JP2553852B2 - サンプル中の生物学的物質の免疫学的測定法 - Google Patents

サンプル中の生物学的物質の免疫学的測定法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的物質を同呈し、結果的に検定（as
say）する方法に関する。
生物学的物質を検出する方法は、多く存在する。これ
らの方法のうちでも、最も一般的なものは、赤血球凝
集、螢光、酵素又は放射能免疫測定法である。
上記免疫検定法では、人工的なカツプリング生成物、
例えば抗体−酵素複合体、又は放射性ラベリングを使用
することが必要である。
本発明は、人工的なカツプリング生成物や放射性生成
物を必要とせず、しかも、赤血球凝集とは異なり、固相
にて実施することのできる方法に関する。この方法は、
特に、単純且つ迅速であり、非常に感度が高い一方で自
動化し得るという利点を有する。
図面の簡単な説明 第１図は、血液型の判定の様子を示す参考図である。
第２図は、本発明の血液型の判定方法を示す図である。
第３図は、実施例４の方法で得られた結果を示すダイヤ
グラムである。
第４図は、正常血漿の百分率で表わされたプロテインＣ
濃度を横軸に、405nmでの光学密度ODを縦軸に示したダ
イヤグラムである。
本発明は、特に、試料中の生物学的物質の測定法であ
って、 ａ）上記生物学的物質に対する結合親和性を有するリガ
ンド（ligand）が、固相（solid phase）上に固定化さ
れ、 ｂ）該リガンドが固定化された上記固相の存在下で試料
がインキユベートされ、 ｃ）インキユベート後、上記固相が洗浄され、そして、 ｄ）リガンドにより上記固相に結合した上記生物学的物
質の存在が、該生物学的物質に固有の性質でもつて顕現
化されることを特徴とする測定法に関するものである。
本発明の方法は、全ての生物学的物質を検証（demons
trate）することができる。これを、以下、「自己顕現
可能な（auto−revealable）」という。即ち、人又は機
械により検出するために直接的又は間接的に検証するこ
とができる固有の性質を有する任意の生物学的生成物で
ある。
自己顕現可能な物質は、特に、例えば赤血球の如く、
天然の色彩（coloration）を有する物質、又は人工的放
射の下で特別な外観を有する物質、或は、該物質が巨大
分子の場合は直接的に又は該物質中に含有される或種の
成分例えば内在の酵素（endogeneous enzyme）又は化学
的成分の故に、基質を着色することができるか、又は螢
光もしくはルミネセンスを発生することができる物質、
例えばプロテインＣである。
自己顕現可能な物質は、当然のことながら、他の多く
の化学的又は物理的性質によつて顕現化され得る。
一般的に、本発明の方法は、自然光又は人工光により
直接的に視覚化され得る生物学的物質を検出することを
特に意図するものである。この場合、それは、高濃度で
存在する一般に着色（colored）され又は着色（pigment
ed）された物質に関する。
加えて、この方法は、着色により或は基質の存在下で
の内在酵素反応、場合によつては、内在酵素、特に、例
えば、放出されているパーオキシダーゼ、ホスフアター
ゼ、ガラクトシダーゼ、グルコース、オキシダーゼ、ト
ランスアミナーゼ等で、酵素活性化又は物質が細胞であ
るならば細胞溶解後の内在酵素反応により、間接的に顕
現化され得る生物学的物質を検出するのに特に魅力的で
ある。
自己顕現可能な物質は、次の如きものである。
１）細胞、特に、 −着色により又は溶解（lysis）後基質に対するパーオ
キシダーゼ活性により顕現化され得る、ABH、ルイス（L
ewis）、Ｐ、ルテラン（Lutheran）、Rhesus（Ｄ、Ｃ、
ｃ、Ｅ、ｅ）、ケル（Kell）、ダフイー（Duffy）、キ
ツド（Kidd）、MNSsその他の血液型を測定するための赤
血球、 −白血球：多核白血球、リンパ球、単球、 −血小板、 −採取された体液に存在するか又は細胞穿孔（cell pun
cture）又は生検により採取された人工的緩衝体液中に
