JP2566327B2 - 細胞の病的変化を検出する方法 - Google Patents
細胞の病的変化を検出する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は，細胞の病的変化（pathology）を検出する
インビトロ法に関し，さらに詳しくは細胞骨格の分解産
物をモニターして細胞の壊死を測定する分析法に関す
る。
インビトロ法に関し，さらに詳しくは細胞骨格の分解産
物をモニターして細胞の壊死を測定する分析法に関す
る。
本発明は,AFSOR契約No.86−0099（P.I.:Lynch）,NIH
補助金No.NS−18427およびNIA補助金NO.AG00538に基づ
く政府の援助を得て完成された。政府は本発明に対する
所定の権利を有する。
補助金No.NS−18427およびNIA補助金NO.AG00538に基づ
く政府の援助を得て完成された。政府は本発明に対する
所定の権利を有する。
細胞の構造的完全性は細胞骨格によって部分的に維持
される。細胞骨格は主としてタンパクからなる網状構造
であり，細胞の内側表面に隣接して存在する。多くの細
胞腫（部分的なリストには，神経細胞，リンパ球，腎
臓，肝臓，心筋および平滑筋，ならびに血小板が含まれ
る）の細胞骨格は，脳スペクトリン（フォドリン（fodr
in）としても知られている）と同一のタンパク，あるい
は非常に関連性の高いタンパクを多量に含んでいる。カ
ルペイン（calpain）は，高レベルのカルシウム存在下
で，スペクトリンを分解して，それによって細胞骨格の
破壊をもたらす酵素である。
される。細胞骨格は主としてタンパクからなる網状構造
であり，細胞の内側表面に隣接して存在する。多くの細
胞腫（部分的なリストには，神経細胞，リンパ球，腎
臓，肝臓，心筋および平滑筋，ならびに血小板が含まれ
る）の細胞骨格は，脳スペクトリン（フォドリン（fodr
in）としても知られている）と同一のタンパク，あるい
は非常に関連性の高いタンパクを多量に含んでいる。カ
ルペイン（calpain）は，高レベルのカルシウム存在下
で，スペクトリンを分解して，それによって細胞骨格の
破壊をもたらす酵素である。
様々な細胞傷害（例えば，毒素，酸素欠乏症など）お
よび疾患状態（例えば，アルツハイマー病，パーキンソ
ン病，筋ジストロフィー症）が細胞の変質および死を引
き起こす。しかし，多くの場合，変質の効果が不可逆に
なってはじめて，傷害が発生していることを測定し得
る。したがって，変質現象を，その発生後であって病的
変化の微候が現れる前に，できるだけ早く検出する確実
な方法が必要とされている。好ましくは，このような方
法は，高い感度，広範囲な適用性，および実施の容易さ
を備えていなければならない。本発明は，この要求を満
足させると共に，関連する利点を提供する。
よび疾患状態（例えば，アルツハイマー病，パーキンソ
ン病，筋ジストロフィー症）が細胞の変質および死を引
き起こす。しかし，多くの場合，変質の効果が不可逆に
なってはじめて，傷害が発生していることを測定し得
る。したがって，変質現象を，その発生後であって病的
変化の微候が現れる前に，できるだけ早く検出する確実
な方法が必要とされている。好ましくは，このような方
法は，高い感度，広範囲な適用性，および実施の容易さ
を備えていなければならない。本発明は，この要求を満
足させると共に，関連する利点を提供する。
発明の要旨 本発明は，細胞骨格の成分であるスペクトリンの安定
な分解産物（BDP,あるいは,BDP1およびBDP2と呼ばれ
る）の存在を測定する免疫学的分析法により，細胞の病
的変化を検出する方法を提供する。本発明のある局面で
は，これらの成分は，スペクトリンを含有する細胞の試
料から,BDPおよびスペクトリンが分離されるような方法
で，例えば，電場に曝すことにより，物理的に分離され
る。次いで,BDPに対して反応性を有する抗体を，分離さ
れた試料と接触させ，この試料のうちいずれかのBDPを
含有する部分に，これらの抗体が結合するのを測定す
る。
な分解産物（BDP,あるいは,BDP1およびBDP2と呼ばれ
る）の存在を測定する免疫学的分析法により，細胞の病
的変化を検出する方法を提供する。本発明のある局面で
は，これらの成分は，スペクトリンを含有する細胞の試
料から,BDPおよびスペクトリンが分離されるような方法
で，例えば，電場に曝すことにより，物理的に分離され
る。次いで,BDPに対して反応性を有する抗体を，分離さ
れた試料と接触させ，この試料のうちいずれかのBDPを
含有する部分に，これらの抗体が結合するのを測定す
る。
