JP2556659B2 - 電気泳動の間に標的物質を検知する方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 従来分野 本発明は、分子的又は微生物学的原因物質のアッセイ
に関し、特に、斯かる原因物質を検知するための蛍光マ
ーカーに基づく電気泳動システムに関する。

背景技術 米国特許第4,811,218号において、エム・ハンカピラ
ー（M.Hunkapiller）等は、複数レーン電気泳動装置を
用いたDNA配列決定システムを教示している。蛍光染料
が、レーンを通って移動する分子に付されている。移動
照明及び検知システムが、複数のレーンを走査する。四
つのカラー・データ・ポイントが、数個のレーンの各々
に関して、ゲルを固定距離だけ下った特定の時間におい
て記録される。複雑な分析処理を通じて、四つの色は、
四つの染料で標識したDNA構成成分の濃度に関連付けさ
れる。目的は、DNA片末端であるＡ、Ｃ、Ｇ若しくは
Ｔ、又はＧ、Ｇ＋Ａ、Ｃ＋Ｔ若しくはＣの濃度を確認す
ることであり、ここで、Ａ＝アデノシン、Ｃ＝シトシ
ン、Ｇ＝グアニン、Ｔ＝チミンである。特定の染料標識
のピーク濃度は、DNA配列における特定の塩基と一致す
る。

米国特許第4,890,247号において、サリン（Sarrine）
等は、試験管内の液体試料をロボット式に取り扱い、こ
れらの試料を電気泳動マトリックスに注ぎ、次いで、電
気泳動を行なう装置を記載している。電気泳動で分離さ
れた分子は、蛍光灯で照明される。走査した視界を表わ
すアナログ信号が発される。コンピュータが、アナログ
信号の強さのレベルを記憶し、密度分析（densitometri
c analysis）を行なって電気泳動データを読み取る。密
度測定法は、斯かるデータを読み取るための従来からの
先行技術である。

「酵素の精製及び関連技術」、ダブルュー・ヤコビー
編集、アカデミック・プレス、1984年、275頁（"Enzyme
Purification and Related Techniques",W.Jakobyed.A
cademic Press,1984,p.275）に報告されたヴァクラヴ・
ホレジュシ（Vaclav Horejsi）による「親和性電気泳
動」（"Affinity Electrophoresis"）と題する論文にお
いて、新規な種類の電気泳動が記載されている。一方の
レーンのゲル媒体は、泳動する巨大分子と反応すること
のできる固定化した配位子で含浸され、もう一方のレー
ンは、対照ゲルであるが、未処理である。そのため、電
気泳動を利用して、親和性ゲル・レーンによって減速さ
れた巨大分子試料と対照ゲル・レーンにおける同様の試
料との間の比較をすることができる。この技術の変更態
様においては、ゲルは、泳動する抗原と相互作用する抗
体と合体していてもよい。二つのレーンを検定すること
ができるため、いろいろな濃度の泳動する巨大分子に関
して、いろいろな減速の程度が分る。更に、配位子で処
理した微小ビーズを、ゲルに捕捉させ、減速剤としての
役割をさせることができる。ビーズは、それらが適当な
大きさならば、ゲルに密に詰めることができる利点があ
る。ゲルの活性化には、部分的な架橋が含まれているの
で、ゲルは、加熱しても溶融しない。ゲル調製の別の方
法が、記載されているが、何れも結果として、巨大分子
減速剤が固定化されている。電気泳動は、通常の態様で
行なわれる。

これらの先行技術の分析システムは、DNA分析等には
非常に有用であるが、標的物質が単一巨大分子又は細菌
等の巨大分子又は病原体である日常の臨床実験室での用
途には適していない。臨床実験室には、心血管系疾患、
免疫疾患、癌、微生物感染症等の種々の疾病の指標であ
る低濃度で存在する増え続ける大多数の標的生化学物質
について体液を迅速に分析する必要がある。更に、性的
感染症が、現在増加し苛烈であり、より多くの試験が必
要であるため、実験室に更なる重荷を負わせている。本
発明の目的は、特に臨床実験室に適しているが、これに
限定されない、迅速で感度が良好で正確な生化学物質及
び病原体のアッセイ・システムを案出することである。

発明の概要 上記の目的は、以下標的検体と称する臨床実験室での
アッセイの典型的な検体であるヒト起源の又は病原体に
由来の物質のアッセイ・システムにおいて達成された。
処理において、蛍光特性を有する結合剤は、既知量の標
的検体と結合した蛍光体になり、この蛍光体は既知濃度
の過剰量で存在する。結合剤は、抗体、抗原、レクチ
ン、レセプター、酵素の基質又は阻害剤又はタンパク質
配位子或いは他の対応する分子に対する特異的親和性を
有する化学又は生化学物質でよい。結合剤は、ヒト又は
動物起源の特定の物質或いは病原体由来の特定の物質に
対して特異性がある。これらの物質は、ヒト又は動物の
疾病又は感染症の診断に役立つものであり、生物学的療
法に役立つものである。標的検体と結合することに加え
て、（未結合の）過剰量の結合剤は、標的検体及び検体
−結合剤対と相対的に異なる移動度を有し、標的検体の
参照指針又はマーカーとしての役割をする。移動度の差
は、電荷と質量との比の違いによって生じるものであ
る。

