培地中において、200μlのTMG溶液に懸濁してあるλファージ
クローン2 x 107 p.f.u.(p.f.u.;プラーク形成単位)と40μlの大腸
菌Y−1090株2 x 108を37℃15分置くことにより感染させた。15
分後さらに1mlの1M塩化カルシウムを加え一晩、概ね14時間ほど培養した
。次に、2mlのクロロフォルムを加え10分ほど置き、15.8gの塩化ナトリウ ムを加え溶かし、それらを4℃において日立冷却遠心機SCR20BBで、ロー
ターRPR9−2を用いて6000回転20分間遠心した上清に20gのポリエチ
レングリコール6000を加えて十分に溶解した後に氷中で1時間静置した。こ
れを日立冷却遠心機SCR20BBで、ローターRPR9−2において6000
回転20分間遠心し沈澱を6mlのA緩衝液〔0.5%NP40、36mM塩化カル
シウム、30mMトリス−塩酸pH7・5 50mM塩化マグネシウム、125mM塩
化カリウム、0.5mMEDTA、0.25%デオキシコール酸、0.6mMメルカプトエ
タノール〕に懸濁しここに 100μlの10mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ
Iと10μlの10mg/mlのリボヌクレアーゼAを加え30℃で30分間保温す
ることにより大腸菌由来の核酸を分解した。その後上記反応液に等量のクロロフ
ォルムを加え良く攪はんしたのちにトミー遠心機LC−06、ローターTS−7
で3000回転10分間遠心し上清を得た。 一方予め日立超遠心機ローターRPS40T用遠心管に40%グリセロール溶液〔
0.5%NP40、30mMトリス−塩酸pH7・5、125mM塩化カリウム、0.5m
MEDTA、0.6mMメルカプトエタノール、10%グリセロール〕を1ml入れ
ておきその上に3mlの10%グリセロール溶液〔0.5%NP40、30mMトリス
−塩酸pH7・5、125mM塩化カリウム、0.5mMEDTA、0.6mMメルカプ
トエタノール、40%グリセロール〕を重層して準備しておいた上に先ほどのヌク
レアーゼ処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機70P72、ロータ
ーRPS40Tで35000回転1時間遠心する。遠心後沈澱として落ちてきた
ファージ粒子を 0.4mlの40mMトリス−塩酸pH7・5、10mMEDTA、
2%SDSに懸濁し4μlの10mg/mlのプロテナーゼKを加えて55℃1時
間保温を行った。その後溶液をエッペンドルフチューブに移し等量のフェノール
/クロロフォルムにてファージDNAを抽出しエタノール沈澱を行うことにより
目的とするファージDNAを 200μg得ることが出来た。このファージDNAを
制限酵素EcoRIで常法で従い切断しアガロース電気泳動法にて解析した。そ
の結果クローンλhHGF21から0.2kbと0.85kbと0.72Kbの3本
のEcoRI断片を得た。一方アガロースゲルから該インサートcDNA断片を
常法に従い回収することにより目的とするcDNA断片を得ることが出来た 。これらcDNA断片 100ngを予め常法に従い制限酵素EcoRIによって切
断しておいたプラスミドベクターpUC18、pUC19及び一本鎖ファージベ
クターM13mp18,M13mp19 200ngと10μlの反応液〔66mMト
リス−塩酸pH7.6、6.6mM塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトール
、66μMATP、基質DNA〕中でユニットのT4DNAリガーゼにより結合し
それぞれのベクターに見合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによ
りEcoRI挿入部位にHGF蛋白質の部分配列を持つサブクローンを得た。得
られたcDNAサブクローンの塩基配列の決定は、Sangerらのジデオキシ法によ
って行った。プライマーは市販のM13ファージベクターに対応するものを使用
した。その結果、最も長いcDNAを持つクローンλhHGF21の塩基配列をアミ
ノ酸に翻訳すると第1図に示すようにすでに明らかにされているアミノ酸配列の
うちプローブの設計に使用したアミノ酸配列とは異なる領域のアミノ酸配列のう
ちのいくつかを含んでいることが判明し、このクローンがhHGFの少なくとも
一部分の領域を含むcDNAであることが判明した。また、λhHGF21にはない
cDNA断片を含むクローンλhHGF502のcDNAの塩基配列をSanger法に従
い解析した結果、クローンλhHGF502はクローンλhHGF21と同じ塩基配列を
第2図で示す制限酵素切断部位NcoIの近傍から5’上流から数えて三番目の
EcoRI切断部位の近傍までの0.8kbの長さで共有し3’側にλhHGF21
にはない0.7kbの塩基配列をもつことがわかった。λhHGF502の塩基配列
のうちλhHGF21の有しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸配