再懸濁された、上皮、内皮又は結合組織起源の正常な又
は病理学的な細胞。
２）微生物：バクテリア、寄生体、ウイルス。該バクテ
リアは、例えば、ガラクトシダーゼ等の内在酵素の作用
により溶解後に顕現化される。
３）生物学的巨大分子、特に、酵素又は酵素活性を有す
る分子、例えば、ヘモグロビン、トランスアミナーゼ、
ホスフアターゼ、プロテアーゼ及び凝固因子（clotting
factors）。下記に、血漿タンパク質Ｃ（plasma prote
in C）についての例（実施例５）が示されている。
上記自己顕現可能な物質は、直接的に活性な形態にあ
つてもよく、また、細胞溶解及び試薬媒体中への放出に
より、又は凝固酵素（clotting enzyme）の如く酵素カ
スケード中での二次的活性化により、二次的に活性化さ
れたものでもよい。
前記固相は、免疫検定法に通常使用されている任意の
支持体でよく、該支持体は、ビーズ、微小滴定プレート
（microtitration plate）上のウエル、反応性細片（be
ndelettes ractives,reactive strip）等の形態にあ
る。この支持体は、天然又は合成起源の任意のポリマー
から又はガラス等のアモルフアス物質から成つているも
のでよい。好ましくは、ニトロセルロース又はナイロン
の膜が反応性細片に使用され、ポリビニル、ポリプロピ
レン、ポリスチレンその他のプラスチツクがビーズ又は
マイクロプレートに使用される。アガロース、アクリル
アミド又はラテツクスに基づくゲル又は粒子も使用する
ことができる。
検定されるべき物質に親和性を有するリガンドによる
上記固相の増感（sensibilization）は、支持体の性質
及び試験の要件に応じて、受動吸着（adsorption passi
ve）により又は共有結合により行なうことができる。リ
ガンドの吸着後、固相は、蛋白質又は巨大分子、例えば
ウシアルブミン、ウシ胎児血清又はゼラチンで飽和さ
れ、又はツウイーン（Tween）等の化学剤で化学的に修
飾され、こうして非特異的相互作用を防止する。この固
相は、貯蔵用に、乾燥された又は凍結乾燥された状態へ
変換できる。上記リガンドとしては、レクチン、抗原又
は最も頻繁には抗体が挙げられる。
自己顕現可能な生物学的物質は、水性媒体中で上記固
相の存在下にインキユベートされる。該媒体としては、
正常な又は病理学的な生物学的液体、例えば血液、血
清、血漿、尿、頭脊椎液又は胸膜、腹膜、滑膜その他の
滲出液、又は試料を再懸濁させる、最適化物質（蛋白
質、塩、巨大分子、Tween等の化学剤）を含有していて
もよい等張人工媒体を挙げ得る。インキユベーシヨン
は、室温にて又は変更された温度にて、攪拌しつつ又は
攪拌することなく、該物質の性質及びそのリガンドに対
する結合能力に応じた時間行なわれる。インキユベーシ
ヨン後、液相は、相分離又は例えば0.05％強度（streng
th）のTween/PBS緩衝液中で洗浄することにより除去さ
れる。
本発明方法は、リガンドとして対応するモノクナロー
ル抗体を用いて、表面抗原に対応する赤血球の表現型を
検証するのに特に使用することができる。
赤血球の結合の顕現化は、現れる赤色の着色の結果、
直接的である。或は、該方法をより高感度にすべく、洗
浄後の結合細胞を溶血剤で溶解し、溶解産物の酵素活
性、特にパーオキシダーゼ活性を検定（assay）する。
パーオキシダーゼの検定法は公知であり、オルトフエニ
レンジアミン（OPD）又はTMB等の発色物質が使用でき
る。
ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性を利用すること
の利点は、次の通りである。即ち、赤血球には他の多く
の酵素が存在するが、欠損していることがかならずあ
る。ところが、ヘモグロビンが完全に又は非常に実質的
に欠損している場合は致命的である。
下記実施例は、本発明方法の他の特徴及び利点を示す
ものである。
実施例１ ABH式血液型の判定 精製抗−Ａ及び抗−Ｂモノクローナル抗体を、Ｕ字型
ウエルを有するマイクロエリザプレート（Microelisa p