結合した結合剤と遊離した結合剤の両方を含む試料
は、ゲル中での電気泳動に供される。「結合した」結合
剤とは、他の物質と反応又は複合したものであり。「遊
離した」結合剤とは、反応していないものである。スリ
ット又はピンホールが、ゲルの照明を狭いトラック又は
点に限定するのに用いられる。結合した材料とは異なる
既知の移動度を有する遊離した蛍光性結合剤は、静止視
界トラックを越えて移動する。この遊離結合剤は、アッ
セイ・システムが正しく機能していることを示す内部マ
ーカーとしての役割をする。結合した蛍光物質は、未結
合の材料の前又は後に視界トラックを越えて移動するこ
とができる。事前キャリブレーションにより、スリット
又はピンホールを通り過ぎる一方の物質の運動に関し、
タイム「ウインド」が、もう一方に対して関連付けられ
る。スリットを通り過ぎる一方の物質の運動は、所定の
限界内にもう一方の物質が到着する予測（expectaion）
をもたらす。遊離した物質に対応する信号の検知された
ピークを参照として用いると、現実の試験において結合
した材料が期待されたウインド内に到着しない場合に
は、ウインドの外側で得られた他の如何なるピークも人
為要素と見做される。遊離した蛍光物質のピークの期待
到着時間は、キャリブレーション試験によるとともに、
ピークの大きさによって決定される。トラックにおける
結合した蛍光物質及び遊離した蛍光物質の強度は、記録
され、これら二つの物質は、信号のピーク間の時間的開
きの分析によって関連付けされる。

上記のように、キャリブレーション手続は、泳動時間
が測定され、記録されるトラックを遊離した結合剤及び
結合した結合剤が通過するであろう期待時間を設定す
る。これらの期待時間は、標的物質の存在が不確かな場
合に、標的物質の存在をサーチするのに用いられる。例
えば、キャリブレーション試験が、未結合の結合剤は最
初にトラックを通過し、結合した結合剤は次にトラック
を通過することを確定したとすると、何回かの試験にわ
たって平均した時間差は、特定のゲルにおけるトラック
に到着する期待時間をもたらす。未知の物質を、標的物
質と反応するよりも多量の標的検体に対して特異的な結
合剤と混合すると、遊離した結合剤及び結合した結合剤
の電気泳動が生じる。結合剤及び、存在するのであれ
ば、標的物質は、同じ蛍光波長を有する。混合物の電気
泳動が行なわれる際に、蛍光特性を有する物質がスリッ
トに到着する時間が測定され、記録される。記録後、蛍
光波長を示す各ピークに関してデータをサーチする。結
合した結合剤と遊離した結合剤との間のスリットに到着
する時間差は、第二のピークが「ウインド」と称する或
る統計的限界内の異なる時間に在るかどうかを確認する
ため、各ピークに適用される。もし在れば、第二のピー
クを、第一のピークと対にして、結合した結合剤と遊離
した結合剤を反映する結合した染料と遊離した染料との
関係を確定する。結合した結合剤の存在は、これがま
た、標的物質の存在を示し、以下に説明するように標的
物質の数量化を可能にする。

蛍光性に標識した結合剤は、標的物質に対して特異的
であるため、異なる蛍光波長の幾つかの異なる標識を、
同じ試料及びゲル・レーンに用いることができる。スリ
ット又はピンホールにおいて一回に一つの波長を観察す
るため、フィルター・ホイール（filter wheel）が用い
られる。各色に関し、遊離した蛍光物質の振幅と結合し
た蛍光物質との時間範囲関係が、それら物質がスリット
を越えて移動する際に、形成される。更に進めたステッ
プとして、振幅比をキャリブレーション測定と比較し
て、標的検体の存在及び正確な濃度を決定することがで
きる。斯かる振幅比は、比の計算に、ピークの高さより
もピークの下の面積を用いることが好ましい。斯かる比
率に関して「振幅」の語を用いる場合、ピークの下の面
積を意図するものである。電気泳動分離は、異なる電荷
／質量比、電荷のみ又は電荷／質量／形状の影響に基づ
くものであり、所定の検体−結合剤の組合せに対して最
適にすることができる。