列に相当する塩基配列があることが判明した。これら2つのクローンの塩基配列
を一部が重複する形でつなぎあわせるとhHGFのアミノ酸配列の全てをカバー
することが判明した。
する遺伝子に関する。 (従来の技術) 肝臓は、生体中で最も高度に分化の進んだ最大の器官である。これは主に各種栄
養素(糖質、タンパク質、脂質、ビタミン、ホルモン等)の処理(代謝)、貯蔵
、解毒、分解、排せつ等の重要な多種の機能を兼ね備えており、なかでも生体内
中間代謝の中心的な役割を果たすことが知られている。これらの機能を担ってい
る肝実質細胞は生体内において各種のホルモンによる制御下に置かれ、ある場合
にはきわめて旺盛な増殖を示す。例えば、ラットの肝臓のほぼ2/3を切除して
も、約10日後には元の大きさに戻ることが知られており、ヒトでも肝癌患者等
において、部分肝切除とその後の再生による治療法が行われている。肝実質細胞
の増殖による肝再生の機構については従来より数多くの研究が行われ、肝実質細
胞増殖因子の存在が報告されてきた。とりわけ、本発明者らの一部は、ヒト劇症
肝炎患者血漿中には、肝実質細胞増殖活性が極めて高いことを見いだし(Biomed.
Res.,6,231(1985)及びExp.Cell.Res.166,139(1986))、その活性を有する因子を
世界で初めて単一のタンパク質として精製することに成功した(特開昭63-22526
号公報及びJ.Clin.Invest.,81,414(1988))。 このヒト肝細胞増殖因子(以下「hHGF」と略す)は非還元条件下のSDS−
PAGEによる推定分子量が約76000-92000 であり、還元条件下のSDS−PA
GEでは分子量56000-65000 及び32000-35000 の2つのバンドに分かれた。中村
らは、ラット血小板由来の同様な活性を有する因子を報告しており(Biochem.Bio
phys.Res.Commun.122,1450(1984))、SDS−PAGEにより、その推定分子量
は約27000であるとしていたが(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,6489(1986))、
その後、単一のタンパク質として精製し、分子量69000 と34000 との2つのポリ
ペプチドからなる分子量82000 のタンパク質であると報告された(FEBS Letters
,224,311(1987))。これらhHGF及びラットHGF以外には単一のタンパク質
として精製された肝細胞増殖因子は今までに報告されていないし、hHGF及 びラットHGFに関しても、その一次構造及び該当するcDNAの塩基配列につ
いては、なんの報告もなされていない。 (発明の解決すべき問題点) hHGFの生体における詳細な機能あるいは肝障害時における肝再生に対する効
果等を生体外で調べるには、多量のhHGFを必要とするが、劇症肝炎患者血漿
から多量のhHGFを精製することは人的、時間的、経費的に必ずしも容易では
なく、また感染源の存在する血漿中からhHGFのみを安定に取り出すことは困
難を極める。かかる理由からhHGFの劇症肝炎患者血漿からの安定かつ大量の
精製は行われていなかった。 (問題点を解決するための手段) そこで、本発明者らは、hHGFを組換えDNA技術により大量に取得するべく
種々検討した結果、かかる目的に有用なhHGFをコードする遺伝子を初めてク
ローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の
要旨は、第1図に示すアミノ酸配列で表される、シグナル配列を含むhHGF、
第1図に示すアミノ酸配列のうち30番目のグルタミン酸残基(Glu)から最
後のセリン残基(Ser)までの配列で表されるhHGF、第1図に示すアミノ
酸配列のうち32番目のグルタミン(Gln)から最後のセリン残基(Ser)
までの配列で表されるhHGF、該アミノ酸配列で表される各hHGFをコード
する遺伝子、第2図に示す塩基配列で表される、シグナル配列を含むhHGFを
コードする遺伝子、第2図に示す塩基配列のうち88番目のGから最後のGまで
の配列で表される遺伝子及び第2図に示す塩基配列のうち94番目のCから最後
のGまでの配列で表される遺伝子に存する。 以下に本発明を説明するに、本発明のhHGFをコードする遺伝子(cDNA)
は例えば第2図に示すような塩基配列を有する。なお、塩基配列は他の相補的な
塩基配列を省略し1本鎖のみを記載した。この遺伝子より組換えDNA技術によ
り例えば第1図に示すアミノ酸配列を有するhHGFを発現させることができる
。この時、hHGFをコードするmRNAから翻訳される蛋白はシグナル配列を
含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され、30番目
のグルタミン酸残基(Glu)または32番目のグルタミン残基(Gln)以後 のアミノ酸配列を有するhHGFが産生される。シグナル配列として、他の蛋白
のシグナル配列を利用する事もできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない
