JP2561753B2 - Immunological assay kit for human tissue plasminogen activator / human plasminogen activator complex and assay method - Google Patents
Immunological assay kit for human tissue plasminogen activator / human plasminogen activator complex and assay methodInfo
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- JP2561753B2 JP2561753B2 JP2513161A JP51316190A JP2561753B2 JP 2561753 B2 JP2561753 B2 JP 2561753B2 JP 2513161 A JP2513161 A JP 2513161A JP 51316190 A JP51316190 A JP 51316190A JP 2561753 B2 JP2561753 B2 JP 2561753B2
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Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明は、ヒト検体中のヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体の免疫学的測定に関する。更に詳しく
はヒト検体中の前記複合体の量を高感度且つ安定して測
定するための免疫学的測定方法及びそのためのキットに
関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunological measurement of human tissue plasminogen activator / human plasminogen activator inhibitor complex in a human sample. More specifically, it relates to an immunoassay method for measuring the amount of the complex in a human sample with high sensitivity and stability, and a kit therefor.
本明細書において使用される記号は、特に断らない限
り下記の意味を有する。The symbols used in the present specification have the following meanings unless otherwise specified.
tPA:ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター PAI: ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(tP
Aに対するインヒビター) tPA−PAI複合体; ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラス
ミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体 b.従来技術 フィブリンを溶解する酵素であるプラスミンは、プラ
スミノーゲンが組織プラスミノーゲンアクチベーター
(tPA)により変換されて生成する。近年、このヒト組
織プラスミノーゲンアクチベーターに対するインヒビタ
ー(ヒトプラスミノーゲンアクチーベーターインヒビタ
ー(PAI)が血管内皮細胞、皮細胞、血小板、胎盤など
に存在しており、速やかにヒト組織プスミノーゲンアク
チベーターと複合体を形成しヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーター活性を抑制することがわかった(M.Phil
ips et al,Blochem Biophys,Acta,802,99−110,1984,S.
Thorsen,Biochem Biophys Acta,802,111−118,1984,T.W
un et al,J,Biol Chem.262,3646−3653,1987,M.A.Sanzo
et al Biochem,26,7443−7449,1987,Y.Sakataet al,J.
Biol Chem.263,1960−1969,1988)。また血中プラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター(PAI)活性値と
疾患との関係が明らかになりつつあり(B.Wiman et al.
Scand.j.Clin Lab Invest 45,43−43、1985、P.Vague e
t al,Metabolism 35,250−253,1986,A.Hamsten,Lancet
8549,3−8,1987)、プラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター(PAI)は血液凝固線系の開始機構の重要な
制御因子であることが示唆されている。従ってPAI,tPA
及びtPA・PAI複合体の血中濃度を知ることができれば線
溶系の以上や病態をモニターできる可能性は大きい。tPA: Human tissue plasminogen activator PAI: Human plasminogen activator inhibitor (tP
Inhibitor for A) tPA-PAI complex; human tissue plasminogen activator / human plasminogen activator inhibitor complex b. Prior Art Plasmin, which is an enzyme that lyses fibrin, is a tissue plasminogen activator of plasminogen. Generated after being converted by beta (tPA). In recent years, an inhibitor of this human tissue plasminogen activator (human plasminogen activator inhibitor (PAI) has been present in vascular endothelial cells, skin cells, platelets, placenta, etc., and human tissue plasminogen activator has been rapidly detected. It was found to form a complex with beta and suppress human tissue plasminogen activator activity (M.Phil
ips et al, Blochem Biophys, Acta, 802 , 99-110, 1984, S.
Thorsen, Biochem Biophys Acta, 802 , 111-118,1984, TW
un et al, J, Biol Chem. 262 , 3646−3653,1987, MASanzo
et al Biochem, 26 , 7443-7449, 1987, Y. Sakata et al, J.
Biol Chem. 263 , 1960-1969, 1988). Furthermore, the relationship between blood plasminogen activator inhibitor (PAI) activity and disease is becoming clear (B. Wiman et al.
Scand.j.Clin Lab Invest 45 , 43−43, 1985, P.Vague e
t al, Metabolism 35 , 250−253,1986, A. Hamsten, Lancet
8549, 3-8, 1987), plasminogen activator inhibitor (PAI) has been suggested to be an important regulator of the initiation mechanism of the blood coagulation line system. Therefore, PAI, tPA
If it is possible to know the blood level of the tPA / PAI complex and tPA / PAI complex, it is highly possible to monitor the above-mentioned fibrinolytic system and the pathological condition.
現在、tPAの測定法としてはサンドイッチ エンザイ
ムイムノアッセイによる方法(特開昭59−174759号公
報)や市販キット(バイオプール社IMULYSE t−PA)
などがあり、一方PAIを測定する方法としては放射性物
質を用いる方法(R.R.Schlef et al,J.Lab Clin Med 10
6,408,1985)やモノクローナル抗体を用いたサンドイッ
チ エンザイムイムノアッセチイ キット(バイオプー
ル社 IMULYSE PAI−I)などがある。Currently, as a method for measuring tPA, a sandwich enzyme immunoassay method (JP-A-59-174759) or a commercially available kit (Biopool IMULYSE t-PA) is used.
On the other hand, as a method for measuring PAI, a method using a radioactive substance (RRSchlef et al, J.Lab Clin Med 10
6 , 408, 1985) and sandwich enzyme immunoassay kit using a monoclonal antibody (Biopool IMULYSE PAI-I).
また、tPA・PAI複合体は血漿中に微量存在すると言わ
れ、このtPA。PAI複合体の測定方法として高田ら(Thro
mbosis Research 55巻、285−289ページ、1989年)によ
る、固定化抗体としてPAIに対するモノクローナル抗体
を用い、標識抗体としてtPAに対するポリクローナル抗
体を用い、かつそのフラグメントがβ−ガクトシダーゼ
により標識された、蛍光法によるエンサイム イムノア
ッセイ法がある。In addition, it is said that the tPA / PAI complex is present in a trace amount in plasma. Takada et al. (Thro
mbosis Research 55, pp. 285-289, 1989), using a monoclonal antibody against PAI as an immobilized antibody, a polyclonal antibody against tPA as a labeling antibody, and a fragment thereof labeled with β-galactosidase, fluorescent. There is an encime immunoassay method.
このtPA・PAI複合体を測定する系は、まず固定化モノ
クローナル抗PAI−1抗体と検体とを30℃で3時間反応
させ、しかるのち洗浄し、β−ガラクトシダーゼ標識さ
れたポリクローナル抗tPAのFab′フラグメントと4℃で
一夜反応させ、免疫反応を完了し、4−メチル−ウンベ
ルフェリルガラクトシドを分解させ、生じた4−メチル
ウンベリエフェロンを、蛍光法で測定し、tPA・PAI複合
体を定量しているものである。かかる方法は2つの免疫
反応における反応温度が異なり、かつ反応時間も一夜必
要で、非常に長く、さらに特殊な測定装置である蛍光光
度計を用いるため、工業的および臨床的には効率的に測
定することが困難であった。The system for measuring the tPA / PAI complex is as follows. Immobilized monoclonal anti-PAI-1 antibody is reacted with a sample for 3 hours at 30 ° C., followed by washing, and β′-galactosidase-labeled polyclonal anti-tPA Fab ′. After the reaction with the fragment overnight at 4 ° C, the immune reaction was completed, 4-methyl-umbelliferylgalactoside was decomposed, and the produced 4-methylumbellieferon was measured by a fluorescence method to quantify the tPA / PAI complex. Is what you are doing. This method requires different reaction temperatures in the two immune reactions, requires a reaction time overnight, is extremely long, and uses a fluorometer, which is a special measuring device, so that it can be efficiently measured industrially and clinically. It was difficult to do.
一方、tPA・PAI複合体の測定方法としてアミラルら
は、PAIに対するモノクローナル抗体及びtPAに対するモ
ノクローナル抗体を用いることによるtPA・PAI複合体の
測定方法を提案している(Thrombosis Research,Supple
ment VIII;99−113、1988)。この方法は2種のモノク
ローナル抗体を使用しており、tPA・PAI複合体は比較的
良好な感度で測定されるが、この文献に記載されたエラ
イザ法に従えば、合計で約5時間以上を必要とする。従
ってこの2種のモノクローナル抗体を使用した前記測定
システムは実際に臨床で援用するには、更に測定感度を
上げまた操作を簡便にし時間も短縮することが不可欠で
ある。On the other hand, as a method for measuring the tPA / PAI complex, Amiral et al. Have proposed a method for measuring the tPA / PAI complex by using a monoclonal antibody against PAI and a monoclonal antibody against tPA (Thrombosis Research, Supple.
ment VIII; 99-113, 1988). This method uses two kinds of monoclonal antibodies, and the tPA / PAI complex can be measured with relatively good sensitivity. However, according to the ELISA method described in this document, it takes about 5 hours or more in total. I need. Therefore, in order to actually apply the above-mentioned measurement system using these two types of monoclonal antibodies in clinical practice, it is indispensable to further increase the measurement sensitivity, simplify the operation, and shorten the time.
c.発明が解決しようとする課題 そこで本発明の第1の目的は、ヒト検体中のtPA・PAI
複合体を高感度で測定することができる免疫測定方法及
びキットを提供することにある。c. Problems to be Solved by the Invention Therefore, the first object of the present invention is to provide tPA / PAI in human samples.
An object of the present invention is to provide an immunoassay method and a kit capable of measuring a complex with high sensitivity.
本発明の第2の目的は、ヒト検体中のtPA・PAI複合体
を実際に臨床に使用しうる簡便な手段で測定する方法及
びキットを提供することにある。A second object of the present invention is to provide a method and kit for measuring the tPA / PAI complex in a human sample by a convenient means that can be used clinically.
本発明の他の目的は、ヒト検体中のtPA・PAI複合体
を、測定する人や測定条件(時間、温度など)などの影
響を出来る限り受けないで、安定して高感度で測定しう
る免疫学的方法及びキットを提供することにある。Another object of the present invention is to stably and highly sensitively measure the tPA / PAI complex in a human sample without being affected by the person who measures it and the measurement conditions (time, temperature, etc.) as much as possible. It is to provide an immunological method and a kit.
本発明のさらに他の目的は、ヒト検体中の活性型PAI
の測定方法を提供することにある。Yet another object of the present invention is the active PAI in human specimens.
To provide a measuring method of.