late）型のリジツドイミユロン（rigid immulon）微小
滴定プレート、ラボラトリー ダイナテツク（Laborato
ry Dynatech）のレフアレンスM124B又はＵ字型ウエルを
有する可撓性PVC微小滴定プレート、同ラボラトリーの
レフアレンスM24上に受動吸着する。抗−（Ａ＋Ｂ）抗
体も使用することができる。この目的のため、上記プレ
ートを粘着フイルムで覆い、上記精製モノクローナル抗
体を0.1M重炭酸塩緩衝液pH9.6中、４μg/mlの濃度に
て、37℃で、ウエル当り100μの割合で、３時間イン
キユベートする。該プレートを、10％強度のウシ胎児血
清溶液で30分間飽和する。
EDTA、クエン酸塩又はヘパリン、及び弱い型（groupe
s faibles）A2、A3、Ax、Aend、B3A1Bx及びcis ABの１
％強度血球懸濁液を含有する試験管にＡ、Ｂ、AB又はＯ
型の全血サンプルを採取し、これをカツプ（cupule,cu
p）当り100μの割合で分配し、室温下30分間インキユ
ベートする。
プレートを、ダイナテツク マルチウオツシユ（Dyna
tech Multiwash）を用いる自動洗浄により、0.05％のTw
een 20を含有するpH7.4の0.15M PBS緩衝液で４サイク
ル洗浄する。反応は、Ａ型及びAB型赤血球については抗
−Ａ抗体で、またＢ型及びAB型赤血球については抗−Ｂ
抗体で自発的に読むことができる。
この陽性反応は、抗体をコートしたカツプの表面上に
赤血球を巨視的吸着（adsorption macroscopique）する
ことにより生じる。陰性反応の場合（例えばＯ型の赤血
球の場合）、小球は認められない。読み取りをより高度
にし又は客観的にするには、赤血球を溶解後、ヘモグロ
ビンのパーオキシダーゼ反応により上記反応を顕現化す
ることができる。この目的のためには、パーオキシダー
ゼの基質を含有する溶血溶液を、カツプに添加する:H2O
2の存在下、pHであり、且つ溶血剤として0.1％のサポニ
ンを含有する0.1Mクエン酸塩緩衝液中3mg/mlのオルトフ
エニレンジアミン（OPD）。10分後、1.5M H2SO450μ
を添加することにより反応を停止させる。反応は、490n
mにて分光光度計にて読む。
この実施例において、種々の正常な型又は弱い型（抗
原性部位を少ししか有しない）を含有する試料は、1.5
光学密度単位よりも大きな陽性反応を与え、抗原性部位
の極めて少ない非常に弱い型、特に（Ax、Aend、A1Bx、
cis AB）は、0.15〜1.5の範囲の又は1.5を越える光学密
度を与える。本実験のバツククラウンドは、0.050未満
である。
表Ｉに、古典的凝集法と比較して、結果の一例を示
す。該結果は、本発明による試験について490nmにおけ
るODで表わされ、凝集反応については、慣用されるよう
に強度に従いプラスの数で評値している。
これらの結果は、本発明の方法がより高い感度を有
し、弱い型又は珍しい型例えばAx、Aend、A1Bx又はcis
ABの試料を明確に検出するのに対し、凝集反応では上記
型はかすかに検出されるか又は陰性であることを示して
いる。本発明のABH型判定法は、凝集反応法と比較し
て、献血者から得られた2000の血液試料について、ま
た、抗原性部位の低密度性及び異常な特徴により選択さ
れた稀な赤血球のサンプルについて、評価された。
参考例１ ニトロセルロース又はナイロン膜上でのABH式血液型の
判定 １）膜の製造 ラボラトワレ パル（Laboratoire Pall）製のナイ
ロン系バイオダイン（Biodyne）TM膜の細片を所望の寸
法に切断する。試験をカーン（Kahn）チューブ中で行な
うのなら、細片を該チューブの内径に合せて切断するこ
とができる。
上記膜を抗−Ａ及び抗−Ｂモノクローナル抗体で増感
（sensibilisee）する。これらは、液体の形態で、ピペ
ツト又は抗体溶液を含浸させたパツドを用いて付着させ
る。生じる反応を同呈するために、抗Ａ−に対してＡ字
型のパツドを、抗−Ｂに対してＢ字型のパツドを、該膜