成熟hHGFを発現させる場合は、hHGFをコードする遺伝子として第2図に
示す塩基配列のうち88番目のGまたは94番目のCから以後の塩基配列を有す
る遺伝子を、ベクターのATGコドンにつなげて使用すればよい。さらに、本発
明においては、肝実質細胞増殖促進活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸
または核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明に含ま
れる。 本発明のhHGFをコードする遺伝子のDNA断片は例えば次の様な方法によっ
て得られる。劇症肝炎患者血漿より、例えばJ.Clin.Invest.81,414(1988)に記載
された方法によって精製されたhHGFは、還元条件下では、ジスルフィド結合
が切断されて2本のポリペプチドに分かれる。分子量56000-65000 のポリペプチ
ドをH鎖、分子量32000-35000 のポリペプチドをL鎖とする。hHGFを還元処
理し生成したシステイン残基のチオール基をカルボキシメチル化したのち、逆相
高速液体クロマトグラフィーでH鎖とL鎖を分離するか、あるいはhHGFを還
元条件下で電気泳動し、そのゲルからH鎖、L鎖のそれぞれを抽出したのち、例
えばアプライド・バイオシステムズ社製気相プロテインシーケンサーで分析する
ことにより、両鎖のアミノ末端アミノ酸配列を調べることができる。さらに、h
HGF自体を、またはH鎖、L鎖分離後に、適切な蛋白分解酵素例えばアクロモ
バクタープロテアーゼI(リジルエンドペプチダーゼ)で分解し、生成するペプ
チド断片を例えば逆相高速液体クロマトグラフィーで分離したのち、各ペプチド
を上記と同様にしてアミノ酸配列分析すればポリペプチド内部のアミノ酸配列を
知ることができる。これらのアミノ酸配列からDNA塩基配列を推定しオリゴヌ
クレオチドを作成しやすい配列を選定して、そのオリゴヌクレオチド、例えば、
後述の実施例に示すようなオリゴヌクレオチドを合成してプローブとして使用す
る。hHGFをコードする遺伝子をスクリーニングするcDNAライブラリーと
しては、人由来の肝臓cDNAライブラリー、脾臓cDNAライブラリー、胎盤
cDNAライブラリー、等が利用できる。これらのライブラリーはクローンテッ
ク社より販売されている。特に胎盤cDNAライブラリーが望ましい。その他h HGFを発現している細胞株、及び組織材料から常法に従ってcDNAライブラ
リーを作成してもよい。このようなcDNAが組み込まれたλファージをManiat
isらの方法(「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、56頁−73頁(1982))により大腸菌に感染させ培養する。形
成されたプラークをhHGFの一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から
作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼーション
法(「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー
、320頁−328頁(1982))に従って選択することにより、容易に目的
とするhHGFのアミノ酸配列の一部と同じアミノ酸配列を有しなおかつhHG
Fのアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異なる
λファージクローンをいくつか得ることができる。さらに上記スクリーニング陽
性のプラークからManiatisらの方法(「モレキュラークローニング」、コールド
スプリングハーバーラボラトリー、76頁−79頁(1982))によりファー
ジを増殖させ、そのものからグリセロールグラヂエント法にしたがってDNAを
精製し適切な制限酵素例えばEcoRI等で切断後、pUC18,pUC19等
のプラスミドベクターあるいはM13mp18,M13mp19などの一本鎖フ
ァージベクターにcDNAをサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ
法(プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
ユー・エス・エー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)745463(1977))
に従って目的cDNAセグメントの塩基配列を決定することができる。得られた
クローンの塩基配列を解析しそれらを統合することにより(第3図)hHGFの
一部をコードするcDNAクローン群によって、第1図に示すhHGFの全アミ
ノ酸配列の全てに対応する遺伝子を得ることができる。かくして得られるcDN
Aの発現は、例えば、該DNA群をその塩基配列の順番がhHGFのアミノ酸配
列に従う形でつないでそれらhHGFの全領域を含むDNA断片としこれをpC
