JP2572931B2 - 美白剤 - Google Patents
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Description
して知られているアンジオジェニンを有効成分とする美
白剤に関する。
してアンジオジェニンが知られている。この物質は血管
形成因子の一つであり、フェットらにより、ヒトの癌性
細胞からヒトのアンジオジェニンが分離された(J.W.Fet
t ,et al.,Biochem,vol.24,5480-5486,1984)。ヒトのア
ンジオジェニンは分子量14,400の蛋白質であるこ
とが知られている。その後ストリドムらによりアンジオ
ジェニンの全アミノ酸配列が決定されている(Strydom,B
iochemistry,vol.24,5486-5494,1985)。アンジオジェニ
ンは血液、乳中にも存在しており、ボンドらはウシアン
ジオジェニンを牛の血液から分離しており(Bond et a
l.,Biochem. vol.27,6282-6287,1988)、またスピックは
牛乳中のアンジオジェニンを単離し(Spik.G et al.,Bio
chem. vol.28,6110-6113,1989)このアミノ酸配列を決定
している。特開平2-296000号公報には牛乳から陽イオン
交換クロマトグラフィーに吸着後弱有機酸のアルカリ金
属塩水溶液で溶出し、この溶出液を再度陽イオン交換ク
ロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーにより
回収する方法が開示されている。このようにして得られ
たアンジオジェニンについて生理的活性の検討が進めら
れている。
なものは、上記に述べた血管形成活性である。この作用
によりアンジオジェニンは外傷、潰瘍、臓器移植、循環
機能不全などの疾患への使用が示唆されているが、この
ような作用以外はあまり知られていない。また特開平4
─210618にはアンジオジェニンを育毛剤に使用す
る例が開示されている。
け等による組織中のメラニンの産生に起因している。メ
ラニンは、初めにチロシンがチロシナーゼにより酵素的
に酸化され、その後数段階の反応を経て形成されること
が知られており、このチロシナーゼを阻害することによ
り、皮膚のシミやそばかすの発生を押さえることができ
ることが確認されている。これまでにアルブチン、コウ
ジ酸やカゼインの加水分解物などにこのような阻害作用
が存在することが確認されており、皮膚美白剤として使
用されている。現在も、このような皮膚美白剤として使
用可能な種々の物質の探索がすすめられている。
ニンの生理活性について検討を進めた結果、従来報告さ
れていた活性に加えて、アンジオジェニンはメラノーマ
細胞であるB−16細胞のメラニン産生を特異的に抑制
することを初めて見出した。本発明はこのような知見に
基づいてなされたもので、アンジオジェニンを有効成分
とする皮膚美白剤の提供を課題とする。
ジオジェニンはどのような由来、どのような種由来のも
のであっても使用可能である。たとえば、ヒトおよびウ
シ由来のアンジオジェニンはすでにその遺伝子配列が明
らかになっており、遺伝子組換えによる製造方法が可能
であるが、このような遺伝子組換えにより生産されたも
のであっても差し支えない。またアンジオジェニンは上
述したように、ウシ初乳中に比較的大量に含有されてお
り、乳から回収したものであっても良い。さらにアンジ
オジェニンは、細胞培養の培養液から回収することも可
能である。特表昭62─502544号公報には、細胞
培養液から回収したアンジオジェニンの例が記載されて
いるが、このような細胞由来のものであっても使用可能
である。
したアンジオジェニンを使用し、皮膚美白剤を調製する
方法、及び調製した美白剤について、以下に開示する
が、乳由来のアンジオジェニンに限定されるものではな
い。乳からアンジオジェニンを得る方法の一例をあげ
る。アンジオジェニンを含有する乳としては、ヒト、ウ
シ、ヤギ、ヒツジなど分娩後1〜7日以内、特に好まし
くは、分娩後1〜5日以内の初乳がアンジオジェニン画
分の含量も高いため適しているが、これら以外の動物
乳、あるいは、通常の泌乳期の乳であっても本発明の原
料として使用可能である。本発明では、まずこれらの乳
を脱脂処理後、ラクトフェリン、ラクトパーオキシダー
ゼ(LPO)を選択的に吸着する作用を有する硫酸化多
糖体と接触させ、ラクトフェリン、LPOを硫酸化多糖
体に吸着させる。この際にアンジオジェニンが同時に吸
着される。
ネート、スルフォン化セルロース、スルフォン化デキス
トラン、スルフォン化キトサンなどが例示できるが、本
発明においてはスルフォン化キトサンが特に好ましい。
スルフォン化キトサンはスルフォン化キトパールの名称
で富士紡績より市販されており容易に入手可能である。
スルフォン化キトパールに導入されたスルフォン基の量
は、担体1ml当たり10〜50μeqに調整されたもの
が好ましく、特に好ましくは担体1ml当たり27〜4
0〜40μeqに調整されたものが良い。担体ゲルは、脱脂
乳容量の約0.5〜5%を用いて吸着操作を行う。吸着
操作は、バッチ処理や担体を充填したカラムに脱脂初乳
を通液する方法など種々の方法を採用できるが、特開平
3─109400号公報に開示された回転型カラムを用
いた循環法により吸着操作を行うことが吸着効率も高く
好ましい。担体はその後イオン強度0.2以下、pH5
以下の水溶液もしくは緩衝液を用いて洗浄し、担体の間
につまった不純物を洗浄する。洗浄後、担体をイオン強
度0.5以上、pH5以上、好ましくはイオン強度0.