複数の蛍光物質を用いる場合には、波長の開きは、少
なくとも10nmであることが好ましい。遊離した染料及び
結合した染料−巨大分子の通過を、トラック内の一箇所
で観察することにより、重合むら、気泡等のあらゆるゲ
ルにおける不均一に起因する信号妨害が回避される。

本発明は、標的物質の泳動が終了するのを待つこと
も、分離した生化学物質による着色された又は蛍光性の
物質の生成を待つこともなしに、リアルタイムに、迅速
に電気泳動の結果を予告するものである。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の装置の平面図である。

図２は、図１に示す単一ゲル・レーンの上面図であ
る。

図３は、結合していない蛍光材料及び結合した蛍光材
料からの検知要素の信号のプロットである。

図４は、結合していない蛍光材料及び結合した蛍光材
料からの異なる波長の重複している検知要素の信号のプ
ロットである。

図５は、電気泳動のための複数レーン・ゲル配列の上
面図である。

発明を実施するための最良の形態 図１を参照すると、一方の端に負の電圧端子16、反対
側の端に正の高電圧電極端子15を備えた井筒口13を有す
る単一路ゲル電気泳動装置11が示されている。この電気
泳動装置は、基板17を有する従来の単一路18、ゲル層19
及び保護ガラス・カバー21を備えている。基板は、通
常、自立材料であり、ガラス、マイラー（Mylar:商標）
又は任意の公知のゲル支持体でよい。ゲル自体は、通
常、ポリアクリルアミド又はアガロースであるが、合成
のアクリルアミド代用品等の他のゲル材料を用いること
もできる。重合が均一であること、気泡やムラのないこ
とが望ましい特性である。ガラス・カバーは、ゲルのた
めの保護カバーとしてのみ働く非反射性ガラスであるこ
とが好ましい。井筒口13は、試料をこぼすことなく受容
するよう、通常、垂直に位置決めされている。井筒口
は、調製した試料をゲルに向けて送る。井筒口は、ゲル
の堆積と分離を兼ねて行なうことができ、試料のスポッ
トをゲル上に生じさせる。次いで、端子15、16におい
て、高電圧がゲルに印加され、帯電したイオンが、正に
帯電した電極に向かって泳動する。井筒口13に近いゲル
の端は、ゲルの一方の端から隔たった端へと相当の電位
差があるよう、負又は地電位に維持される。

井筒口13に投入する試料は、流体であり、分取した血
液試料であることが多い。血液は、前処理をして、アッ
セイを妨げる成分を取り除くのが良い。除去は、電気泳
動のための所望の標的検体を得ることができるよう、所
望の又は望ましくない成分の何れかのろ過、吸収、遠心
分離又は沈降により行なうことができる。所望の標的検
体は、それに対する特異的結合剤が存在するものでなけ
ればならない。蛍光標識、例えば市販のものが、結合剤
に共有結合させることのできる染料又は染色ビーズを専
門に取り扱っているオレゴン州のモレキュラー・プロー
ブズ社により製造されている。標的検体が、病原因子の
ようなより大きな組織に存在する場合には、斯かる染料
−結合剤複合体は、その病原因子を追跡するのに適して
いよう。この結合剤の挙動が、一様で、多くのアッセイ
に関して予測可能であるよう、現在、モノクローナル抗
体を製造することができる。モノクローナル抗体は、ポ
リクローナル抗体よりも高価であるが、より高い特異性
を有しており、単一エピトープに向けられ、多量に製造
しやすく、一般的により有用であり、結合物質及び遊離
物質の正確な分離を可能にする。

標識した結合剤は、検体との反応が、理に適った又は
都合の良い長さの時間内に完全に又はほぼ完全に行なわ
れるよう、過剰に供給する。過剰の標識の量は、結合し
た標識の予想される最大量の、約２〜50倍の範囲が数字
的には可能であるが、20倍を越えるべきではない。標識
物質は、検体と結合し、電気泳動フィールドに晒された
時に、質量対荷電の比を変化させなければならない。

ビーム25を発生させるため、発光ダイオード又はレー
ザー等の強力に発光する光源23が用いられる。発光ダイ
オード23は、蛍光標識材料の蛍光を励起する波長帯にお
いて約50mWの出力を有している。斯かる励起放射線は、
化学線として知られている。ビームは、バリヤー29のス
リット孔を通してビームを送る合焦レンズ27によって受
光される。スリットを出る光は、発散し、視準レンズ31
によって受光される。ビームは、次いで、プリズム35の
部分である反射面33に送られる。反射面33は、ビームに
対して45度の角度なので、反射されたビームは、入射ビ
ームと90度の角度をなす。反射ビームは、合焦レンズ37
に送られ、ビームは、この合焦レンズの半分を通過する
一方、別の半分は、ゲル層19から反射された反対方向に
進行する光のために残されている。合焦レンズを通過す
る光は、ゲル層19に送られるスリット29の像を担持して
いる。