図面の簡単な説明 第１図.A.内側嗅皮質の片側に損傷を与えて２日後の
反対側（左側のレーン）および同一側（右側のレーン）
の歯状回のブロット試料中におけるスペクトリンの免疫
反応性。矢印は，それぞれ約240KDaおよび約230KDaの見
かけのMrsを有する，スペクトリンのαサブユニットお
よびβサブユニット，ならびに，それぞれ約155KDaおよ
び約150KDaの見かけのMrsを有する２つの付加的な免疫
反応性ペプチド（BDP1およびBDP2）を表す。
反対側（左側のレーン）および同一側（右側のレーン）
の歯状回のブロット試料中におけるスペクトリンの免疫
反応性。矢印は，それぞれ約240KDaおよび約230KDaの見
かけのMrsを有する，スペクトリンのαサブユニットお
よびβサブユニット，ならびに，それぞれ約155KDaおよ
び約150KDaの見かけのMrsを有する２つの付加的な免疫
反応性ペプチド（BDP1およびBDP2）を表す。
B.次の条件下でインキュベートした精製脳スペクトリ
ン。レーン1:添加物なし；レーン2:1mM CaCl2,1.8μg/m
lカルペイン（calpain）I,10分間；レーン3:1mM CaCl2,
3μg/mlカルペインI,30分間；レーン4:損傷を与えて２
日後の,10μｇの歯状回タンパクホモジェネート。レー
ン5:1mM CaCl2,13μg/mlカルペイン,1.25μg/mlコルモ
ドゥリン（colmodulin）,3分間；レーン6:1mM CaCl2,13
μg/mlカルペイン,1.25μg/mlコルモドゥリン,30分間。
ン。レーン1:添加物なし；レーン2:1mM CaCl2,1.8μg/m
lカルペイン（calpain）I,10分間；レーン3:1mM CaCl2,
3μg/mlカルペインI,30分間；レーン4:損傷を与えて２
日後の,10μｇの歯状回タンパクホモジェネート。レー
ン5:1mM CaCl2,13μg/mlカルペイン,1.25μg/mlコルモ
ドゥリン（colmodulin）,3分間；レーン6:1mM CaCl2,13
μg/mlカルペイン,1.25μg/mlコルモドゥリン,30分間。
第２図.BDP1（黒丸）およびBDP2（白丸）のレベル
は，走査反射式自動濃度記録計によって測定された，ス
ペクトリンの全免疫反応性の割合（％）として表されて
いる。
は，走査反射式自動濃度記録計によって測定された，ス
ペクトリンの全免疫反応性の割合（％）として表されて
いる。
第３図．対照マウスおよび斑色（Brindled）マウスの
脳の領域におけるBDPレベルであり，銅を用いた処理に
よる効果を示している。
脳の領域におけるBDPレベルであり，銅を用いた処理に
よる効果を示している。
図4.トリメチルスズを与えたラットの海馬の歯状回お
よびCA1領域におけるBDPレベル。
よびCA1領域におけるBDPレベル。
図5.虚血を起こしたアレチネズミから採取した海馬の
歯状回およびCA1領域におけるBDPレベル。
歯状回およびCA1領域におけるBDPレベル。
好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は，細胞の死および分解を早期に検出する高感
度で効果的な方法に関する。この方法は多くの細胞腫の
細胞骨格の成分であるスペクトリンの安定な分解産物を
認識する抗体を利用する免疫学的検定法を含む。
度で効果的な方法に関する。この方法は多くの細胞腫の
細胞骨格の成分であるスペクトリンの安定な分解産物を
認識する抗体を利用する免疫学的検定法を含む。
スペクトリンはＦ−アクチンを結合させ，それらは共
に，一般的には細胞膜の内側に連結しており，そこで糸
状の網目構造を形成する。脳および他の多くの組織は，
カルシウムに刺激されてタンパク分解活性を発現するも
のであると，いつしか知られている。末梢神経における
変質の研究は，カルペインと呼ばれるカルシウム依存性
プロテアーゼが，脱神経または傷害に引き続いて起こる
神経フィラメントタンパクの分解と，密接に関係してい
ることを示している。カルシウムによる活性化の閾値よ
り区別される，このプロテアーゼの２つの形態が，脳お
よび他の組織において同定されている：カルペインＩ
は，マイクロモルのカルシウムを必要とするのに対し，
カルペインIIは,0.1mMと0.5mMとの間のカルシウム濃度
で活性化される。これら２つの形態は相違して脳に分布
している。カルペインIIが主として脳細胞の細胞質画分
に局在しているのに対し，カルペインＩの活性が最も高
い部分は小さな突起部に見られる。
に，一般的には細胞膜の内側に連結しており，そこで糸
状の網目構造を形成する。脳および他の多くの組織は，