本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一層明ら
かとなるであろう。Still other objects of the present invention will become more apparent from the following description.
d.課題を解決するための手段 かくして本発明者らの研究によれば、前記本発明の目
的並びに利点は、ヒト検体中のtPA・PAI複合体を免疫学
的に測定するためのキットであって、 (i) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に
結合したヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体(第1抗体) (ii) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するポリクローナル抗体(第2
抗体) (iii) 酵素活性を測定するための基質および反応停
止剤 (iv) 希釈剤 および (v) HLB(Hydrophile Lipophile Balance)値が少
くとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤 よりなることを特徴とする免疫学的測定キットによって
達成されることが見出された。d. Means for Solving the Problems Thus, according to the studies by the present inventors, the object and advantages of the present invention are that a kit for immunologically measuring the tPA / PAI complex in a human sample. (I) a monoclonal antibody (first antibody) to a human plasminogen activator inhibitor bound on an insoluble solid support having a mirrored surface (ii) an enzyme-labeled human tissue plasminogen activator Polyclonal antibody against (second
Antibody) (iii) Substrate and reaction terminator for measuring enzyme activity (iv) Diluent and (v) Detergent containing nonionic surfactant having HLB (Hydrophile Lipophile Balance) value of at least 16 It was found to be achieved by an immunoassay kit characterized in that
さらに本発明者らの研究によれば下記のtPA・PAIの免
疫学的測定方法及び活性型PAIの測定方法が提供され
る。Further, according to the study by the present inventors, the following immunological assay method for tPA / PAI and assay method for active PAI are provided.
tPA・PAIの免疫学的測定方法; (1) 不溶性固体担体に結合した第1抗体にヒト検体
を接触させ、次いで標識化された第2抗体を接触させる
か、或いは (2) 不溶性固体担体に結合した第1抗体、標識化さ
れた第2抗体及びヒト検体を同時に接触させる、 ことにより、ヒト検体中のヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンビター複合体を免疫学的に測定する方法であって、 (a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に
結合したヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターに対するモノクロナール抗体を第1抗体として使用
し、 (b) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するポリクローナル抗体を第2
抗体として使用し、且つ (c) HLB(Hydrophile Lipophile Bakance)値が少
くとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤を
洗浄剤として使用する、 ことを特徴とする免疫学的測定方法。Immunological assay method for tPA / PAI; (1) contacting a human sample with a first antibody bound to an insoluble solid carrier, and then contacting with a labeled second antibody, or (2) using an insoluble solid carrier By simultaneously contacting the bound first antibody, the labeled second antibody, and the human specimen, the human tissue plasminogen activator / human plasminogen activator-inhibitor complex in the human specimen is immunologically analyzed. (A) a monoclonal antibody against a human plasminogen activator inhibitor bound on an insoluble solid support having a mirrored surface is used as a first antibody, and (b) is labeled with an enzyme. Second polyclonal antibody against humanized tissue plasminogen activator
An immunological measurement method, comprising: (c) a detergent containing a nonionic surfactant having an HLB (Hydrophile Lipophile Bakance) value of at least 16 as an antibody.
活性型PAIの測定方法; (A)ヒト検体中に存在するヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーター・ヒトプラスミノーゲンインヒビター複
合体及び (B)ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターを添加
したヒト検体中に存在するヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンインヒビター複合
体を夫々サンドイッチ法による免疫学的測定法によって
測定し、その測定値の差に基いてヒト検体中の活性型ヒ
トプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターの量を
測定する方法において、 (a) 鏡面化された表面を有する不溶性固体担体上に
結合したヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターに対するモノクロナール抗体を第1抗体として使用
し、 (b) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するポリクローナル抗体を第2
抗体として使用し、且つ (c) HLB(Hydrophile Lipophile Bakance)値が少
くとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤を
洗浄剤として使用する、 ことを特徴とする活性型ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターオンヒビターの測定方法。Method for measuring active PAI; (A) Human tissue plasminogen activator / human plasminogen inhibitor complex present in human specimen and (B) Present in human specimen to which human tissue plasminogen activator is added Human tissue plasminogen activator and human plasminogen inhibitor complex were measured by immunoassay by sandwich method, respectively, and the active human plasminogen activator in human specimen was analyzed based on the difference between the measured values. A method for determining the amount of an inhibitor comprising: (a) using as a first antibody a monoclonal antibody against a human plasminogen activator inhibitor bound on an insoluble solid support having a mirrored surface; Labeled human tissue plasminogen activator A polyclonal antibody against the Tar second
An active human plasminogen, which is used as an antibody, and (c) is a detergent containing a nonionic surfactant having an HLB (Hydrophile Lipophile Bakance) value of at least 16. Activator-on-hibitor measurement method.
前記した本発明は、 (i) 第1抗体(固体化抗体)としてPAIに対するモ
ノクローナル抗体を、第2抗体として酵素標識化された
tPAに対するポリクローナル抗体を組合せて使用するこ
と、 (ii) 第1抗体を固定化するための不溶性固体担体と
して、その表面が鏡面化された、すなわち極めて平滑な
表面を有する固体担体を使用すること、及び (iii) 非イオン界面活性剤であってそのHLB値が一定
値以上のものを含む洗浄剤を使用すること、 に特徴があるのであり、これら(i)、(ii)及び(ii
i)が相乗的に影響することによって本発明の目的が達
成される。すなわち、前記(i)、(ii)及び(iii)
の相乗的効果として、ヒト検体中に存在する多数のタン
パク質、為にtPA、PAIらの固体担体への非特異的吸着が
極力抑制され、また第2抗体の非特異的吸着が抑制され
且つ特異的な吸着が選択的に促進され、免疫反応に不必
要な成分を効果的に洗浄除去できる。In the present invention described above, (i) a monoclonal antibody against PAI is used as the first antibody (solidified antibody) and enzyme-labeled as the second antibody.
using a polyclonal antibody against tPA in combination, (ii) using a solid support having a mirror-finished surface, that is, having a very smooth surface, as an insoluble solid support for immobilizing the first antibody, And (iii) the use of a cleaning agent containing a nonionic surfactant having an HLB value equal to or higher than a certain value, and (i), (ii) and (ii)
The object of the present invention is achieved by the synergistic effect of i). That is, the above (i), (ii) and (iii)
As a synergistic effect of, the nonspecific adsorption of tPA, PAI and other solid carriers to a large number of proteins present in human specimens is suppressed as much as possible, and the nonspecific adsorption of the second antibody is also suppressed and specific Adsorption is selectively promoted, and components unnecessary for immune reaction can be effectively washed away.
かくして本発明によれば、ヒト検体中に極めて微量含
まれるtPA・PAIを高感度に、簡便に正確に且つ安定して
測定できるのであり、しかも測定に要する時間は、従来
法と比べて大巾に短縮されまた洗浄剤の使用量も低減さ
れるという実用上の効果も達成される。Thus, according to the present invention, tPA / PAI contained in an extremely small amount in a human sample can be measured with high sensitivity, simply, accurately and stably, and the time required for the measurement is much wider than that of the conventional method. In addition, the practical effect that the amount of the cleaning agent used is also reduced is achieved.
さらに本発明によれば、免疫反応を2−ステップで行
う場合、各ステップで異なる温度を設定する必要はな
く、同じ温度で実施することが容易に可能であり、免疫
反応及び酵素反応を含め全工程を2時間或いはそれ以下
の短い時間で行うことができる。Furthermore, according to the present invention, when performing an immune reaction in two steps, it is not necessary to set different temperatures in each step, and it is possible to easily carry out the reaction at the same temperature. The process can be performed in a short time of 2 hours or less.
従って本発明にける免疫測定系は、凝固線溶活性に異
常があるか或いはその疑いあるヒト検体を効率的に且つ
迅速に測定することができるので、その臨床的意義は極
めて甚大である。Therefore, the immunoassay system according to the present invention can efficiently and rapidly measure a human specimen having or suspected to have an abnormality in coagulation / fibrinolytic activity, and its clinical significance is extremely great.
以下本発明についてさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
[A]抗原の調製及び精製; 本発明において使用されるPAIに対するモノクローナ
ル抗体及びtPAに対するポリクローナル抗体は、下記に
説明する抗原を用いることによって得ることができる。[A] Preparation and purification of antigen; The monoclonal antibody against PAI and the polyclonal antibody against tPA used in the present invention can be obtained by using the antigen described below.
すなわち、これら抗体を得るための抗原としてのtPA
或いはPAIは原則的には天然の材料から抽出した天然型
のものと遺伝子組換え技術によるリコンビナント型のも
のいずれも用いられるが、tPAまたはPAIの天然型と同等
の免疫学的性質を持つ物であれば、遺伝子工学的手法に
よってえられるものでよい。天然型のtPAまたはPAIを得
る材料としては細胞培養液が好んで用いられる。分離、
精製は、通常用いられる蛋白分離技術、例えば塩析、注
出、遠心分離、限凱過、各種のクロマトグラフィーな
どを組み合わせて行うことができる。That is, tPA as an antigen for obtaining these antibodies
Alternatively, as PAI, in principle, both a natural type extracted from a natural material and a recombinant type produced by gene recombination technology are used, but PAI has immunological properties equivalent to those of tPA or PAI. If it is available, it can be obtained by a genetic engineering method. A cell culture medium is preferably used as a material for obtaining natural tPA or PAI. Separation,
Purification can be carried out by combining commonly used protein separation techniques, for example, salting out, pouring out, centrifugation, ultrafiltration, various chromatographies and the like.
このようにして得られたtPAまたはPAIを抗原としてポ
リクローナル抗体或いはモノクローナル抗体を作成する
ことができる。Using tPA or PAI thus obtained as an antigen, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be prepared.
[A]−(1) tPAに対するポリクローナル抗体の調
製; 本発明において使用されるtPAに対するポリクローナ
ル抗体は、前期のtPAを抗原として、それ自体公知の方
法に従って得ることができる。例えば「日本生化学会
編、続生化学実験講座、5巻、1−10頁、東京化学同
人、1986年」に記載されているように、免疫動物、例え
ばモルモット、ウサギ、ラット、マウス、ヤギなど抗体
産生能力のある動物を用いる通常の方法でtPAを用いて
免疫した後、採血し、抗血清を得る。抗血清より通常用
いられる方法、例えば、塩析、抽出、遠心分離、限外
過、各種のクロマトグラフィーなどを組み合わせて精製
抗体を得ることができる。[A]-(1) Preparation of polyclonal antibody against tPA; The polyclonal antibody against tPA used in the present invention can be obtained according to a method known per se by using the early stage tPA as an antigen. For example, as described in "The Biochemical Society of Japan, Sequel Biochemistry Laboratory, Vol. 5, 1-10, Tokyo Kagaku Dojin, 1986", immunized animals such as guinea pig, rabbit, rat, mouse, goat, etc. After immunization with tPA by a usual method using an animal capable of producing antibodies, blood is collected to obtain antiserum. A purified antibody can be obtained from antiserum by combining a method usually used, for example, salting out, extraction, centrifugation, ultrafiltration, various chromatography and the like.
[A]−(2) PAIに対するモノクローナル抗体の調
製; 本発明において使用されるPAIに対するモノクローナ
ル抗体は、PAIを抗原として使用し、それ自体知られた
ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法(G.Khle
r and Mulstein,Nature(Lind on),256,495−497(197
5)により作成されたハイブリドーマを培養して分泌さ
せ、その培養液から分離することにより得ることができ
る。すなわち、PAIでマウスを免疫した後、このマウス
の膵臓細胞とマウスミエローマ細胞を融合させハイブリ
ドーマを作成する。このようにして得たハイブリドーマ
は融合された種々のリンパ球に応じて種々のモノクロー
ナル抗体を産生するので、目的とするモノクローナル固
体を産生するハイブリドーマをクローニングによってク
ローン化されたハイブリドーマとして単離する。このク
ローン化されたハイブリドーマをイン・ビトロまたはマ
ウス腹腔内で培養してモノクローナル抗体を分泌させ
る。この培養液から通常の方法に従ってPAIに対するモ
ノクローナル抗体を分離する。[A]-(2) Preparation of Monoclonal Antibody Against PAI; The monoclonal antibody against PAI used in the present invention uses PAI as an antigen, and the cell fusion method (K.
r and Mulstein, Nature (Lind on), 256, 495−497 (197
It can be obtained by culturing and secreting the hybridoma prepared in 5) and separating it from the culture solution. That is, after immunizing a mouse with PAI, pancreatic cells of this mouse are fused with mouse myeloma cells to prepare a hybridoma. The hybridoma thus obtained produces various monoclonal antibodies in response to various fused lymphocytes, so that the hybridoma producing the desired monoclonal solid is isolated as a cloned hybridoma by cloning. The cloned hybridoma is cultured in vitro or intraperitoneally in the mouse to secrete the monoclonal antibody. Monoclonal antibodies against PAI are separated from this culture medium by a conventional method.