標識された複合体から放射された蛍光及びゲル層から
反射された光は、レトロ・ビーム39となって合焦レンズ
37の左半分へと進行する。合焦レンズの半分は、各方向
に進行する光によって使用されることに留意する。右半
分は、入来ビームによって使用される一方、左半分は、
レトロ・ビームによって使用される。そこから、レトロ
・ビームは、プリズム35の部分である反射面41へと送ら
れる。レトロ・ビームは、蛍光性標識からの所望の波長
以外の如何なる光も通さないフィルター43を通過する。
フィルターを透過した光は、合焦レンズ45に向けて送ら
れる。そこから、ビームは、光検知要素、例えば、ゲル
の像面に位置するスリットを有する光電子増倍管47に送
られる。

開始時間、即ち、電気泳動を開始させる高電圧の印加
に対して蛍光物質の到着時間が測定される。到着時間は
厳密ではなく、正確には正規曲線（ガウス曲線）なの
で、ピーク時間は記録される。標的物質及び対応する蛍
光結合剤の各々は、キャリブレーション試験（calibrat
ion run）と同様の操作を受ける。キャリブレーション
試験では、測定スリット又はピンホールへの平均泳動時
間が、測定される。次いで、結合した標的物質に関して
だけでなく、遊離した結合剤に関しても標準偏差が決定
される。本発明では、平均泳動時間、即ち、特定の標的
物質に関する結合した結合剤及び遊離した結合剤の期待
到着時間を知ることが必要であり、それは、これらの時
間を、標的物質が存在するかも知れないが、必ずしも存
在するとは限らない試料において標的検体をサーチする
のに用いるためである。結合した結合剤と遊離した結合
剤との間の到着時間の差は、一方の到着を、もう一方の
サーチにおいて、もう一方と対にすることができるよ
う、タイム・ウインド（time window）を作成するのに
用いることができる。もう一方が標準偏差又は２の範囲
内にあることをサーチが示す場合には、もう一方は、対
のメンバーとして認定される。タイム・ウインド内に何
も見出されない場合には、対の第一のメンバーは、人為
要素（artifact）と見做され、処分される。

光電子増倍管の出力は、緩衝記憶装置49において維持
され、結合した染料で標識した結合剤を示す信号と遊離
した染料で標識した結合剤を示す信号との間の比率をだ
すことができる。蛍光ピークを示す記録された信号を受
信するため、データ読取装置50が、緩衝記憶装置49に接
続されている。データ読取装置は、種々のピークを相互
に関連させるコンピュータである。各ピークは、記録さ
れたデータにおいて結合した蛍光物質及び遊離した蛍光
物質をサーチするため、記録される。通常、遊離した蛍
光物質の出現の時間は、事前キャリブレーション時間
（prior calibration time））から決定することができ
る。遊離した蛍光物質のピークの位置が分ったら、或る
時間間隔を置いて統計的限界により規定されるタイム・
ウインド内に位置するはずの対応する結合した蛍光物質
に関してサーチが行なわれる。このタイム・ウインド内
のピークが、結合した蛍光物質、即ち、標的検体として
認定される。次いで、認定されたピークの振幅（amplit
udes）が検査され、比率がコンピュータ50において計算
される。遊離した蛍光物質を結合した蛍光物質と相互に
関連させる方法を、以下、更に説明する。コンピュータ
は、未知の濃度の推定値を得るために比率を比較するこ
とができるよう、更に、標的物質の既知の濃度のキャリ
ブレーションを記憶する。

図２において、ゲル11の平面図は、スリット29の像2
9′が、正の高電圧端子15と、負の電圧端子16と一致す
る井筒口13からのスポットとの間にくることを示してい
る。作動にあっては、端子15に印加された高電圧が、高
電圧の供給による電場に応答する正又は負に帯電した分
子である結合した及び遊離した標識結合剤の泳動を生じ
させる。遊離した標識結合剤は、結合した標識結合剤と
は異なる時間に、所定の位置に定置されたスリット29の
像29′に達する。結合していない標識結合剤は、タイム
・ウインドの一方のマーカーとしての役割をし、タイム
・ウインドは、対応するマーカーとしての結合した標識
結合剤を有しており、これら二つのマーカーは、規定さ
れた統計的な限界内において時間的に離れた一対のマー
カーを形成する。