7〜2.0でpH6〜8の水溶液または緩衝液で吸着画
分の溶出を行う。
るため脱塩処理を行う。脱塩処理としては、透析、イオ
ン交換、分子篩による脱塩などの方法により処理でき
る。50kD以下の分子量画分を限外濾過膜により除去
する工程を採用することにより、脱塩、濃縮、アンジオ
ジェニン含有の精製を同時に行いうる。限外濾過は電気
伝導度、硫酸イオン濃度を指標とすることにより、脱塩
効果を判定できる。電気伝導度400μs/cm、硫酸イオ
ン濃度0.29%( 全固形分当たり) 以下となった段階
で限外濾過を終了させる。以上の操作により、アンジオ
ジェニン含有画分を回収することができる。この画分は
乾燥処理により粉末化することができる。しかしアンジ
オジェニンの失活をふせぐためには可能な限り低温条件
での乾燥、例えば凍結乾燥等の処理を行うことが望まし
い。
しくは2〜3Mのチオシアン酸ナトリウムを含む少量の
Tris-HCl緩衝液(pH7.0)に溶解する。チオシアン
酸ナトリウムは本発明の有効成分であるアンジオジェニ
ンを溶解させるために必須の要件である。溶解した試料
は遠心分離もしくは濾過により不溶解物を除き、ついで
最終濃度が50〜80%になるように冷却したエタノー
ルを加える。この溶液を−40℃で1 時間放置若しくは
5℃以下で1 昼夜放置した後、生じた沈殿を除去する。
エタノール沈殿相にはアンジオジェニンと挙動をともに
するラクトフェリンおよびLPOが移行し、アンジオジ
ェニンのみがエタノール相に残る。アンジオジェニンの
含まれる上清は、濃縮後透析等の脱塩処理を行いアンジ
オジェニンを高含量で含む画分を回収する。この画分は
必要によっては凍結乾燥処理を行うことができる。 回
収した画分がアンジオジェニンであることの確認は、ボ
ンドらの方法(Bond M. D.,Analytical Biochemmistry,
vol.173,166-173,1988) によるリボヌクレアーゼインヒ
ビターに対する阻害活性を確認することで行う。また必
要におうじて、得られた画分のN 末端アミノ酸配列をア
ミノ酸シーケンサーを用いて分析し、アミノ酸配列から
確認することができる。
%(重量%)以上、好ましくは0.01〜20%濃度の
アンジオジェニンを含有している。アンジオジェニンを
含有する皮膚美白剤は従来使用されている化粧料基材を
用いて常法により、クリーム、乳液、化粧水等の適当な
形態で製造することができる。またこの美白化粧料は、
紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、アルブチンなどのメラニ
ン合成抑制剤、その他の薬効成分、増粘剤、可塑剤、着
色料、香料等の任意の公知の添加物を含有させることが
できる。またアンジオジェニンは、皮膚に対する毒性も
刺激もなく、副作用もないことを確認している。以下に
本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
り脱脂乳とした。この脱脂乳200l (14℃に冷却)
を、スルフォン基導入量38.9μeq/ml・ゲルのス
ルフォン化キトパールSU-3( 富士紡績製) を882ml
を充填した内容積1474mlの回転型吸着装置( 東京
理化製) に通液した。通液速度は25kg/時間とし、
2回繰り返して通液した。回転型反応装置の回転数は3
0rpmに調整した。 (2)次いで30〜35℃の温湯40lを(1)と同様
に通液し、洗浄を行った。洗浄は280nmの吸光度を
測定し、吸光度が光路長1cmのセルを用いて測定した
場合、0.01以下になることを確認し、洗浄を終了させ
た。
の炭酸水素ナトリウム ,pH7.0に溶解して調製す
る) 約67.5lを(1)と同様な条件で通液し、溶出
を行った。溶出は280nmの吸光度を測定し、吸光度
が光路長1cmのセルを用いて測定した場合、0.01