かかるPAIに対するモノクローナル抗体には、本出願
人により先に提案され、ヨーロッパ特許公開第339302号
に記載されたJTI−1、JTI−2,JTI−3またはJTI−4を
使用することができる。これらのうち、本発明において
は、JTI−3およびJTI−4が好ましく、特にJTI−4が
優れている。As such a monoclonal antibody against PAI, JTI-1, JTI-2, JTI-3 or JTI-4 previously proposed by the present applicant and described in European Patent Publication No. 339302 can be used. Of these, JTI-3 and JTI-4 are preferable in the present invention, and JTI-4 is particularly excellent.
このJTI−3およびJTI−4の2つのモノクローナル抗
体は、下記に説明するようにブタペスト条約による国際
寄託されている。The two JTI-3 and JTI-4 monoclonal antibodies have been internationally deposited under the Budapest Treaty as described below.
PAIに対するモノクローナル抗体JTI−3; このPAIに対するモノクローナル抗体JTI−3は、それ
を産生するハイブリドーマが、ブタペスト条約に基づく
国際寄託期間である微工研(Fermenatation Research I
nstaitute)に1988年11月22日にFERMp−10405として寄
託され、その後1989年3月2日に国際寄託に変更された
(国際寄託;No.BP−2317)。Monoclonal antibody JTI-3 against PAI; this monoclonal antibody JTI-3 against PAI has a hybridoma producing it, which is an international deposit period under the Budapest Treaty.
nstaitute) on November 22, 1988 as FERMp-10405 and subsequently converted to an international deposit on March 2, 1989 (international deposit; No. BP-2317).
このPAIに対するモノクローナル抗体JTI−3は、サブ
クラスがIgG1でありPAIにtPAが結合した場合(すなわ
ち、tPA−PAI複合体に対して)でもPAIに対して結合を
阻害されないが、PAIに対して結合した場合、tPAは結合
を阻害されるような抗原決定部位を認識する特性を有し
ている。The monoclonal antibody JTI-3 against this PAI is not inhibited from binding to PAI even when the subclass is IgG 1 and tPA binds to PAI (that is, to the tPA-PAI complex), but to PAI. When bound, tPA has the property of recognizing an antigenic determinant site that inhibits binding.
PAIに対するモノクローナル抗体JTI−4; このPAIに対するモノクローナル抗体JTI−4は、それ
を産生するハイブリドーマが、上記微工研に1988年11月
22日にFERMp−10406として寄託され、その後1989年3月
2日に国際寄託に変更された(国際寄託No.BP−231
8)。Monoclonal antibody JTI-4 against PAI; this monoclonal antibody JTI-4 against PAI is a hybridoma producing the same, which was reported to the above-mentioned Micro Engineering Institute in November 1988.
It was deposited as FERMp-10406 on the 22nd and was subsequently converted to the international deposit on March 2, 1989 (International Deposit No. BP-231.
8).
このPAIに対するモノクローナル抗体JTI−4は、サブ
クラスがIgG1であり、PAIにtPAが結合してもPAIに対す
る結合を阻害されない。The subclass of this monoclonal antibody JTI-4 against PAI is IgG 1 , and even if tPA binds to PAI, the binding to PAI is not inhibited.
[B]tPA−PAI複合体の測定キットの調製; [B]−(1)第1抗体の調製 本発明の第1抗体としては、鏡面化された表面を有す
る不溶性固体担体上に結合したPAIに対するモノクロー
ナル抗体を使用することが必要である。[B] Preparation of tPA-PAI complex measurement kit; [B]-(1) Preparation of first antibody As the first antibody of the present invention, PAI bound to an insoluble solid carrier having a mirrored surface is used. It is necessary to use a monoclonal antibody against.
この固体担体として表面が鏡面化されたものすなわち
表面が極めて平滑なものを使用することにより非特異的
吸着が低くなり、tPA−PAI複合体の測定感度が向上す
る。By using a solid support having a mirror surface, that is, an extremely smooth surface, non-specific adsorption is reduced and the measurement sensitivity of the tPA-PAI complex is improved.
従来、高感度な測定のための不溶性固体担体として
は、むしろその表面を研摩して粗くし、表面積を大きく
したものが用いられてきた。確かに表面積を大きくする
と、抗体の固定量を増加させるというメリットがある
が、しかしながら非特異的吸着も大きくなるというデメ
リットがあった。本発明者らの研究したところによれ
ば、tPA−PAI複合体の測定においては、中心線平均粗さ
(Ra)が1.5μm以下である鏡面化された固体担体は、
抗体の固定量は粗面化された固体担体とほぼ同等である
が、非特異的吸着は飛躍的に減少し、tPA−PAI複合体の
高感度測定に有利であることを見出した。かかる鏡面化
された不溶性固体としては、その材質形状は特に制限さ
れているが例えばポリスチレンビーズ、ガラスビーズが
あげられる。Conventionally, as an insoluble solid carrier for highly sensitive measurement, a carrier whose surface has been polished to roughen it to increase its surface area has been used. Certainly, increasing the surface area has the advantage of increasing the amount of immobilized antibody, but has the disadvantage of increasing non-specific adsorption. According to the research conducted by the present inventors, in the measurement of tPA-PAI complex, a mirror-finished solid support having a center line average roughness (Ra) of 1.5 μm or less was
It was found that the amount of immobilized antibody was almost the same as that of the roughened solid support, but non-specific adsorption was drastically reduced, which was advantageous for highly sensitive measurement of tPA-PAI complex. The material shape of the mirror-finished insoluble solid is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene beads and glass beads.
中心線平均粗さ(Ra)は、粗さ曲線からその中心線の
方向に測定長さlの部分を抜取り、この抜取り部分の中
心線をX軸、縦倍率の方向をY軸とし、あらさ曲線をy
=f(x)で表わしたとき、次式で与えられるRaの値を
ミクロン単位で表わした値を意味する。The center line average roughness (Ra) is obtained by extracting a portion of the measurement length 1 from the roughness curve in the direction of the center line, setting the center line of the extracted portion as the X axis and the direction of the vertical magnification as the Y axis. To y
= F (x) means that the value of Ra given by the following equation is expressed in micron units.
この中心線平均粗さ(Ra)については、JIS B 060
1−1982(日本)、ANSI B46.1−1979(USA)及びR468
−1966(ISO)に説明されている。 Regarding this center line average roughness (Ra), JIS B 060
1-1982 (Japan), ANSI B46.1-1979 (USA) and R468
-1966 (ISO).
なお以下の本発明の実施例では、不溶性担体は東京精
密(株)製の表面粗さ計サーフコム を用いて表面粗さ
を測定した。 In the following examples of the present invention, the insoluble carrier is
SURFCOM, a surface roughness meter manufactured by Mikko Co., Ltd. Surface roughness using
Was measured.
かくなる不溶性担体に固定されるPAIに対するモノク
ローナル抗体としては、前記のモノクローナル抗体分子
のみならず抗原結合能が失われないそのフラグメンント
たとえば(ab′)2、Fab、Fab′、Facbなどあるいは抗
原結合能が失われない抗体またはそのフラグメントの誘
導体である。これらの抗体を不溶製担体へ固定する方法
は、物理的吸着法たとえばポリスチレンの担体を該抗体
の溶液に浸漬する方法など;イオン結合法たとえばイオ
ン交換樹脂あるいはアミン基、カルボン酸基、スルホン
酸基、リン酸基などのイオン化する官能基をもった担体
を用いる方法など;あるいは化学反応による共有結合法
たとえばカルボキシ・クロライド法、カルボジイミド
法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体
法、臭化シアン活性化多糖法、ジアゾ法、活性エステル
法、架橋試薬による担体結合法(架橋試薬としてグルタ
ールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート、コハ
ク酸イミド・マレイミド化合物など)など、更にはPAI
に対しては結合能はないがPAIに対するモノクローナル
抗体に対して生物学的反応により結合しうる物質を介し
て結合する方法例えばプロテインA結合担体を用いる方
法などである。As a monoclonal antibody against PAI immobilized on an insoluble carrier that becomes harder, not only the above-mentioned monoclonal antibody molecule but also its fragment such as (ab ′) 2 , Fab, Fab ′, Facb or the like which binds to the antigen It is a derivative of an antibody or fragment thereof that does not lose its ability. Methods for immobilizing these antibodies on insoluble carriers include physical adsorption methods such as immersing a polystyrene carrier in a solution of the antibodies; ionic bonding methods such as ion exchange resins or amine groups, carboxylic acid groups, sulfonic acid groups. , A method using a carrier having an ionizable functional group such as a phosphate group; or a covalent bond method by a chemical reaction, for example, a carboxy chloride method, a carbodiimide method, a maleic anhydride derivative method, an isocyanate derivative method, a cyanogen bromide activity Polysaccharide method, diazo method, active ester method, carrier binding method using a cross-linking reagent (glutaraldehyde, hexamethylene isocyanate, succinimide / maleimide compounds etc. as cross-linking reagents), and PAI
A method of binding via a substance which has no binding ability to PAI but can bind to a monoclonal antibody against PAI by a biological reaction, for example, a method using a protein A binding carrier.
[B]−(2)第2抗体(標識化抗体)の調製; 本発明においては、第2抗体として酵素により標識化
されたtPAに対するポリクローナル抗体が使用される。
前記[A]−(1)で説明したtPAに対するポクローナ
ル抗体またはそれと同等のフラグメントを免疫測定法に
使用される酵素を用いて標識化する。[B]-(2) Preparation of second antibody (labeled antibody); In the present invention, a polyclonal antibody against tPA labeled with an enzyme is used as the second antibody.
The poclonal antibody against tPA described in [A]-(1) above or a fragment equivalent thereto is labeled with an enzyme used in an immunoassay.
この標識化のために使用される酵素としては、例えば
リゾチームマレート・デヒドロゲナーゼ、グルコース−
6−フォスフェート、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコース・オキシダーゼ、アルカリフォスファ
クターゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなど
が挙げられる。これら酵素とポリクローナル抗体との結
合方法は、グルタルアルデニド法、過ヨーソ酸法、マレ
イミド法など通常の方法に従うことができるが、マレイ
ミド法が好ましく用いられる。Examples of the enzyme used for this labeling include lysozyme malate dehydrogenase, glucose-
6-phosphate, dehydrogenase, peroxidase, glucose oxidase, alkaline phosphatase, luciferase, β-galactosidase and the like can be mentioned. As a method for binding these enzymes to the polyclonal antibody, a usual method such as a glutaraldenide method, a periodate acid method, and a maleimide method can be used, but the maleimide method is preferably used.