カルシウムに刺激されてタンパク分解活性を発現するも
のであると，いつしか知られている。末梢神経における
変質の研究は，カルペインと呼ばれるカルシウム依存性
プロテアーゼが，脱神経または傷害に引き続いて起こる
神経フィラメントタンパクの分解と，密接に関係してい
ることを示している。カルシウムによる活性化の閾値よ
り区別される，このプロテアーゼの２つの形態が，脳お
よび他の組織において同定されている：カルペインＩ
は，マイクロモルのカルシウムを必要とするのに対し，
カルペインIIは,0.1mMと0.5mMとの間のカルシウム濃度
で活性化される。これら２つの形態は相違して脳に分布
している。カルペインIIが主として脳細胞の細胞質画分
に局在しているのに対し，カルペインＩの活性が最も高
い部分は小さな突起部に見られる。
脳スペクトリンは,DavisおよびBennett（J.Biol.Che
m.258:7757−7766（1983）；参照文献としてここに採用
する）の方法により,90％を越える純度まで精製され得
る。カルペインは,Seubertら（Synapse1:20−24（198
7）；参照文献としてここに採用する）の方法に従っ
て，ラット赤血球の細胞質ゾルから同様の純度レベルま
で精製され得る。
m.258:7757−7766（1983）；参照文献としてここに採用
する）の方法により,90％を越える純度まで精製され得
る。カルペインは,Seubertら（Synapse1:20−24（198
7）；参照文献としてここに採用する）の方法に従っ
て，ラット赤血球の細胞質ゾルから同様の純度レベルま
で精製され得る。
スペクトリン分解産物を同定するために,75μg/mlの
スペクトリンを,100μM CaCl2,3μg/mlカルペインI,20m
Mトリス−Cl,5mMメルカプトエタノール，および150mM N
aCl,pH7.5と共に,30℃にてインキュベートした。その一
部をいくつか取り出し,3X SDS−PAGE緩衝液（150mMトリ
ス−Po4,6％SDS,30％グリセロール,3.75mM EDTA,3％メ
ルカプトエタノール,pH6.8）の1/3容量に加えた。これ
らの試料を,90℃の湯浴中で,3〜10分間加熱し,3〜10％
の濃度勾配ゲル状のSDS−PAGEに供した。ゲルをまずク
ーマシー・ブルーで染色し，次いで７％酢酸で再染色し
た。第１図,Seubertら,Synapse1:20−24（1987）を参照
されたい（これは参考文献としてここに採用する）。ス
ペクトリンが消失するにつれて，約150,000ダルトンの
ペプチドバンドが増大することがわかった。これらのバ
ンドのペプチドは,BDPと呼ばれた。さらなる分解に対す
るBDPの見かけの安定性は，スペクトリンに対する抗体
が，細胞，体液などのような生物学的試料中のBDPを認
識し得ることを示唆した。
スペクトリンを,100μM CaCl2,3μg/mlカルペインI,20m
Mトリス−Cl,5mMメルカプトエタノール，および150mM N
aCl,pH7.5と共に,30℃にてインキュベートした。その一
部をいくつか取り出し,3X SDS−PAGE緩衝液（150mMトリ
ス−Po4,6％SDS,30％グリセロール,3.75mM EDTA,3％メ
ルカプトエタノール,pH6.8）の1/3容量に加えた。これ
らの試料を,90℃の湯浴中で,3〜10分間加熱し,3〜10％
の濃度勾配ゲル状のSDS−PAGEに供した。ゲルをまずク
ーマシー・ブルーで染色し，次いで７％酢酸で再染色し
た。第１図,Seubertら,Synapse1:20−24（1987）を参照
されたい（これは参考文献としてここに採用する）。ス
ペクトリンが消失するにつれて，約150,000ダルトンの
ペプチドバンドが増大することがわかった。これらのバ
ンドのペプチドは,BDPと呼ばれた。さらなる分解に対す
るBDPの見かけの安定性は，スペクトリンに対する抗体
が，細胞，体液などのような生物学的試料中のBDPを認
識し得ることを示唆した。
脳スペクトリンに対する抗体は,BDP1およびBDP2に対
する反応性をも有するが，周知の方法（例えば,Hurn,B.
A.L.およびChantler,S.M.Meth.Enz.70:104−135（198
0）を参照されたい；これは参考文献としてここに採用
する）を用いて，これの抗体をウサギ中に生じさせた。
抗脳スペクトリン抗体は，当該技術分野で周知の方法を
用いて，脳スペクトリン−セファロース・アフィニティ
クロマトグラフィーにより，血清から精製された。
する反応性をも有するが，周知の方法（例えば,Hurn,B.