5〜0.020になることを確認した。溶出液66.5
kgを回収した。この回収液の電気伝導度は26.5m
s/cmであった。 (4)この工程で得た溶液を、50kDのUF膜をセッ
トした限外濾過装置を用いて限外濾過濃縮を行った。濃
縮液の電気伝導度及び硫酸イオン濃度を測定し、電気伝
導度400μS/cm、硫酸イオン濃度0.29%( 全
固形分当たり) になった時点で濃縮操作を終了し、アン
ジオジェニンを含む画分を回収した。ついでこの画分を
凍結乾燥処理し、乾燥粉末9.11gを得た。 (5)上記(4)で得たアンジオジェニンを含む画分7
20mgを3Mチオシアン酸ナトリウムを含む10mM
Tris-HCl 緩衝液(pH7.0)100mlに溶解させ
た。溶解後、1000r.p.m.で30分間遠心分離
を行い不溶解物を除去した。 (6)次いでこの上清に、エタノール濃度が80%にな
るように冷却したエタノールを加えた。約−40℃で1
時間放置後遠心分離を行い、沈殿を除去した。 (7)この沈殿を除去したのち、上清をロータリーエバ
ポレーターに移し、液量が80mlになるまで濃縮し、
濃縮液を透析チューブに移し、蒸留水に対し1晩透析を
行い、ついで凍結乾燥を行った。このようにしてアンジ
オジェニン約9mgを回収した。
脱脂乳100lを得た。以下の操作を実施例1(1)〜
(7)と同様に行い、アンジオジェニン約200mgを
得た。
化粧料の配合例を示す。 (1)化粧水(油性) ソルビトール(70%) 3.0g グリセリン 5.0g アンジオジェニン 0.2g 水 70.0g これらの成分の混合溶解液に、 アラントイン 0.1g ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体 0.5g エタノール 20.0g 香料 適量 の混合溶液を攪拌しながら加えて均一な溶液とし、皮膚
美白効果を有する化粧水を得た。
美白効果を有する化粧水を得た。
を有する洗顔クリームを得た。
し、皮膚美白効果を有する油性クリームを得た。
のアンジオジェニンのメラニン産生抑制活性について説
明する。 (1)生物活性の測定 24穴カルチャープレート(culture plate)にマウスメ
ラノーマB16細胞を1×105 /ml/wellの密
度で播種し、37℃、5% CO2 の培養条件で24時
間インキュベートした。次いで、ウエル当たりで5μg
/mlの濃度になるように10%ウシ胎児血清(FC
S)を含有したダルベッコ変法イーグル培地(DME
M)で調製したアンジオジェニン溶液、およびこの溶液
を原液としてDMEMで二倍段階希釈したアンジオジェ
ニン溶液を1mlずつ、各ウエルに加えた。またメラノ
ーマ細胞のメラニン産生を抑制し、皮膚の美白効果を有
することが知られているアルブチンを終濃度50μMに
なるようにDMEMで調製し、陽性対照として同様に1
ml添加した。その後、カルチャープレートをさらに3
7℃、5% CO2 の培養条件で6日間インキュベート
した。6日経過後、DMEMのみを添加したウエルをコ
ントロールとして、各濃度のアンジオジェニンを添加し
たウエル、およびアルブチンを添加したウエルの吸光度
を測定した。次の数1式により、各ウエルのメラニン産
生抑制活性を求めた。
ウエルのメラノーマ細胞のメラニン産生抑制活性を表1
に示す。
の濃度においても、強いメラニン産生抑制を示した。
含有する皮膚美白剤が提供される。本発明による美白剤
は、細胞を用いた試験においても、細胞の成育にはなん
の影響も与えないことから、安全で、美白効果の高いこ
とが判明した。
Claims (2)
- 【請求項1】アンジオジェニンを有効成分とする美白
剤。 - 【請求項2】アンジオジェニンが乳由来である請求項1
記載の美白剤。
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