DL−SRα296等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンAT
Gとフェーズを合わせて接続して蛋白質発現用プラスミドを形成し、該プラスミ
ドで形質転換された動物細胞の宿主内等で行うことができる。次いで、常法に従
い発現された蛋白質を回収することにより本発明のHGFを得ることができる。 上記発現用プラスミドとしては、工業的生産のためには、安定した宿主−ベクタ
ー系を構築することが望ましい。例えば、特願平1−115831号に記載されている
ようなものが挙げられる。具体的には、大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とする
ときは、プロモーター、リボゾーム結合配列、hHGF遺伝子、転写終結因子、
及びプロモーターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。プロモーターとし
ては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン(trp),ラクトースオペロン
(lac)、リボプロテインのプロモーター(lpp)等が挙げられ、また、t
ac(trp:lac),trc(trp:lac),pac(ファージ:大腸
菌)等のハイブリッドプロモーターでもよい。hHGF遺伝子としてはシグナル
配列に相当する部分を除去したものが好ましいが、シグナル配列に相当する部分
を含むものでも産生されるプレ体からシグナル配列を除くことによってhHGF
を得ることが出来る。使用するプラスミドとしては、大腸菌や枯草菌で多コピー
数になるプラスミド、例えばpBR322系プラスミド、pUB110系プラス
ミド等が望ましい。通常の方法により形質転換された大腸菌、枯草菌などは、通
常の培地を用いて15−42℃で培養すればよい。酵母を宿主とする場合は、酵
母由来のプロモーター、例えばピルビン酸キナーゼ(pYK),ホスホグリセロ
キナーゼ(pGK)等の配列の支配下にhHGF遺伝子を接続し、酵母内に導入
して30℃前後で培養すればよい。 しかしながら、天然のhHGFは糖蛋白であることを考慮すると、宿主としては
動物細胞が望ましい。また、動物細胞を宿主とする場合はシグナル配列に相当す
る部分を含むhHGF遺伝子を導入することにより、シグナル配列が除かれたh
HGFが分泌生産されるという利点が期待される。シグナル配列としてはhHG
Fの本来のシグナル配列以外にもヒト血清アルブミン、インターフェロン、ヒト
・アミラーゼ等のシグナル配列を利用してもよく、その場合は本来のシグナル配
列をコードするDNA断片にかえて、それらのシグナル配列に相当する塩基配列
のDNA断片を5’側に置換すればよい。動物細胞を宿主とする場合、プロモー
ターとしては、SV40後期プロモーター、アポリポプロテインE遺伝子のプロ
モーター、アポリポプロテインA1遺伝子のプロモーター、熱ショック蛋白遺伝
子のプロモーター、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター、HSVTKプロモ ーター、アデノウイルスのプロモーター、レトロウイルスのLTR等が挙げられ
るが、SV40プロモーター及びメタロチオネイン遺伝子のプロモーターが好ま
しい。発現ベクターには、hHGF遺伝子の下流にポリアデニル化部位が含まれ
る。ポリアデニル化部位の具体例としては、SV40 DNA,β−グロビン遺
伝子またはメタロチオネイン遺伝子に由来するものが挙げられる。また、β−グ
ロビン遺伝子のポリアデニル化部位及びSV40 DNAのポリアデニル化部位
が連結したものであってもよい。発現ベクターは、形質転換体の選択マーカーを
有していてもよい。発現ベクター中に選択マーカーがなくても、二重形質転換に
より、形質転換された動物細胞を選択できる。このような選択マーカーとしては
、メトトレキセート耐性を与えるDHFR遺伝子、HAT培地中での形質転換t
k-株の選択を可能とするヘルペス・シンプレックスウイルス(HSV)のtk
遺伝子、3’−デオキシストレプタミン抗生物質G418に対する耐性を付与す
る大腸菌のトランスポゾンTn5からのアミノグリコシド3’−ホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、重層増殖によるウシパピローマウイルス遺伝子、aprt遺
伝子等が挙げられる。また、二重形質転換法により、発現ベクターで形質転換し
た動物細胞を選択するには、上記した選択マーカーとなる遺伝子を含有するプラ
スミドその他のDNAを発現ベクターと一緒に形質転換し、選択マーカーの発現
による上記した表現形質により、形質転換細胞を選択出来る。発現ベクターは、
大腸菌等の細菌由来の複製開始点を有するプラスミド断片を有すると、細菌中で
のクローニングも可能となり有利である。このようなプラスミド断片としてはp
BR322、pBR327、pML等のプラスミド断片が挙げられる。発現ベク
ターに使用されるプラスミドベクターの具体例としては、SV40初期プロモー