抗体や酵素のマレイミド化はそれ自体公知の方法(石
川栄治編「酵素免疫測定法」、医学書院)、例えばサク
シンイミジル 4−(N−マレイミドメチル)シクロヘ
キサン カーボネート(SMCC)、スルホサクシンイミジ
ル、4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン カ
ーボネート(スルホSMCC)、サクシンイミジル−メタマ
レイミドベンゾエート(MBS)、サクシンイミジル 6
−マレイミドヘキサノエート(EMCS)などの架橋試薬を
使用して行うことができる。Maleimidation of antibodies and enzymes is a method known per se (Eiji Ishikawa, “Enzyme Immunoassay”, Medical Institute), for example, succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane carbonate (SMCC), sulfosuccinimidyl, 4-. (N-maleimidomethyl) cyclohexane carbonate (sulfo SMCC), succinimidyl-metamaleimidobenzoate (MBS), succinimidyl 6
It can be done using a cross-linking reagent such as maleimidohexanoate (EMCS).
tPAに対するポリクローナル抗体またはそのフラグメ
ントと標識物質との反応は、前記架橋試薬によりマレイ
ミド化したポリクローナル抗体またはそのフラグメント
と、例えばδ−アセチルメルカプトコハク酸無水物によ
りSH基を導入した酵素とを、例えば4〜30℃の温度でし
かも前記抗体またはフラグメントとSH基を導入した酵素
のモル比1:1〜1:80の割合で、且つ1〜48時間行なわれ
る。The reaction of a polyclonal antibody against tPA or a fragment thereof with a labeling substance is carried out by using the above-mentioned cross-linking reagent for maleimide-ized polyclonal antibody or a fragment thereof and, for example, an enzyme introduced with an SH group by δ-acetylmercaptosuccinic anhydride, for example, 4 It is carried out at a temperature of -30 ° C and a molar ratio of the antibody or fragment to the SH group-introduced enzyme of 1: 1 to 1:80 and for 1 to 48 hours.
この場合には主として、抗体またはそのフラグメント
の硫黄原子を介して標識物質が抗体またはそのフラグメ
ント1分子当り1分子標識されたものを得ることが好ま
しい。In this case, it is preferable to obtain mainly one molecule of the labeling substance per molecule of the antibody or its fragment through the sulfur atom of the antibody or its fragment.
[B]−(3)洗浄剤 サンドイッチ法による免疫学的測定法において、固定
抗体(第1抗体)と標識抗体(第2抗体)とを単に組み
合わせるだけでは、非特異的吸着が起こり高感度な測定
系を組み立てられない。従って非特異的反応を抑えるこ
とが高感度測定のポイントである。例えば、界面活性剤
を測定系に用いると非特異的吸着が少なくなるが、全て
の界面活性剤がtPA−PAI複合体の測定系に有効であるわ
けではない。[B]-(3) Detergent In the immunological assay method by the sandwich method, non-specific adsorption occurs with high sensitivity by simply combining the immobilized antibody (first antibody) and the labeled antibody (second antibody). I cannot assemble the measurement system. Therefore, suppressing non-specific reactions is the key to high-sensitivity measurement. For example, when a surfactant is used in the measurement system, non-specific adsorption is reduced, but not all surfactants are effective in the measurement system of tPA-PAI complex.
本発明者らによれば、前記の如く第1抗体及び第2抗
体を組合せると共に特定の界面活性剤がtPA−PAI複合体
の測定系における免疫反応を抑制せず、免疫反応に関与
しない物質や標識抗体の非特異的吸着のみを抑制する効
果があることがわかった。According to the present inventors, a substance which does not suppress the immune reaction in the assay system of tPA-PAI complex and which does not participate in the immune reaction, in which the first antibody and the second antibody are combined as described above It was found that it has the effect of suppressing only nonspecific adsorption of labeled antibody.
本発明においては、このような界面活性剤を免疫活性
剤を免疫反応液中に存在させたり、洗浄液中に存在させ
ると高感度測定に有利である。免疫反応が2段反応の場
合には、いずれに存在させることもできるが、2段目の
反応に存在させるのが好ましい。In the present invention, the presence of such a surfactant in the immune reaction solution or in the washing solution is advantageous for highly sensitive measurement. When the immune reaction is a two-step reaction, it can be present in any of the reactions, but it is preferable that it is present in the second reaction.
本発明に用いられる界面活性剤はHLB値(Hydraphile
Lipophile Balance)が16以上の非イオン界面活性剤で
ある。The surfactant used in the present invention has an HLB value (Hydraphile
Lipophile Balance) is 16 or more nonionic surfactants.
HLBが16未満の界面活性剤は、非特異的吸着を抑制す
ると同時に免疫反応を抑制してしまい、好ましくない。A surfactant having an HLB of less than 16 suppresses nonspecific adsorption and simultaneously suppresses an immune reaction, which is not preferable.
HLB値が16位上の非1イオン界面活性剤としては、例
えば、ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル
系、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル系、ポリオ
キシアルキレン多価アルコール脂肪酸エステル系、ポリ
オキシエチレンポリオキシプロピレンポリオール系など
のHLB値が16位上のものであればよく、例えばトリトン
X−305(HLB17.3)、トリトンX−405(HLB17.9)、エ
マルゲン950(HLB18.2)、エマルゲン985(HLB18.9)、
Tween20(HLB16.7)ブルロニックF68(HLB29)、テトラ
ニック707(HLB>20)などが挙げられる。Examples of the non-ionic surfactant having an HLB value in the 16th position include polyoxyalkylene alkylaryl ether type, polyoxyalkylene alkyl ether type, polyoxyalkylene polyhydric alcohol fatty acid ester type, polyoxyethylene polyoxypropylene polyol. The HLB value of the system or the like may be 16th or higher, for example, Triton X-305 (HLB17.3), Triton X-405 (HLB17.9), Emulgen 950 (HLB18.2), Emulgen 985 (HLB18. 9),
Examples include Tween20 (HLB16.7), Bluronic F68 (HLB29), and Tetranic 707 (HLB> 20).
これらの界面活性剤は単独で使用することもできる
し、二種以上の界面活性剤を併用することもできる。These surfactants can be used alone or in combination of two or more kinds.
洗浄液等における界面活性剤ののうどは1w/w%以下で
あり、好ましくは0.001%以上0.1w/w%以下である。The odor of the surfactant in the cleaning solution is 1 w / w% or less, preferably 0.001% or more and 0.1 w / w% or less.
本発明においては、0.1w/w%以下の界面活性剤量でも
洗浄効果に優れ、更に洗浄時の泡立ちが少くなり、その
結果泡立ちが激しくて、泡の除去が煩雑となったり、そ
の除去が不十分になって逆に洗浄としては不十分になっ
たりするといった問題も少なくなるので、好ましい。In the present invention, even with a surfactant amount of 0.1 w / w% or less, excellent cleaning effect, less foaming during cleaning, resulting in severe foaming, complicated removal of foam, or its removal. This is preferable because it causes less problems such as insufficient cleaning and conversely insufficient cleaning.
非イオン界面活性剤の溶媒としては水、生理食塩水、
あるいはリン酸緩衝液のような緩衝液など、測定に悪影
響を及ぼさないものならいずれであってもよい。As a solvent for the nonionic surfactant, water, physiological saline,
Alternatively, any buffer such as a phosphate buffer may be used as long as it does not adversely affect the measurement.
[B]−(4)希釈剤: 本発明の測定キットおよび測定方法に使用される希釈
剤としては、免疫学的測定において通常使用されるもの
であればよい。該希釈剤として免疫反応に悪影響を与え
ないものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス
塩酸緩衝液、酢酸緩衝液などのpHが6.0〜8.0の範囲のも
のが主として使用される。[B]-(4) Diluent: The diluent used in the measurement kit and the measurement method of the present invention may be any diluent usually used in immunological measurement. Any diluent may be used as long as it does not adversely affect the immune reaction, and for example, a phosphate buffer, a Tris-HCl buffer, an acetate buffer or the like having a pH in the range of 6.0 to 8.0 is mainly used.
[B]−(5)酵素活性を測定するための基質および反
応停止剤: 本発明の測定キットおよび測定方法に使用される前記
基質および反応停止剤は、標識物質としての酵素の種類
に対応して、免疫学的測定において通常知られているも
のを使用することができる。その例としては、ペルオキ
シダーゼの基質として2,2′−アジノ−ジ−[3エチル
ベンツチアゾリンスルフォン酸]ジアンモニウム塩(AB
TS)、オルトフェニレンジアミン(OPD)、3,3′,5,5′
−テトラメチルベンヂジン(TMB)等があり、停止剤と
してはH2SO4、HCl、酢酸、グリシン緩衝液(pH10.3)、
フッ化ナトリウム溶液等がある。[B]-(5) Substrate and reaction terminator for measuring enzyme activity: The substrate and reaction terminator used in the assay kit and assay method of the present invention correspond to the type of enzyme as a labeling substance. Then, those generally known in immunological measurement can be used. As an example thereof, 2,2'-azino-di- [3ethylbenzthiazolinesulfonic acid] diammonium salt (AB
TS), orthophenylenediamine (OPD), 3,3 ', 5,5'
-There is tetramethylbenzidine (TMB), etc., and H 2 SO 4 , HCl, acetic acid, glycine buffer (pH 10.3),
Sodium fluoride solution and the like.
アルカリフォスファターゼの基質としては4−ニトロ
フェニルフォスフェート、4−メチルウンベリフェリル
フォスフェート、NADP等がある。Substrates for alkaline phosphatase include 4-nitrophenyl phosphate, 4-methylumbelliferyl phosphate, NADP and the like.
β−ガラストシダーゼの基質としては2−ニトロフェ
ニル−β−D−ガラクトシド、4−メチルウンベリフェ
リル−β−D−ガラクトシド等がある。停止剤として
は、0.1M Na2CO3などがある。Substrates for β-glass tosidase include 2-nitrophenyl-β-D-galactoside, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside and the like. Examples of the terminator include 0.1M Na 2 CO 3 .