図３を参照すると、検知要素の信号のプロットを示し
ており、この図において、横軸は時間であり、縦軸は検
知した信号の振幅である。例として、電気泳動が第一の
時点、ｔ＝０で始まり、検知要素は、作動状態になる。
第二の時点、t2で、第一の色の遊離した蛍光物質を示す
比較的大きなピーク51が観察される。別の信号54（以下
に説明する）が、ピーク51の後に検知される。その後、
t3、同じ色の弱い信号53が観察される。ピーク53は、X1
とX2との間のウインドW1の中間領域に存在している。ウ
インドW1の存在は、強い遊離した蛍光物質の信号51によ
って確定される。ピーク53は、ウインドW1内にあり、結
合した蛍光物質の信号として認められる。ピーク54は、
この信号が遊離した蛍光物質の信号51と間違えられてい
ないかどうかを決定するために検査した後、疑陽性又は
人為要素として処理される。遊離した蛍光物質及び結合
した蛍光物質に関する最も論理的な位置を決定するた
め、全ての信号のサーチが行なわれる。タイム・ウイン
ドW1に信号がない場合には、標的検体が存在しないこと
が推定される。各ウインドＷは、時間領域フィルターと
して作用し、偽蛍光信号及びノイズの識別を可能にして
いる。全ての信号が記録され、記録後に記録されたデー
タを解析することにより、信号の識別が行なわれること
に留意されたい。たとえゲル間の（gel to gel）特性が
変化しても、結合した蛍光物質と遊離した蛍光物質とは
同じ経路を通過するので、本発明は、殆どの変化に対し
て免疫性を有している。

ピーク51及び53の下の領域（area）によって示される
二つの信号の比率は、データを良好な結合効率を仮定し
たキャリブレーションに関して正規化した後、結合した
蛍光物質と遊離した蛍光物質との比率の推定値を表わ
す。更に後に、別の大きなピーク55が観察される。これ
は、別の遊離した結合剤を示している。これは、それに
続く時間における別のタイム・ウインドW2を規定し、よ
り小さなピーク57が、このウインド内に測定される。こ
れは、結合した蛍光物質を表わすと考えられる。再び、
結合した染料と遊離した染料の比率が計算され、もう一
度、第二の染料と結合した標的検体の濃度を推定するこ
とができる。

図４に示すように、ピークが、互いに重複することも
あり得る。ここでは、二つの異なる蛍光物質を用いた試
験において、比較的大きな振幅を有する第一の遊離した
蛍光物質のピーク61が、同様の振幅の第二のピーク65と
重複している。第二のピーク65は、第二の蛍光物質の信
号である。しかしながら、異なる色を用いているため、
図１のフィルター43によって分離されるので、二つのピ
ークを分離して観察することができる。ピーク61は、タ
イム・ウインドW3を確定し、このウインドには、結合し
ていない結合性に標識された結合剤のピーク61に関する
色と同じ色の結合した蛍光性に標識された結合剤を示す
ピーク63が、全体的に、第二のピーク内に現れる。しか
しながら、フィルター43があるため、ピーク63は、空間
的及び光学的にピーク65と識別することができる。結合
したものの信号と結合していないものの信号との振幅の
比は、約2:1であることが分る。結合した標識物質と結
合していない標識物質の対応する分子の量は、同じ比で
あると推定される。ピーク65に関しては、タイム・ウイ
ンドW4が設定されるが、このウインドには、蛍光物質の
信号は見出されず、そのため、標的検体の存在しないこ
とが推定される。

図５を参照すると、複数レーンの電気泳動シート・ゲ
ルが、示されている。シート71は、二つのレーン73及び
75を有している。各々のレーンは、それぞれの井筒口83
及び85、並びにそれぞれのスリット像87及び89を有して
いる。二つのレーンは、スリット像の位置が同じ位置に
ある同様の構成になっている。レーン73は、検定量の標
的検体及び既知量の遊離した蛍光性に標識した結合剤を
流すのに用いられる。レーン75には、未知量の標的検体
が、遊離した蛍光性に標識した結合剤とともに流され
る。二つのレーンは、レーン75の未知の検体の量を決定
するために比較することができる。より正確にするに
は、記憶装置に多くの比率が記憶されるよう、レーン73
において種々の量の検体を流すことをたくさん行なう。
すると、未知量の検体を流すことによる比率を、調べ、
最も合った検体量を示す既知の比率と比較することがで
きる。