ター、ウサギのβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列DNA,ウサギの
β−グロビン遺伝子からのポリアデニル化部位、SV40初期領域からのポリア
デニル化部位並びにpBR322からの複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子
を含有するpKCR,pKCRのpBR322部分をpBR327で置換し、ウ
サギβ−グロビン遺伝子のエクソン3中に存在するEco R1部位をHind
III 部位に変えたpKCR H2、BPV遺伝子及びメタロチオネイン遺伝子を
含有するpBPV MT1等が挙げられる。発現ベクターで形質転換される動物 細胞としては、CHO細胞、COS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、
マウスFM3A細胞等が挙げられる。発現ベクターの動物細胞への移入はトラン
スフェクション法、マイクロインジェクション法等により行われるが、その中で
は、リン酸カルシウム法が最も一般的である。移入により形質転換された動物細
胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、MEM,RPMI1640などが一般的である。 産生されたhHGFの分離精製は、劇症肝炎患者血漿からの精製と同様に、ヘパ
リン・セファローズやハイドロキシアパタイト等を用いたカラムクロマトグラフ
ィーにより行うことが出来る。 (発明の効果) 本発明に係わるhHGFをコードする遺伝子は常法により発現ベクターに導入す
ることによって、これを鋳型とする発現によりhHGFまたはhHGF様物質あ
るいはこれを含む融合蛋白を得ることができる。得られる組換えhHGF,hH
GF様物質あるいはhHGFを含む融合蛋白は肝再生促進剤、肝機能改善剤、肝
炎治療剤あるいは肝硬変抑制剤等肝疾患の治療薬となる可能性がある。 (実施例) 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、その要旨を越えない限
り、以下の実施例に限定されるものではない。 実施例1 〔1〕hHGFの部分アミノ酸配列決定及びプローブの作製 劇症肝炎患者血漿より、J.Clin.Invest.,81,414(1988)に記載された方法に従っ
てhHGFを精製した。これをSDS−PAGEにかけたところ、非還元条件下
では、分子量76000-92000 の位置にややブロードな単一バンドが現れ、還元条件
下では、分子量56000-65000 のややブロードなバンドと分子量32000-35000 のバ
ンドの2つのバンドが現れた。この精製hHGF50μgを5モル濃度の尿素を
含有するpH9の50ミリモル濃度のトリス塩酸緩衝液100μlに溶解し、こ
れに、hHGFに対しモル比で1/200 に相当するアクロモバクタープロテアー
ゼIを加えて37℃で6時間反応させた。生成したペプチド混合物は常法により
還元カルボキシメチル化したのち、J.T.Baker 社製Bakerbond WP Octyl Colum n を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離して、各ペプチドを分取
した。 6つのペプチドについて気相プロテインシーケンサー(Applied Biosystems社Mo
del470A)を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示すような配列が
見いだされた。 〔2〕hHGFの一部をコードするcDNAのスクリーニング (1)プラークハイブリダイゼーション スクリーニングを行うλファージcDNAライブラリーとして34週齢のヒト胎
盤由来のcDNA(クローンテック社)のスクリーニングを説明書に従って行っ
た。100万クローンのファージを大腸菌Y−1090株に感染させ24.5cmx
24.5cmのシャーレ中のNZY軟寒天培地〔NZY培地;1%NZ−アミン、
0.5%イーストイクストラクト、0.5%塩化ナトリウム、pH7・5に調整し0.25
%塩化マグネシウムを加えたもの、NZY軟寒天培地;NZY培地に 0.7% になるように寒天沫を加えオートクレイブしたもの〕中で1枚あたり20万クロ
ーンの割合で5枚分を42℃で一晩培養した。次に培地中のλファージクローン
を市販のナイロン膜であるジーンスクリーニングプラス(デュポン社)上に移し
取り、以下に説明するプラークハイブリダイゼーションを行った。即ち、1枚の
シャーレあたりナイロン膜2枚の割合でファージ粒子を移し取り、その様にして
できたナイロン膜を 0.1M水酸化ナトリウム− 1.5M塩化ナトリウムが染み込ん
だろ紙上に2分間静置し別に用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、次に、同