A.L.およびChantler,S.M.Meth.Enz.70:104−135（198
0）を参照されたい；これは参考文献としてここに採用
する）を用いて，これの抗体をウサギ中に生じさせた。
抗脳スペクトリン抗体は，当該技術分野で周知の方法を
用いて，脳スペクトリン−セファロース・アフィニティ
クロマトグラフィーにより，血清から精製された。
精製した脳スペクトリンを，第１図Ｂについて述べた
ようにイキュベートした。SDS−PAGEを行った後，免疫
プロット分析キット（Immuno−Blot Assay Kit）（Bio
−Rad,Richmond,CA）を用い，高分子量タンパクの転移
に関する製造業者の勧告に従って，これらのタンパクを
電気泳動でニトロセルロースメンブレンに移した。第１
図Ｂに示されているように，カルペインの存在下で，ス
ペクトリンが分解することにより,BDP,すなわち本質的
にはBDP1およびBDP2が産出される。
ようにイキュベートした。SDS−PAGEを行った後，免疫
プロット分析キット（Immuno−Blot Assay Kit）（Bio
−Rad,Richmond,CA）を用い，高分子量タンパクの転移
に関する製造業者の勧告に従って，これらのタンパクを
電気泳動でニトロセルロースメンブレンに移した。第１
図Ｂに示されているように，カルペインの存在下で，ス
ペクトリンが分解することにより,BDP,すなわち本質的
にはBDP1およびBDP2が産出される。
以下の実施例は本発明を例示するためのものであっ
て，本発明を限定するものではない。これらは使用し得
る典型的なものであるが，当業者は周知の他の方法も使
用可能である。
て，本発明を限定するものではない。これらは使用し得
る典型的なものであるが，当業者は周知の他の方法も使
用可能である。
実施例Ｉ 脳損傷から生じるBDP1およびBDP2 哺乳類の中枢神経系（CNS）における外傷は，損傷を
受けた神経細胞の分解と，損傷を受けていない神経要素
の成長応答とをもたらす。これらの過程の背後にある機
構を解明するために充分に実証された事例は，内側嗅皮
質に損傷を与えることを包含する。この損傷により，大
部分の軸索入力を拒む，輪郭のはっきりとした樹枝状領
域が歯状回中に発生する。脱神経の解剖結果には，樹枝
状萎縮，神経膠の肥大および萎縮，ならびに損傷を受け
ていない軸索における成長応答が包含される。さらに，
細胞質のカルシウムレベルに異常が起こる；例えば,Bau
dryら,J.Neurosci3:252−259（1983）を参照されたい
（これは参考文献としてここに採用する）。
受けた神経細胞の分解と，損傷を受けていない神経要素
の成長応答とをもたらす。これらの過程の背後にある機
構を解明するために充分に実証された事例は，内側嗅皮
質に損傷を与えることを包含する。この損傷により，大
部分の軸索入力を拒む，輪郭のはっきりとした樹枝状領
域が歯状回中に発生する。脱神経の解剖結果には，樹枝
状萎縮，神経膠の肥大および萎縮，ならびに損傷を受け
ていない軸索における成長応答が包含される。さらに，
細胞質のカルシウムレベルに異常が起こる；例えば,Bau
dryら,J.Neurosci3:252−259（1983）を参照されたい
（これは参考文献としてここに採用する）。
内側嗅皮質の片側に定位的に位置づけられた電解的損
傷は，スパラーグードーレイ（Sprague−Dawley）ラッ
トに与えられた。手術してから,0.2日,0.5日,1日,2日,4
日,7日,14日，および27日間生存させた後に，これらの
動物を殺した。
傷は，スパラーグードーレイ（Sprague−Dawley）ラッ
トに与えられた。手術してから,0.2日,0.5日,1日,2日,4
日,7日,14日，および27日間生存させた後に，これらの
動物を殺した。
断頭により動物を殺した直後に，氷冷したホモジェナ
イゼーション緩衝液中で，脳を急いで解剖した。この緩
衝液は,0.32Mスクロース,10mMトリス,2mM EDTA,1mMエチ
レングリコール−ビスβ−アミノ−エチルエーテル（EG
TA）N,N,N′,N′−四酢酸,100μＭロイペチン,1μg/ml
N−トシル−Ｌ−フェニアラニンクロロメチルケトン（T
PCK）,pH7.4からなる。各々の海馬を切除し，メスを用
いて切断し，歯状回を単離した。胞状表面に海馬が残存
しているので，海馬の溝に沿って縦方向に切断して海馬
台を分離し，さらに縦方向に切断して大部分のCA3領域
を取り除いた。次いで,3回目は，溝に対して平行に,CA1
を切断して,CA1の大部分を取り除いた。残りの細胞（10
〜20mg）は歯状回試料とした。
イゼーション緩衝液中で，脳を急いで解剖した。この緩
衝液は,0.32Mスクロース,10mMトリス,2mM EDTA,1mMエチ
レングリコール−ビスβ−アミノ−エチルエーテル（EG
TA）N,N,N′,N′−四酢酸,100μＭロイペチン,1μg/ml
N−トシル−Ｌ−フェニアラニンクロロメチルケトン（T
PCK）,pH7.4からなる。各々の海馬を切除し，メスを用
いて切断し，歯状回を単離した。胞状表面に海馬が残存
しているので，海馬の溝に沿って縦方向に切断して海馬
台を分離し，さらに縦方向に切断して大部分のCA3領域
を取り除いた。次いで,3回目は，溝に対して平行に,CA1
を切断して,CA1の大部分を取り除いた。残りの細胞（10
〜20mg）は歯状回試料とした。
切除された歯状回は,500μｌの解剖緩衝液中にホモジ
ェナイズされた。その一部を,1/3容量の3X SDS−PAGE試
料緩衝液（150mMトリス−Po4,5％SDS,30％グリセロー
ル,3.75mM EDTA,3％メルカプトエタノール,pH6.8からな
る）に加え，沸騰した湯浴中に３分間放置した。ホモジ
ェネートのタンパク濃度は,Bradford（Anal.Biochem.7
2:248−254（1976）；参考文献としてここに採用する）
の方法により決定した。試料緩衝液中のタンパク濃度
は,0.33mg/mlに調節された。10μｇの各試料を,3〜10％