本発明の利点のうちの一つは、結合した染料及び遊離
した染料を示すピークの分析が、電気泳動が終了する
前、即ち、泳動する物質が離れた高圧電極に到着する前
に計算できることである。別の利点は、本システムは、
単一レーンの電気泳動装置のみを用いるので、ゲル間の
不均一性を無にできることである。電気泳動装置におい
て第二のレーンを参照又はキャリブレーションとして用
いることは可能であるが、斯かるキャリブレーション
は、前以て行ない、結果を記憶装置に記憶させることが
できる。関連する検体のパネルをつくる関心のある追加
の検体のための第二又は第三又は第四のレーンを用いる
ことも可能である。先行技術においては、標的検体の分
析には、通常、電気泳動の終了と、それに続く複数の菌
株、色をつけた又は蛍光性の物質等による分析が必要で
ある。本発明を用いると、結合した蛍光物質と遊離した
蛍光物質との間の充分な分離が生じるとすぐにリアルタ
イムで分析を行なうことができる。斯かる分離は、レー
ンの長さのほんの25％又は33％の場所において行なうこ
とができる。充分な分離が生じている場所が分ると、ス
リット又はピンホールの像は、その位置に位置決めさ
れ、次いで、全ての測定がそこから行なわれる。これ
は、開放式の電気泳動システムであること、即ち、全て
の材料を「オン・スケール（on scale）」の状態にする
ため、規定された位置で電気泳動を停止させる必要がな
いことも注目さるべきである。ゆっくりと泳動する物質
と、速く移動する標的検体と同様に検知することができ
る。ノイズ及び人為信号（artificial signals）に対す
る別の標識要素として振幅限界を用いてもよい。

同じゲル・レーンにおいて二以上の蛍光性に標識され
た標的物質を識別するため、図１のフィルター43が異な
る蛍光波長を充分に解像することができる限り、異なる
蛍光波長を用いることができる。各々特定の波長に関す
る複数の試験を同時に行なうことができる。

実施例1.人間の血液に存在する蛋白質の検知 クレアチンキナーゼは、種々の哺乳動物の組織に存在
する酵素である。クレアチンキナーゼは、イソ酵素とし
て知られる三つの異なる形態で存在している:CK−MM
｛骨格筋型（skeletal）｝、CK−MB｛心筋型（cardia
c）｝及びCK−BB｛脳型（brain）｝である。組織を離れ
た後、血中を循環すると、MM及びMB型は、分解してイソ
型又はサブ型として知られるより小さなフラグメントの
形をとる。心筋梗塞の場合には、心筋に存在するMBイソ
酵素は、血奨中に放出される。そのため、MBイソ酵素
は、心臓性の虚血又は壊死に関する特異的な診断用分子
マーカーとしての役割をする。このイソ酵素及びそのイ
ソ型の早急な検知は、心筋梗塞の診断及び血栓融解治療
の開始にとって極めて重大である。

試験を行なうため、血液試料を、血奨と赤血球に分離
する。血奨を、CK−MBに対して送られる蛍光染料で標識
した過剰の抗体と混合した。CKアッセイのために蛍光性
抗体を添加することは、公知であり、エム・ゴメス（M.
Gomez）等の米国特許第4,353,982号に記載されている。
CK−MBが、血奨中に存在するのであれば、CK−MBと蛍光
性に標識された抗体からなる免疫複合体が形成される。
電場を印加すると、蛍光性免疫複合体と未反応蛍光性抗
体からなる反応混合物は、ゲル上を泳動する。電荷及び
質量が異なるため、標識した変化を受けていない免疫複
合体は、標識した抗体とは異なる態様で泳動する。結合
したマーカー及び遊離したマーカーと関連する蛍光が検
知され、到着時間が測定され、記録される。遊離したマ
ーカーは、大きなピークによって確認される。遊離物質
の期待時間内にある全ての物質は、標的検体と見做され
る。

実施例2.性的感染症の存在の検知 多くの性的に感染する病原体、例えば、クラミジア、
ヘルペス等は、尿−生殖部に病変部を形成する。これら
の病原体を検知するため、病変部からスワブで直接試料
を採取し、この抽出物に関して多くの異なる種類の試験
を行なう。これらの試験には、培養試験及び／又は免疫
化学的試験が含まれている。

スワブで病変部の試料採取を行なった後、スワブを可
溶化試薬で処理して、存在する微生物を解放する。この
工程は、微生物に由来する標的検体も可溶化する。この
抽出溶液をろ過し、かなり過剰の未反応の標識物質が存
在するように蛍光性に標識された抗体と反応させる。示
差（differential）アッセイは、上記のように進行す
る。

上記の方法は、スリットの像29′（図２参照）を何処
に位置決めするかによって、量を変えることにより電気
泳動を加速させる。結合した物質と遊離した物質との間
の電荷、質量及び形状の差異が大きい場合には、早い分
離が期待でき、像の位置29′を井筒口13に近づけること
ができる。両者の量（quantities）の間の差異が大きく
ない場合には、像の位置29′を井筒口13からより遠隔け
て、結合した蛍光物質と遊離した蛍光物質との分離時間
をより長くすることが必要である。何れの場合にも、電
気泳動の結果は、電気泳動試験完結よりも早い時点で予
告できる。