様に2xSSCP(2倍の濃度のSSCP溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。10 x SSCP; 1.2M塩化ナトリウム、150mMクエン酸ナトリウム
、130mM燐酸二水素カリウム、1mMEDTA pH7.2)− 0.2Mトリス
−塩酸(pH7.4)を染み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し乾いたろ紙上
で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した。こうして処理したナイロン膜は、3
xSSC(20倍の濃度のSSC溶液;3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナ
トリウム)− 0.1% SDSで60℃15分間2回洗浄し、次にナイロン膜1枚
当り5 mlのプレハイブリダイゼーション液〔3xSSC、0.1%SDS、10xD
enhardt’s(50倍の濃度のDenhardt’s溶液;1%BSA(
牛血清アルブミン)1%ポリビニルピロリドン、及び1%フィコール400)、
20μg/ml鮭***DNA〕に65℃3時間浸した。次に、表1のペプチド4、
すなわち Asn-Met-Glu-Asp-Leu-His-Arg-His-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro-Asp-Ala-Se
r-Lys のうちのAsn-Met-Glu-Asp-Leu-His およびHis-Ile-Phe-Trp-Glu-Pro を基
に合成オリゴヌクレオチドを作成した。即ち、前述のアミノ酸配列の順に17塩
基64種類のTH23(5’−T−G−T/C/A/G −A−A/G −A/G −T−C−T/
C −T−C−C−A−T−A/G −T−T−3’)、17塩基24種類のTH24
(5’−G−G−T/C −T−C−C−C−A−A/G −A−A−A/G/T −A−T−
A/G −T−G−3’)を作成した。これらを常法に従いポリヌクレオチドキナー
ゼによりその5’末端を反応液〔50mMトリス−塩酸pH7.6、10mM塩化マ
グネシウム、10mMメルカプトエタノール、100μM〔γ32P〕ATP、基質D
NA〕中で32P標識した後、常法に従いDEAEセルロースカラムをかけて余分
なモノヌクレオチドを除いた。こうしてできあがった32P標識合成オリゴヌクレ オチドプローブを含むハイブリダイゼーション液〔3xSSC、10xDenha
rdt’s、50μg/ml鮭***DNA1M塩化ナトリウム、1%SDS、250μg
/ml鮭***DNA、合成プローブ1種類当り10万c.p.m./ml32P標識プローブ
DNA〕中で前述のフィルターをプローブに応じAまたはTを2℃に、Gまたは
Cを4℃に置き換えて全ての塩基を合計した温度、実際はプローブにより42℃
(TH23)46℃(TH24)で36時間保温した。その後、ナイロン膜を取
り出し、4xSSC溶液中で室温で30分間2回洗い、4xSSC溶液でハイブ
リダイゼーションの時と同じ温度で30分間2回洗った後2xSSC溶液で室温
で15分間2回洗い、オートラジオグラフィーをとった。 2枚1組のナイロン膜のオートラジオグラフィー上のシグナルが一致したものは
6個あった。得られたシグナルに相当するクローンを単離するために、これらシ
グナルと一致する軟寒天培地上のプラークをガラス管で打ち抜き50μlのクロ
ロフォルム存在下1mlのTMG緩衝液〔50mMトリス−塩酸pH7・5、1
00mM塩化ナトリウム、10mM塩化マグネシウム及び0・01%ゼラチン〕
中でファージ粒子を一晩抽出し再び大腸菌Y−1090株に感染させ9cmシャ
ーレ中で適当量培地し前述の方法でプラークハイブリダイゼーションを行った。
この一連の操作を繰り返すことによりシグナルに相当するクローンを各々単離す
ることができた。その結果独立した6個のクローンを得た。そのうち2個のクロ
ーン、すなわちλhHGF21とλhHGF502について、含まれるcDNAの塩基配
列を解析した。 (2)cDNA断片のサブクローニング及び塩基配列の決定 これらのλファージクローンから以下のようにDNAを抽出しプラスミドベクタ
ーpUC18、pUC19及び一本鎖ファージベクターM13mp18,M13
mp19にサブクローニングをおこなった。即ち、500ml三角フラスコ中の 20
0mlのNZY培地中において、200μlのTMG溶液に懸濁してあるλファージ
クローン2 x 107 p.f.u.(p.f.u.;プラーク形成単位)と40μlの大腸
菌Y−1090株2 x 108を37℃15分置くことにより感染させた。15
分後さらに1mlの1M塩化カルシウムを加え一晩、概ね14時間ほど培養した
。次に、2mlのクロロフォルムを加え10分ほど置き、15.8gの塩化ナトリウ ムを加え溶かし、それらを4℃において日立冷却遠心機SCR20BBで、ロー
ターRPR9−2を用いて6000回転20分間遠心した上清に20gのポリエチ
レングリコール6000を加えて十分に溶解した後に氷中で1時間静置した。こ