の濃度勾配ゲル上のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供した。電気泳動は，ブロモフェノールのマーカー
染料がゲルの前面に達するまで行った。ブロットを移す
器具（BioRad,Richmond,CA）を用い，高分子量タンパク
に関する製造業者の指示に従って，これらタンパクをニ
トロセルロースメンブレンに移した。
ェナイズされた。その一部を,1/3容量の3X SDS−PAGE試
料緩衝液（150mMトリス−Po4,5％SDS,30％グリセロー
ル,3.75mM EDTA,3％メルカプトエタノール,pH6.8からな
る）に加え，沸騰した湯浴中に３分間放置した。ホモジ
ェネートのタンパク濃度は,Bradford（Anal.Biochem.7
2:248−254（1976）；参考文献としてここに採用する）
の方法により決定した。試料緩衝液中のタンパク濃度
は,0.33mg/mlに調節された。10μｇの各試料を,3〜10％
の濃度勾配ゲル上のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供した。電気泳動は，ブロモフェノールのマーカー
染料がゲルの前面に達するまで行った。ブロットを移す
器具（BioRad,Richmond,CA）を用い，高分子量タンパク
に関する製造業者の指示に従って，これらタンパクをニ
トロセルロースメンブレンに移した。
抗体は以下の方法のより調節された：各ウサギに対し
て，約200μｇの精製された脳スペクトリンを，（電気
泳動で分離した後の）SDS−ポリアクリルアミドゲルか
ら切り取り，フロイントの完全アジュバンドを用いて乳
化させた。多数回の皮下注射を行い，この手順を，フロ
イントの不完全アジュバンドを用いて,2〜４週間後に再
び繰り返した。さらに２週間後に，約100μｇのスペク
トリンを含有するエマルジョンを皮下注射した。この手
順を，約１ヶ月後に繰り返した。この一連の注射に続く
10日後に，約20mlの血液を，ウサギから採取し，この血
液を４℃にて一晩凝固させた後，血清を収集した。
て，約200μｇの精製された脳スペクトリンを，（電気
泳動で分離した後の）SDS−ポリアクリルアミドゲルか
ら切り取り，フロイントの完全アジュバンドを用いて乳
化させた。多数回の皮下注射を行い，この手順を，フロ
イントの不完全アジュバンドを用いて,2〜４週間後に再
び繰り返した。さらに２週間後に，約100μｇのスペク
トリンを含有するエマルジョンを皮下注射した。この手
順を，約１ヶ月後に繰り返した。この一連の注射に続く
10日後に，約20mlの血液を，ウサギから採取し，この血
液を４℃にて一晩凝固させた後，血清を収集した。
脳スペクトリンに対する抗体を,6−アミノヘキサン酸
で活性化されたセファロース4B（Sigma Chemical Co.,S
t.Louis,MO）に結合している脳スペクトリンに吸着させ
ることにより，血清から単離した。次いで，特異的に結
合した抗体を,0.2Mグリシン,pH2.8中に溶出させた。次
いで，アフィニティ精製された抗体を,pH7.4まで平衡化
させ，使用時まで凍結した。ブロッキング,1次抗体およ
び２次抗体のインキュベーション，ならびに発色は,5−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートでア
ルカリホスファターゼに結合させた抗ウサギIgG（Bio−
Rad,Richmond,CA）／ニトロブルーテトラゾリウム基質
検出システムを用い，製造業者の勧告に従って,Biorad
（Bio−Rad Immuno−BlotTM分析キット：使用マニュア
ル）によって推奨されているとおりである。アフィニテ
ィ精製された抗スペクトリン抗体を,1/750に（50mlの容
量に）希釈し,1次抗体段階の間にブロットと一晩インキ
ュベートした。ソフトレーザー走査式自動濃度系（Mode
l ＃SLR504−XL,BioMed Instruments,Fullerton,CA）を
用いて，免疫活性種の定量を行った。インテグレーター
（4270Varion,Sunnyvale,CA）により，各バンドの反応
生成物の量を合計し，その試料における全体の割合
（％）として表した。
で活性化されたセファロース4B（Sigma Chemical Co.,S
t.Louis,MO）に結合している脳スペクトリンに吸着させ
ることにより，血清から単離した。次いで，特異的に結
合した抗体を,0.2Mグリシン,pH2.8中に溶出させた。次
いで，アフィニティ精製された抗体を,pH7.4まで平衡化
させ，使用時まで凍結した。ブロッキング,1次抗体およ
び２次抗体のインキュベーション，ならびに発色は,5−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートでア
ルカリホスファターゼに結合させた抗ウサギIgG（Bio−
Rad,Richmond,CA）／ニトロブルーテトラゾリウム基質
検出システムを用い，製造業者の勧告に従って,Biorad
（Bio−Rad Immuno−BlotTM分析キット：使用マニュア
ル）によって推奨されているとおりである。アフィニテ
ィ精製された抗スペクトリン抗体を,1/750に（50mlの容
量に）希釈し,1次抗体段階の間にブロットと一晩インキ
ュベートした。ソフトレーザー走査式自動濃度系（Mode
l ＃SLR504−XL,BioMed Instruments,Fullerton,CA）を
用いて，免疫活性種の定量を行った。インテグレーター
（4270Varion,Sunnyvale,CA）により，各バンドの反応
生成物の量を合計し，その試料における全体の割合
（％）として表した。
第１図Ａには，片側の内側嗅に損傷を与えた２日後に
歯状回中に存在する抗スペクトリン反応種が示されてい
る。同一側歯状回のモホジェネートは，それぞれ約155,
000および約150,000ダルトンの見かけのMrSを有する（B
DP1およびBDP2と呼ばれる）２つのペプチド量の著しい