実施例3.ヒト血清アルブミン（HSA）抗体の検知 以下の実施例では、HSAに対する抗体が、蛍光性HSAで
標識することにより検知される標識物質である。HSA、
フラクションＶ、は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chem
ical Company）（ミズーリ州、セントルイス）から取得
した。モノクロナール・HSA−抗体（monoclonal anti−
HSA）は、カルフォルニア州のバイオ・スペーシフィッ
ク社（Biospacific Inc.）から取得した。Cy5−標識HSA
が、Cy5蛍光染料｛バイオロジカル・リサーチ（Biologi
cal Research）｝とHSAとを結合させることにより合成
され、モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes）
（オレゴン州、ユージーン）から取得された。この蛍光
物質は、結合剤である。

示差分離アッセイ（differential separation assay:
DSA）を、以下のように行なった。Cy5−標識HSAを、モ
ノクローナル・HSA−抗体（標的）とともに、0.09Mトリ
ス、0.08Mホウ酸塩、0.26mMエチレンジアミン四酢酸（E
DTA）中にCy−HSAが400ng/mlでHSA−抗体が200μg/mlの
最終濃度、pH8.3で温置（incuvation）した。対照試料
は、抗体を添加せずに400ng/mlのCy5−HSAのみからなっ
ている。反応を、1.5mlのエッペンドルフ管（Eppendorf
tubes）内で、20μｌの全反応容積で行なった。試料を
室温（20℃）で30分間温置した後、10μｌのアリコート
を、0.09Mトリス、0.08Mホウ酸塩、0.26mMエチレンジア
ミン四酢酸を含むpH8.3の６％非変性性アクリルアミド
・ゲル（8cm×10cm×0.75mm）（ジュール研究所:Jule l
abs）に供した。

ゲルの井筒口の下方1.3cmの位置に合焦されたHe−Ne
レーザー・ビームを用いて、電気泳動中に蛍光性蛋白質
のリアル・タイム検知を行なった。反射された蛍光は、
光電子増倍管（PMT）を用いて集光した。データは、で
ラブウインドウズ（Labwindows:商標）データ収集ボー
ドを用いてIBMのパソコン（PC）に集められ、分析及び
グラフィクスのためにマイクロソフト・ウインドウズ・
エクセル（Microsoft Windows Excel）ファイルに移送
される。過剰のCy5−HSAを含む試料を、過剰のモノクロ
ーナル−HSA抗体と反応させ、次いで、６％のアクリル
アミド・ゲルに供した。図６は、反射された蛍光に比例
したボルト単位の信号として、信号の振幅を示してい
る。このゲル・システムを用いた分離は、蛋白質の電荷
／質量特性に基づいており、より速く泳動する種は、レ
ーザー・ビームの後で、よりゆっくりと泳動する種より
も早く泳動する。

Cy5−HSAのピーク91は、レーザー・ビームの後、約８
分で泳動する。これは、Cy5−HSAに関する時間を確定す
るためのキャリブレーション試験である。一方、［｛Cy
5−HSA｝−HSA抗体］からなる免疫複合体は、レーザー
のスポットの後25.5分で泳動するピーク93を有してい
る。この実施例は、この結合剤（HSA−抗体）と蛍光性
標識（Cy5−HSA）との対に関する相対的なタイム・ウイ
ンドは、17.5分であることを実証している。８分のピー
ク91は、免疫複合体（｛Cy5−HSA｝−HSA抗体）のピー
ク93を見出すためのデータ収集ウインド内に参照位置を
規定する。