れを日立冷却遠心機SCR20BBで、ローターRPR9−2において6000
回転20分間遠心し沈澱を6mlのA緩衝液〔0.5%NP40、36mM塩化カル
シウム、30mMトリス−塩酸pH7・5 50mM塩化マグネシウム、125mM塩
化カリウム、0.5mMEDTA、0.25%デオキシコール酸、0.6mMメルカプトエ
タノール〕に懸濁しここに 100μlの10mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ
Iと10μlの10mg/mlのリボヌクレアーゼAを加え30℃で30分間保温す
ることにより大腸菌由来の核酸を分解した。その後上記反応液に等量のクロロフ
ォルムを加え良く攪はんしたのちにトミー遠心機LC−06、ローターTS−7
で3000回転10分間遠心し上清を得た。 一方予め日立超遠心機ローターRPS40T用遠心管に40%グリセロール溶液〔
0.5%NP40、30mMトリス−塩酸pH7・5、125mM塩化カリウム、0.5m
MEDTA、0.6mMメルカプトエタノール、10%グリセロール〕を1ml入れ
ておきその上に3mlの10%グリセロール溶液〔0.5%NP40、30mMトリス
−塩酸pH7・5、125mM塩化カリウム、0.5mMEDTA、0.6mMメルカプ
トエタノール、40%グリセロール〕を重層して準備しておいた上に先ほどのヌク
レアーゼ処理をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機70P72、ロータ
ーRPS40Tで35000回転1時間遠心する。遠心後沈澱として落ちてきた
ファージ粒子を 0.4mlの40mMトリス−塩酸pH7・5、10mMEDTA、
2%SDSに懸濁し4μlの10mg/mlのプロテナーゼKを加えて55℃1時
間保温を行った。その後溶液をエッペンドルフチューブに移し等量のフェノール
/クロロフォルムにてファージDNAを抽出しエタノール沈澱を行うことにより
目的とするファージDNAを 200μg得ることが出来た。このファージDNAを
制限酵素EcoRIで常法で従い切断しアガロース電気泳動法にて解析した。そ
の結果クローンλhHGF21から0.2kbと0.85kbと0.72Kbの3本
のEcoRI断片を得た。一方アガロースゲルから該インサートcDNA断片を
常法に従い回収することにより目的とするcDNA断片を得ることが出来た 。これらcDNA断片 100ngを予め常法に従い制限酵素EcoRIによって切
断しておいたプラスミドベクターpUC18、pUC19及び一本鎖ファージベ
クターM13mp18,M13mp19 200ngと10μlの反応液〔66mMト
リス−塩酸pH7.6、6.6mM塩化マグネシウム、10mMジチオスレイトール
、66μMATP、基質DNA〕中でユニットのT4DNAリガーゼにより結合し
それぞれのベクターに見合った宿主の大腸菌を常法に従い形質転換することによ
りEcoRI挿入部位にHGF蛋白質の部分配列を持つサブクローンを得た。得
られたcDNAサブクローンの塩基配列の決定は、Sangerらのジデオキシ法によ
って行った。プライマーは市販のM13ファージベクターに対応するものを使用
した。その結果、最も長いcDNAを持つクローンλhHGF21の塩基配列をアミ
ノ酸に翻訳すると第1図に示すようにすでに明らかにされているアミノ酸配列の
うちプローブの設計に使用したアミノ酸配列とは異なる領域のアミノ酸配列のう
ちのいくつかを含んでいることが判明し、このクローンがhHGFの少なくとも
一部分の領域を含むcDNAであることが判明した。また、λhHGF21にはない
cDNA断片を含むクローンλhHGF502のcDNAの塩基配列をSanger法に従
い解析した結果、クローンλhHGF502はクローンλhHGF21と同じ塩基配列を
第2図で示す制限酵素切断部位NcoIの近傍から5’上流から数えて三番目の
EcoRI切断部位の近傍までの0.8kbの長さで共有し3’側にλhHGF21
にはない0.7kbの塩基配列をもつことがわかった。λhHGF502の塩基配列
のうちλhHGF21の有しない塩基配列のなかには既に解析されているアミノ酸配
列に相当する塩基配列があることが判明した。これら2つのクローンの塩基配列
を一部が重複する形でつなぎあわせるとhHGFのアミノ酸配列の全てをカバー
することが判明した。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明のhHGFのアミノ酸配列を表す。図中、下線はすでに明らか
にされていたアミノ酸配列を示す。 第2図は、実施例1で得られた本発明のhHGFをコードする遺伝子を含むcD
NAの塩基配列を表す。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。また下線は
すでに明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示しそのうち二重下線は 最初のクローンを得る際に使用したプローブに対応するアミノ酸配列を表す。