増加を示した。片側の内側嗅皮質の損傷に伴う，歯状回
内におけるBDP1およびBDP2の経時的変化を第２図に示
す。BDPは，普通，手術していない動物から採取した試
料では検出限界以下である。同一側の試料におけるBDP
の著しい増加は，損傷を与えて４時間後ぐらいの初期段
階で明らかになる。この増加は損傷を与えて２日後に最
大となり，この時,BDPは全免疫反応性の25％を示す。損
傷を与えて２週間後，および４週間後でさえ,BDPの量は
さらに著しく増加した。２週間後および４週間後におけ
る反対側の歯状回は検出可能なBDPを示さず,BDP2の平均
レベルは0.1％を下回った。手術していない動物と比較
して，損傷を与えてから最初の一週間に,BDP量のわずか
な増加が反対側の領域に観察された。これらの結果は，
歯状回への主要な入力を取り除くことにより，細胞骨格
タンパクである脳スペクトリンの分解を急速にかつ長期
にわたって増大させる。
歯状回中に存在する抗スペクトリン反応種が示されてい
る。同一側歯状回のモホジェネートは，それぞれ約155,
000および約150,000ダルトンの見かけのMrSを有する（B
DP1およびBDP2と呼ばれる）２つのペプチド量の著しい
増加を示した。片側の内側嗅皮質の損傷に伴う，歯状回
内におけるBDP1およびBDP2の経時的変化を第２図に示
す。BDPは，普通，手術していない動物から採取した試
料では検出限界以下である。同一側の試料におけるBDP
の著しい増加は，損傷を与えて４時間後ぐらいの初期段
階で明らかになる。この増加は損傷を与えて２日後に最
大となり，この時,BDPは全免疫反応性の25％を示す。損
傷を与えて２週間後，および４週間後でさえ,BDPの量は
さらに著しく増加した。２週間後および４週間後におけ
る反対側の歯状回は検出可能なBDPを示さず,BDP2の平均
レベルは0.1％を下回った。手術していない動物と比較
して，損傷を与えてから最初の一週間に,BDP量のわずか
な増加が反対側の領域に観察された。これらの結果は，
歯状回への主要な入力を取り除くことにより，細胞骨格
タンパクである脳スペクトリンの分解を急速にかつ長期
にわたって増大させる。
実施例II 斑色マウスにおけるBDP分析，遺伝的変性の条件 12日齢の子マウスの海馬，皮質，および線条から得た
試料を，実施例Ｉに記載したように処理した。実験グル
ープは，対照のマウス，斑色マウス，補足的に銅を与え
た斑色マウスである。補足的に銅を与えたのは，早期に
死亡するのを防ぐための処理であり，この処理を行わな
ければ早期に死亡する。斑色マウスには銅欠乏症を有す
るという特徴があり，処理しなければ通常の分解を起こ
す。第３図から明らかなように，スペクトリンBDPは病
的変化状態で上昇し，この上昇は銅の補足により阻害さ
れる。
試料を，実施例Ｉに記載したように処理した。実験グル
ープは，対照のマウス，斑色マウス，補足的に銅を与え
た斑色マウスである。補足的に銅を与えたのは，早期に
死亡するのを防ぐための処理であり，この処理を行わな
ければ早期に死亡する。斑色マウスには銅欠乏症を有す
るという特徴があり，処理しなければ通常の分解を起こ
す。第３図から明らかなように，スペクトリンBDPは病
的変化状態で上昇し，この上昇は銅の補足により阻害さ
れる。
実施例III 産業用の毒物であるトリメチルスズ（TMN）に暴露した
後のBDP分析 ラットに体重1Kg当り10mgのTMTを注射した（腹腔
内）。処理後，数回にわたり，海馬の歯状回領域および
CA1領域を取り出し，実施例Ｉに記載したようして,BDP
について分析した。第４図に示されているように，この
毒物に対して最も危険性の高い領域において,BDPの容量
増加が認められた（Balabinら,Neurosa26:337−361（19
88）を参照されたい；これは参考文献としてここに採用
する）。
後のBDP分析 ラットに体重1Kg当り10mgのTMTを注射した（腹腔
内）。処理後，数回にわたり，海馬の歯状回領域および
CA1領域を取り出し，実施例Ｉに記載したようして,BDP
について分析した。第４図に示されているように，この
毒物に対して最も危険性の高い領域において,BDPの容量
増加が認められた（Balabinら,Neurosa26:337−361（19
88）を参照されたい；これは参考文献としてここに採用
する）。
実施例IV 虚血に伴うBDPの分析 皮質へ血液が流れないようにモンゴリアンアレチネズ
ミの頚動脈を10分間締めつけた。虚血させてから４時間
後または24時間後に取り出したCA1の海馬領域の試料
は，第５図に示されているように，対照の動物に比べて
BDPの上昇を示した。小脳への血液の供給を阻止しなか
ったが，この場合にはこのような上昇を示さなかった。
BDPレベルの分析は実施例Ｉに記載したとおりである。
ミの頚動脈を10分間締めつけた。虚血させてから４時間
後または24時間後に取り出したCA1の海馬領域の試料
は，第５図に示されているように，対照の動物に比べて
BDPの上昇を示した。小脳への血液の供給を阻止しなか
ったが，この場合にはこのような上昇を示さなかった。
BDPレベルの分析は実施例Ｉに記載したとおりである。
スペクトリンは他の様々な細胞中に見い出される。例
えば，スペクトリンの類似BDPは血小板（Foxら,Blood6
9:537−545（1987））および腸の刷子縁細胞（Glenny
ら,PNAS79:4002−4005（1982））において観察されてい
る。上述の分析は他の細胞および体液にも応用できる。
ラットから取り出した以下の組織を，上述の方法を用い
て検査したところ，スペクトリンおよびBDPを示すこと
がわかった：顎下腺，刷子縁，精巣，胸腺，骨格筋，心
筋，肺，肝臓，脾臓，副臓，腎臓，脳。さらに，ヒト，
アレチネズミ，およびマウスについても，スペクトリン
およびBDPを含有することが測定されているが，このこ
とは両者が動物に共通していることを示唆している。
えば，スペクトリンの類似BDPは血小板（Foxら,Blood6
9:537−545（1987））および腸の刷子縁細胞（Glenny