[B]−(6)蛋白質の使用 本発明者らの研究によれば、tPA−PAI複合体の測定に
おいて、免疫反応溶液中に分子量1.6万〜5.0万、好まし
くは2.0〜4.6万及び等電点1.0〜5.0、好ましくは1.2〜
4.8である蛋白質を存在せしめ、この蛋白質の免疫反応
溶液における最終濃度が0.02〜0.9重量%となるように
調整すると、一層非特異的吸着が抑制され、従ってバッ
クグランドが著しく低くなりさらに高感度が得られやす
いことがわかった。かかる物質としては、例えばカゼイ
ン、βカゼイン、αカゼイン、ペプシン、オボグリコプ
ロテイン、オロソムコイドなどが挙げられる。あるいは
また、かかる蛋白質はその混合物を使用することもでき
る。このような混合物としては、例えば主成分として前
記蛋白質10〜60重量%、好ましくは20〜50重量%、糖
(例えば乳糖)30〜80重量%、好ましくは40〜60重量
%、その他脂肪(例えば0.5〜2重量%)、灰分(例え
ば5〜12重量%)、水分(例えば2〜8重量%)などを
含むことができる。このような混合物として典型的なの
はスキムミルクである。スキムミルクは蛋白質としてカ
ゼインを含むものであるが、カゼインを単独で使用した
場合に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中におけ
る分散性がよく、蛋白質単位重量当りの非特異的吸着抑
制効果が高く、温度4℃における保存性がよい(沈澱が
生じにくい)という特長を有する。なお、本発明に用い
るスキムミルクとしては、脱脂したミルクであれば何の
由来の乳であってもよい。すなわち、免疫反応溶液にス
キムミルクを存在せしめ免疫反応溶液におけるその最終
濃度が0.002〜0.8重量%となるように調整することが、
同様に高感度が得られるので好ましい。0.002重量%よ
り低濃度では十分な抑制効果が得られず、また、スキム
ミルクの場合には0.8重量%、上記蛋白の場合には0.9重
量%より高濃度とすると、特異的反応も抑制されるので
好ましくない。[B]-(6) Use of protein According to the studies conducted by the present inventors, in the measurement of tPA-PAI complex, the molecular weight of the immunoreaction solution was 16,000 to 50,000, preferably 20 to 46,000 and isoelectric. Point 1.0-5.0, preferably 1.2-
When the protein of 4.8 is present and adjusted so that the final concentration of this protein in the immunoreaction solution is 0.02 to 0.9% by weight, the nonspecific adsorption is further suppressed, and therefore the background is remarkably lowered and the high sensitivity is further enhanced. It turned out that it was easy to obtain. Examples of such substances include casein, β-casein, α-casein, pepsin, ovoglycoprotein, orosomucoid and the like. Alternatively, such proteins can be used as a mixture. Examples of such a mixture include, for example, 10 to 60% by weight, preferably 20 to 50% by weight, of the above-mentioned protein as a main component, 30 to 80% by weight of sugar (e.g., lactose), preferably 40 to 60% by weight, and other fats (for example, 0.5 to 2% by weight), ash (eg 5 to 12% by weight), water (eg 2 to 8% by weight) and the like can be contained. A typical example of such a mixture is skim milk. Skim milk contains casein as a protein, but skim milk has better dispersibility in an immunoreaction solution, a higher effect of suppressing non-specific adsorption per unit weight of protein, and a higher temperature than the case of using casein alone. It has the characteristic of good storage stability at ℃ (precipitation does not easily occur). The skim milk used in the present invention may be milk of any origin as long as it is defatted milk. That is, it is possible to allow skimmed milk to exist in the immune reaction solution and adjust its final concentration in the immune reaction solution to 0.002 to 0.8% by weight.
Similarly, high sensitivity is obtained, which is preferable. If the concentration is lower than 0.002% by weight, sufficient inhibitory effect is not obtained, and if the concentration is higher than 0.8% by weight for skim milk and 0.9% by weight for the above proteins, the specific reaction is also suppressed. Not preferable.
上記蛋白質は、前述したように免疫反応溶液中に前記
濃度となるように使用すればよく、希釈剤中に存在させ
ていてもよくまた二次抗体中に含有させていてもよい。The above-mentioned protein may be used so as to have the above-mentioned concentration in the immune reaction solution as described above, and may be contained in the diluent or contained in the secondary antibody.
[B]−(7)測定方法 本発明の測定方法におけるヒト検体としては、通常の
臨床サンプル、例えば血清あるは血漿形態の血液、関節
液、リンパ液、胸腺水、腹水、羊水、細胞組織液、骨髄
液、尿などのtPA−PAI複合体を含有する液体であればい
ずれであってもよい。好ましいのは血清または血漿形態
の血液である。[B]-(7) Measuring method As the human sample in the measuring method of the present invention, an ordinary clinical sample, for example, blood in the form of serum or plasma, synovial fluid, lymph, thymus fluid, ascites fluid, amniotic fluid, cell tissue fluid, bone marrow. Any liquid such as liquid or urine may be used as long as it contains the tPA-PAI complex. Preferred is blood in serum or plasma form.
本発明の測定方法においては、前記一次抗体および二
次抗体を組合せて使用し、 (i) 不溶性固体担体に結合した第1抗体にヒト検体
を接触させ、洗浄後、次いで標識化された第2抗体を接
触させるか、或いは、 (ii) 不溶性固体担体に結合した第1抗体、標識化さ
れた第1抗体、標識化された第2抗体及びヒト検体を同
一系に存在せしめる、 ことにより、ヒト検体中のtPA−PAI複合体の量を高感度
に測定することができる。前記(i)の方法はヒト検体
中に高濃度でtPAが存在する場合、例えばtPAを治療の目
的で投与された患者検体においてもtPAの影響を受けず
(ii)の方法より優れている。In the measurement method of the present invention, the primary antibody and the secondary antibody are used in combination, and (i) a human sample is contacted with a first antibody bound to an insoluble solid carrier, washed, and then labeled with a second antibody. By contacting the antibody, or (ii) allowing the first antibody bound to the insoluble solid carrier, the labeled first antibody, the labeled second antibody and the human sample to exist in the same system, The amount of tPA-PAI complex in a sample can be measured with high sensitivity. The method (i) is superior to the method (ii) when tPA is present in a human sample at a high concentration, for example, even in a patient sample to which tPA is administered for the purpose of treatment, tPA is not affected.
測定に際しての免疫反応温度条件は、構成要素である
蛋白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制
しないかぎり制限はないが、一般には、50℃以下、好ま
しくは約4〜45℃程度の温度条件下に約5分から5時間
好ましくは30分〜3時間程度を要して反応を行えばよ
い。The temperature of the immune reaction at the time of measurement is not limited as long as it does not denature the properties of the protein as a constituent element and significantly suppresses the immune reaction, but it is generally 50 ° C or lower, preferably about 4 to 45 ° C. The reaction may be performed under temperature conditions for about 5 minutes to 5 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours.
例えば、反応温度を37℃の如き体温に近い温度の場
合、非特異的吸着反応は非常に少なくすることができ、
測定系の高感度化という点において大きな威力を発揮す
るのも、本発明系の特徴の一つである。For example, when the reaction temperature is close to the body temperature such as 37 ° C., the nonspecific adsorption reaction can be extremely reduced,
It is also one of the characteristics of the system of the present invention that it exerts great power in terms of high sensitivity of the measurement system.
[C]活性型PAIの測定方法 前記した本発明によるtPA−PAI複合体の測定方法は、
極めて感度よくヒト検体中のtPA−PAI複合体を測定する
ことができるので、この方法を利用することにより、ヒ
ト検体中の活性型PAIの量を容易に且つ感度よく測定す
ることが可能となる。[C] Method for measuring active PAI The method for measuring the tPA-PAI complex according to the present invention described above is
Since the tPA-PAI complex in a human sample can be measured with extremely high sensitivity, the use of this method makes it possible to easily and sensitively measure the amount of active PAI in a human sample. .
従来活性型PAIの濃度を測定する方法としてtPAかPAI
と反応してtPA−PAI複合体を生成することを利用した方
法が高田らにより報告されている。[Thrombosis Rese
aech55巻、285〜589ページ(1989)]。この方法におい
ては、検体中のPAIとtPAとの反応は4℃で一夜行ない、
次いで生成にtPA−PAI複合体の量を測定している。Conventionally, tPA or PAI was used to measure the concentration of active PAI.
Takada et al. Have reported a method that utilizes the reaction to generate a tPA-PAI complex. [Thrombosis Rese
aech55, 285-589 (1989)]. In this method, the reaction between PAI and tPA in the sample is carried out at 4 ° C overnight,
The amount of tPA-PAI complex is then measured for production.
そしてこのtPA−PAI複合体を測定する方法は、まず30
℃で3時間反応させ、しかるのち洗浄し、β−ガラクト
ダーゼ標識されたポリクローナル抗体tPA・Fab′フラグ
メントと4℃で一夜反応させ、免疫反応を完了し、4−
メチル−ウンベルフエリルガラクトシドを分解させ、生
じた4−メチルウンベリフエロンを、蛍光性で測定し、
tPA−PAI複合体を定量しているものである。かかる方法
は2つの免疫反応における反応温度が異なり、測定に関
する時間も2日間必要で、非常に長く、さらに特殊な測
定装置である蛍光光度計を用いるため、工業的および臨
床的には効率的に測定することが困難であった。And the method to measure this tPA-PAI complex is 30
After reacting for 3 hours at ℃, washed and then reacted with β-galactosidase-labeled polyclonal antibody tPA.Fab 'fragment overnight at 4 ℃, complete the immunoreaction, 4-
Methyl-umbelliferylgalactoside was decomposed, and the resulting 4-methylumbelliferone was measured by fluorescence,
It is a quantification of the tPA-PAI complex. Such a method requires different reaction temperatures in two immune reactions, requires two days for measurement, is very long, and uses a fluorometer, which is a special measuring device, so that it is industrially and clinically efficient. It was difficult to measure.
これに対して本発明によれば、ヒト検体にtPAを加え
活性型PAIとtPAとを反応させ、生じたtPA−PAI複合体の
量を測定し、tPAを加えなかった検体中の該複合体の量
との差から活性型PAIの量が簡便でしかも短時間で測定
できる。On the other hand, according to the present invention, tPA was added to a human sample to react with active PAI and tPA, the amount of the resulting tPA-PAI complex was measured, and the complex in the sample to which tPA was not added was measured. The amount of active PAI can be measured easily and in a short time from the difference with the amount of PAI.
e.発明の効果 かくして、本発明方法によれば、臨床サンプルなどの
微量のtPA−PAI複合体を含む試料を検体として、該検体
中のtPA−PAI複合体を高感度、高精度に、しかも簡便な
操作で定量することができる。e. Effect of the Invention Thus, according to the method of the present invention, a sample containing a trace amount of tPA-PAI complex such as a clinical sample is used as a sample, and the tPA-PAI complex in the sample is highly sensitive and highly accurate, and It can be quantified by a simple operation.
さらに同様に検体中の活性型PAIの量を高感度、高精
度に簡単に且つ短時間に測定することができる。Further, similarly, the amount of active PAI in the sample can be easily measured in a short time with high sensitivity and high accuracy.
f.実施例 以下実施例により本発明を詳細に説明する。実施例
中、%表示は重量%を示す。f. Examples The present invention will be described in detail below with reference to examples. In the examples, "%" indicates "% by weight".
図面の簡単な説明 第1図は、tPA−PAI複合体の免疫学的測定のための検
量線を示すものであり、tPA−PAI複合体の濃度と吸光度
との関係を示すものである。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows a calibration curve for immunological measurement of tPA-PAI complex, showing the relationship between the concentration of tPA-PAI complex and the absorbance.
第2図は、tPA−PAI複合体の免疫学的測定において洗
浄時間と吸光度との関係を示すものである。FIG. 2 shows the relationship between the washing time and the absorbance in the immunological measurement of the tPA-PAI complex.
第3図は、tPA−PAI複合体の免疫学的測定において不
溶性固体担体の表面粗さの程度と非特異的吸着率との関
係を示すものである。FIG. 3 shows the relationship between the degree of surface roughness of the insoluble solid support and the nonspecific adsorption rate in the immunological measurement of the tPA-PAI complex.