上に置く。この付着は、オペレーター又は機械により読
みとることのできる他の同呈標識又はコードの形態で行
なうこともできる。精製抗体を用いる場合、これは10μ
g/ml又は実験結果に応じた他の濃度にて付着される。希
釈腹水液、又は抗体を含有する培養上清も使用できる。
上記膜を、室温下２時間又は乾燥オーブン中37℃で30
分間乾燥する。乾燥後、該膜をpH7.4のPBS緩衝液で洗浄
し、次いで、１％強度（strength）のウシアルブミンの
PBS緩衝液溶液等の蛋白質溶液で又は10％強度のウシ胎
児血清又は１％強度のゼラチンで飽和させる。
この段階で、上記膜は、直ちに使用されるか、又は、
乾燥後、引続く適用のため貯蔵される。
２）実際の型判定試験 増感細片を、全血又は血液細胞懸濁液を含有する試験
管に３分間室温にて攪拌しつつ又は攪拌することなく浸
漬する。インキユベーシヨン期間の終了時に、これらを
0.15M塩化ナトリウム溶液で洗浄し、直ちに読みとる。
血液がＡ型であれば、赤血球の結合の結果文字Ａが現わ
れ、血液がＢ型であれば、文字Ｂが現われ、血液がABで
あれば、双方の文字が現われ、血液がＯ型であれば、細
片は完全に白のままである（第１図）。
本発明の方法は、ヒト血清又は血漿中の抗−エリスロ
抗原抗体（anti−erythrantigen antibodies）の検出に
も適用できる。次に、まず、該方法の第一の実施方法を
説明する。これは、検出すべき抗体がエリスロ抗原（er
ythrantigen）で増感された固相上に免疫吸着され、ヒ
ト赤血球の特異的固定化により顕現化されるサンドイツ
チ試験に関する。この第一の方法を、実施例２に示す。
実施例２ 抗−Ａ、抗−Ｂ又は抗−AB抗体の検出 １゜／−Ｕ字型ウエルを備えたマイクロエリザプレー
ト（Microelisa plate）タイプのリジツド“イミユロン
（Immulon）”微小滴定プレート、ラボラトリー ダイ
ナテツク（Laboratory Dynatech）、レフアレンス M12
4B上、又はＵ字型ウエルを備えた可撓性PVC微小滴定プ
レート、同ラボラトリーのレフアリンスM24上にＡ又は
Ｂエリスロ抗原を受動吸着させる。
上記Ａ又はＢ抗原は、各種起源のものが使用できる： −或る種の被験者の唾液に存在するか又は粘液、特に卵
巣嚢胞から抽出される、ヒト起源の可溶性抗原。
−馬又は豚等の動物起源の抗原（胃粘液から抽出され
る）。
−A1、A2、Ｂ又はAB型のヒト赤血球の膜から抽出された
抗原。この場合、赤血球の支質が製造される（例えば、
ガーダス・エー（GARDAS A.）及びコシスラク・ジエイ
（KOSCISLAK J.）によりVoxSag.,1971,20,2,137〜149
に記載の方法による）。上記エリスロ抗原は、２％W/v
強度のオクチルグルコシド（シグマ ラボラトリー（SI
GMA Laboratory））及び５％V/V強度のアンモニアの存
在下、４℃にて15分間、膜から抽出される。他の解離剤
（dissociatingagents）、例えば、１％濃度のトリトン
（Triton）X100等も使用できる。しかし、組成物は、不
溶物を除去するために15000gにて30分間遠心分離され
る。
この抗原原料抽出物は、微小滴定プレートを増感させ
るためにpH7.4の0.05Mリン酸塩緩衝液に希釈後直接使用
することもでき、また、追加的な精製工程に供すること
もできる。
−例えばウシアルブミンのような巨大分子基質に結合し
ているかもしれない合成抗原。
−抗−イデイオタイプ抗体も、固相を増感（sensitiz
e）するのに使用できる。
微小滴定プレート上への受動吸着（passive adsorpti
on）のため、抗原を希釈し、赤血球膜から抽出された抗
原については、pH7.4の0.05Mリン酸塩緩衝液中に、また
可溶性抗原については、pH9.6の0.1％Ｍ重炭酸塩緩衝液
中に、10μg/mlの範囲の濃度に希釈する。
この目的のため、プレートを粘着フイルムで覆い、抗
原希釈物を、ウエル当り200μの割合で37℃にて３時
間インキユベートする。