ら,PNAS79:4002−4005（1982））において観察されてい
る。上述の分析は他の細胞および体液にも応用できる。
ラットから取り出した以下の組織を，上述の方法を用い
て検査したところ，スペクトリンおよびBDPを示すこと
がわかった：顎下腺，刷子縁，精巣，胸腺，骨格筋，心
筋，肺，肝臓，脾臓，副臓，腎臓，脳。さらに，ヒト，
アレチネズミ，およびマウスについても，スペクトリン
およびBDPを含有することが測定されているが，このこ
とは両者が動物に共通していることを示唆している。
本発明は現在のところ好ましい実施態様について説明
されているが，本発明の精神から逸脱することなく様々
な改変がなされ得ることは理解されるべきである。した
がって，本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
されているが，本発明の精神から逸脱することなく様々
な改変がなされ得ることは理解されるべきである。した
がって，本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開92／1935（ＷＯ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，81，Ｐ．3572−3576, （1984) Ｂｌｏｏｄ，69（２），Ｐ．537− 547，（1987) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，79，Ｐ．4002−4005, （1982) Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ ａ Ａｃｔａ，830，Ｐ．147−158, （1985) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，258 （12），Ｐ．7757−7767，（1983) Ｓｙｎａｐｓｅ，Ｉ，Ｐ20−24, （1987)
Claims (14)
- 【請求項１】被検体における細胞の死または分解を検出
する方法であって，以下の工程を包含する方法： （ａ）被検体から得た生物学的試料を，スペクトリン分
解産物の存在について分析する工程であって，該スペク
トリン分解産物が約150,000および155,000ダルトンの見
かけの分子量を有する，工程；および （ｂ）該スペクトリン分解産物の量を，正常な被検体に
おける該スペクトリン分解産物の量と比較する工程であ
り，該スペクトリン分解産物の増加レベルは被検体にお
ける細胞の死または分解を示す，工程。 - 【請求項２】前記正常な被検体におけるスペクトリン分
解産物の量が実質的に検出不可能である，請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】前記生物学的試料が哺乳類由来の細胞組織
を含有し，前記細胞の死または分解が該試料の細胞内で
発生している，請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記生物学的試料が脳脊髄液および血液成
分からなる群から選択される，請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記細胞の死または分解が非病理学的細胞
傷害から生じる，請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記細胞の傷害が，外傷，虚血，病変，お
よび被毒からなる群から選択される，請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】前記細胞の傷害が神経系に対するものであ
り，前記生物学的試料が神経組織または脳脊髄液を含有
する，請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】前記細胞の死または分解が病的変化から生
じる，請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】前記病的変化が神経系に影響を与える，請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記病的変化が，アルツハイマー病，パ
ーキンソン病，および筋ジストロフィー症からなる群か
ら選択され，前記生物学的試料が神経組織または脳脊髄
液を含有する，請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】生物学的試料をスペクトリン分解産物の
存在について分析する前記工程が，該試料中のスペクト
リン分解産物を，検出可能に標識された抗体と接触させ
ることを包含する，請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】生物学的試料を分析する前記工程が，以
下の工程を包含する，請求項１に記載の方法： （ａ）該試料を電気的勾配に曝して，スペクトリン分解
産物がスペクトリンから分離される方法で，その成分を
分離する工程； （ｂ）該分離成分を，スペクトリン分解産物に結合する
検出可能に標識された抗体と接触させる工程；および， （ｃ）抗体結合の存在を測定する工程であり，該抗体結
合の存在がスペクトリン分解産物の存在を示す，工程。 - 【請求項１３】生物学的試料を分析する前記工程が，以
下の工程を包含する，請求項１に記載の方法： （ａ）該試料を電気的勾配に曝して，スペクトリン分解
産物がスペクトリンから分離される方法で，その成分を
分離する工程； （ｂ）分離された産物を可視化する染色剤で該産物を染
色する工程；および， （ｃ）染色剤結合の存在を測定する工程であり，該染色
剤の存在がスペクトリン分解産物の存在を示す，工程。 - 【請求項１４】前記検出が，前記細胞の死または分解に
より微候の発現に先だって行われる，請求項１に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24015488A | 1988-09-02 | 1988-09-02 | |