参考例[ペルオキシダーゼ標識抗tPAモノクローナル抗
体Fab′フラグメントの作成] ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに対するモ
ノクローナル抗体(JTA−l;ヨーロッパ特許公開第33930
2号参照)のFab′フラグメントをニソノフの方法に準じ
て調整し、常法によりペルオキシダーゼと結合してペル
オキシダーゼ標識Fab′を得た(日本生化学会編、続生
化学実験講座、5巻、109−112頁、東京化学同人、1986
年)。すなわち、該モノクローナル抗体の1.0mg/ml溶液
(0.01Mリン酸−0.15M NaCl pH7.2(PBS))の2mlに40
μgのペプシンを加え、1Mクエン酸緩衝液(pH3.5)でp
H3.7に調整したあと37℃で1時間消化分解した。反応液
に1N NaOHを滴下し、pH8として反応を停止した。TSKGe
i G−3000SWカラム(東ソー)−HPLCで溶出液に5mM
EDTA−0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)を用いて、この反応
液から分子量10万のF(ab′)2フラグメントを分離し
た。Reference Example [Preparation of peroxidase-labeled anti-tPA monoclonal antibody Fab 'fragment] Monoclonal antibody against human tissue plasminogen activator (JTA-l; European Patent Publication No. 33930)
Fab ′ fragment (see No. 2) was prepared according to the method of Nisonov, and bound to peroxidase by a conventional method to obtain a peroxidase-labeled Fab ′ (edited by the Biochemical Society of Japan, sequel to biochemistry laboratory, Vol. 5, 109- 112 pages, Tokyo Kagaku Dojin, 1986
Year). That is, 40 mL of 2% of a 1.0 mg / mL solution of the monoclonal antibody (0.01 M phosphate-0.15 M NaCl pH7.2 (PBS)) was used.
Add μg of pepsin and p with 1M citrate buffer (pH 3.5).
After adjusting to H3.7, it was digested and decomposed at 37 ° C. for 1 hour. 1N NaOH was added dropwise to the reaction solution to adjust the pH to 8 to stop the reaction. TSKGe
i G-3000SW column (Tosoh) -5 mM for eluate by HPLC
An F (ab ') 2 fragment having a molecular weight of 100,000 was separated from this reaction solution using EDTA-0.1M phosphate buffer (pH 6.0).
これを限外濾過器により濃縮した。これに0.1M 2−
メルカプトエチルアミン200μを加え、37℃で2時間
還元処理した。この反応液を限界濾過器によって、濃縮
後、F(ab′)2と同様にHPLCによって分子量5万のFa
b′を分離し1.07mg/mlのFab′フラグメントの液を1.0ml
得た。It was concentrated by ultrafiltration. 0.1M 2-
200 μm of mercaptoethylamine was added and reduction treatment was carried out at 37 ° C. for 2 hours. The reaction solution was concentrated by an ultrafiltration filter and then concentrated by HPLC in the same manner as F (ab ′) 2 by HPLC to obtain a Fa of 50,000.
b'is separated and 1.07 mg / ml of Fab 'fragment is added to 1.0 ml.
Obtained.
一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡I−C)
の6.0mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)0.9ml
に溶解し、N−サクシンイミジル−3−マレイミドメチ
ル−シクロヘキサンカルボネート(ピアース社、SMCC)
のジメチルホルムアミド溶液を60μ(2.9mg/80μ)
滴下し、30℃で1時間反応した。この反応液をセフアデ
ツクスG−25カラムに添加、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝
液(pH6.0)を流してマレイミド化ペルオキシダーゼを
分離した。かくして得られたマレイミド化ペルオキシダ
ーゼ3.2mgとFab′フラグメント1.0mgを25℃で24時間反
応させTSK Gel G−3000 SWカラム−HPLC(溶出液0.
01M PBS)にて分離精製したところ、分子量約13万のペ
ルオキシダーゼ標識マウス抗tPA抗体Fab′フラグメント
が0.35mg得られた。得られた標識抗体の280nmと403nmの
吸光度より求めたFab′フラグメントとペルオキシダー
ゼの結合モル比は1:2であった。On the other hand, horseradish peroxidase (Toyobo IC)
6.0mg of 0.1M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 0.9ml
Dissolved in N-succinimidyl-3-maleimidomethyl-cyclohexane carbonate (Pierce, SMCC)
Dimethylformamide solution of 60μ (2.9mg / 80μ)
It was dropped and reacted at 30 ° C. for 1 hour. This reaction solution was added to a Sephadex G-25 column, and 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0) was passed to separate the maleimidated peroxidase. 3.2 mg of the thus obtained maleimidated peroxidase and 1.0 mg of Fab ′ fragment were reacted at 25 ° C. for 24 hours, and TSK Gel G-3000 SW column-HPLC (eluent: 0.
After separation and purification with (01M PBS), 0.35 mg of peroxidase-labeled mouse anti-tPA antibody Fab ′ fragment with a molecular weight of about 130,000 was obtained. The binding molar ratio of Fab ′ fragment to peroxidase determined from the absorbance at 280 nm and 403 nm of the obtained labeled antibody was 1: 2.
実施例1 [ペルオキシダーゼ標識抗tPAポリクローナル抗体の作
成] ヤギ抗ヒトtPA抗体(バイオプール社)のPBS溶液(1m
g/ml)5.0mlにN−(m−マレイミド安息香酸)−N−
サクシンイミドエステル(MBS、ピアース社)のジメチ
ルホルムアミド溶液(10mg/ml)250μを加え、25℃の
温度で30分間反応させたあと、セフアテックスG−25を
充填したカラムを用い、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)で
ゲル濾過を行い、マレイミド化ポリクローナル抗体と未
反応のMBSとを分離した。Example 1 [Preparation of peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody] Goat anti-human tPA antibody (Biopool) in PBS (1 m
g / ml) 5.0 ml to N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-
250 μm of succinimide ester (MBS, Pierce) dimethylformamide solution (10 mg / ml) was added and reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Then, using a column packed with Sephatex G-25, 0.1 M phosphoric acid was added. Gel filtration was performed with a buffer solution (pH 6.0) to separate the maleimidated polyclonal antibody and unreacted MBS.
一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH6.5)の溶液(10mg/ml)5.4mlにS−ア
セチル無水コハク酸のジメチルホルムアミド溶液(60mg
/ml)を197μ加え、25℃の温度で30分間反応し、次に
0.1M−トリス緩衝液(pH7.0)を2.2ml、1M−ヒドロキシ
ルアミン水溶液4.3ml、0.1M EDTA水溶液0.4mlを加え4
分間攪拌し、セフアテックスG−25を充填したカラムを
用いて、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0)でゲル濾過を行
い、SH化されたペルオキシダーゼを分離した。On the other hand, 5.4 ml of a 0.1M phosphate buffer solution (pH 6.5) containing horseradish peroxidase (HRP) (10 mg / ml) was added to dimethylformamide solution of S-acetylsuccinic anhydride (60 mg).
/ ml), and react at 25 ° C for 30 minutes, then
Add 2.2 ml of 0.1M-Tris buffer (pH 7.0), 4.3 ml of 1M-hydroxylamine aqueous solution, 0.4 ml of 0.1M EDTA aqueous solution, and add 4.
The mixture was stirred for 1 minute, and gel filtration was performed with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) using a column packed with Sephatex G-25 to separate SH-modified peroxidase.
MBS化した抗体(2.4mg)とSH化されたペルオキシダー
ゼ(5.3mg)を25℃で20時間反応させ、HPLC(TSK Gel
G−3000SW)を用いるゲル濾過でペルオキシダーゼ標
識、抗tPAポリクローナル抗体1.9mgを得た。The MBS antibody (2.4 mg) and the SH-oxidized peroxidase (5.3 mg) were reacted at 25 ° C for 20 hours and then subjected to HPLC (TSK Gel
G-3000 SW) was used for gel filtration to obtain 1.9 mg of peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody.
[固定抗体の作成] 中心線平均粗さ(Ra)が1.35μmであるポリスチレン
ビーズ(イムノケミカル社、D−7)をマウス抗PAIモ
ノクローナル抗PAI抗体(JTI−4)の0.1Mリン酸クエン
酸緩衝液(pH3.0)の溶液(20μg/ml)に浸し、4℃で2
0時間放置した。ビーズをPBS溶液で洗浄したあと、1%
BSA−PBS溶液に室温で2時間静置後、再度PBS溶液で洗
浄し、マウス抗PAI抗体固定ビーズを得た。[Preparation of Immobilized Antibody] Polystyrene beads having a center line average roughness (Ra) of 1.35 μm (D-7, Immunochemical Co., Ltd.) were added with 0.1 M phosphoric acid citrate of mouse anti-PAI monoclonal anti-PAI antibody (JTI-4). Immerse in a buffer solution (pH 3.0) (20 μg / ml) at 4 ℃ for 2
Left for 0 hours. After washing the beads with PBS solution, 1%
After standing still in the BSA-PBS solution at room temperature for 2 hours, the beads were washed again with the PBS solution to obtain mouse anti-PAI antibody-immobilized beads.
[検量線の作成] ヒトtPA・PAI複合体を0.25%スキムミルクを含む、0.
01Mリン酸−0.5M NaCl−2%BSA緩衝液(pH7.2)で希
釈して25、12.5、6.25、3.125、1.56、0ng/mlの溶液を
作成した。各濃度の溶液0.4mlとマウス抗PAI抗体固定ビ
ーズを小試験管に入れ、37℃で1時間インキユベーショ
ンした。次にPBSに0.05%Tween 20を含む洗浄液で2回
洗浄した。[Preparation of calibration curve] Human tPA / PAI complex containing 0.25% skim milk, 0.
Diluted with 01M phosphate-0.5M NaCl-2% BSA buffer (pH 7.2) to prepare 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56 and 0 ng / ml solutions. 0.4 ml of each concentration solution and mouse anti-PAI antibody-immobilized beads were placed in a small test tube and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the plate was washed twice with a washing solution containing 0.05% Tween 20 in PBS.
ペルオキシダーゼ標識tPAポリクローナル抗体を1μg
/mlであるようにPBS−0.05%Tween 20溶液で調整し、
0.4mlづつ小試験管に加えた37℃で30分間インキユベー
ションした。洗浄液で3回洗浄後、0.4mlのペルオキシ
ダーゼ用基質液、2.5mM H2O2−0.025%、3,3′,5,5′
−テトラメチルベンチジン0.1M リン酸クエン酸(pH4.
0)溶液を加え37℃で30分間発色させ、1N硫酸で発色を
停止し、450nmの吸光度を測定した。1 μg of peroxidase-labeled tPA polyclonal antibody
/ ml with PBS-0.05% Tween 20 solution,
0.4 ml each was added to a small test tube and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing three times with a washing solution, 0.4 ml of a substrate solution for peroxidase, 2.5 mM H 2 O 2 -0.025%, 3,3 ′, 5,5 ′
-Tetramethylbenzidine 0.1M phosphoric acid citric acid (pH 4.
0) The solution was added and color was developed at 37 ° C for 30 minutes, the color development was stopped with 1N sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured.
検量線を第1図に示す。 The calibration curve is shown in FIG.