プレートを、ウシ胎児血清の10％強度溶液又はウシア
ルブミンの１％強度溶液で30分間飽和する。0.05％のTw
een 20を含有するpH7.4の0.15M PBS緩衝液中でプレー
トを洗浄後、試験すべき血漿又は血清サンプルをウエル
当り150μの割合で分配し、２％の表現型A1、A2、
Ｂ、AB又はＯを含有する小球溶液をウエル当り50μの
割合で添加する。反応を増感させるために、上記小球
は、パパイン等の酵素で処理することができる。
上記プレートを室温にて30分間インキユベートし、次
いで0.05％のTween 20を含有するpH7.4の0.15 PBS緩
衝液中で４サイクルの間自動洗浄により洗浄する。
反応は、抗−ＡについてはA1及びA2赤血球で、抗−Ｂ
についてはＢ、抗−ABについてはA1、A2又はＢにより、
夫々、抗−Ａ、抗−Ｂ又は抗−AB血清について自発的に
読むことができる。
この陽性反応は、抗体でコートされたカツプの表面上
に赤血球を巨視的に吸着させることにより生起させ得る
ものであり、陰性反応の場合（例えばＯ型の赤血球の場
合）は、小球は視認できない。反応をより高感度にし、
又は客観的なものとするために、赤血球溶解後、ヘモグ
ロビンのパーオキシダーゼ反応により、該反応を顕現化
することもできる。この目的のため、パーオキシダーゼ
のための基質を含有する溶血溶液をカツプに添加する:H
2O2の存在下pHであり、且つ溶血剤として0.1％のサポニ
ンを含有する0.1Mクエン酸塩緩衝液中の3mg/mlのオルト
フエニルジアミン（OPD）。10分後、1.5M H2SO450μ
を添加して反応を停止させる。反応は、490nmにて吸光
光度計にて読む。
第２図は、夫々抗−Ａ抗体を含有する血清及び抗−Ｂ
抗体を含有する血清の滴定の場合の実施例２の方法（方
法Ｉ）により得られた結果を示すダイヤグラムである。
血清の希釈率の逆数（reciprocal dilution）を横軸に
示し、495nmでの光学密度（OD）を縦軸に示す。第２図
は、滴定の感度が、試験管内での標準的な凝集反応の手
法のそれと同等以上であることを示す。
抗−エリスロ抗原抗体の検出方法は、第二の方法によ
つても実施できる。これは、２工程の試験を構成するも
のであつて、検出すべき抗−赤血球抗体を含有するサン
プルを各種表現型のヒト赤血球の存在下にインキユベー
トするものである。赤血球と反応しなかつた抗体を除去
（巨大分子フイルターを通過させるか又は洗浄による）
後、検出すべき抗体と反応した赤血球のみを固相に特異
的に残留させるように、ヒト抗−免疫グロブリンでコー
トされた固相とともに赤血球をインキユベートする。こ
の方法は、或る患者又は献血者の血清中に存在するもの
かも知れず、その検出がなされなければ輸血後溶血事故
を伴い得る抗赤血球抗体のクームス（Coombs）試験によ
る検出法を、より高い感度及び定量的結果をもつて、代
替することができるものである。この方法IIを実施例３
に示す。
実施例３ 抗RHESUS Ｄ抗体の検出 アフイニテイークロマトグラフイーで精製したヒト抗
−免疫グロブリン抗体、又はヒトIgG及びIgMを認識する
モノクローナル抗体又はヒト抗IgG及び抗IgMの混合物
を、Ｕ字型又はＶ字型ウエルを備えたマイクロエリザ
（Microelisa）型の微小滴定プレート上に受動吸着させ
る。この目的のため、抗体を、pH9.6の0.1M重炭酸塩緩
衝液中、10μg/mlの濃度で、ウエル当り100μの割合
で37℃にて３時間インキユベートする。固相を、0.05％
のTween 20を含有するpH7.4の0.15M PBS緩衝液中、自
動洗浄により洗浄する。
同時に、表現型Rhesus Dの赤血球２％を含有する懸濁
液の同量を、抗Rhesus D抗体が探査される血漿又は血清
と共に５〜10分間インキユベートする。こうしてインキ
ユベートされた赤血球を、生理食塩水溶液中で洗浄又は
巨大分子溶液上で過後、ヒト抗−免疫グロブリンでコ
ートされた微小滴定プレートと接触させ、室温下30分間
インキユベートする。
プレートを、0.05％のTween 20を含有するpH7.4の0.