| US240,154 | 1988-09-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04504753A JPH04504753A (ja) | 1992-08-20 |
| JP2566327B2 true JP2566327B2 (ja) | 1996-12-25 |
Family
ID=22905332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1509837A Expired - Lifetime JP2566327B2 (ja) | 1988-09-02 | 1989-08-30 | 細胞の病的変化を検出する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0432218B1 (ja) |
| JP (1) | JP2566327B2 (ja) |
| AT (1) | ATE124537T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340182C (ja) |
| DE (1) | DE68923285T2 (ja) |
| DK (1) | DK33991A (ja) |
| WO (1) | WO1990002949A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5118606A (en) * | 1988-09-02 | 1992-06-02 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting cellular pathology by assaying spectrin and spectrin breakdown products |
| FR2745174B1 (fr) † | 1996-02-22 | 1998-04-30 | Oreal | Composition cosmetique de fixation et de brillance |
-
1989
- 1989-08-30 EP EP89910554A patent/EP0432218B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-30 AT AT89910554T patent/ATE124537T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-30 WO PCT/US1989/003748 patent/WO1990002949A1/en active IP Right Grant
- 1989-08-30 JP JP1509837A patent/JP2566327B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-30 DE DE68923285T patent/DE68923285T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-05 CA CA000610248A patent/CA1340182C/en not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-02-27 DK DK033991A patent/DK33991A/da not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (11)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，８３０，Ｐ．１４７−１５８，（１９８５） |
| BIOCHIM.BIOPHYSICA ACTA=1985 * |
| Ｂｌｏｏｄ，６９（２），Ｐ．５３７−５４７，（１９８７） |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８（１２），Ｐ．７７５７−７７６７，（１９８３） |
| J.BIOL.CHEM.=1983 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.=1982US * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.=1984US * |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９，Ｐ．４００２−４００５，（１９８２） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８１，Ｐ．３５７２−３５７６，（１９８４） |
| SYNAAPSE=1987 * |
| Ｓｙｎａｐｓｅ，Ｉ，Ｐ２０−２４，（１９８７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0432218B1 (en) | 1995-06-28 |
| DE68923285T2 (de) | 1995-11-09 |
| DK33991D0 (da) | 1991-02-27 |
| ATE124537T1 (de) | 1995-07-15 |
| CA1340182C (en) | 1998-12-15 |
| JPH04504753A (ja) | 1992-08-20 |
| EP0432218A4 (en) | 1992-01-22 |
| DK33991A (da) | 1991-02-27 |
| WO1990002949A1 (en) | 1990-03-22 |
| DE68923285D1 (de) | 1995-08-03 |
| EP0432218A1 (en) | 1991-06-19 |
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