実施例2[ペルオキシダーゼ標識した抗tPAモノクロー
ナル抗体と抗tPAポリクローナル抗体の比較] ヒトtPA・PAI複合体を0.25%スキムミルクを含む0.01
Mリン酸−0.5M NaCリツトル−2%BSA緩衝液(pH7.2)
で希釈して25、12.5、6.25、0ng/mlの溶液を作成した。
各濃度の濃度0.4mlと実施例1[固定抗体の作成]で作
成したマウス抗PAI抗体固定ビーズを小試験管に入れ37
℃で1時間にインキユベーションした。次にPBSに0.05
%Tween20を含む洗浄液で2回洗浄後実施例1で得られ
たペルオキシダーゼ標識抗tPAポリクローナル抗体又は
参考例で得られたペルオキシダーゼ標識マウス抗tPA抗
体Fab′フラグメントを1μg/mlであるようにPBS−0.05
%Tween20溶液で調整し、0.4mlづつ小試験管に加えて37
℃で30分間インキユベーションした。洗浄液で2回洗浄
したあと、3mlの洗浄液を小試験管に入れて、0、15、1
0、20、30分間静置後アスピレーターで吸引除去した。
次いで、0.4mlのペルオキシダーゼ基質(実施例1と同
じ)を加え、30分間発色させ、1N硫酸で発色を停止し45
0nmの吸光度を測定した。洗浄液を入れて静置した時間
を吸光度の関係を第2図に示す。この図よりペルオキシ
ダーゼ標識抗tPAポリクローナル抗体を使用した場合に
は吸光度の減少が少く、洗浄操作所要時間による影響を
受けにくいことが判る。Example 2 [Comparison of peroxidase-labeled anti-tPA monoclonal antibody and anti-tPA polyclonal antibody] 0.01 containing 0.25% skim milk of human tPA / PAI complex.
M Phosphate-0.5M NaC Rittor-2% BSA buffer (pH7.2)
Was diluted with to prepare solutions of 25, 12.5, 6.25 and 0 ng / ml.
0.4 ml of each concentration and the mouse anti-PAI antibody-immobilized beads prepared in Example 1 [Preparation of immobilized antibody] were put in a small test tube.
Incubation was carried out at ℃ for 1 hour. Then 0.05 in PBS
After washing twice with a washing solution containing 10% Tween 20, the peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody obtained in Example 1 or the peroxidase-labeled mouse anti-tPA antibody Fab ′ fragment obtained in Reference Example was adjusted to 1 μg / ml with PBS-0.05.
Adjust with% Tween20 solution and add 0.4 ml to each small test tube.
Incubated for 30 minutes at ℃. After washing twice with the washing solution, add 3 ml of the washing solution to a small test tube, and add 0, 15, 1
After standing for 0, 20 and 30 minutes, it was removed by suction with an aspirator.
Next, 0.4 ml of peroxidase substrate (the same as in Example 1) was added, color was developed for 30 minutes, and the color development was stopped with 1N sulfuric acid.
Absorbance at 0 nm was measured. FIG. 2 shows the relationship between the absorbance and the time when the cleaning solution was added and allowed to stand. From this figure, it can be seen that when the peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody is used, the decrease in absorbance is small and the effect of the time required for the washing operation is small.
実施例3 直系が6.35mmで表面の粗さが異なるポリスチレン製の
ビーズと実施例1の[固定抗体の作成]と同様に処理し
て、マウス抗体PAI抗体固定ビーズを得た。ヒトtPA・PA
I複合体を0.25mg/mlを含む溶液を0.25%スキムミルク−
0.01Mリン酸−0.5M NaCl−2%BSA緩衝液で作成し、各
濃度の溶液0.4mlと表面粗さの異なるマウス抗PAI抗体固
定ビーズと小試験管に入れ37℃で1時間インキユベーシ
ヨンした。次にPBSに0.05%Tween20を含む洗浄液で2回
洗浄した。実施例1で得られたペルオキシダーゼ標識抗
体tPAポリクローナル抗体のPBS−0.05%Tween20溶液
(1μg/ml)を0.4mlづつ小試験管に加え37℃で30分間
インキユーベーシヨンした。洗浄液で3回洗浄したあ
と、0.4mlのペルオキシダーゼ用基質流を加えて37℃で3
0分間発色させ、1N硫酸で発色を停止、450mmの吸光度を
測定した。得られた吸光度から非特異的吸着率(0ng/ml
の吸光度÷25ng/mlの吸光度×100)を求めた。ポリスチ
レンビーズの表面粗さは東京精密(株)の表面粗さ サ
ーフコム で測定した。非特異的吸着率を縦軸に、表面
粗さを示す中心線平均粗さ(Ra)を横軸にとると第3図
の如くなり、この図より表面粗さが小さい程非特異的吸
着率に小さいことが判る。非特異的吸着率が2.5%以下
のとき、中心線平均粗さは1.5μm以下であった。Example 3 Made of polystyrene having a direct diameter of 6.35 mm and different surface roughness
The beads were treated in the same manner as in [Preparation of immobilized antibody] in Example 1.
Thus, mouse antibody PAI antibody-immobilized beads were obtained. Human tPA / PA
A solution containing 0.25 mg / ml of I complex was added to 0.25% skim milk-
Prepared with 0.01 M phosphate-0.5 M NaCl-2% BSA buffer,
Concentration solution 0.4ml and mouse anti-PAI antibody with different surface roughness
Put in a fixed bead and a small test tube and incubate at 37 ℃ for 1 hour.
I did it Next, wash twice with PBS containing 0.05% Tween 20.
Washed. The peroxidase-labeled anti-antibody obtained in Example 1
PBS-0.05% Tween20 solution of body tPA polyclonal antibody
Add 0.4 ml of (1 μg / ml) to a small test tube at 37 ℃ for 30 minutes.
Ink used. Washed three times with the cleaning solution
And 0.4 ml of peroxidase substrate flow at 37 ° C for 3
Color for 0 minutes, stop coloring with 1N sulfuric acid, and absorb at 450 mm
It was measured. From the obtained absorbance, the non-specific adsorption rate (0ng / ml
Absorbance of ÷ absorbance of 25 ng / ml x 100) was determined. Polisti
The surface roughness of renbeads is that of Tokyo Seimitsu Co., Ltd.
Elf It was measured at. Non-specific adsorption rate on the vertical axis, surface
The centerline average roughness (Ra), which indicates the roughness, is plotted on the horizontal axis in Fig. 3.
The smaller the surface roughness, the more non-specific absorption
It turns out that the arrival rate is small. Non-specific adsorption rate is 2.5% or less
At that time, the center line average roughness was 1.5 μm or less.
実施例4 実施例1[検量線の作成]における洗浄液として、第
1表記載の各種の表面活性剤を生理水に溶解して使用し
た時のtPA・PAI濃度0ng/ml(N)、25ng/ml(S)の吸
光度とその比(S/N)を示す。S/N比が40を非特異的吸着
の許容限度とするとき、第1表の如く、HLBが16以上の
非イオン界面活性剤を使用した場合非特異的吸着抑制に
有効である。しかしHLBが16以下の非イオン界面活性剤
であるP−8PやTween40では非特異的吸着は抑制するが
特異反応(S)も抑制し高感応分析には有効ではなかっ
た。Example 4 As the washing solution in Example 1 [Creation of calibration curve], various surfactants described in Table 1 were dissolved in physiological water and used, and the tPA / PAI concentration was 0 ng / ml (N), 25 ng / The absorbance of ml (S) and its ratio (S / N) are shown. When the S / N ratio is set to 40 as the allowable limit for nonspecific adsorption, as shown in Table 1, the use of a nonionic surfactant having an HLB of 16 or more is effective in suppressing nonspecific adsorption. However, nonionic surfactants having an HLB of 16 or less, such as P-8P and Tween 40, suppressed nonspecific adsorption but also suppressed specific reaction (S), and were not effective for highly sensitive analysis.
実施例5[スキムミルク添加による非特異的吸着の抑
制] (a)一次反応溶液へのスキムミルク添加効果 スキムミルクを0、0.01、0.125、0.25、0.5、0.8、
1.0%含有する、0.01M PB−0.5M NaCl−2%BSA(pH
7.2)緩衝液でヒトtPA・PAI複合体を希釈し、0、25ng/
mlの溶液を作成した。各溶液0.4mlとマウス抗PAI抗体固
定ビーズを小試験管に入れ、37℃で1時間インキユベー
シヨンした。次にPBSに0.05%Tween20を含む洗浄液で2
回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗tPAポリクローナ
ル抗体を1μg/mlであるようにBPS−0.05%Tween20溶液
で調整し、0.4mlづつ小試験管に加えて、37℃で30分間
インキユベーシヨンした。洗浄液で3回洗浄後0.4mlの
ペルオキシダーゼ用基質液を加え37℃で30分間発色さ
せ、lN硫酸で発色を停止し、450nmの吸光度を測定し
た。その結果を表2aに示す。非特異的吸着(N)と特異
反応(S)のS/N比が40.0を許容限界とするとスキムミ
ルク濃度が0.01〜0.8%の間で有効であることがわか
る。 Example 5 [Suppression of non-specific adsorption by adding skim milk] (a) Effect of adding skim milk to primary reaction solution 0, 0.01, 0.125, 0.25, 0.5, 0.8
Contains 1.0%, 0.01M PB-0.5M NaCl-2% BSA (pH
7.2) Dilute human tPA / PAI complex with buffer solution, and add 0,25ng /
A ml solution was made. 0.4 ml of each solution and mouse anti-PAI antibody-immobilized beads were placed in a small test tube and incubated at 37 ° C for 1 hour. Next, wash with PBS containing 0.05% Tween20
Washed twice. The peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody was adjusted to 1 μg / ml with BPS-0.05% Tween20 solution, 0.4 ml each was added to a small test tube, and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After washing three times with a washing solution, 0.4 ml of a peroxidase substrate solution was added to develop color for 30 minutes at 37 ° C., color development was stopped with 1N sulfuric acid, and absorbance at 450 nm was measured. The results are shown in Table 2a. It can be seen that when the S / N ratio of non-specific adsorption (N) and specific reaction (S) is 40.0 as an allowable limit, it is effective when the skim milk concentration is 0.01 to 0.8%.
(b)二次反応溶液へのスキムミルクの添加効果 スキムミルクを0.25%含有する0.01M−PB−0.5M NaC
l−2% BSA(pH7.2)緩衝液でヒトtPA・PAI複合体を
希釈し、0、25ng/mlの溶液を作成した。各溶液0.4mlと
マウス抗PAI抗体固体ビーズを小試験管に入れ、37℃で
1時間インキユベーシヨンした。次にPBSに0.05%Tween
20を含む洗浄液で2回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識
抗tPAポリクローナル抗体を1μg/mlの濃度で含有しス
キムミルクを0、0.01、0.25、0.5、0.8、1.0%含有す
るPBS−0.05%Tween20の溶液を調整し、0.4mlづつ小試
験管に加え、37℃で30分間インキユベーシヨンした。洗
浄液で3回洗浄後、0.4mlのペルオキシダーゼ用基質を
加えて37℃で30分間発色させ、1N硫酸で発色を停止し、
45nmの吸光度を測定した。その結果を第2表bに示す。
非特異的吸着(N)と特異反応(S)によるS/N比はス
キムミルクを0.01〜0.8%添加することにより上昇し、
スキムミルクが有効であることがわかる。(B) Effect of adding skim milk to the secondary reaction solution 0.01M-PB-0.5M NaC containing 0.25% skim milk
The human tPA / PAI complex was diluted with 1-2% BSA (pH 7.2) buffer to prepare a solution of 0, 25 ng / ml. 0.4 ml of each solution and mouse anti-PAI antibody solid beads were placed in a small test tube and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then add 0.05% Tween to PBS.
It was washed twice with a washing solution containing 20. Prepare a solution of PBS-0.05% Tween20 containing peroxidase-labeled anti-tPA polyclonal antibody at a concentration of 1 μg / ml and 0, 0.01, 0.25, 0.5, 0.8, 1.0% skimmed milk, and add 0.4 ml to each small test tube. Incubated at 37 ° C for 30 minutes. After washing three times with the washing solution, 0.4 ml of the substrate for peroxidase was added and color was developed for 30 minutes at 37 ° C, and the color development was stopped with 1N sulfuric acid.