15M PBSを用いた自動洗浄により洗浄する。
反応は、Rhesus D抗原を保有する赤血球で、抗Rhesus
D抗体を含有する血清について自発的に読むことができ
る。
陽性反応は、抗体でコートされたカツプ表面上へ赤血
球を巨視的に吸着させることにより生起され、陰性反応
の場合、小球は視認できない。読みをより高感度とし、
客観的なものとするために、赤血球溶解後、ヘモグロビ
ンのパーオキシダーゼ反応により、反応を顕現化させる
こともできる。この目的のため、パーオキシダーゼのた
め基質を含有する溶血溶液をカツプに添加する:H2O2の
存在下pHであり、溶血剤として0.1％のサポニンを含有
する0.1Mクエン酸塩緩衝液中3mg/mlのオルト−フエニレ
ンジアミン（OPD）。10分後、1.5M H2SO4の50μを添
加して反応を停止させる。反応を、490nmにて吸光光度
計で読む。
第３図は、実施例３の方法（方法II）で得られた結果
を示すダイヤグラムである。第３図に報告された検定に
は、クームス試験に従い最後の陽性希釈率に対応する希
釈率に予め調整した血清サンプル３種を用いた。第２図
と同様に、希釈値を横軸に示し、495nmで測定された光
学密度ODを縦軸に示した。第３図に示される曲線は、本
発明の方法が、抗Rhesus D抗体の滴定のクームス試験よ
りも、32倍以上高感度であることを示している。
本発明の方法は、血漿プロテインＣ（plasma protein
C）の生物学的活性の計量（dosage）に使用することも
できる。
この適用を、次の実施例４に示す。
実施例４ 精製抗プロテインＣモノクローナル抗体を、マイクロ
エリザ（Microelisa）タイプの微小滴定プレート、ラボ
ラトリー ダイナテツク（Laboratory Dynatech）、レ
フアレンス M124B上、又は、分割可能な小さな棒（bar
s）、同社のレフアリンスM1798上に受動吸着させる。
この目的のため、プレートを粘着フイルムで覆い、精
製モノクローナル抗体を、ウエル当り200μの割合
で、37℃にて３時間、pH9.6の0.1M重炭酸塩緩衝液中、
最適濃度（５〜10μg/ml）でインキユベートする。0.1
％のTween 20を含有するpH7.4の0.15M PBS緩衝液中で
上記プレートを洗浄後、血漿サンプル又はその0.5M TB
S Tris緩衝液、0.1M NaCl、１％ウシアルブミン、pH
7.35中への希釈物を、200μの割合で、37℃にて30分
間インキユベートする。
実施例１と同様にして洗浄後、免疫吸着されたプロテ
インＣを、0.15M TBS緩衝液、pH7.35＋9mM CaCl2中、6
mMのヒトトロンビン−ウサギトロンボモデユリン（rabb
it Trombomoduline）複合体の存在下に活性化させる。
この活性化溶液を、200μの割合で分配し、37℃にて3
0分間インキユベートする。実施例１と同様にして洗浄
後、200μの基質を各カツプに添加する（0.05M Tris
緩衝液、0.15M NaCl、pH8.3中1mMの基質2366（カビ
ダイアグノステイツク（KABI Diagnostic）社製）。
１時間後、最終濃度15％の酢酸を添加して反応を停止
させる。
実施例４の計量が、正常又は病的血漿に対して適用さ
れた。
20の正常ヒト血漿をプールしたものを、プロテインC1
00％のレフアレンスとする。このレフアレンスをプロテ
インＣ濃度20％、15％、10％及び５％に対応するように
希釈したものを検定に導入し、レフアレンス曲線を得
る。陰性チエツクサンプル０％は、あらかじめ免疫吸着
によりプロテインＣを除去した血漿から構成する。レフ
アレンス曲線が示される（第４図）。第４図は、正常血
漿の、百分率で表わされたプロテインＣ濃度を横軸に、
405nmでの光学密度ODを縦軸に示したダイヤグラムであ
る。
６群の血漿サンプルを試験し、定量的計量の標準的サ
ンドイツチ法ELISA試験と比較して、本発明の試験の臨
床的相互関係を評価した。
結果を表IIに示す。
本発明の試験により得られた結果は、ELISA試験の臨
床的及び定量的結果と密接な相互関係を有するものであ
る。しかも、本発明に従う試験は、プロテインＣの定性
的欠損（定量的欠損（deficit）のない酵素の生物学的
活性の劣化）を検出できる。該欠損を、ELISA用量決定
では、単に定量的であるにすぎないので、明白にするこ
とができない。
本発明の方法は、他のモードでも実施することができ
る。
即ち、血漿プロテインＣを、サンプルを微小滴定ウエ
ル中に分配する前又はサンプルの最初のインキユベーシ
ヨン中に活性化することができる。このような場合、基
質は、固相の洗浄後、直接添加される。また、上記活性
化は、トロンビン単独又はトロンビンと他の酵素活性化
剤及び特にヘビ毒から抽出された或る種の酵素（例えば
シグマ社のvenom RVVX）とを併用して、行なうこともで