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】電気泳動の間に標的物質を検知する方法で
   あって、 特異的な結合剤を、標的物質を含んでいるかもしれない
   試料と混合する工程であって、結合剤は、標的物質に対
   して特異的で、蛍光特性を有しており、結合剤の量は、
   試料中に遊離した結合剤及び結合した結合剤が存在する
   よう、標的物質と反応する物質よりも多く、結合した結
   合剤及び遊離した結合剤は、何れもスタート位置から測
   定位置までの期待電気泳動時間を有する工程と、 電極によって規定された経路において、前記混合物の電
   気泳動を行なう工程と、 前記蛍光特性を有する物質が測定位置に到着する時間を
   測定し、記録する工程と、 前記測定時間との比較に前記期待電気泳動時間を用い、
   遊離した結合剤と関連して結合した結合剤の前記記録時
   間をサーチする工程であって、前記結合剤の見出すこと
   によって前記標的物質の存在を示す該工程とを、 含むことを特徴とする電気泳動の間に標的物質を検知す
   る方法。
2. 【請求項２】前記結合剤は、蛍光性の抗体、抗原、レセ
   プター、酵素−基質複合体、酵素−阻害剤複合体及びレ
   クチンからなる群から選択されることを特徴とする請求
   項１記載の方法。
3. 【請求項３】前記結合剤は、蛍光性染料と結合している
   ことを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】前記測定位置は、前記結合した結合剤及び
   結合していない結合剤の電気泳動路の途中にあるスリッ
   トであることを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】電気泳動の間に標的物質を検知する方法で
   あって、 （ａ）一以上の既知の標的検体を、各々過剰量の特性蛍
   光物質と反応させ、結合した蛍光物質と遊離した蛍光物
   質との混合物を調製する工程と、 （ｂ）既知のスタート位置からスタートする結合した蛍
   光物質及び遊離した蛍光物質のゲル内での電気泳動を生
   じさせる工程であって、蛍光物質は、経路に沿って電極
   に向かって泳動する工程と、 （ｃ）化学線を、前記蛍光物質に送り、それにより、蛍
   光を生じさせる工程と、 （ｄ）前記経路の固定位置で、結合していない蛍光物質
   の特性蛍光を検知する工程と、 （ｅ）前記固定位置での遊離した物質の測定の時間と異
   なる時間において検体に結合した蛍光物質の特性蛍光を
   検知し、それにより、時間差を生じさせる工程と、 （ｆ）結合した物質の進行時間と、遊離した物質の進行
   時間とをリンクするタイム・ウインドを、前記固定位置
   の後に形成するため、時間差を記録する工程と、 （ｇ）標的検体の存在が未知である患者の試料に対して
   （ａ）〜（ｅ）の工程を繰り返す工程と、 （ｈ）患者の試料中における標的検体の存在を確認する
   ため、タイム・ウインドを用いて結合した蛍光物質を遊
   離した蛍光物質と関連させる工程とを、 含むことを特徴とする電気泳動の間に標的物質を検知す
   る方法。
6. 【請求項６】検体の前記反応は、結合剤に付された蛍光
   染料又はビーズ若しくは微小球に埋め込まれた染料によ
   ることを特徴とする請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】前記結合剤は、蛍光性の抗体、抗原、レセ
   プター、酵素−基質複合体、酵素−阻害剤複合体及びレ
   クチンからなる群から選択されることを特徴とする請求
   項５記載の方法。
8. 【請求項８】前記電気泳動は、単一のレーンにおけるも
   のであることを特徴とする請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】前記電気泳動は、複数のレーンにおけるも
   のであり、それらのうちの一以上は、既知量の標的検体
   に用いることを特徴とする請求項５記載の方法。
10. 【請求項１０】レーンは、ゲルを充填した毛細管又はキ
    ュベットであることを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】各々検知された特性蛍光の各ピークの下
    の面積を測定することを特徴とする請求項５記載の方
    法。
12. 【請求項１２】特性蛍光の振幅の前記検知は、検体がス
    リット又はピンホールを泳動して通り過ぎる際に、前記
    スリット又はピンホールを通して測定が行なわれること
    を特徴とする請求項６記載の方法。
13. 【請求項１３】前記タイム・ウインドは、ほぼ１の統計
    的分散を用いて形成されていることを特徴とする請求項
    ５記載の方法。
14. 【請求項１４】電気泳動の間に標的物質を検知する装置
    であって、 電圧供給端子、ゲル・レーン及び試料供給源を有する電
    気泳動装置であって、電圧供給端子は、移動物質の泳動
    経路を設定する装置と、 ビーム、スリット若しくはピンホール、及び電圧供給端
    子と試料供給源との間の前記経路においてゲル・レーン
    にスリット若しくはピンホールの像を投射する第一の光
    学要素を含む第一の光学手段と、 前記ビームの光から隔絶された光検知要素と、 反射されたビーム、フィルター、及び前記検知要素にス
    リットの反射像を投射する第二の光学要素を含む第二の
    光学手段であって、前記第一及び第二の光学要素は、合
    焦レンズを共有している第二の光学手段と、 遊離した蛍光物質と蛍光物質で標識した検体材料の試料
    であって、それらの成分は何れもゲル・レーンにおける
    移動物質である試料と、 蛍光物質の検知を示す信号の時間を測定し、記録する手
    段と、 遊離した蛍光物質の存在と、結合した蛍光物質とを相互
    に関連させるためのデータ読取り手段とを、 備えていることを特徴とする電気泳動の間に標的物質を
    検知する装置。
15. 【請求項１５】第一及び第二の反射面を有するプリズム
    であって、第一の反射面が、前記ビームを受光するため
    角度をなして傾斜しており、前記ビームを前記共有の合
    焦レンズに送り、前記第二の反射面が、スリットの反射
    像を受像するため角度をなして傾斜しており、前記像を
    検知要素に送るプリズムによって更に規定されることを
    特徴とする請求項14記載の装置。
16. 【請求項１６】複数のゲル・レーンが、並列関係に配置
    されており、一つのゲル・レーンが、試験レーンであ
    り、一以上のレーンがキャリブレーション・レーンであ
    り、前記スリット又はピンホールの像は、前記レーンの
    同じ相対位置にあることを特徴とする請求項14記載の装
    置。