The absorbance at 45 nm was measured. The results are shown in Table 2b.
The S / N ratio due to non-specific adsorption (N) and specific reaction (S) is increased by adding 0.01-0.8% skim milk,
It turns out that skim milk is effective.
実施例6[正常人、患者検体の測定] 実施例1[検量線の作成]において、検体として正常
人5名と血栓症の患者3名の血漿を4倍希釈して測定し
た結果を第3表に示す。 Example 6 [Measurement of normal humans and patient samples] In Example 1 [Creation of calibration curve], plasma obtained from 5 normal humans and 3 thrombotic patients was diluted 4-fold and measured as the third sample. Shown in the table.
血栓症の患者のtPA・PAI複合体濃度は明らかに高値を
示し、tPA・PAI複合体濃度は血栓症の診断でマーカーと
なり得ることがわかった。 The concentration of tPA / PAI complex in patients with thrombosis was clearly high, and it was found that the concentration of tPA / PAI complex could be a marker for the diagnosis of thrombosis.
実施例7 [活性型PAI濃度の測定] 正常人血漿、血栓症患者血漿(50μ)にヒトtPA溶
液(0.5μg/ml、50μ)を加え、37℃で30分間インキ
ユベーシヨンした。このあと実施例1の検量線の作成に
従ってtPA・PAI複合体の濃度を求めた(結果A)。同時
にtPAを添加していない正常人血漿、血栓症患者の血漿
を実施例1の検量線の作成にしたがってヒトtPA・PAI複
合体の濃度を求めた(結果B)。活性型PAIの濃度は両
者測定値の差を求め、PAIの分子量換算をして求めた
(結果C)。結果を表4に示す。Example 7 [Measurement of Active PAI Concentration] Human tPA solution (0.5 μg / ml, 50 μ) was added to normal human plasma and thrombotic patient plasma (50 μ), and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After that, the concentration of the tPA / PAI complex was determined according to the preparation of the calibration curve of Example 1 (Result A). At the same time, the concentration of human tPA / PAI complex was determined for normal human plasma to which tPA was not added and plasma of patients with thrombosis according to the preparation of the calibration curve of Example 1 (Result B). The concentration of active PAI was obtained by calculating the difference between the measured values and converting the molecular weight of PAI (result C). The results are shown in Table 4.
血栓症の活性型PAI濃度は正常人に比べて、有意に上
昇しており、活性型PAI濃度は血栓症の診断マーカーと
なり得ることがわかった。 The active PAI level of thrombosis was significantly higher than that of normal subjects, and it was found that the active PAI level could be a diagnostic marker for thrombosis.
フロントページの続き (72)発明者 村上 敏信 栃木県下都賀郡国分寺町駅東1―7―9 ―202 (72)発明者 坂田 洋一 栃木県宇都宮市山本町253―77 (56)参考文献 特開 昭59−68674(JP,A) 特開 昭53−32114(JP,A) 特開 昭60−36964(JP,A) 国際公開89/1624(WO,A) THROMBOSIS RESEAR CH,VOL.55,(1989),P.285 〜289Front page continued (72) Inventor Toshinori Murakami 1-7-9-202 East, Kokubunjicho Station, Shimotsuga-gun, Tochigi Prefecture (72) Yoichi Sakata 253-77 Yamamotocho, Utsunomiya City, Tochigi Prefecture (56) Reference JP-A-59 -68674 (JP, A) JP-A-53-32114 (JP, A) JP-A-60-36964 (JP, A) International Publication 89/1624 (WO, A) THROMBOSIS RESEARCH CH, VOL. 55, (1989), p. 285 ~ 289
Claims (12)
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体を免疫学的に測定するためのキツトで
あつて、 (i)中心線平均粗さ(Ra)が1.5μ以下の表面を有す
るポリスチレン担体上に結合したヒトプラスミノーゲン
アクチベーター・インヒビターに対するモノクローナル
抗体(第1抗体) (ii)酵素により標識化されたヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターに対するポリクローナル抗体(第2抗
体) (iii)酵素活性を測定するための基質および反応停止
剤 (iv)希釈剤 および、 (v)HLB(Hydrophile Lipophile Balance)値が少な
くとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤 よりなることを特徴とする免疫学的測定キツト。1. A kit for immunologically measuring a human tissue plasminogen activator-human plasminogen activator inhibitor complex in a human specimen, comprising: (i) center line average roughness (Ra). ) Is a monoclonal antibody against human plasminogen activator inhibitor bound to a polystyrene carrier having a surface of 1.5 μm or less (first antibody) (ii) Enzyme-labeled polyclonal antibody against human tissue plasminogen activator (Second antibody) (iii) Substrate and reaction terminator for measuring enzyme activity (iv) Diluent, and (v) Nonionic surfactant having HLB (Hydrophile Lipophile Balance) value of at least 16 were contained. An immunoassay kit comprising a detergent.
〜5.0の蛋白質がさらに前記二次抗体および/または前
記希釈剤に含まれている請求項1記載の免疫学的測定キ
ツト。2. A molecular weight of about 16,000 to about 50,000 and an isoelectric point of 1.0.
The immunoassay kit according to claim 1, wherein a protein of -5.0 is further contained in the secondary antibody and / or the diluent.
キレンアルキルアリールエーテル系、ポリオキシアルキ
レンアルキルエーテル系、ポリオキシアルキレン多価ア
ルコール脂肪酸エステル系およびポリオキシエチレンポ
リオキシプロピレンポリオール系からなる群から選ばれ
る少なくとも一種である請求項1または2記載の免疫学
的測定キツト。3. The nonionic surfactant is selected from the group consisting of polyoxyalkylene alkylaryl ether type, polyoxyalkylene alkyl ether type, polyoxyalkylene polyhydric alcohol fatty acid ester type and polyoxyethylene polyoxypropylene polyol type. The immunological measurement kit according to claim 1 or 2, which is at least one of the following:
求項1〜3のいずれかに記載の免疫学的測定キツト。4. The immunoassay kit according to claim 1, wherein the monoclonal antibody is JTI-4.
4いずれかに記載の免疫学的測定キツト。5. The method according to claim 2, wherein the protein is skim milk.
4. The immunological measurement kit according to any one of 4 above.
体にヒト検体を接触させ、次いで標識化された第2抗体
を接触させるか、或いは (2) 不溶性固体担体に結合した第1抗体、標識化さ
れた第2抗体及びヒト検体を同時に接触させる、 ことにより、ヒト検体中のヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体を免疫学的に測定する方法であつて、 (a) 中心線平均粗さ(Ra)が1.5μm以下の表面を
有するポリスチレン担体上に結合したヒトプラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を第1抗体として使用し、 (b) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するポリクローナル抗体を第2
抗体として使用し、且つ (c) HLB(Hydrophile Lipophile Balance)値が少
なくとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤
を洗浄剤として使用する、 ことを特徴とする免疫学的測定方法。6. A human specimen is brought into contact with a first antibody bound to an insoluble solid carrier, and then a labeled second antibody is brought into contact therewith, or (2) a first antibody bound to an insoluble solid carrier. A method for immunologically measuring a human tissue plasminogen activator-human plasminogen activator inhibitor complex in a human specimen by simultaneously contacting the labeled second antibody and the human specimen. (A) using a monoclonal antibody against human plasminogen activator inhibitor bound on a polystyrene carrier having a surface with a centerline average roughness (Ra) of 1.5 μm or less as the first antibody, (b) using an enzyme A second polyclonal antibody against a labeled human tissue plasminogen activator was used.
An immunological assay method, comprising: (c) a detergent containing a nonionic surfactant having an HLB (Hydrophile Lipophile Balance) value of at least 16 is used as a detergent.
検体を接触させ、次いで標識化された第2抗体を接触さ
せることによる請求項6記載の免疫学的測定方法。7. The immunoassay method according to claim 6, wherein a human sample is brought into contact with a first antibody bound to an insoluble solid carrier, and then a labeled second antibody is brought into contact therewith.
〜5.0の蛋白質がさらに前記二次抗体および/または前
記希釈剤に含まれている請求項6または7記載の免疫学
的測定方法。8. A molecular weight of about 16,000 to about 50,000 and an isoelectric point of 1.0.
The immunological assay method according to claim 6 or 7, wherein a protein of -5.0 is further contained in the secondary antibody and / or the diluent.
キレンアルキルアリールエーテル系、ポリオキシアルキ
レンアルキルエーテル系、ポリオキシアルキレン多価ア
ルコール脂肪酸エステル系およびポリオキシエチレンポ
リオキシプロピレンポリオール系からなる群から選ばれ
る少なくとも一種である請求項6〜8のいずれかに記載
の免疫学的測定方法。9. The nonionic surfactant is selected from the group consisting of polyoxyalkylene alkylaryl ether type, polyoxyalkylene alkyl ether type, polyoxyalkylene polyhydric alcohol fatty acid ester type and polyoxyethylene polyoxypropylene polyol type. The immunological measurement method according to any one of claims 6 to 8, which is at least one of the following:
請求項6〜9のいずれかに記載の免疫学的測定方法。10. The immunological assay method according to any one of claims 6 to 9, wherein the monoclonal antibody is JTI-4.
〜10のいずれかに記載の免疫学的測定方法。11. The protein is skim milk.
11. The immunological measurement method according to any one of to 10.
プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲ
ンインヒビター複合体及び (B) ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターを添
加したヒト検体中に存在するヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーター・ヒトプラスミノーゲンインヒビター複
合体をそれぞれサンドイツチ法による免疫学的測定方法
によつて測定し、その測定値の差に基いてヒト検体中の
活性型ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ーの量を測定する方法において、 (a) 中心線平均粗さ(Ra)が1.5μm以下の表面を
有するポリスチレン担体上に結合したヒトプラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を第1抗体として使用し、 (b) 酵素により標識化されたヒト組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するポリクローナル抗体を第2
抗体として使用し、且つ (c) HLB(Hydrophile Lipophile Balance)値が少
なくとも16である非イオン界面活性剤を含有した洗浄剤
を洗浄剤として使用する、 ことを特徴とする活性型ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビターの測定方法。12. (A) Human tissue plasminogen activator-human plasminogen inhibitor complex present in human specimen and (B) human tissue present in human specimen to which human tissue plasminogen activator is added. Tissue plasminogen activator-human plasminogen inhibitor complex was measured by an immunological measurement method using the Sangerti method, and based on the difference in the measured values, active human plasminogen activator in human specimens was measured. In the method for measuring the amount of an inhibitor, (a) a monoclonal antibody against a human plasminogen activator inhibitor bound on a polystyrene carrier having a surface with a center line average roughness (Ra) of 1.5 μm or less is used as a first antibody. (B) human tissue labeled with an enzyme Polyclonal antibodies against Las plasminogen activator second
An active human plasminogen activator characterized in that it is used as an antibody and (c) a detergent containing a nonionic surfactant having an HLB (Hydrophile Lipophile Balance) value of at least 16 is used as a detergent. Method for measuring beta inhibitor.
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WO1989001624A1 (en) * | 1987-08-12 | 1989-02-23 | Teijin Limited | Immunoassaying method and reagent kit for it |
-
1990
- 1990-10-02 JP JP2513161A patent/JP2561753B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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