きる。また、螢光基質を使用することも可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−98656（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−106154（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500732（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サンプル中の凝固因子を測定する方法であ
    って、 ａ）上記凝固因子に対する結合親和性を有する抗体が固
    相上に固定化され、 ｂ）上記抗体が固定化された上記固相の存在下で、上記
    サンプルがインキュベートされ、 ｃ）インキュベーション後、上記固相が洗浄され、 ｄ）抗体を介して上記固相に結合した上記凝固因子の酵
    素活性が、発色性又は蛍光基質の存在下に顕現化され、 上記因子が工程ｂ）と工程ｄ）の間に活性化されること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】凝固因子が工程ｃ）と工程ｄ）の間に活性
    化されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】測定されるべき凝固因子が、血漿プロテイ
    ンＣであることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
    第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】サンプル中の細胞又は微生物を測定する方
    法であって、 ａ）上記細胞又は微生物に対する結合親和性を有するリ
    ガンドが固相上に固定化され、 ｂ）上記リガンドが固定化された上記固相の存在下で、
    上記サンプルがインキュベートされ、 ｃ）インキュベーション後、上記固相が洗浄され、 ｄ）リガンドを介して上記固相に結合した上記細胞又は
    微生物の存在が、細胞又は微生物の溶解後、該細胞又は
    該微生物の酵素活性又は化学的内在活性を顕現化するこ
    とにより示される ことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】上記細胞が、赤血球、白血球、血小板、上
    皮、内皮もしくは結合起源の正常な又は病理学的な細胞
    であり、上記微生物が、バクテリア、寄生体又はウイル
    スであるという事実を特徴とする特許請求に範囲第４項
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】上記リガンドが、レクチン、抗原及び抗体
    の中から選択されることを特徴とする特許請求の範囲第
    ４項又は第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】細胞表面抗原を測定する方法であって、 ａ）関心のある抗原に対応する抗体が、固相上に固定化
    され、 ｂ）上記抗体が固定化された上記固相の存在下で、上記
    細胞を含有するサンプルがインキュベートされ、 ｃ）インキュベーション後、上記固相が洗浄され、そし
    て、 ｄ）該細胞の存在が、その溶解後、該細胞中に含まれる
    酵素活性を顕現化することにより示される ことを特徴とする方法。
  8. 【請求項８】サンプル中の、赤血球の表面抗原に対応す
    る血液型を判定する方法であって、 ａ）判定すべき型に特異的な抗体が、固相上に固定化さ
    れ ｂ）上記抗体が固定化された上記固相の存在下で、上記
    サンプルがインキュベートされ、 ｃ）インキュベーション後、上記固相が洗浄され、そし
    て、 ｄ）上記抗体を介して、結合した上記赤血球の存在が、
    赤血球の溶解後、内在酵素活性又は化学的活性により顕
    現化することにより示される ことを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】上記内在酵素活性が、発色性基質により顕
    現化された、ヘモグロビンのパーオキシダーゼ活性であ
    ることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】分析されるべきサンプルが、汚染されて
    いない血液又は血液希釈物であることを特徴とする特許
    請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】抗体がモノクローナル抗体であることを
    特徴とする特許請求の範囲第８〜10項のいずれかに記載
    の方法。
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