にされていたアミノ酸配列を示す。 第2図は、実施例1で得られた本発明のhHGFをコードする遺伝子を含むcD
NAの塩基配列を表す。図中に主な制限酵素の認識部位を併記した。また下線は
すでに明かにされていたアミノ酸配列に対応する部分を示しそのうち二重下線は 最初のクローンを得る際に使用したプローブに対応するアミノ酸配列を表す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)下記のアミノ酸配列で表されるシグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子の
全アミノ酸配列をコードすることを特徴とする遺伝子。 (2)下記の塩基配列で表される、シグナル配列を含む肝実質細胞増殖因子の全
アミノ酸配列をコードすることを特徴とする遺伝子。
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TW302369B (ja) | ||
CA2022752C (en) | Hepatic parenchymal cell growth factor, gene encoding the same, process for producing the factor, and transformants producing the factor | |
JPH11503901A (ja) | インターロイキン−1β転換酵素様アポトーシスプロテアーゼ−3および4 | |
EA005581B1 (ru) | ПОЛИПЕПТИДЫ ЦИТОКИНА Zcyto10 ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ И АНТИТЕЛА К УКАЗАННЫМ ПОЛИПЕПТИДАМ | |
JPH02460A (ja) | ポリペプチドおよびその製造法 | |
AU665199B2 (en) | Vitamin K-dependent carboxylase | |
MXPA06012321A (es) | Derivados c3 del complemento humano con funcion similar al factor de veneno de cobra. | |
Higgins et al. | Interleukin 1 beta propeptide is detected intracellularly and extracellularly when human monocytes are stimulated with LPS in vitro. | |
EP0990703B1 (en) | Novel polypeptide, dna encoding the same and use thereof | |
JP2577091B2 (ja) | 肝実質細胞増殖因子及びそれをコードする遺伝子 | |
JP2859577B2 (ja) | 肝実質細胞増殖因子 | |
JP2980889B2 (ja) | 肝実質細胞増殖因子 | |
JP2980888B2 (ja) | 肝実質細胞増殖因子をコードする遺伝子 | |
JP2577091C (ja) | ||
US6664383B1 (en) | Polypeptides, cDNA encoding the same and utilization thereof | |
WO1999055863A1 (fr) | Nouveau polypeptide, adnc le codant et son utilisation | |
JP2515975B2 (ja) | 抗腫瘍作用を有するポリペプチド | |
JP2676341B2 (ja) | B細胞分化因子の製造法 | |
JPH11187882A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするcDNA、そのcDNAからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 | |
CA2413754C (en) | Canine hepatocyte growth factor | |
JPH09500017A (ja) | 血小板糖蛋白v遺伝子と使用 | |
JPH09505733A (ja) | エンドテリン変換酵素 | |
AU758898B2 (en) | Human deadenylating nuclease, its production and its use | |
Kawooya et al. | The expression, affinity purification and characterization of recombinant pseudomonas exotoxin 40 (pe40) secreted from escherichia coli | |
JPS63270697A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子関連蛋白質 |